Krooninen sairaus

tiivistelmä

Oli tutkimuksia vaikutusten tutkiminen laajakaistan infrapunasäteilyn (IR) päälle syöpäsolun, vaikka vaikutteita keski infrapuna säteily (MIR) ovat vielä tuntemattomia. Tässä tutkimuksessa, joka on MIR emitteri emissioaallonpituusarvoja bändi 3-5-pm kehitettiin säteilyttää A549 keuhkoadenokarsinooma soluja. Todettiin, että MIR altistuminen esti solujen lisääntymistä ja indusoi morfologiset muutokset muuttamalla solun jakautuminen solun tukirangan komponentteja. Käyttämällä kvantitatiivinen PCR, huomasimme, että MIR edisti ekspressiotasot ATM (ataksia telangiectasia mutatoitunut), ATR (ataksia-telangiektasiassa ja Rad3 liittyviä ja Rad3 liittyvä), TP53 (tuumoriproteiinia p53), p21 (CDKN1A, sykliiniriippuvainen kinaasi estäjä 1A) ja GADD45 (kasvun pysähtymisen ja DNA-vaurion indusoituva), mutta laski ekspressiotasot sykliini B koodaavan geenien, CCNB1 ja CCNB2 sekä CDK1 (sykliiniriippuvainen kinaasi 1). Vähentäminen proteiinin ekspressiotasot CDC25C, sykliini B1 ja fosforylaatiota CDK1 at Thr-161 kokonaan ehdottaa G

2 /M pidätys tapahtui A549-soluissa MIR. DNA korjaus pesäkkeitä muodostumista DNA double-säikeen katkoksia (DSB) markkeri γ-H2AX ja anturi 53BP1 aiheutettiin MIR hoitoa, se merkitsee MIR indusoi G

2 /M solukierron pysähtymisen johtui DSB. Tutkimus havainnollistaa mahdollinen rooli käyttöä MIR keuhkosyövän hoidossa käynnistämällä DSB ja estää solusyklin etenemisen.

Citation: Chang HY, Shih MH, Huang HC, Tsai SR, Juan HF, Lee SC ( 2013) Middle Infrapunasäteilyä indusoi G

2 /M solukierron pysähtymisen A549 Keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 8 (1): e54117. doi: 10,1371 /journal.pone.0054117

Editor: Jasti Rao, University of Illinois College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 syyskuu 2012; Hyväksytty: 06 joulukuu 2012; Julkaistu: 15 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Chang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Science neuvosto, Taiwan (NSC 100-2120-M-002-014, NSC 99-2621-B-002-005-MY3, NSC 99-2621-B-010-001-MY3) ja National Taiwan University Huippuluokan Steering Research Project (10R70602C3 ja 101R4000). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kasvain on tärkein kuolinsyy maailmassa, ja keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuolemaan [1]. Koska Tupakointi vähenee, esiintyvyys keuhkosyövän on heikentynyt monissa maissa vastaavasti [2]. Paitsi tupakointi, muut tekijät, kuten asbesti, radon tai raskasmetalleja vastuita myös edistää keuhkosyövän [3]. Tilastot dataa 2008 International Agency for Research Cancer (IARC) riskinarviointi osoittaa, että keuhkosyöpään kuolee noin 1,4 miljoonaa ihmistä vuodessa maailmanlaajuisesti [4]. Koska suuri esiintyminen ja kuolleisuutta keuhkosyöpään, siihen liittyvä hoito etenee näiden ongelmien ratkaisemiseksi.

sähkömagneettinen säteily Auringon säteily voidaan jakaa useisiin alueisiin, kuten γ-ray, röntgen-, ultravioletti- (UV), näkyvä valo, infrapuna (IR) säteily, mikroaaltouuni ja radioaaltojen. Niistä auringon säteilyn, IR valon aallonpituuksia vaihtelevat +0,76-1000 um voidaan jakaa kolmeen alueeseen, lähi-infrapuna (NIR, 0,76-1,5 um), keski-infrapuna (MIR, 1,5-5,6 um) ja pitkälle infrapuna ( FIR, 5,6-1000 um). Hakemukset IR on luotu laajasti päivittäisessä käyttötarkoituksia ja kliinisiin tarkoituksiin, mukaan lukien ihon mikroverenkiertoa, haavan paranemista, kaasu-anturi, ja kauko lämpötilan mittaus [5].

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että NIR laukaisi taaksepäin mitokondriaalisen signalointi vastaus tuloksena ROS välitteisen matriksimetalloproteinaasi-1 (MMP-1) tuotanto kautta mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasien (MAPK) reitti [6]. Se osoitti myös, että NIR suojattu ihmisen ihon fibroblasti UV-induced sytotoksisuuden indusoimalla Hsp27 joka estää apoptosome kokoonpano, ensimmäinen tapahtuma apoptoosin [7], [8].

