Krooninen sairaus

tiivistelmä

papillaarinen kilpirauhassyövän (PTC) on heterogeeninen ja monimutkainen sairaus; alttius PTC vaikuttavat yhteisvaikutukset useita yhteisiä, matalan penetrance geenit, vaikka suhteellisen harvat ovat tähän mennessä identifioitu. Täällä soveltaa tiukkaa yhdistetty lähestymistapa arvioida sekä yksilön ja epistaattinen maksut geneettisten tekijöiden PTC alttius, joka perustuu yksi suurimmista sarjan kilpirauhassyövän tapauksissa kuvattu. Tunnistamisen lisäksi osallistumista

TSHR

vaihtelua klassinen PTC, meidän edelläkävijä tutkimus epistasia paljasti huomattavan vuorovaikutus variantit

STK17B

ja

PAX8

. Vuorovaikutus havaittiin MD-MBR (p = 0.00010) ja vahvistettu muilla menetelmillä, ja sitten replikoidaan toinen itsenäinen sarja potilaista (MD-MBR p = 0,017). Lisäksi osoitimme käänteinen korrelaatio ilmaus

PAX8

ja

STK17B

useista eri solulinjoista peräisin ihmisen kilpirauhasen karsinoomat. Kaiken työmme suojista lisävalaistusta geneettisen perustan kilpirauhassyöpä alttius, ja ehdottaa uutta suuntaa etsintä periytyvän geneettisen panos tautia assosiaatiotutkimuksilla.

Citation: Landa I, Boullosa C, Inglada -Pérez L, Sastre-Perona A, pastori S, Velázquez A, et al. (2013) Lentotoiminnan epistaattinen Vuorovaikutus

PAX8

ja

STK17B

Geenit papillaarinen kilpirauhassyövän Herkkyys. PLoS ONE 8 (9): e74765. doi: 10,1371 /journal.pone.0074765

Editor: Xiaoping Miao, MOE Key laboratorio ympäristöä ja terveyttä, School of Public Health, Tongji Medical College, Huazhong tiede ja teknologia, Kiina

vastaanotettu: 09 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 05 elokuu 2013; Julkaistu 23 syyskuuta 2013

Copyright: © 2013 Landa et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Avustukset Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS) hanke PI11 /01359 (MR), Red Temática de Investigación Cooperativa en syöpä, Instituto de Salud Carlos III, RD12 /0030/0060 (PS), RD12 /0036/0050 (NM) ja S2011 /BMD-2328 TIRONET päässä Madridin itsehallintoalue (MR ja PS), ja Euroopan aluekehitysrahasto. IL tukee FIS avustus FI07 /00326; CB tukee FPI avustuksen BES-2008-006332; LI-P tukee Centro de Investigación BioMedica en Red de Enfermedades Raras, ja AS-P on predoctoral stipendiaattiin FPU ohjelman (MICINN) vastaavasti. SR-LL on post doc-tutkijana FIS (sopimus # CD05-0055). RDU tukevat hanketta BIO2009-12458 Espanjan talousministeriö ja innovaatio. RM, SP ja AV tukee Katalonian, CIRIT (2009SGR-725). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

follikulaarinen-soluista peräisin kilpirauhasen karsinoomat ovat yleisin hormonitoimintaa maligniteetit ja niiden esiintyvyys on merkittävästi kasvanut viime vuosina [1], [2]. Joukossa, papillaarinen kilpirauhassyövän (PTC, 80-85% tapauksista), ja follikulaarinen kilpirauhasen karsinooma (FTC, 5-10%) ovat yleisimpiä alatyyppejä [3]. On yleisesti hyväksytty, että follikulaarinen-soluista peräisin kilpirauhassyöpä käyttäytyy monimutkainen sairaus, jossa useita geneettisiä variantteja, joka sijaitsee matalan penetrance geenejä (LPG), vuorovaikutuksessa keskenään ja ympäristön kanssa, ja siten muokataan yksittäisiä herkkyys [4] – [6].

