Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Exosomal MikroRNA (miRNA) on houkutella tärkeiksi mahdollisina diagnostinen biomarkkereita syövän. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia luonnehtia miRNA profiilit seerumin eksosomeiksi ja tunnistaa ne, jotka ovat muuttuneet kolorektaalisyövässä (CRC). Arvioida niiden käyttöä diagnostisina biomarkkereita, suhde tiettyyn exosomal miRNA tasoja ja patologisia muutoksia potilaiden, mukaan lukien sairauden vaihe ja kasvaimen resektion, tutkittiin.

Kokeellinen malli

Microarray analyysit miRNA vuonna eksosomi fraktiolla seeruminäytteiden 88 ensisijaista CRC potilaiden ja 11 terveen kontrollin tehtiin. Ilmentymistasojen miRNA viljelyalustaan ​​viiden koolonsyöpäsolulinjoissa verrattiin myös näiden viljelyalustassa normaalin paksusuolen-solulinjaa. Ilmaisu profiilit miRNA jotka ilmentyvät eri välillä CRC ja ohjaus näytejoukoilla varmennettiin käyttäen 29 pariksi näytteitä tuumorin resektio potilaille. Herkkyyden valittu miRNA biomarkkereina CRC arvioitiin ja verrattiin tunnettujen kasvainmerkkiaineet (CA19-9 ja CEA) käyttäen toimivan vastaanottimen ominaisuuden analyysin. Ilmaisu tasot valittujen miRNA myös vahvistanut kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR-analyysit riippumaton sarja 13 CRC potilaista.

Tulokset

seerumissa exosomal tasot seitsemän miRNA (kirjaimien 7a, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223, ja miR-23a) olivat merkitsevästi korkeammat ensisijainen CRC potilailla, myös niitä, joilla varhaisessa vaiheessa tauti, kuin terveillä verrokeilla, ja olivat merkittävästi alassäädetty kirurgisen resektion jälkeen kasvaimia. Nämä miRNA myös erittää huomattavasti korkeampi by koolonsyöpäsolulinjoissa kuin normaali paksusuoli-solulinjaa. Korkea herkkyydet seitsemän valitun exosomal miRNA varmistettiin toimivan vastaanottimen ominaisuus analyysi.

Johtopäätös

Exosomal miRNA allekirjoitukset näyttävät peilata patologisia muutoksia CRC potilaiden ja useat miRNA ovat lupaavia biomarkkereita non -invasive taudinmääritys.

Citation: Ogata-Kawata H, Izumiya M, Kurioka D, Honma Y, Yamada Y, Furuta K, et ai. (2014) Circulating Exosomal MikroRNA biomarkkereina paksusuolen syöpä. PLoS ONE 9 (4): e92921. doi: 10,1371 /journal.pone.0092921

Editor: Tadayuki Akagi, Kanazawa University, Japani

vastaanotettu 13 marraskuuta 2013 Hyväksytty: 26 helmikuu 2014; Julkaistu: 04 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Ogata-Kawata et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoitus The Advanced Research for Medical Products Mining ohjelmaansa National Institute of Biomedical Innovation (NIBIO) (08-02), https://www.nibio.go.jp; Grant-in-aidsin alkaen terveysministeriön, Labour and Welfare (13802015), https://www.mhlw.go.jp/; Grant-in-aidsin alkaen opetus-, kulttuuri-, Sports Technology of Japan (13314780), https://www.jsps.go.jp/; National Cancer Center tutkimus- ja kehitysrahasto (23-B-08), https://www.ncc.go.jp. National Cancer Center Biopankkiverkosto tukevat National Cancer Centerin tutkimus- ja kehitysrahasto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Hideki Ohta, Hiroyuki Okamoto ja Hikaru Sonoda, ovat työntekijät Shionogi Co., Ltd. Shionogi Co., Ltd on yksinomainen lisenssi useita miRNA esitellään tässä työssä. Shionogi Co., Ltd on hakenut patenttia (WO2011 /040525) kehittämiseksi näiden miRNA diagnostisina markkereita. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi tärkeimmistä syistä syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti [1]. Systemaattisia menetelmiä diagnosoimiseksi patologisia tiloja voisi myötävaikuttaa korkeaan paljastumisaste potilaiden varhaisvaiheessa CRC, mikä alentaa kuolleisuutta. Täytäntöönpano ulosteen piilevän veren testi ja sigmoidoskopiaa kuten seulontamenetelmiä on vähentänyt CRC kuolleisuutta [2], [3]. Nämä tekniikat on luontaisia ​​rajoituksia; herkkyyttä havaita ulosteen piilevän veren testi on melko alhainen ja sigmoidoskopiaa on invasiivinen ja epämiellyttävä potilaille. Hiilihydraattiantigeeniä 19-9 (CA19-9) ja karsinoembryonaalisen antigeenin (CEA) on laajalti käytetty kasvainmerkkiaineet havaitsemiseksi monien syöpien, mukaan lukien paksusuoli-, maksa-, haima-, ja vatsaan. Kuitenkin herkkyys näiden markkereiden havaitsemiseksi CRC on alhainen, erityisesti alkuvaiheessa taudin [4]. Näin ollen on olemassa tarve kehittää CRC-erityisiä diagnostisia markkereita nopean, ei-invasiivisia, ja erittäin herkkä seulonnan potilaille.