In vivo

tutkimukset osoittivat, että NIR lisääntynyt angiogeenisen indusoija endoteelikasvutekijä ja vähensi angiogeeninen inhibiittori trombospondiini-2, aloitetaan ihon angiogeneesiä ihmisen ihossa [9]. Lisäksi altistuminen FIR edistetään angiogeneesiä ihmisen mikroverisuonten endoteelisolujen yhdessä aktivoitumisen p38 ja ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasisignaloinnin [10], tehostettu verenkierto ihossa [11], [12] ja aiheutti tulehdusta aktiivisuutta verisuonten endoteelin [13]. Se on myös todettu, että FIR inhiboi solujen proliferaatiota tehostamalla ilmentymisen syklisen AMP-riippuvaisen transkription tekijä (ATF) 3 syöpäsoluja, joiden pohjapinta ekspressiotason lämpöshokkiproteiini (HSP) 70A oli alhainen [14], [15].

vaikutukset MIR syöpäsoluihin kuitenkin edelleen tuntematon. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia vaikutukset MIR Aallonpituuskaistojen on 3-5 um järjestelmät on erittäin proliferoituneita syöpäsoluja. Tätä varten olemme kehittäneet MIR emitterin ja rajoittanut MIR aallonpituus 3 5 pm. Koska molekyyli C-H, N-H ja O-H sidoksia voidaan virittää tuottaa venyttämällä tärinän 3-5 um infrapuna-, on odotettavissa, että tärkeät biokemiallinen reaktio tulee vaikuttamaan säteilytys infrapuna kanssa aallonpituuden tällä alueella [16]. Olemme paljasti, että MIR vähensi solujen elinkelpoisuuden, aiheutti merkittäviä muutoksia solun tukirangan järjestely, ja indusoi G

2 /M solusyklin pysähtymiseen, jotka saattavat olla peräisin induktio kaksinkertaisen-säikeiden tauot (DSB) DNA pitkin ATM /ATR-p53 -p21 akseli.

tulokset

aallonpituudella MIR rajoitti 3-5 um ja lämpötila Culture Medium oli johdonmukainen 37 ° C: ssa

laajakaistaisen mustan lähde oli valmistettu tarjoamaan laajakaista MIR ja asettaa metalli kammiossa välttää häiriön ympäristön (kuvio 1). Kun yhä lämmityksen lämpötilan, päästöjen voima piisubstraatin nostettiin vastaavasti. Säteilytehon asetettiin 3 mW /cm

2 säätämällä lämmityksen lämpötilan ja mittauspisteen suuruuden mukaan THORLAB PM100D tehomittarilla. Lämmön poistamiseksi vaikutukset MIR, asetamme kierrättää jäähdytin koneen 28 ° C jäähtyä ilmaa kammiossa, kun sellaiset MIR lähde siten, että lämpötila pysyi kasvatusliuosta 37 ° C: ssa. Järjestely laite on esitetty kuviossa 1B.

(A) sivukuva laajakaistainen mustan lähde. (B) Kaavakuva osoittaa asennusohjelma MIR säteilytys kokeilu. Solut maljattiin 12-kuoppalevyille ja viljeltiin inkubaattorissa 100% kosteudessa, 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

solulisäkasvumäärityk- A549 Cells pysyi ennallaan MIR Suojaamaton Medium

erottaa, onko vaikutuksia MIR tapahtui suoraan viljeltyjä soluja tai epäsuorasti muuttamalla solun väliaineen viljelyväliaine altistettiin MIR 48 tuntia ennen sen lisäämistä soluviljelmään. Sen jälkeen kun A549-soluja (2 x 10

4 solua per kuoppa) ympättiin 12-kuoppalevylle, me substituoitu kasvualustaan ​​MIR-altistuvat tai valottamattomat väliaineessa vielä 48 tuntia, ja sitten määritettiin solujen elinkelpoisuus MTT: llä. Havaitsimme, että solujen lisääntymistä A549-solujen ei muuttunut merkittävästi alle MIR-alttiina keskipitkän verrattuna valottamattomat keskipitkän (kuva S1). Sieltä, käytimme 48 tunnin aikana altistumisen soluja kaikissa kokeissa, ellei toisin mainita.

