Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Nimotutsumabi on humanisoitu IgG1 monoklonaalinen vasta-aine on erityisesti suunnattu EGFR. Tässä tutkimuksessa pyrittiin selvittämään molekyylitason mekanismeja Nimotutsumabi sen vaikutuksia parantaa syöpäsolun radioherkkyyttä.

Keskeiset löytäminen

Keuhkosyöpä A549-soluja ja rintasyövän MCF-7-solut esikäsiteltiin tai ilman Nimotutsumabi 24 tuntia ennen säteilyä suorittamaan klonogeeniset -eloonjäämiskoe ja analysoida solun apoptoosin virtausta ctyometry. γ-H2AX pesäkkeitä havaittiin konfokaalimikroskopialla arvioida vaikutusta Nimotutsumabi on säteilyn aiheuttaman DNA: n korjaukseen. EGFR aktivointi tutkittiin ja tasoja DNA Vahinkosaneerauksen liittyviä proteiineja A549-soluja eri ajankohtana ja vaihtelevilla annoksilla altistuksen jälkeen Nimotutsumabi ja sädehoitoa tutkittiin Western blot. Esikäsittely Nimotutsumabi pienentää klonogeeniset selviytymisen jälkeen säteily, esti säteilyn aiheuttamien EGFR aktivointi ja lisäsi säteilyn aiheuttamista apoptoosia sekä A549-soluja ja MCF-7-soluissa. Pesäkkeet of γ-H2AX 24 h kuluttua säteilyä merkittävästi lisääntynyt Nimotutsumabi esikäsitelty soluissa eri annoksilla. Fosforylaatio AKT: n ja DNA-PKcs oli huomattavan estyy yhdistelmäryhmä kullakin annoksella vaiheessa sekä ajankohta.

Johtopäätökset

tulokset paljastivat, että mahdollinen mekanismi Nimotutsumabi parantaa syöpää radioherkkyyttä että Nimotutsumabi esti säteilyn aiheuttamien aktivointi DNA- PKcs kautta estää PI3K /AKT-reitin, joka lopulta vaikuttaa DNA DSB korjaus.

Citation: Qu Yy, Hu Sl, Xu Xy, Wang Rz, yu Hy, Xu Jyväsky, et ai. (2013) Nimotutsumabi Parantaa radioherkkyyttä syöpäsolujen in vitro estämällä säteilyn aiheuttamien DNA Damage Repair. PLoS ONE 8 (8): e70727. doi: 10,1371 /journal.pone.0070727

Editor: Xianglin Shi, University of Kentucky, Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 tammikuu 2013; Hyväksytty: 18 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 16 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Qu et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Sädehoito on merkittävä rooli hoidossa useita syöpiä parantavien tai lievittävä aikomus. Noin 50% potilaista, jotka kärsivät syöpiä tarvitsevat sädehoidon koko käsittelyprosessin. Kuitenkin taudin torjuntaa ja eloonjäämisaste potilaiden, jotka saavat sädehoitoa yksin tai yhdessä kemoterapian jäävät surkeasti alhainen. Perinteinen sytostaattien kanssa sädeherkistävä toiminto usein samalla lisätä normaalin kudoksen myrkyllisyys, mikä rajoittaa niiden kliinistä soveltamista yhdistettynä sädehoitoon. Äskettäin hoitojen kohdistaminen kasvutekijän reseptorin (EGFR) ovat osoittaneet erinomaisia ​​syöpää ehkäisevistä vaikutuksista lievästi haittavaikutuksia ja tehostaa merkittävästi syövän säteilyherkkyyttä prekliinisissä ja kliinisissä tutkimuksissa [1], [2]. EGFR suunnattu hoitojen yhdistetään sädehoitoon on pidetty erittäin potentiaalisia strategian joidenkin syöpien hoidossa epiteelin alkuperää.

EGFR suunnattu hoitoja ovat pääasiassa kaksi lähestymistapaa: 1) monoklonaalisia vasta-aineita (mAb), jotka kohdistuvat ekstrasellulaarinen domeeni ja reseptorin ligandia sitovan alueen, eli setuksimabi, Nimotutsumabi ja panituzumab; tai 2) pienet molekyylit, jotka estävät EGFR: n solunsisäistä tyrosiinikinaasiaktiivisuuden, kuten gefitinibi ja erlotinibi [3]. Useimmat näistä aineista on tutkittu laajasti

in vitro

ja

in vivo

niiden kapasiteetin lisäämiseksi kasvain radioherkkyyttä. Estämällä EGFR aktivaation ja sen alavirran signalointia, kuten PI3K-AKT ja RAS-MAPK polkuja, nämä anti-EGFR aineet parantavat sytotoksista vaikutusta ionisoivan säteilyn indusoimalla solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin ja solun uudiskasvun estämiseksi, etäpesäkkeiden ja kasvaimen angiogeneesissä [ ,,,0],4], [5].