aiemmin raportoitu yhdistys

FOXE1

geenin PTC alttiuteen [7], että tulos on laajasti toistettu [8] – [10]. Tähän asti useimmat yhdistys tutkimukset ovat keskittyneet tärkeimmät vaikutukset ja tunnistaa vain yhden, tai hyvin rajoitettu määrä, osallistuvien geenien PTC synnyssä. Variantit Näiden geenien selittää suhteellisen pienen osan tapauksista. Vaikka ylimääräinen alhaisen penetraation geenejä voidaan tunnistaa tulevaisuuden tutkimuksen tärkeimmistä vaikutuksista, on myös todennäköistä, että yhteinen variantteja eri

loci

vuorovaikutuksessa muuttaa alttius. Kun geneettisiä variantteja vaikuttaa fenotyypin yhdessä ei-lisäainetta tavalla, tämän geenin-geenin vuorovaikutusta kutsutaan epistasia. Havaitseminen epistaattinen vuorovaikutusten on paitsi tilastollista, vaan myös laskennallisia haasteita [11], [12]. Näitä voidaan voittaa keskittymällä yhdistys tutkimukset geenejä,

a priori

voisivat osallistua yhdessä, joko koska ne sijaitsevat samalla polkuja, tai koska ne ilmentyvät differentiaalisesti kilpirauhasen kasvaimia. Suhteellinen riski kilpirauhassyövän ensimmäisen asteen sukulaiset probands on suurempi kuin minkään muun kuin Mendelin neoplasia [13] – [15], mikä viittaa vahvempi geneettinen komponentti sen etiologia ja siten mahdollisesti suurempi todennäköisyys tunnistaa geeni-geeni vuorovaikutusta.

tämän tutkimuksen tarkoituksena oli saada entistä kattavan kuvan geneettisen perustan PTC mukaan, toisaalta vielä arvioida vaikutuksia yhteisten varianttien kandidaattigeenit, ja toisaalta testaus epistaattinen kaksisuuntaisia ​​yhteisvaikutuksia näiden variantteja. Tätä varten kaksivaiheista yhdistys lähestymistapa hyväksyttiin, joka perustuu yksi suurimmista kilpirauhassyöpäpotilailla potilaan sarja kuvattu toistaiseksi. Siihen sisältyi löytö joukko 609 tapausta ja 525 valvontaa (sarja I), ja kaksi riippumatonta replikointi sarja, joka käsittää 969 tapausta ja 1040 tarkastuksia (sarja II ja III). Havaitsimme ja replikoituu yhteisvaikutuksesta varianttien

PAX8

ja

STK17B

, ikään kuin he voivat olla uusia pelaajia kilpirauhassyöpä alttius. Funktionaaliset analyysit vahvistivat, että näiden geenien ilmentymistä korreloi käänteisesti, vaikkakin taustalla oleva mekanismi, joka johtaa syövän kehittymiseen on vielä selvittämättä.

Tulokset

Laajennetut replikointi sarja Edelleen Vahvista osallistuminen

FOXE1

PTC Alttius

edelleen itsenäisesti monistaa aiemmin raportoitu yhdessä yhteisten vaihtelun

FOXE1

geeni [7]. Meidän Toisessa viime aikoina kerätyt Espanjan tapaus-verrokki sarjaa (III), joka käsittää 451 PTC tapauksissa ja 540 ohjauksessa, vahvistimme erittäin merkittävää yhteyttä toiminnallinen variantin rs1867277

FOXE1

promoottorialueen, samoissa kerrannaisvaikutukset malli, jossa OR (per alleeli) 1,44 (95% CI = 1,19-1,74;

P

= 2,0 × 10

-4). Kaiken kaikkiaan, joka perustuu yhteenlaskettu 1358 PTC tapauksissa ja 1551 tarkastuksia valkoista eurooppalaista alkuperää Espanjasta ja Italiasta, per-alleelin OR 1,45 arvioitiin (95% CI = 1,30-1,61; p = 4,7 × 10

– 12).

ositus Potilaat julkistaa Otaksutuista alatyyppi erityisiä Associations välillä Yksilöllinen SNP ja kilpirauhassyöpä Risk

Kun genotyyppi tapauksissa ja valvontaa löytö vaiheessa, valitsimme 9 vaihtoehtoja sijaitsevat 9 eri geenit sisällytettäväksi replikointi vaiheessa. Kukin SNP oli joko merkittävin tagSNP tietyllä

lokuksen

tai johdonmukaisesti ennustetaan olevan toimiva, kuten on esitetty taulukossa 1.