MIR esti solun lisääntymis- ja Altered morfologia A549 Cells

vaikutuksen tutkimiseksi MIR syöpäsolujen, keuhkon adenokarsinoomasolua A549 käytettiin arvioimaan sytotoksisuuden MIR ja normaali keuhkojen fibroblasteista MRC-5 testattiin vertailun. -Soluja (2 x 10

4) maljattiin 12-kuoppaisille viljelylevyille yön yli ennen MIR altistumista. Solun elinkelpoisuus määritettiin MTT: llä ja trypaanisininen perustuu solulaskennan jälkeen MIR altistuksen. Tulokset osoittivat, että leviämisen A549 merkittävästi tukahdutti MIR altistus 48 tunnin ajan (kuvio 2A), kun taas kasvu ja morfologia MRC-5-solut eivät vaikuta MIR käsittely (kuvio S2A, S2B). Mielenkiintoista, me paljasti morfologiset muutokset A549 päälle MIR altistumista. Havaitsimme, että MIR-alttiina A549-solut olivat pyöristetty muoto, suurennettuna kooltaan, ja muodostivat säteittäinen esiliina alle faasikontrasti- mikroskooppinen tutkimus (kuvio 2B). Tulokset osoittavat, että MIR voisi säädellä solun tukirangan dynamiikkaa, joka määrittää solun morfologia.

(A) Solujen määrä mitattiin 0, 24 ja 48 tunnin kuluttua MIR altistuksen käyttämällä trypaanisini ja hemosytometrillä. Keskimääräinen solujen lukumäärät ohjaus (valottamattomat) ja MIR altistumisen hoitoja ilmaistiin keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. **

P

0,01. (B) Cell kuvat havainnoitiin faasikontrastimikroskopiaan 48 tunnin kuluttua MIR altistumista. Nuolet osoittavat säteittäinen esiliinat on laajentunut soluja. Scale palkki edustaa 50 um.

MIR Altistuminen Aktivoidut uudelleenjärjestelystä aktiinifilamentin, vinkuliini ja Microtubule

tukirangan tärkeä rooli säätelyssä solussa kunnossa [17], [18] ja sekä aktiinifilamenttien ja mikrotubulusten tiedetään vaikuttavan muodostumista ja jakelu solujen paikallisessa tarttumisessa [17], joka määrittää solun morfologia ja liikkuvuus. Erottaa vaikutukset MIR solun tukirangan, suoritimme immunofluoresenssivärjäyksen tutkia, kaksi tärkeää komponentteja tukirankansa aktiinifilamenttien ja mikrotubulusten sekä polttovälin adheesiomolekyyli vinkuliini mukana tässä elimellisen muutoksen. Tulokset osoittivat, että MIR indusoi merkittävän vähenemisen F-aktiini, joka sisältää stressiä kuituja määritettynä värjäämällä rodamiini-leimatun phalloidin (kuvio 3). Lisäksi aktiinisäikeiden näytteillä tiheä meshwork polarisoitumattoman järjestelyn ja vinkuliini laskettiin yhteen solun ympärille kehän MIR-altistetuissa soluissa (kuvio 3), mikä tarkoittaa, että MIR voivat estää migraatiota säätelemällä uudelleenjärjestely aktiinisäikeiden ja jakelu vinkuliini [ ,,,0],19]. Toisaalta, mikrotubulusten jaettiin on perinuclear sytoplasman alueilla jälkeen MIR hoidon (kuvio 4). Tämä erityinen jakelu epäsäännöllinen mikrotubulusten fragmenttien ehdottaa, että MIR voisi aiheuttaa G

2 /M solukierron pysähtymisen kuten aiemmin osoittanut [20], [21].

Solut ympättiin lasipeitinlevyille 12-kuoppalevyillä , altistuvat MIR 48 tuntia, vahvistettu värjäystä ja visualisoitu fluoresenssimikroskopiaan. Aktiinisäikeiden jotka on merkitty rodamiinileimattu phalloidin (punainen), vinkuliinin leimattiin hiiren anti-vinkuliinin-vasta-aine ja vastaava FITC- konjugoidulla sekundaarisella anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (vihreä), ja tumat värjättiin DAPI (sininen). Scale palkki edustaa 10 um. Nuolet osoittavat aseman vinkuliinin.

Solut ympättiin lasipeitinlevyille 12-kuoppalevyillä, altistetaan MIR 48 tuntia, kiinteä värjäystä ja visualisoitiin fluoresenssimikroskopialla. Mikrotubulusten leimattiin α-tubuliinin-vasta-aine ja vastaava FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (vihreä), ja tumat leimattiin DAPI (sininen). Scale palkki edustaa 10 um.