Nimotutsumabi on humanisoitu IgG1 monoklonaalinen vasta-aine, joka salpaa EGF, TGF-α ja muiden ligandien sitoutumista EGFR, sekä estää reseptorin paljastaen sen dimerisaation motiivi [6]. Nimotutsumabi kiinnittyy EGFR Keskivaikeaa sitoutumisaffiniteettia (Kd: 4,5 × 10

-8 m) verrattuna setuksimabin, joka on sitoutumisaffiniteetti yli 10 kertaa suurempi [6]. Tutkimukset

in vitro

ovat osoittaneet, että Nimotutsumabi sitoo bivalenttisesti (eli molemmat vasta-aseita kaksi tavoitteita samanaikaisesti) ja EGFR on kohtalainen tai korkea tiheys, joka on stabiili tarttumismallin [7], [8]. Normaaleissa kudoksissa, joilla on alhainen EGFR tiheys, Nimotutsumabi on vähemmän affiniteetti ja sitoutuu EGFR vähemmän aviditeetillä, mikä säästää normaaleissa kudoksissa, kuten ihon ja limakalvojen, vaikea sytotoksisuus. Tämä selittää, miksi Nimotutsumabi on ominaista hoitoon liittyvää vähäistä toksisuudessa kliinisen käytön, kun näyttö samanlaisia ​​tai parempia syöpää ehkäisevistä vaikutuksista verrattuna muiden EGFR monoklonaalisia vasta-aineita. Lupaava terapeuttinen monoklonaalinen vasta-aine, Nimotutsumabi yhdistettynä säteilyn on tutkittu laajasti sen tehokkuuden syöpien epiteelin alkuperää.

Nimotutsumabi on todettu selektiivisesti parantaa antituumorivaikutukset ionisoivan säteilyn NSCLC solulinjoja, joilla on korkea EGFR ilmaisun [9]. Lisäksi in vivo hiirillä ksenografteissa transplantoitu kanssa glioomasolulinjaa osoitti, että sekä Nimotutsumabi ja setuksimabi lisäsi radioherkkyyttä siirretyn ihonalainen kasvaimissa [10]. Faasi II /III kliinisissä tutkimuksissa, Nimotutsumabi yhdistetään sädehoitoon on saavutettu erinomaisia ​​tulos hoidossa paikallisesti levinnyt pään ja kaulan alueen syövät [11], [12]. On todettu, että setuksimabi estää säteilyn aiheuttamien EGFR tumaansiirtymiseen, ja tämä prosessi liittyy tukahduttaminen DNA- PKcs toimintaa [13], [14]. Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että tyrosiinikinaasi-inhibiittorit parantavat radioherkkyyttä estämällä solun kapasiteetti säteilyn aiheuttaman DNA-vaurion korjaamiseen [15], [16]. Nämä tulokset osoittavat, että terapeuttista monoklonaalista vasta-ainetta hoito yhdistetään sädehoitoa voidaan vaikuttaa säteilyn aiheuttamien DNA-vaurioita vasteen. Kuitenkin taustalla mekanismeja, joilla Nimotutsumabi toimintojen säteilylle herkäksi edelleen epäselvää. Tässä tutkimuksessa käytetään kahta viljeltyjä syöpäsolulinjoissa, pyrittiin tutkimaan mahdollisia molekyylimekanismi Nimotutsumabi parantamisessa solujen radioherkkyyttä syöpiä.