Merkittävin yhdistys löytö vaiheessa saatiin SNP rs2284734

TSHR

geeni (resessiivinen OR = 2,64; 95% CI = 1,69-4,13;

P

= 1,8 × 10

-5), mikä viittaa sen osallistuminen riskitekijänä erityinen kehittämiseen klassinen PTC. Havaitsimme myös näyttöä alatyypin-erityinen vaikutus rs2687834

TG

geeni (resessiivinen OR = 2,28; 95% CI = 1,50-3,46;

P

= 1,1 × 10

-4), lisäksi viittaa siihen, että kasvaimen ositus näyttää olevan merkityksellinen näkökohta harkitsemaan assosiaatiotutkimuksissa. Tämä on esitetty graafisesti kuvassa S1. Yhdistys

TSHR

-rs2284734 kanssa CPTC oli hieman tilastollisesti merkitsevä replikointi vaiheessa (resessiivinen OR = 1,42;

P

= 0,058, taulukko 1). Liitot jäljellä 8 SNP: tä ei jäljitellä.

epistaattinen vuorovaikutus

STK17B

ja

PAX8

kilpirauhassyövän hoitoon Alttius

Kaikista PTC tapauksissa yksi vuorovaikutus havaittiin yhdenmukaisesti analyyseissä kolmella tavalla; epistasia välillä SNP-paria rs721992 ja rs6554198, joka sijaitsee

CCDC6

ja

KIT

geenien vastaavasti, havaittiin MDR, SNPHarvester ja MB-MDR (taulukko 2). Tämä vuorovaikutus ei toistettu sarja II ja III (p = 0,13).

Kun tarkastellaan vain potilaille, joilla on diagnosoitu CPTC, yksi vuorovaikutus havaittiin neljällä viidestä menetelmät. Tämä vuorovaikutus, joihin SNP rs4848323 ja rs1378624, joka sijaitsee

PAX8

ja

STK17B

geenejä, tässä järjestyksessä, oli liittyvän p-arvon MB-MDR of 0.00010 löytö vaiheessa ja 0,017 replikaatioon vaiheessa (taulukko 3, kuvio 1). Vastaava p-arvo yhdistetyn analyysin tulokset molemmissa vaiheissa oli 0.00002 arvion mukaan 100000 yhdistelmää. Tämä vuorovaikutus havaittiin yhdenmukaisesti MB-MDR kun koko PTC asia sarja (mukaan lukien kaikki alalajit) pidettiin (p-arvo = 0,026 ja 0,045 löytämisen ja replikointi vaiheet, tässä järjestyksessä).

suhteellinen taajuudet yhdeksän genotyyppi yhdistelmiä jäljitellä vuorovaikutuksen (

PAX8

–

STK17B

) näkyvät tapauksissa ja valvontaa (punainen ja sininen pylväät, vastaavasti). Solu, joka sisältää korkean riskin genotyypin yhdistelmää on korostettu vaaleanpunainen, joilla on alhaisen riskin yhdistelmät vaaleansininen, ja ne neutraalilla yhdistelmät ovat väritön. Figure1a – perustuu havaintoon, vaiheessa (sarja I); Kuva 1b – perustuu replikointi vaiheen (sarja II ja III); Kuva 1c – perustuu molempien vaiheiden yhdistettynä (sarja I, II ja III).

Saadakseen toiminnallisia oivalluksia PAX8-STK17B vuorovaikutus, ensin arvioi näiden geenien ilmentymistä tietojen avulla aiemmasta array-pohjainen tutkimus 63 kilpirauhasen kasvaimia [16] ja havaitaan käänteinen korrelaatio (r = -0,77; p = 8,65 x 10

-14; Kuva S2). Olemme myöhemmin havaittiin johdonmukaisesti seurausta sarjassa kilpirauhassyöpä solulinjojen eri ihmisen kasvaimissa; korkea STK17B ilmentyminen havaittiin kaikkein erilaistumattoman ihmisen anaplastinen kilpirauhasen soluja (8505c, Hth7 ja Hth83), joille on ominaista hyvin alhainen tai nolla PAX8 tasoilla (kuvio 2).

mRNA: n ilmentymisen tasot molemmat geenit olivat määräytyy qRT-PCR: llä ja ovat edustettuina suhteellinen yksikköä. Nimi solulinjan ja sen alkuperä (follikulaarinen papillaarinen tai anaplastinen) on merkitty.

tutkia suhdetta PAX8 ja STK17B kilpirauhassyövän hoitoon, rotan kilpirauhasen solut Pax8-vaiennetaan ja STK17B ilme analysoidaan. Yhden päivän jälkeen ohimenevä vaiennettu PAX8, mRNA tasoilla PAX8 väheni noin 70% suhteessa villityypin tai siScamble transfektoitujen solujen. Kuitenkin, mitään muutosta ei havaittu mRNA-tasot STK17B. Pax8 proteiini tasot olivat myös alemmat vaiennettu soluissa samalla STK17b pysyivät ennallaan suhteessa siScamble transfektoituja soluja (Fig. 3A). Sen määrittämiseksi, onko puuttuminen korrelaatio johtui lyhyen aikavälin luonne äänenvaimennusjärjestelmän, joka on siPax8 stabiili solulinja ja proteiinin tasot määritettiin 7, 14 ja 21 päivän kuluttua transfektion. Jälleen lasku PAX8 tasojen havaittiin ilman huomattavaa vaihtelua STK17B tasoilla. (Fig. 3B).