MIR Altistuminen säädelty mRNA Expression taso G

2 /M geenien A549 Cells

Koska jakautuminen solun tukirangan merkitse mahdollinen rooli MIR säätelyyn solusyklin etenemistä, on tärkeää tutkia geenien mukana G

2-M siirtyminen oli edelleen valittu vahvistettava. G

2 /M solusyklin Checkpoint vastaa DNA-vaurioita ja siihen aktivointi ataksia-telangiektasiassa mutatoitunut (ATM) ja ataksia-telangiektasia ja Rad3 liittyvien (ATR) proteiinit [22]. Sekä ATM ja ATR aktivoida p53 fosforylaatio Ser15 vastauksena DNA-vaurioita, mikä lisää transkription kasvun pysähtymisen ja DNA-vaurioita indusoituva geeni (GADD45) ja p21, joita tarvitaan estämään ilmentymistä keskeisiä säätelijöitä G

2 /M siirtymä, sykliiniriippuvainen kinaasi 1 (CDK1) ja sykliini B [23], [24], [25], [26]. Ilmaisu liittyvien geenien indusoiva G

2 /M pidätys korotettiin MIR-käsiteltyjen A549-solut, kuten ATM, ATR, p53, GADD45A, GADD45B, ja p21 (kuvio 5A). Sitä vastoin mRNA-ekspressiotasot CDK1, CCNB1 ja CCNB2 laskivat jälkeen MIR altistuksen (kuvio 5A). Tulokset osoittavat, että MIR altistuminen aktivoi ilmauksia ATM, ATR, p53 ja p21-geenien vastauksena DNA vaurioita ja säätelee geenien valvoa G

2 /M solusyklin etenemisen.

Soluja altistettiin rahalaitoskorkoja 48 tuntia, ja kerättiin RNA ja proteiini uuttamalla. (A) Geenien ilmentyminen liittyvien geenien säätelyyn G

2 /M siirtymä (x-akseli). Y-akseli osoittaa suhteellisen transkriptin määrät lasketaan käyttäen ΔΔCt menetelmää GAPDH ohjearvon monistettu geeni jokaisesta näytteestä. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. (

n

= 3). *

P

0,05, **

P

0,001. (B) Proteiinin ekspressiotasoja tutkittiin Western blot aktiini kuin sisäisen valvonnan. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa. (C) virtaussytometrinen analyysi DNA-pitoisuus. Solut altistettiin MIR 48 tuntia. Solut kuudesta itsenäisestä kokeesta kerättiin analysointia solusyklin jakeluun. (D) solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa saatiin multicycle analyysi.

MIR Altistuminen poistettiin ilmentäminen Cdc25C ja sykliini B1, ja vähensi fosforylaatio CDK1

solun syklin etenemistä G

2 M vaihetta säätelee aktivoituminen CDK1, jonka toiminta on riippuvainen koordinointi sykliini B [27], [28]. Aktivointi CDK1 /sykliini B-ylläpidetään fosforylaation Thr161 ja defosforylointia Thr14 ja Tyr15 on CDK1 [27], [28]. Defosforyloimalla Thr14 ja Tyr15 jäämiä CDK1 katalysoivat fosfataasi Cdc25C. Se mielletään nopeutta rajoittava vaihe G

2 tuloa mitoosiin [27], [29]. Kun otetaan huomioon rooli CDK1 /sykliini B monimutkainen ja Cdc25C säätelyssä G

2 M faasimuutos, me arvioi MIR altistuminen muuttunut proteiinin ilmentymistä CDK1, sykliini B1, ja Cdc25C sekä fosforylaatiota CDK1. Tulokset osoittivat, että fosforylaatiota CDK1 proteiinia Thr161 ja tasot sykliini B1 ja Cdc25C olivat kaikki vähentää käsitellyissä soluissa MIR (kuvio 5B). Se osoittaa, että MIR altistus indusoi tyypillisen G

2 /M solukierron pysähtymisen A549-soluissa säätelemällä sykliini B1 ja Cdc25C ilmaisun, ja CDK1 fosforylaatio.

MIR Altistuminen Johti solusyklin pysähtymiseen G

2 /M-vaiheen

vieressä tutki solusyklin jakautumista A549 vaikutti MIR säteilytys. Saamiseksi DNA-sisältöä suoritimme virtaussytometria analysoida PI-leimattuja soluja. Tulokset osoittivat, että solut G

2 /M väestön korotettiin vuoden MIR altistumista. Coordinately, G

2 /M sääntelyviranomaisten molemmat aktivoituvat niiden transkription, translaation ja translaation jälkeiset tasot, jotka johtavat kertyminen solujen G

2 /M vaiheessa.