Materiaalit ja menetelmät

Solut, soluviljelmissä, ja reagenssit

ihmisen NSCLC A549 ja rintasyövän MCF-7 (tarjoama Heilongjiang institute of cancer Research, Harbin, Kiina) ylläpidettiin RPMI 1640 (GIBCO), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS ) (NQBB, Australia) kostutetussa ilmakehässä 5% CO2, 37 ° C: ssa. Nimotutsumabi tarjosi Biotech Pharmaceutical Co. Ltd (Peking, Kiina).

klonogeeninen -eloonjäämiskoe

Eksponentiaalisesti kasvavat solut 25 cm

2 pulloissa trypsinoitiin, korjattu, ja laskettiin. Ne tehtiin laimennussarja asianmukaista tiheydet, ja maljattiin kolmena kappaleena tiettyihin numeroihin (eri solujen määrä annoksen suuruuden säteilytetty. Esimerkiksi 200 solua pulloa kohti 2Gy, 500 soluja 4Gy, 1000 soluja 6Gy, 4000 soluja 8Gy, 10000 solujen 10Gy ja 100 solujen valvontaa.) 25 cm

2 pulloissa, jotka sisälsivät 5 ml kasvatusliuosta ilman tai läsnä 700 nM Nimotutsumabi. Kaksikymmentäneljä tuntia inkubaation jälkeen solut altistettiin 2, 4, 6, 8 ja 10 Gy 4MV X-ray syntyy runsaasti energiaa lineaarikiihdyttimellä (Elekta synergiaa, Tukholma, Ruotsi) annoksena nopeudella 3 Gy min

-1. Sitten solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja viljeltiin huumeiden väliaineessa 10-14päivä muodostaa pesäkkeitä. Tämän jälkeen pesäkkeet kiinnitettiin methanol:acetic hapon (10:01, v /v), ja värjättiin sitten kristallivioletilla. Pesäkkeet, jotka sisältävät ≥50 solut laskettiin. Elossa jae laskettiin: (keskiarvo pesäkkeiden määrä) /(lukumäärä ympätty solujen × maljaustehokkuus). Pinnoitus tehokkuus määriteltiin: (keskiarvo pesäkkeiden lukumäärä) /(lukumäärä ympättiin solujen valvontaa, jotka eivät ole altistuneet säteilylle tai ilman Nimotutsumabi). Tiedot sovitettiin osaksi klassinen yhden osuma monen tavoite malli: SF = 1- (1-e

-D /D0)

N kiinnittää annokseen selviytymisen käyrä, josta parametrit (D0, dq, N ja SF2), joka edustaa luontainen solu radioherkkyyttä olivat peräisin. Herkkyys lisälaite suhde (SER) laskettiin: (D

0 Säteilyn käsiteltyjen solujen /D

0 Nimotutsumabi yhdistettynä säteilyllä käsitellyt solut).

Solun apoptoosin analyysi

Solut, jotka käsitelty tai ilman 700 nM Nimotutsumabi 24 tuntia altistettiin eri annoksille säteilyn (0, 2, tai 8 Gy), ja kerättiin 48 tuntia sen jälkeen, kun säteily solujen apoptoosin analyysillä. Noin 1 x 10

6 solua kussakin ryhmässä värjättiin anneksiini V-FITC ja propidiumjodidilla (PI) apoptoosin analyysin mukaan valmistajan ohjeiden (Beyotime, Kiina). Solut analysoitiin sitten fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS, Calibur, BD, USA).

γ-H2AX pesäkkeitä havaitseminen konfokaalimikroskopialla

soluja kasvatettiin peitinlaseilla kuuden kuopan levyillä oli käsitelty tai ilman 700 nM Nimotutsumabi 24 tuntia. Sen jälkeen solut säteilyteho vaihtelevilla annoksilla (1, 2, 4 tai 8 Gy), jota seurasi inkubointi 24 tunnin ajan. Sen jälkeen solut kiinnitettiin jääkylmällä 70% etanolissa 30 minuutin ajan, pestiin 3 kertaa PBS: llä ja blokattiin 3% BSA: ta ja 0,1% Triton-X100 PBS: ssä 30 minuutin ajan. Poistamisen jälkeen estopuskurilla, soluja inkuboitiin 2-4 ug /ml γ-H2AX vasta-ainetta, joka oli konjugoitu FITC: tä (Millipore, Billerica, MA) estopuskurissa 2 tuntia pimeässä. Liiallista vasta-aineet huuhtoutuvat PBS. Lopuksi, 24 h jäljellä γ-H2AX tutkittiin konfokaalimikroskopialla (Zeiss, LSM700, Saksa). Datapisteen ainakin 300 tumat arvioitiin.