PCCl3 solut olivat väliaikaisesti (A) tai stabiilisti (B) vaimentaa transkriptiotekijän Pax8 (siPax8). Kontrollina, villityypin tai siScramble transfektoituja soluja käytettiin. Ilmaisu tasot arvioitiin qRT-PCR (A, ylempi paneeli) tai Western blot (A, alempi paneeli, ja B).

Keskustelu

Vaikka määrä tunnistettu nestekaasun follikulaarinen-soluista peräisin kilpirauhaskarsinoomaa on lisääntynyt viime vuosina, se on edelleen jäljessä, että muita monimutkaisia ​​sairauksia. Kuten äskettäin arvosteli, yhdistykset ovat johdonmukaisesti toistettu vain rajallinen määrä

loci

[4], [6], siis suuri osa periytyvyys tämän monitekijäinen tauti on yhä selittämättä.

kilpirauhassyöpä on vahva geneettinen komponentti, jossa suhteellinen riski ensimmäisen asteen sukulaiset probands on korkein neoplasioihin ei näy säännöllisesti Mendelin perintö [13] – [15]. Panostus tunnistaakseen uusia geenejä arvioinnin kautta geenien-geenin vuorovaikutus voi siten paljastaa ainakin osan tästä selittämättömiä geneettinen komponentti. Viime vuosina suuri määrä herkkyyden variantteja tunnistettu monimutkaisia ​​sairauksia on synnyttänyt tarpeen suorittaa tarkkoja analyysejä arvioimaan niiden mahdollisia epistaattinen vaikutuksia. Tärkeys Näiden analyysien on pääasiassa paljastamisessa miten läsnäollessa yksi geneettinen variantti vaikuttaa vaikutuksen toista versiota [17] – [19].

Tällaiset epistaattinen analyysejä, toisin kuin geneettinen tärkeimmistä vaikutuksista, muodostavat laskennallisen ja tilastollinen haaste. Monia menetelmiä on kehitetty havaitsemiseksi epistasia, mutta ne kaikki on rajoituksia ja niiden suorituskyky vaihtelee. Lisäksi jotkut näistä menetelmistä ovat laskennallisesti kannattamattomaksi varten GWAS tietojen [20]. Koska meidän tutkimuksessa tarkasteltiin vain 768 SNP geenien perusteella valittu niiden

a priori

otaksuttu rooli taudin, oli mahdollista soveltaa useita monimutkaisia ​​algoritmeja johdettu täydentäviä strategioita, mikä lisää luotettavuutta vuorovaikutuksen havaitsemista .

käyttö MB-MDR toisessa replikointi vaiheen hiljaista useita etuja, kuten mahdollisuus testata tarkka epistaattinen mallin tunnistettu löytö vaiheessa, ja kyky sopeutua mahdollisten sekoittavien tekijöiden sekä marginaalinen SNP vaikutuksia, jälkimmäinen välttää vaikutus tuloksiin SNP paria toimii puhtaasti lisäaineena tavalla. Lisäksi permutaatio-pohjainen p-arvo voidaan helposti saada kohtuullisin laskennallisen kustannuksin. Se, että pystyimme toistamaan toinen vuorovaikutukset havaittiin löytö vaiheessa on osoitus luotettavuutta ehdotetun putkilinjan.

Toistaiseksi lukuisia tutkimuksia, joissa hiiva malleja on tunnistettu yksiselitteisen geeneihin geeni vuorovaikutusta [21] – [24]. Päinvastoin, pyrkii tunnistamaan epistaattinen tai muunlaista vuorovaikutusta ihmisen alttius sairauksille ovat vasta suhteellisen hiljattain alkaneet tuottaa tulosta [25] – [29]. Kuitenkin vähän jos ollenkaan ole vakuuttavasti jäljitellä. Tämä tutkimus on, ensimmäistä kertaa, tunnistetaan ja itsenäisesti monistaa epistaattinen yhdessä CPTC alttius yhteisten variantit kahteen geeniin. Tämä menestys johtuu todennäköisesti paitsi jolla on vähentynyt luettelo kandidaattigeenejä, vaan myös suuren periytyvyys kilpirauhassyöpä, sekä huolellinen kliininen luonnehdinta tapauksessa sarja tunnistaa taudin alatyyppejä pienellä virhe.