MIR Exposure Käynnistetty rinnakkaispaikantumisen of 53BP1 ja γ-H2AX Nuclear Foci vastauksena reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) välittämä DNA Damage

Koska MIR aktivoida ATM /ATR-p53-p21 akseli, joka on DNA-vaurioita tarkistuspisteen koulutusjakso, se on kriittinen tutkia, onko MIR aiheuttanut DNA-vaurioita A549-soluja. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että tuumorisuppressoriproteiinia p53 sitoutuva proteiini (53BP1) ja γ-H2AX osallistuvat ATM-riippuvaisen DNA-vaurioita-signalointireittiä ja muodostavat ydin- pesäkkeitä vastauksena ionisoivan säteilyn aiheuttamia DNA-vaurioita [30], [31]. Tämän tutkimiseksi A549 solut kiinnitettiin asetonilla ja värjättiin 53BP1 ja γ-H2AX jälkeen MIR altistuksen. Me näytteillä että 53BP1 (kuvio S3A) ja γ-H2AX (kuvio S3B) on hajautetusti lokalisoitu ytimet valottamattomat soluja, mutta muodostunut lukuisia erottaa subnuclear pesäkkeitä vastauksena MIR. Olemme myös osoittaneet, että 53BP1 ja γ-H2AX pesäkkeet colocalized vuonna nucei MIR alttiina solujen. Muodostuminen ja rinnakkaispaikantumisen on 53BP1 /γ-H2AX pesäkkeet vähentynyt kun esikäsittely tai yhteiskäsittely 10 mM ROS raadonsyöjä NAC (kuva 6). Voimme olettaa, että MIR indusoi G

2 /M solusyklin pysähtymiseen saattaa johtua ROS välittämän DNA-vaurioita, joista vahinko markkereita 53BP1 ja γ-H2AX pesäkkeitä havaittiin tässä tutkimuksessa.

Solut ympättiin lasi peitelevy 12-kuoppalevylle, valotuksen MIR 48 tunnin ajan, kun läsnä ollessa tai ilman 10 mM N-asetyyli-kysteiini (NAC). Soluja käsiteltiin NAC 1 h ennen MIR altistusta (NAC 1 h) tai cotreated koko valotus 48 tuntia (NAC). Solut kiinnitettiin värjäystä ja visualisoitu fluoresenssimikroskopiaan. 53BP1 on leimattu kanin anti-53BP1-vasta-aineen ja vastasi FITC-konjugoitua anti-kani-lgG-vasta-ainetta (vihreä), γ-H2AX leimattiin hiiren anti-γ-H2AX-vasta-ainetta vastasi PE-konjugoidulla anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (punainen), ja tumat leimattiin DAPI (sininen). Scale palkki edustaa 10 um.

Keskustelu

Koska molekyylitason muutokset liittyvät säätelyyn solusyklin etenemisen mukana seuraa pidättämättä jättäminen lisääntymistä syöpäsoluja, soluproliferaation inhibointi häiritsemällä kanssa solusyklin on lupaava lähestymistapa syövän hoitoon. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että MIR altistuminen voi estää leviämisen A549-solut (kuvio 2A), ja johtaa myös suurennettu, säteittäinen esiliina ja pyöristetty muoto solujen morfologia (kuvio 2B) vaikuttamalla järjestely ja jakelu aktiinisäikeiden (kuva 3), fokaalisen adheesion (kuvio 3), ja mikrotubulusten (kuvio 4). Perinuclear hajanainen jakauma mikrotubulusten on sopusoinnussa solumorfologia havaittu G

2 /M solusyklin pysähtymiseen, jota vielä validoitu analysoimalla solusyklin jakautumisen geenien ilmentymisen ja proteiinin säätely sääntelyviranomaisten G

2 /M check Point (kuva 5). Kehittyneissä olemme myös osoittaneet, että MIR voivat aiheuttaa muodostumista ja rinnakkaispaikantumisen 53BP1 ja γ-H2AX ydinaseiden pesäkkeitä (kuvio 6) vastauksena DNA-vaurioita, jotka tyypillisesti aktivoi ATM /ATR-p53-p21-reitin johtaa G

2 /M solu sykli pidätys.

MIR on osa valosta auringon säteilyä, joka voi aiheuttaa DNA-vaurioita suoralla heräte DNA: n tai epäsuoralla mekanismilla, johon heräte muista solun chromophores [32]. Suora viritys prosessi aiheuttaa lyhyen aallonpituuden säteilyn, kuten UVB (280-315 nm) ja UVC (100-280 nm), ja useimmiten johtaa tuottaa syklobutaani tymiinidimeeri ja valolle, jotka on valmistettu säteilyn absorptiolla DNA [32 ]. Toisaalta, epäsuora mekanismi on myötävaikuttanut reaktiivisen hapen (ROS), joka on tuotettu endogeeninen valoherkistimien. Välilliset DNA vahinko johtuu aallonpituus säteilyllä edellä 320 nm, kuten UVA (315-400 nm) ja lähes näkyvän valon, jossa DNA absorboi vain heikosti [33], [34]. Säteily pidemmillä aallonpituus siten imeytyy valoherkisteiden tuottaa ROS. Sen jälkeen UVA valon imeytymistä, endogeeninen photosensitizer ylittää yli tripletin tilaan ja siirtää energiaa tuottaa singlettihappea [35]. Nämä UVA säteilytetty photosensitizers kuuluvat flaviinit [36], NADH /NADPH [37], urokaanihappo [38] ja jotkut sterolit [39]. Koska lyhyt puoliajalla vuonna soluissa singlettihappea on läsnä vain, kun säteily [40]. Kuitenkin ROS voidaan esittää pitkään sen jälkeen, kun säteilyaltistusta koska ylimääräinen ROS voidaan tuottaa alkuperäisen lajin [41]. Superoksidianionin radikaali (