Detection EGFR fosforylaatiota ja DNA-vaurioiden korjaamiseen liittyviä proteiineja Western-blot

A549-soluja ja MCF-7-soluja käsiteltiin tai ilman 700 nM Nimotutsumabi 24 tuntia ja ne säteilytetään 4 Gy X-ray havaita EGFR fosforylaatiota. Käsitellyt solut kerättiin 2 h kuluttua säteilyä. A549-soluja käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla kerättiin 0,5, 1, 2, tai 6 tuntia sen jälkeen säteily dynaamisen analyysin DNA-vaurion korjaamiseen liittyviä proteiineja. Samat määrät A549-soluja, joilla on sama hoito-ohjelman säteilytettiin eri annosta (0, 1, 2, 4, 6Gy), inkuboitiin 2 tuntia, sitten kerättiin. Sen jälkeen solupelletit käsiteltiin lyysipuskurilla (Beyotime, Kiina), 1 mM PMSF (Beyotime, Kiina) ja 1 proteaasiestäjäseostabletit tabletti (Roche sovellettu science, Mannheim, Saksa) per 10 ml liuosta lisättiin, ja koko proteiinit eristettiin . Yhtä suuret määrät proteiineja (30 ug) erotettiin 8% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin PVDF-kalvoille. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa TBS-T20 1 h huoneen lämpötilassa ja sen jälkeen inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa. Kun oli pesty kolme kertaa TBST-liuoksella, membraaneja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (Zhongshan, Kiina) 1 h. Blotit kehitettiin kemiluminesenssidetektiolla sarja HRP (BI, Isreal) ja visualisoitiin kemiluminesenssin kuvantamisjärjestelmä (FLuorchemFC2, Alpha Innotech, US).

ensisijainen vasta-aineet laimennettiin seuraavat: anti-EGFR ja anti -pEGFR (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-DNA-PK (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-pDNA-PK (Abcam, Cambridge, UK), 1:500; anti-Ku70 (Epitomic, Burlingame, Kalifornia), 1:4000; anti-ATM (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-Patm (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-AKT (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-Pakt (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-γ-H2AX (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; ja anti-β-aktiini (Zhongshan, Peking, Kiina), 1:2000.

Tilastollinen

Data analysoitiin käyttäen parillista t-testiä ja kuvattu keskiarvona ± SD. Ero pidettiin merkittävinä, jos P 0,05.

Tulokset

Nimotutsumabi hoito tehostetun cellular radioherkkyyttä että klonogeeniset -eloonjäämiskoe

tutkia Nimotutsumabi tehosti syövänvastainen vaikutus ionisoivan säteily, olemme suorittaneet klonogeenisten -eloonjäämiskoe A549 ja MCF-7-soluissa (kuvio 1; radiobiological parametrit on esitetty yhteenvetona taulukossa 1). Emme löytäneet että maljaustehokkuus sekä A549 ja MCF-7-solut olivat merkittävästi vähentynyt esikäsittelyn jälkeen Nimotutsumabi (P: 0,256, ja 0,063 vastaavasti esitetty kuvio 1 B). Annos-eloonjäämiskäyrät osoitti, että esikäsittely Nimotutsumabi tukahdutti klonogeenisten eloonjäämistä sekä A549-solujen ja MCF-7 jälkeen vaihtelevia annoksia säteilyä (kuvio 1A). Annos lisälaite suhde oli 1,36 ja 1,47, vastaavasti, jotka ehdottivat, että Nimotutsumabi oli tehokkaampi sädeherkistävä MCF-7-solut kuin A549-solut in vitro.

(A) A549-soluja ja MCF-7-soluja esi-inkuboitiin ja ilman 700 nM Nimotutsumabi 24 tuntia, ja sitten säteilytetään ionisoivan säteilyn annoksia välillä 2 ja 10 Gy. After10-14 päivää, pesäkkeet värjättiin ja laskettiin. Elossa fraktiot laskettu pesäkkeiden lukumäärästä ja pinnoitus tehokkuutta. Tietoja on esitetty keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Käyrät sovitettiin SF = 1- (1-e

-D /D0)

N. (B) Plating tehokkuus A549-soluja ja MCF-7-soluissa. Plating hyötysuhde = (keskimääräinen lukumäärä pesäkkeiden) /(lukumäärä ympättiin soluja, jotka oli esikäsitelty tai ilman Nimotutsumabi). Ei ollut tilastollista merkitykset välillä Nimotutsumabi esikäsitelty A549 /MCF-7-solut ja ohjaus, jossa P: 0,256, ja 0,063, tässä järjestyksessä.