Analyysimme epistasia, soveltaa tapauskontrollitutkimuksessa perustuu kandidaattigeeni lähestymistapa [7], on havaittu vuorovaikutusta

PAX8

ja

STK17B

. Tämä ja tulevat havainnot epistaattinen geneettisten yhdistysten voisi olla ensimmäinen askel kohti syvempää biologisia ominaisuuksia koskevat kilpirauhassyöpä.

STK17B

koodaa DRAK2, seriini-treoniinikinaasi osallisena apoptoosin säätelyyn. Se oli alun perin valittu ehdolle geeni tutkia perustuu sen differentiaalikaavojen PTC kasvaimissa suhteessa normaaliin kilpirauhaskudokseen [7], [16].

PAX8

valittiin, koska se on tunnettu kilpirauhasen transkriptiotekijä, jotka liittyvät kilpirauhasen eriyttäminen, sääntelyn erityisiä geenejä, ja synnynnäiset sairaudet [30] – [33]. Mielenkiintoista, tuore tutkimus yhdistyvät genominlaajuisia analyysi Pax8 sitoutumiskohtien kanssa geeniekspressioprofiilien on määritellyt apoptoosin tärkeänä koulutusjakson alle Pax8 asetuksen [34]. Vaikka toiminnalliset analyysit suoritetaan siRNA ei selittänyt taustalla biologinen mekanismi, geenien ilmentyminen tutkimukset perustuvat sekä ihmisen kasvaimista ja solulinjoja ovat löytäneet käänteinen korrelaatio

PAX8

ja

STK17B

. Tämä jälkimmäinen havainto vahvistavat havaintojen yhdistyksen tutkimus viittaa siihen, että nämä kaksi

loci

todellakin vuorovaikutuksessa vaikuttaa alttiuteen CPTC. Siten on houkuttelevaa spekuloida, että PAX8 voisi olla rooli säätelyssä

STK17B

ilme, osoittaen tätä jälkimmäistä, suhteellisen tuntematon geeni uutena otaksuttu toimija kilpirauhasen aineenvaihduntaan.

Lopuksi tuloksemme yksittäisten varianttien in

TSHR

ja mahdollisesti

TG

ja epistaattinen vaikutus SNP

PAX8

ja

STK17B

, kaikki ilmeisesti vahvempi tiettyjä sairauksien alatyyppejä, korostavat mahdollista merkitystä kasvaimen luonnehdinta ja kerrostumista assosiaatiotutkimuksissa. Yhdistys tagSNP rs2284734 in

TSHR

kanssa riski CPTC oli toiseksi tilastollisesti merkitsevä (OR = 2,64; 95% CI = 1,69-4,13;

P

= 1,8 × 10

-5), johdonmukainen havaitut tulokset replikointi vaiheessa (OR = 1,42; 95% CI = 0,99-2,03;

P

= 0,058). Useat tutkimukset ovat osoittaneet yhdistyksen välillä

TSHR

ja alttius sairastua autoimmuunipatologioita kilpirauhanen [35] – [38], yksi heistä, jotka koskevat samaa tagSNP (rs2284734). Assosiaatio Gravesin tauti on myös raportoitu [39]. Harvat tutkimukset ovat arvioineet yhdistyksen välillä

TSHR

ja kilpirauhassyövän riskiä ja ne, jotka ovat, ovat raportoineet negatiivisia tuloksia tähän mennessä [40], [41]. Aikaisemmat tutkimukset ovat arvioineet vain rajoitettu määrä eksoni

TSHR

variantteja. Vaikuttaa ennenaikaiselta sulkea pois tätä

lokus

kilpirauhassyövän hoitoon alttius. Fine-kartoitus alueen tulisi suorittaa, jotta voidaan tunnistaa toimiva variantti, mahdollisesti introni ja /tai sääntelyyn, selittää meidän havaittiin yhdessä CPTC.

Yhteenvetona ehdotamme geneettisiä tekijöitä, jotka voivat osittain selittää ratkaisemattoman periytyvyys kilpirauhassyöpä. Sen lisäksi, että tunnistetaan mahdollinen rooli

TSHR

varianttien CPTC riski, olemme havainneet, ja itsenäisesti monistettavaksi ensimmäistä kertaa epistaattinen suhde

PAX8

ja

STK17B

geenien kilpirauhassyöpä alttius. Tämä geeni-geeni vuorovaikutus osoittaa, että epistaattinen vaikutukset voivat olla tärkeä rooli kilpirauhassyöpä, ja voisi selittää puute havaitun yhdistyksen jokaista geeniä erikseen. Lisätutkimuksia tarvitaan, onko geeni-geeni vuorovaikutukset voivat olla käyttökelpoisia riski markkereita follikkelisolujen johdettu kilpirauhassyövän, samoin kuin muita kasvaimia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Kirjallinen suostumus saatiin kaikkien osallistujien mukaisesti protokollien hyväksymässä ”Comité de bioética y bienestar eläinten del Instituto de Salud Carlos III” ja eettiselle komitealle AK (Regional Cancer Center), Padova, Italia, joka hyväksyi tämän tutkimuksen.