• O

2

-), vetyperoksidia (H

2O

2), ja hydroksyyli radikaali (

• OH) on kuulunut ROS ryhmään, jotka kaikki voidaan tuottaa endogeeninen mekanismi sivutuotteina normaalin mitokondrioiden toiminnan tai eksogeeninen stressi [42].

kun eksogeeninen rasitukset ROS tasolla ovat huomattavasti korkeammat kuin solu voi poistaa, oksidatiivisen stressin tapahtuu ja tulokset oksidatiivisen DNA-vaurioita DNA proteiini ristisidosyhdisteiden, pohja ja sokeri muuttaminen, depurinaatio tai deprimidination [43], [44], [45], [46], [47]. Oksidatiivisen DNA aiheuttaman vaurion ROS voi laukaista solusyklin Checkpoint vasteita mukaan lukien rekrytointi 53BP1 ja γ-H2AX seuraa hajoaminen CDC25C G

2 /M pidätys havaitsimme, mikä antaa lisäaikaa DNA korjaukseen [48], [49]. Lisäksi NIR on todettu tuottaa ROS peräisin mitokondrioita, ja sytokromi

c

oksidaasi on ehdotettu mahdolliseksi fotoreseptorilla [6], [50]. Todisteita viittaavat siihen, että IR voi kiihdyttää oksidatiivista Fosforylointireaktio mitokondrioita säteilyttämällä photoreceptors kuten sytokromi c oxidatse ja NADH. Parannettu korko oksidatiivisen fosforylaation synnyttää paljon ROS lisää siten välillisiä vahinkoja DNA.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että MIR altistuminen tukahdutti proteiinien tasoa CDC25C ja sykliini B1, ja esti fosforylaatiota CDK1. Downregulation CDC25C estäisi aktivoitumisen CDK1, jolloin dissosiaatio sykliini B1 ja ehkäisy solusyklin etenemisen G

2 M vaiheeseen. Lisäksi esittelimme että 53BP1 andγ-H2AX muodostavat lukuisia subnuclear pesäkkeitä vastauksena MIR hoitoon. 53BP1 osallistuu ATM-riippuvaisen DNA-vaurioita-signalointireittiä ja muodostaa ydinaseiden pesäkkeitä vastauksena ionisoivan säteilyn aiheuttamia DNA-vaurioita [30], [31], kun taas γ-H2AX helpottaa rekrytointia useita vahinkoa vasteen proteiineja, kuten BRCA1, MDC1 ja RAD51 DNA korjaukseen [51], [52]. On mahdollista, että MIR altistus indusoi G

2 /M pidättäminen on aiheuttanut DNA-vaurioita, vaikka aallonpituus MIR on lähellä NIR joka on vaikea aiheuttaa suoranaista vahinkoa DNA. Täällä olettaa, että MIR altistuminen saattaa imeytyä endogeeniset photosensitizer nostaen ROS ja aiheuttaa oksidatiivisen DNA-vaurioita.

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että vetyperoksidi indusoi G