Nimotutsumabi estyy EGFR aktivoinnin jälkeen säteily

Todistaakseen kapasiteettia Nimotutsumabi estämisessä EGFR aktivointi, fosforylaatio EGFR at Tyr1173 havainnoitiin western-blot (kuvio 2). Koska se osoitti, säteilyä 4Gy aiheuttama aktivoitu fosforylaatiota EGFR sekä A549- ja MCF-7-soluissa. Kun esikäsittely Nimotutsumabi tasot fosforyloitua EGFR merkittävästi vähentynyt, kun säteilyä.

A549-soluja ja MCF-7-solut esikäsiteltiin kanssa tai ilman Nimotutsumabi 24 tuntia ennen säteilyä 4 Gy. Solut kerättiin ja lysoitiin 2 tuntia sen jälkeen, kun säteily. Lysaatit tehtiin elektroforeesi ja inkuboitiin vasta-aineita EGFR, pEGFR ja β-aktiini. Pylväs kaavioissa ovat määrällisesti bändejä perustuvan densitometrisen analyysiin. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD suhteellinen tiheys suhteen kontrolliin. * Tarkoittaa merkitsevää eroa (P 0,05).

Nimotutsumabi lisääntynyt solujen indusoiman apoptoosin säteilyn

Cell apoptoosin hinnat rutiininomaisesti analysoitiin arvioimiseksi syöpää ehkäisevistä vaikutuksista säteilyn. Tässä tutkimuksessa, apoptoosin hinnat A549 ja MCF-7, käsiteltiin Nimotutsumabi olivat korkeammat kuin kontrollisolujen saatuaan eri säteilyannosten (kuva 3). Tuloksena osoittivat, että Nimotutsumabi lisääntynyt sytotoksista vaikutusta ionisoivan säteilyn indusoimalla solujen apoptoosia.

Soluja esikäsiteltiin ja ilman 700 nM Nimotutsumabi 24 tuntia, ja sitten säteilytettiin 0, 2 tai 8 Gy. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia säteilytyksen jälkeen, solut kerättiin ja solujen apoptoosia tutkittiin virtaussytometrialla. Yksi edustaja kolmen erillisen kokeen kahden soluissa esitetään (A, C). Vertailuja apoptoosin määrien A549-solut ja MCF-7 välillä niomtuzumab esikäsitelty ja kontrolliryhmissä on esitetty (B, D). Kukin pylväs keskiarvoa ± SD apoptoosin korko. * Tarkoittaa merkitsevää eroa (P 0,05).

esikäsittely Nimotutsumabi kasvoi γ-H2AX muodostuminen vastauksena säteilyn

Kun määritellään γ-H2AX muodostuminen on keskeinen indikaattori säteilyn indusoimaan DNA kaksinkertainen katkeamisen (DSB: t). Vaikutusten arvioimiseksi yhdistetyn hoidon Nimotutsumabi ja säteily DNA: n korjaukseen, me määrällisesti jäljellä γ-H2AX pesäkkeitä 24 tunnin kuluttua säteilyn vaihtelevalla annoksia konfokaalimikroskopiaa. Havaitsimme, että esikäsittely Nimotutsumabi yksinään ei lisännyt γ-H2AX sukupolven sekä A549 ja MCF-7-soluissa verrattuna ohjaus, kun taas sädehoitoa eri annoksilla sekä solulinjoja esikäsiteltiin Nimotutsumabi enemmän jäljellä γ-H2AX muodostumista 24 tunnin kuluttua kuin solujen säteilyn yksin (kuvio 4).

A549 ja MCF-7-solut esikäsiteltiin kanssa tai ilman 700 nM Nimotutsumabi 24 tuntia, ja sitten tehtiin säteilytetään 1, 2, 4 ja 8 Gy. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun säteily solut kiinnitettiin ja inkuboitiin γ-H2AX-vasta-aine konjugoituna FITC: n kanssa. Kukin pylväs keskiarvoa ± SD jäljellä γ-H2AX pesäkkeitä solua kohti. Datapisteen ainakin 300 tumat arvioitiin. * Tarkoittaa merkitsevää eroa (P 0,05). Alla olevat kuvat ovat edustavia ytimet γ-H2AX pesäkkeitä alle immunofluoresenssimikroskopian avulla, käsiteltiin 1Gy tai 1Gy yhdistettynä Nimotutsumabi.

esikäsittely Nimotutsumabi säännellään DNA vahinkosaneerauksessa vastauksena säteilylle A549-soluja

Säteily aiheuttaman DNA-vaurion korjaus on ominaista ilmaus useiden DNA-vahinkosaneeraus liittyviä proteiineja. Siksi tutkittiin joitakin liittyvän proteiinin ilmaisuja ja niiden aktivoidut muodot yhdistetyllä hoidon Nimotutsumabi ja säteilyllä A549-solut.