Oppiaineet

kolme sarjaa kilpirauhassyövän tapausten ja kontrollien rekrytoitiin, kuten alla on kuvattu:

Discovery (sarja I). ​​

Rekrytoimme 609 kilpirauhassyöpä potilaiden Espanjan sairaalaverkostoon. Nämä olivat tärkeimmät kilpirauhasen follikulaarinen-soluista saatu karsinoomien: 520 PTC, jota edustaa tärkein alatyyppien ”klassinen PTC” (CPTC; n = 304) ja ”follikulaarinen variantti PTC” (fvPTC; n = 146); ja 69 follikulaarinen kilpirauhasen karsinoomat (FTC). Medullary kilpirauhasen karsinoomat (LVM) ei ollut mukana tutkimuksessa.

Sarjan 525 syöpää vapaa tarkastuksia rekrytoitiin samoilla maantieteellisillä alueilla kuulu sairaaloiden mukana tutkimuksessa. Sekä kotelo ja ohjaa keski-ikä oli 46 vuotta ja naisten: mies sukupuolen suhteen oli 4.6:1.

Replikointi (sarja II ja III yhdistetty).

Toinen tapaus-verrokki series (sarja II) käsitti 412 PTC ja 44 FTC potilaiden palvelukseen kolme sairaalaa sijaitsevat Italiassa ja 500 valvontaa samasta kolmella maantieteellisellä alueella.

kolmas, riippumaton ryhmä Espanjan kilpirauhassyöpä potilaiden saatiin myös 451 PTC ja 62 FTC sekä täydentävänä joukko 540 Espanjan valvonnan (sarja III).

Kaiken replikointi tutkimus käsitti 969 kilpirauhassyöpä tapauksissa valkoisia Euroopan syntyperä, mukaan lukien 863 PTC (582 CPTC ja 118 fvPTC) ja 106 FTC. Heidän keski-ikänsä oli 47 vuotta ja naaras: mies sukupuolen suhteen oli 4.4:1. Keski-ikä koko 1040 tarkastuksia oli 53 vuotta ja naisten: mies sukupuolen suhteen oli 2.4:1.

Hoitohenkilökunta kaikista osallistuvista keskuksista valmistunut yksityiskohtainen kliininen kyselylomake jokaisen potilaan jotka sisältyvät henkilökohtaiset ja kliiniset tiedot, kuten kuten kasvain alatyyppi ja vaihe, sekä tiedot leikkauksen, hoito ja kehittäminen etäpesäkkeiden seuranta-aikana.

DNA Isolation ja kvantifiointi

Veren tai sylkinäytteellä saatiin kaikissa tapauksissa ja valvontaa. Genomi-DNA uutettiin periferaalisen veren lymfosyyttejä automatisoiduilla menetelmillä mukaan valmistajan ohjeiden (Magnapure, Roche, Madrid, Espanja), tai manuaalisesti, käyttäen tavanomaisia ​​menetelmiä [42]. DNA uutettiin syljestä käyttämällä Oragene DNA Self-Collection Kit (DNA Genotek, Ottawa, Kanada). DNA: n konsentraatio kvantifioitiin kaikissa näytteissä ennen genotyyppi käyttäen Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent (Invitrogen, Eugene, OR, USA).

Gene ja SNP Selection

yhdeksänkymmentäseitsemän kandidaattigeenejä olivat valitaan biologisesti suuntautunut tavalla ja 768 yhden nukleotidin polymorfismien (SNP) (taulukko S1) tunnistettiin siinä, kuten aiemmin on kuvattu [7].

SNP genotyypin

SNP genotyypattiin löytö vaiheessa käyttämällä Illumina GoldenGate® genotyypin määritys (San Diego, CA, USA) järjestelmä, on Sentrix Universal-96 array Matrix monen näyterivistön muodossa. Genotyypin replikaatioon vaiheessa suoritettiin käyttäen Kaspar SNP genotyypin System (Kbiosciences, Herts, UK) kuten aiemmin on kuvattu [7].