2 /M solusyklin pysähtymiseen ja vaikutti järjestämisestä mikrotubuleiksi ja aktiinisäikeiden rele kapasiteetin vähentämiseksi hapettuneen tukirangan proteiineja tai tasapainon tiolin häiriöitä [51], [52], [53]. Vetyperoksidia lisääntynyt monomeerinen tubuliinin, mutta laski polymeroidun tubuliinin viittaa vetyperoksidia aiheutti depolymerisaatiossa mikrotubulusten. Tässä tutkimuksessa MIR altistuminen aiheutti perinuclear jakelun ja tiheästi yhdistäminen mikrotubulusten mikä vähentää mikroputkiverkostoa. Tämä havainto on samanlainen mikrotubulusten kohdistaminen lääkkeitä, kuten vinka-alkaloidit [54]. Perinuclear jakauma mikrotubulusten merkitsee, että MIR altistuminen saattaa aiheuttaa oksidatiivista stressiä näin rikkoa mikrotubulusten verkoissa.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että MIR altistus indusoi DNA-vaurioita vastaus. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että γ-H2AX ydin- pesäkkeitä havaittiin colocalized korjaus- proteiineja, jotka liittyvät homologia rekombinaation ja nonhomologousend-liittymällä (NHEJ) [55]. Muut korjaus proteiineja, mukaan lukien MCD1 /NFBD1 ja 53BP1, myös dokumentoitu vuorovaikutuksessa γ-H2AX muodostaa ydin- pesäkkeitä [56]. Aiemmat raportit osoittavat, että konformaatiomuutoksia 53BP1 johtuu fosforylaatio 53BP1 ATM mikä altistaa kromatiinin sitova domeeni, joka osallistuu suoraan korjaus DNA DSB: t aktivoimalla DNA-ligaasi-IV /XRCC4 kompleksin NHEJ koulutusjakson [57]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että MIR altistus muodostuu ydin- pesäkkeitä 53BP1 ja γ-H2AX (kuvio 6) merkitsee sitä, että MIR altistuminen aiheuttaa DNA: n korjautumista vastauksena DAN vaurioita.

Yhteenvetona, tämä tutkimus osoittaa MIR on aallonpituus 3-5 pm voi muuttaa järjestämiseen aktiinifilamentin, mikrotubulusten ja vinkuliinin, ja aiheuttaa estoa solusyklin etenemisen kautta aktivoimalla ATM /ATR-p53-p21 akseli vastauksena DNA-vaurioita, myös Cdc25C säätelevä polun rinnakkain mikä johtaa in downregulation defosforylaatioentsyymien vuonna CDK1 ja sykliini B. erityisesti Tutkimuksemme osoittaa ensimmäistä näyttöä estävä vaikutus MIR keuhkojen syöpäsoluja ja antaa hyödyllistä tietoa syövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Middle Infrapuna säteily (MIR) lähetin

aallonpituus MIR syntyvät laajakaistaista mustan lähde rajoittui alueella välillä 3-5 um käyttämällä 3-5 mm kaistan syöttö safiiri kiekkojen (SingHuang Technology Co., Ltd., Taipei, Taiwan) (kuvio 1A). Leveä kaistanpäästösuodatin on suunniteltu eristämään 3-5 um ilmakehän ikkunat, joiden halkaisija on 25,4 mm ± 0,1%. 50% leikkaus /katkaista siirtoasemiin asetettiin 3,0 mikrometriä ± 4% ja 5,0 mikrometriä ± 4%: lla. Suodatin näytteillä keskimääräisen lähetyksen päästökaistalla yli 60% ja alle 0,1% lähetys tasoilla päästökaistan ulkopuolella. 300 nm paksuus molybdeeni kalvo kerrostetaan plasmasaostuksen takapuolelle n-tyypin piisubstraatin kuin lämmönlähteen (kuvio 1A). Säteilytehon mitattiin THORLAB PM100D tehomittarilla olevan 3 mW /cm

2. Ylläpitää soluviljelyn lämpötila, kierrättää jäähdytin laite oli asetettu säilyttämään lämpötilan elatusaineeseen 37 ° C: ssa, kuten kuviossa 1B on esitetty. Solut ympättiin 12-kuoppaisille kudosviljelylevyille (Corning Costar, Corning, NY, USA) ennen 24 h IR altistumisen asetettiin suodattimen kuten kuviossa 1B.

Cell Culture

Human keuhkojen epiteelisoluissa A549 (ATCC, CCL-185) ja ihmisen sikiön keuhkojen fibroblastisoluja MRC5 (ATCC, CCL-171) saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). A549-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (Biological Industries, Beit Haemek, Israel). MRC5-soluja viljeltiin Minimal Essential Medium (Gibco), johon oli lisätty 1 mM natriumpyruvaattia (Gibco), 0,1 mM ei-välttämättömiä aminohappoja (Gibco), ja 10% naudan sikiön seerumia (Gibco). Molemmat solulinjat olivat vapaita mykoplasmasta, kuten havaitaan PCR-tekniikkaan perustuva menetelmä ja viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