Ensinnäkin, vertasimme kineettinen muutos näiden DNA-vaurioiden korjaamiseen liittyviä proteiineja Nimotutsumabi käsitelty ja ei- käsitellyissä soluissa sen jälkeen, kun altistus säteilylle (katso kuvio 5). Tässä kokeessa, γ-H2AX molemmissa soluryhmissä osoitti suuntaus ajasta riippuvaa kasvua. Vuonna Nimotutsumabi esikäsitelty ryhmä, tasot γ-H2AX olivat merkittävästi korkeammat kuin kontrolliryhmän 1 h, 2 h ja 6 h (kuvio 5B). DNA-PKcs, Ku70, ATM ja AKT jälkeen säteily ei muuttanut kunakin ajankohtana sekä ohjaus ja Nimotutsumabi esikäsitelty ryhmiä. Kuitenkin fosforyloidun muodon DNA-PKcs on Thr2609 ja fosforyloidun muodon AKT on Thr308, jotka ovat aktivoituja muotoja kahden proteiinin aiheuttama säteily, ekspressoitiin alemmilla tasoilla Nimotutsumabi esikäsitelty ryhmä kuin ohjaus eri ajankohtina . Valitettavasti molemmat tasot Phospho-DNA- PKcs ja Phospho-AKT puuttui normaali yhä useammin vastaten ajan (kuvio 5C, D). Fosforyloitu muoto ATM Ser1981 osoittivat vähän muutosta molemmissa ryhmässä sekä eri ajankohtina (kuvio 5E).

(A) A549-soluja oli esikäsitelty tai ilman Nimotutsumabi 24 tuntia säteilytettiin 4 Gy . Solut kerättiin ja lyysattiin osoitettuina aikoina. Lysaatit merkityillä aikoina tehtiin elektroforeesi ja inkuboitiin vasta-aineita γ-H2AX, AKT, Pakt, DNA- PKcs, pDNA PKcs, Ku70, ATM, Patm ja β-aktiini. (B-E) kvantifiointi bändejä perustuvan densitometrisen analyysiin. Tulokset ovat suhteellinen tiheys suhde säteilyttämätön valvontaa. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * Tarkoittaa merkitsevää eroa (P 0,05).

Toiseksi, tutkia lisäämällä säteilyannos laukaisi enemmän DNA: n ekspression aiheutuvia vahinkoja proteiineja, ja jos Nimotutsumabi voi estää aktivaatiota DNA-PKcs ja AKT, me säteilyteho Nimotutsumabi esikäsitelty A549-soluja ja kontrollisoluja kanssa vaihtelevissa annoksissa. γ-H2AX osoitti annoksesta riippuvaista lisääntymistä sekä ohjaus- ja Nimotutsumabi esikäsitelty ryhmä, ja Nimotutsumabi esikäsittely johti merkittävään kasvuun γ-H2AX (kuvio 6B). Tasot DNA-PKcs, Ku70, ATM, Patm ja AKT ei muuttunut, vaikka voimakkaan säteilyannos ja esikäsittely Nimotutsumabi (kuvio 6A, E). pDNA PKcs ja Pakt olivat ilmeisesti pienempi Nimotutsumabi esikäsitelty ryhmässä kuin kontrolliryhmässä, mutta eivät osoittaneet mitään merkittävää vaihtelua kullakin annoksella kummassakaan ryhmässä (kuvio 6C, D).

(A) A549-soluja esikäsitelty tai ilman Nimotutsumabi oli säteilytetään osoitetulla annoksilla. Kaksi tuntia sen jälkeen, kun säteily solut kerättiin ja lyysattiin. Lysaatit tehtiin elektroforeesi ja inkuboitiin vasta-aineiden kanssa on kuvattu kuviossa 5. (B-E) kvantifiointi bändejä perustuvan densitometrisen analyysiin. Kukin pylväs edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * Tarkoittaa merkitsevää eroa (P 0,05).