Tilastollinen analyysi

Lähtö Hardy-Weinberg tasapaino (HWE ) kaikkien SNP testattiin kontrolli käyttämällä Fisherin testiä. SNP tärkeimmät vaikutukset arvioitiin arvioimalla genotyyppispesifinen kertoimet suhde (OR) kautta ehdoton logistista regressiota käyttäen homozygoottien yleisimmistä alleeli kontrolleilla kuin vertailuryhmän. Jokaisen SNP, parhaiten sopiva geneettinen malli määritettiin, ja vastaava p-arvo laskettiin perustuen Wald tilastoa. Kaikki mallit olivat oikaistu otaksuttu sekoittavia tekijöitä ikä, sukupuoli, ja kun asiaan, maa. Arvioimme heterogeenisyys per-alleelin tai kilpirauhassyöpä alatyypin käyttäen uskottavuusosamäärä, kuten aiemmin on kuvattu [43]. Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS for Windows 17.0 ja STATA versio 10®, ellei toisin mainita.

arviointimenetelmien SNP-SNP vuorovaikutukset

testattiin epistasia käyttämällä tapausta homogeenisia ja voimakkaasti edustettuna tauti ryhmien, kuten PTC yleinen ja CPTC. Arvioimme kaksisuuntainen vuorovaikutukset SNP viidestä eri menetelmiä, Multifactor Ulotteisuus Reduction (MDR) [44], [45], Maximum Entropy ehdollinen todennäköisyys Modeling (MECPM) [46], SNPHarvester [47], MegaSNPHunter [48], ja Model Based – Usea Ulotteisuus Reduction (MB-MDR) [49]; katso Menetelmät S1). Me oikaistu sukupuolen ja iän löytö vaiheessa, jossa sallimissa rajoissa kyseessä. Vain vuorovaikutukset (SNP paria) tunnistaa ainakin kolme menetelmiä valittiin replikointi sarjaan II ja III. Käytimme MB-MDR testata replikointi vaiheessa epistaattinen mallin tunnistettu löytö vaiheessa (katso Methods S1). Ikä, sukupuoli ja maa olivat mukana kovariantteja. MB-MDR määrittää kunkin yhdeksän mahdollisen yhdistetyn kahden SNP genotyyppiä kolmeen riskiluokkaan (korkea, matala, ja neutraali) logistisen regressiomallin. Me mukana ikä, sukupuoli ja maa kovariantteja ja lasketut p-arvot perustuvat permutaatio testi [44], [45]. Replikointi vuorovaikutusten arvioitiin pakottamalla genotyypin yhdistelmät riskiluokan määritelty löytö vaiheessa. Vuorovaikutus siihen liittyvän p-arvon 0,05 pidettiin toistensa kopioita. Samanlaista strategiaa sovellettiin yhdistettiin tietoja molemmista vaiheita jäljitellä vuorovaikutusten.

Toiminnalliset analyysit

Soluviljely.

Solulinjat ystävällisesti lahjoitti Dr. Heidin (SW1736, Hth7 ja Hth83 [50]), tohtori Fagin (WRO [51]) ja Dr. Fusco ja Dr. Santoro (BCPAP [52] ja TPC-1 [53]), tai saatu Saksan kokoelma mikro-organismi ja solut Culture (Cal62, 8505c) ja Euroopan kerääminen soluviljelmässä (NthyORI, FTC133). Kaikkia solulinjoja geneettisesti sormenjäljet ​​ja tarkasti olla ainutlaatuinen ja kilpirauhasen alkuperästä [54].

PCCl3 solut ovat jatkuva linja rotan kilpirauhasen follikulaarinen ilmentävien solujen kilpirauhasen erityisiä transkriptiotekijöiden Nkx2.1, Foxe1, ja Pax8. Ne kasvatettiin Coon n muuttaminen Hamin F-12-väliaineessa, jota oli täydennetty 5% fetaalivasikan seerumia ja kuuden hormoni seos [55].

Ihmisen solulinjoja käytetään olivat peräisin normaalista kilpirauhaskudokseen tai follikulaarinen , papillaarinen tai anaplastinen kilpirauhasen karsinoomat. 8505c, WRO ja SW1736-soluissa, sekä NthyORI3.1 valvonta-soluja kasvatettiin RPMI-väliaineessa, kun taas FTC133, TPC1, BCPAP ja Cal62 soluja kasvun DMEM-alustassa, ja Hth7 ja Hth83 soluja MEM-väliaineessa. Kaikki alustat täydennetty 5% naudan sikiön seerumia.