Immunofluoresenssivärjäys

A549-solut ympättiin lasi peitelasi 12-kuoppaisella kulttuuri levy, viljeltiin 1 päivän ajan, ja paljastanut MIR viljellyt pimeässä edelleen 48 tuntia. Solut kiinnitettiin ja permeabilisoitiin esijäähdytetään asetonissa 5 min -20 ° C: ssa ja sitten inkuboitiin 1% BSA: ta (BioShop, Burlington, ON, Kanada) PBS: ssä, kuten estopuskurissa 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen solut leimattiin hiiren monoklonaalisella anti-tubuliini-vasta-ainetta (Millipore, Billerica, MA, USA; 1:1000), hiiren monoklonaalinen anti-vinkuliinin-vasta-aine (Millipore, 1:200), kanin polyklonaalinen anti-53BP1-vasta-aine (GeneTex, San Antonio, TX, USA; 1:500), tai hiiren anti-γ-H2AX vasta-aineella (Abcam, Cambridge, MA, USA, 1:500) 4

oC yössä. Sen jälkeen pestiin PBST: llä (PBS, joka sisältää 0,05% Tween-20, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) kolme kertaa, solut leimattiin johdetun anti-hiiri-IgG-Alexa 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA; 1:1000 ), anti-hiiri-IgG-PE (Abcam, 1:1000), tai sekundaarinen anti-kani FITC-IgG: tä (Millipore, 1:200) 1 tunnin ajan pimeässä huoneen lämpötilassa. Solut leimattiin anti-vinkuliini oli counter värjättiin TRITC konjugoidulla falloidiinia (Millipore, 1:1000) 15 minuutin ajan pimeässä huoneenlämmössä. Solut pestiin sitten PBST: llä kolme kertaa, ja asennettu ProLong® Gold reagenssin DAPI (Invitrogen). Kuvat otettiin mukaan fluoresenssimikroskooppiin Leica HCX FL PLAN 100 x /1,25 öljy tavoite käyttäen SPOT kameralla (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, USA) ja SPOT Advanced ohjelmisto (Diagnostic Instruments).

solunelinkykyisyysmääritys

2 x 10

4-solut ympättiin 12-kuoppalevyille kohti ja annettiin kiinnittyä yön yli ennen MIR altistusta. MTT: n jauhetta (3 [4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi, Sigma-Aldrich) valmistettiin varastossa PBS pitoisuudella 5 mg /ml ja suodatettiin. Sen jälkeen, kun alttiina MIR 48 h, 150 ui MTT-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 3 tuntia, kunnes rikkovat kide muodostuu. Formatsaanikiteet liuotettiin 500 ui dimetyylisulfoksidiin (DMSO, Scharlau Chemie, Barcelona, ​​Espanja) ja levoton välttää valolta 15 minuuttia täysin liuottamiseksi kiteitä. Absorbanssi mitattiin 570 nm: ssä ELISA-lukijalla (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa.

RNA uuttaminen ja Käänteinen transkriptio

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invotrogen) sen jälkeen, kun 48-tunnin altistuksen. Lyhyesti, 400 ui TRIzol-reagenssia (Invitrogen), lisättiin kuhunkin kuoppaan 12-kuoppaisen TC levy sen jälkeen, kun väliaine poistettiin. Näytteitä kerättiin kolmen erillisen kokeen ja varastoidaan -80

oC. RNA uutettiin ohjekirjan mukaisesti, ja RNA-pitoisuus ja laatu määritettiin NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Montchanin, DE, USA). mRNA reverstranscripted by RevertAid ™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA). 1 ug kokonais-RNA oli sekoitettu oligo (dT)

18-aluketta ja denaturoidaan. Tämän jälkeen RNA-näytettä sekoitettiin 5X reaktiopuskuria, dNTP, RiboLock ™ RNaasi Inhibitor, ja RevertAid ™ H Minus käänteistranskriptaasia. Käänteiskopiointireaktio tehtiin 42

oC 60 min ja päättyy 70

oC 5 min. Käänteiskopiointireaktio Tuote käytettiin suoraan PCR-monistuksen tai varastoida -20

oC.

Real Time PCR

Geeni alukkeita reaaliaikaiseen PCR suunnitellut Beacon Designer 7 ohjelman (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA) ja sekvenssit on lueteltu taulukossa 1. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green Supermix (BIO-RAD, Hercules, CA) ja 40 monistussykliä käytettäessä iCycler iQ5 ™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories). Suhteellinen transkripti määrät laskettiin käyttäen ΔΔCt (kynnys sykli) menetelmää GAPDH ohjearvon geeni monistetaan näytteitä. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisina.

Protein Extraction ja Western-blottaus

Kun MIR altistus 48 tuntia, yhteensä proteiini uutettiin käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen) seuraten valmistajan ohjeita. Proteiini liuotettiin lyysipuskurissa (7 M urea (Boehringer, Mannheim, Saksa), 2 M tioureaa, 4% CHAPS (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA) ja 0,002% bromifenolisinistä (Amersco, Solon, OH, USA)) ja proteiinipitoisuus määritettiin BCA-menetelmällä (Pierce Biotech Inc., Rockford, IL, USA).