Keskustelu

Vaikka monoterapiana anti-EGFR-mAb: t osoittaa rajoitettu kliinisissä kokeissa, niiden yhdistelmänä sädehoidon ja /tai kemoterapian on saatu lupaavia tuloksia hoidettaessa kehittynyt okasolusyöpä pään ja kaulan, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [17] – [22]. Onnistuminen monimuotoiset hoito on huomattavasti johtuvan herkistävää vaikutusta anti-EGFR-mAb: t säteilylle ja /tai sytotoksisten aineiden. Nimotutsumabi, humanisoitu anti-EGFR-mAb: t, on osoittanut ainutlaatuista kapasiteettia tuottaa sädeherkistävä vaikutukset aiheuttaen samalla lievä toksisuutta normaaleissa kudoksissa kliinisissä kokeissa [8], [12]. Vaikka syöpää ehkäisevistä vaikutuksista Nimotutsumabi on vahvistettu in vitro ja in vivo [23], mahdollinen molekyylimekanismeihin Nimotutsumabi jotta radiosensitize syöpäsolut vielä tutkittava.

Tässä tutkimuksessa olemme vahvistaneet, että radioherkkyyttä syöpäsolun linjat voitaisiin tehostaa esikäsittelemällä Nimotutsumabi. Koska Nimotutsumabi yksinään ei vaikuttanut pesäkkeiden muodostumista, se ollut herkistävää mutta ei lisäaineena rooli yhdistettynä säteily. Koska tavoite Nimotutsumabi, aktivointi EGFR aiheuttama säteily oli ilmeisesti inhiboi kuin odotettiin. Lisäksi olemme osoittaneet, että Nimotutsumabi lisääntynyt säteilyn indusoiman apoptoosin kahden solulinjoissa. Crombet-Ramos

et al

[23] kertoi, että A431-solut inkuboitu imotuzumab 48 tuntia eivät osoittaneet selviä apoptoottisia merkkejä ja totesi, että edustaja on toiminut pääasiassa sytostaatit sijasta sytotoksinen. Tutkimuksessamme olemme kuitenkin havainneet, että Nimotutsumabi lisäsi apoptoosia määrä sekä A549-solujen ja MCF-7-soluissa olennaisesti, mikä ehdotti, että Nimotutsumabi terapeuttisena aineena voi indusoida apoptoosia ainakin in vitro. Säteilyä yhdistetään Nimotutsumabi johti synergistinen vaikutus solujen apoptoosiin on suurempi kuin summa indusoiman apoptoosin Nimotutsumabi ja säteilyn yksin (eli 1 + 1 2 vaikutus), se on osoituksena, että Nimotutsumabi on kyky sädeherkistävä nämä syöpäsolut . Lisäksi Tutkimuksessamme vaikka Nimotutsumabi lisäsi apoptoosin syöpäsoluissa, se ei heikennä pesäkkeiden muodostumista. Me arveltu, että klonogeenisten solujen syöpiä olivat kestäviä ja vaikea vaikuttaa Nimotutsumabi, ja se oli lisääntyvät solut, jotka indusoitiin apoptoosiin, jonka Nimotutsumabi.

perusteella edellä esitetyt tulokset, me sitten keskityttiin potentiaali molekyylimekanismeja Nimotutsumabi n sädeherkistävä vaikutuksia. On hyvin tunnettua, että syöpä radioherkkyyttä määräytyy pääasiassa kapasiteetti syöpäsolujen tehokkaasti korjata säteilyn aiheuttamien DNA vahingot. Siksi me arveltu, että Nimotutsumabi voisi radiosensitize syöpäsolujen vaikuttamalla DSB korjaus mekanismi. γ-H2AX muodostuminen on herkkä markkeri DSB vaurioita ja rutiininomaisesti käytetään arvioimaan solujen radioherkkyyttä. Enemmän γ-H2AX pesäkkeitä tarkoittaa lisää DSB jätetään korjaamatta. Määrällisiä havaitseminen γ-H2AX immunofluoresenssilla ja immunoblottauksella osoitti, että enemmän DNA DSB: t jäivät korjaamatta jälkeen säteilyn Nimotutsumabi esikäsitelty soluissa, mikä lopulta johti solujen apoptoosin, ja osoitti lineaarinen korrelaatio säteilyannoksia tai post-säteilyn ajan.