Generation of PCCl3-Pax8-vaiennetaan kilpirauhasen soluja.

hiljentäminen Pax8 suoritettiin PCCl3 soluissa joko ohimenevästi tai stabiilisti. Ohimenevä transfektio suoritettiin käyttäen DharmaFECT 1 siRNA transfektioreagenssi sekä salattu ja

Pax8

siRNA olosuhteissa (Dharmacon, Denver, CO). Vakaa lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) saatiin infektion pGIPZ lentiviruksen plasmidi, joka sisältää häiritseviä sekvenssin puromysiiniresistenttiä Pax8 tai sen ohjaus (sekoituskoodin) (Open Biosystem, Denver, CO).

Kokonais-RNA saatiin ohjaus (villityypin) ja ohimenevästi-Pax8-vaiennetaan soluja (si

Pax8

tai salattu siRNA) käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) seuraten valmistajan suosittelemaa menetelmää; semikvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin sitten kuten aiemmin on kuvattu [56] käyttämällä spesifisiä alukkeita Pax8 (

eteenpäin

CAAGGTGGTGGAGAAGATTG ja

reverse

GAGGTTGAATGGTTGCTG), STK17B (

eteenpäin

CCTGAGTTGGCTGAAATG ja

reverse

TCTGTTGCTGTGGTAATGGG) tai βactin (

eteenpäin

CACTCTTCCAGCCTTCCTT ja

reverse

CTCGTCATACTCCTGCTTGCT).

validointi Pax8 hiljentämisen ja STK17B ilmentyminen testattiin joko RT-PCR tai Western blot käyttäen polyklonaalista Pax8 hiiren vasta-aineen (Biopat, Milano, Italia) tai ihmisen STK17B vasta-ainetta (RD System, Minneapolis, MN), vastaavasti. βactin tasot käytettiin latauskontrollina jälkeen immunoblottauksella spesifistä vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, CA).

tukeminen Information

Kuva S1.

alatyyppi-erityinen Manhattan juoni esityksiä eroja Alleelifrekvenssien tapausten ja kontrollien välillä löytö sarjassa. Ylempi paneeli: klassinen PTC

vs.

Valvontaa; Alempi paneeli: follikulaarista variantti PTC

vs.

Valvontaa. Esiin alueita vastaavat variantit

TSHR

ja

TG

, erityisesti liittyvät kuhunkin mainituista PTC alatyyppejä, vastaavasti. Asetettua taulukossa esitetään tulokset kahden parhaan variantit erityisten alatyyppeihin sekä kirjeenvaihtaja

P

-arvot johdettu uskottavuusosamäärä, mikä osoittaa alatyyppi-spesifisyys

TSHR

ja

TG

yhdistysten.

doi: 10,1371 /journal.pone.0074765.s001

(TIF) B Kuva S2.

Ohjaamaton klusterointia varten PAX8 ja STK17B antureista meidän aiemmin julkaistu mRNA array, mukaan lukien 63 kilpirauhasen kasvaimet (Montero-Conde et ai, 2008- ref. 26). Merkittävä käänteinen korrelaatio havaitaan (r = -0,77; p = 8,65 x 10

-14). Lyhenteet: PTC = papillaarinen kilpirauhassyövän; FVPTC = follikulaarinen variantti PTC; FTC = Follikulaarinen kilpirauhassyöpä; FA = Follikulaarinen Adenoma; PDTC = Huonosti erilaistunutta kilpirauhaskarsinoomaa; ATC = Anaplastic kilpirauhassyövän; N = normaali kilpirauhanen.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0074765.s002

(TIF) B Taulukko S1.

Täydellinen SNP tutkittu löytö sarjassa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0074765.s003

(DOC) Tool Menetelmät S1.

lyhyt kuvaus, jota käytetään laitteen epistaattinen vuorovaikutusta.

doi: 10,1371 /journal.pone.0074765.s004

(DOC) B

Kiitokset

Tekijät Kiitokset Leticia de la Vega erinomaista teknistä tukea sekä Javier Maravall, Ignacio Ramos, Víctor Andía, Paloma Rodríguez-Poyo, Amparo Meoro, Luis Arribas, Pedro Iglesias, Javier Caballero, Joaquín Serrano, Antonio Pico, Francisco Pomares, Gabriel Giménez, Pedro López-Mondéjar ja Cristina Álvarez-Escolá, jotka ovat osallistuneet potilasrekrytointi ja kokoelma kliinistä tietoa. Kiitämme myös Dr Erik Heidin (Rudbeck Laboratory, Uppsala, Ruotsi) tohtori James A. Fagin (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, USA) ja Dr. Alfredo Fusco ja tohtori Maximo Santoro (Universita Federico II di Napoli, Napoli, Italia) tarjoamiseksi solujen linjat.