Seuraavaksi tutkimme miten Nimotutsumabi esti säteilyn aiheuttamien DSB korjaus. DNA-PKcs on kriittinen proteiini osallistuu ei-homologisen end-liittymällä korjaus DNA DSB: itä. Aktivoituminen DNA-PKcs suoraan moduloi korjaus säteilyn aiheuttama DSB. Esillä olevassa tutkimuksessa, ilmentymisen taso DNA-PKcs jälkeen säteily ei muuttanut onko esikäsitelty Nimotutsumabi vai ei. Mutta fosforyloitua muotoa DNA-PKcs on Thr2609, joka liittyy DSB: n korjautumisessa ja solujen radioherkkyyttä, voimakkaasti kohonnut jälkeen säteily, joka osoittaa radioresistent ominaisuus A549-solut ja merkittävästi vähentynyt Nimotutsumabi esikäsittelyn ryhmä. Lisäksi tutkimme yksi säätelyalayksiköt DNA-PK: kompleksin Ku70. Kuitenkin, Ku70 ei muuttanut kummassakaan ryhmässä. Yhdessä tuloksemme osoittivat, että Nimotutsumabi esti toiminta DNA-PKcs DSB korjaus tukahduttamalla sen aktivoitumisen.

Toulany

et al

[24] ilmoitetaan, että EGFR-PI3K-AKT koulutusjakso on säätelyyn osallistuvan DNA-PKcs. He ehdottivat, että joko EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittorin tai AKT-estäjällä kumottu säteilyn aiheuttamien DNA-PKcs fosforylaation Thr2609 K-RAS mutatoituja kasvainsoluja. Koska Nimotutsumabi estää EGFR alavirran signalointia, on mahdollista, että Nimotutsumabi moduloi fosforylaation DNA-PKcs kautta tukahduttaa aktivointi AKT. Olemme havainneet, että fosforyloitua muotoa AKT on Thr308, joka on aktivoitu muoto liittyy solujen eloonjäämistä, erittäin lisääntynyt säteilyteho A549-soluja, mutta samanlaisia ​​fosfo-DNA-PKcs (Thr2609), oli täysin inhiboi esikäsittelyn jälkeen Nimotutsumabi. Niinpä pääteltiin, että Nimotutsumabi välittämien sen vaikutukset DNA korjaukseen polkuja kautta tukahduttaminen PI3K-AKT-reitin. Takaisin apoptoosin analyysi vahvisti, että inhibitio AKT aktivaation Nimotutsumabi on sukua edistämiseen solun apoptoosin. Mahdollinen mekanismi on kautta estämällä aktivaation DNA- PKcs, korjaamiseen säteilyn aiheuttamien DNA DSB: iden estyi, joka lopulta indusoi apoptoosia.

ATM, tärkeä proteiini osallistuu säteilyn aiheuttamien DNA-vaurion korjaamiseen, oli tutkitaan sen selvittämiseksi, sen ilmentymistä tai aktiivisuutta voidaan vaikuttaa esikäsittelemällä Nimotutsumabi. ATM ja sen aktivoitu muoto, fosforyloidun muodon ATM Ser1981, eivät muuttuneet, onko esikäsitelty Nimotutsumabi vai ei. Sekä DNA-PKcs ja ATM fosfory- γ-H2AX jälkeen ionisoivan säteilyn [24], [25]. Tutkimuksessamme koska aktivointi DNA-PKcs säteilytyksen jälkeen estyi Nimotutsumabi kautta estämällä PI3K-AKT reitti, fosforylaatiota H2AX voi johtua toiminnasta ATM.

Yhteenvetona osoitti, että EGFR mAb Nimotutsumabi herkistää säteilylle syöpäsolujen jotka lisäävät apoptoosin ja korjaamatta DSB. Taustalla olevan mekanismin tämän sädeherkistävä vaikutus liittyy inhibitio DNA-PK mukana DNA: n DSB: itä korjauksen kautta tukkeutumisen PI3K-AKT kautta. Koska Nimotutsumabi on hyväksytty EGFR mAb terapeuttiseen käyttöön syövän hoidossa, tutkimalla tarkka syövän vastaisen mekanismit Nimotutsumabi auttaa lisäämään tehoa tämän aineen kliinisessä käytännössä.