MikroRNA (miRNA) ovat endogeenisiä, pieni, ei-koodaavat RNA: t ja niiden kudosspesifisen ilmentymisen edistää tarkan ohjauksen eri biologisten prosessien [5], [6]. Toimintahäiriö miRNA löytyy erilaisia ​​syöpiä ja endogeenisen ilmentymisen profiilit miRNA voidaan luokitella syöpätyyppejä [7], [8]. Useat miRNA osoittavat korkeita ilmentymisen syövän kudoksissa on raportoitu sopivia diagnostisia tai ennustetekijöitä markkereita [9]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että miRNA erittyvät eri solut, mukaan lukien syöpäsolut, elimistön nesteistä, kuten verestä, virtsasta, rintamaito, ja sylki,

kautta

eksosomeiksi [10] – [12]. Eksosomeiksi ovat pieniä membraanivesikkeleitä on noin 100 nm, joka upottaa proteiinia, lipidejä, mRNA: ita, ja miRNA, riippuen alkuperästä erittävien solujen [13], [14]. Näin ollen, exosomal miRNA kehon nesteissä voi olla käyttökelpoinen diagnostinen biomarkkereita havaitsemiseksi syövän [10], [15]. Kuitenkin tällä hetkellä riittävästi tietoa suhteesta exosomal miRNA profiilien veressä ja patologinen tila syöpäpotilaita.

Täällä suoritimme microarray-pohjainen profilointi exosomal miRNA seerumista terveiden verrokkien (HC ) ja ensisijainen CRC potilaita. Mirna profiilit eksosomeiksi alkaen koolonsyöpäsolulinjaa tutkittiin sen tunnistaa ehdokas biomarkkerit erittävät koolonkarsinoomasoluissa. Exosomal miRNA allekirjoitukset vaihteli CRC potilaiden ja verrokkien. Vertaamalla miRNA profiilit kliinisten näytteiden ja solulinjojen kahdeksan miRNA (let-7a, miR-1224-5p, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223, ja miR-23a) , joita on huomattavasti kohonnut seerumin eksosomeiksi primaarisista CRC potilaista ja oli alassäädetty leikkauksen jälkeen tunnistettiin. CRC-liittyvä korkeus seitsemän näistä exosomal miRNA validoitiin riippumattomalla näytejoukolla käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR (qRT-PCR). Yhdessä tässä esitetyt tulokset osoittavat, että exosomal miRNA allekirjoitukset heijastaa patologisia muutoksia CRC potilaiden ja ovat sovellettavissa kehittämiselle diagnostisten strategioiden havaitsemiseen ensisijaisen CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet

Seeruminäytteitä 88 CRC potilasta (ikä 35-65 vuotta), jossa on ensisijainen kasvain toimitti National Cancer Center Hospital Biopankkiverkosto, Japani (Tokio, Japani) vuodesta 2003 vuoteen 2004. Seeruminäytteitä kerättiin myös 29 potilaista jälkeen kirurginen resektio primaarikasvaimen vuodesta 2003 vuoteen 2004. validointi qRT-PCR, seeruminäytteet 13 eri CRC potilasta (iältään 45-70 vuotta), jossa on ensisijainen kasvain toimitti National Cancer Center Hospital Biopankkiverkosto , Japani vuonna 2009. Surgical yksilöiden ensisijainen paksusuolensyöpä ja ympäröivän ei-syöpä alueet saatiin potilailta hoidettiin Teikyo yliopistollisen sairaalan (Tokio, Japani) [16]. Seerumit 19 henkilöä (ikä 35-65 vuotta), joka koki täydellisen fyysisen näytöksen NTT Medical Center Tokio (Japani) vuonna 2011 käytettiin HC näytteitä. Seeruminäytteet varastoitiin -20 ° C: ssa käyttöön asti.

Ethics lausunto

Institutional Review Board hyväksynnät käytettäväksi näytteistä saatu NTT Medical Center, University of Tokyo, ja National Cancer Keskusta. Kirjallinen suostumus saatiin kaikki potilaat mukana tutkimuksessa.

Solulinjat

Kaikki solulinjat tässä tutkimuksessa käytetyt saatiin American Tissue Culture Collection. Ihmisen normaalista paksusuolen johdettuja FHC-soluja viljeltiin DMEM-F12, joka sisälsi 25 mM HEPES, 10 ng /ml koleratoksiinia, 5 ug /ml insuliinia, 5 ug /ml transferriiniä, 100 ng /ml hydrokortisonia, ja 10% naudan sikiön seerumia [17]. HCT116, HT-29, RKO, SW48, ja SW480 ihmisen paksusuolen syövän solulinjoja viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia [18] – [20]. Viljelyväliaine otettiin talteen sen jälkeen, kun solujen kasvu 48 tuntia.

valmistaminen eksosomi fraktiolla

eksosomi fraktiot valmistettiin vaiheittain sentrifugoimalla-ultrasentrifugoimalla menetelmällä, kuten aiemmin on kuvattu, joissa vähäisiä muutoksia [13]. Lyhyesti, elatusaine koolonsyöpäsolulinjoissa sentrifugoitiin 500 x g: ssä 5 min solujätteiden poistamiseksi, ja sitten sentrifugoitiin 16500 x g 20 min käyttäen JA-30,50 roottori (Beckmann). Kirkastettu supernatantti läpi 0,20 um: n suodattimen ja sitten ultrasentrifugoitiin 120,000 x g 70 min käyttäen TLA-110 roottorin (Beckmann). Pelletit pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja suspendoidaan sitten uudelleen 250 ul: aan PBS: ää eksosomi-fraktiolla. Seeruminäytteet (750 ui) CRC-potilaat ja HC laimennettiin kahdeksan kertaisesti PBS: llä ja eksosomi fraktiolla valmistettiin kuten edellä on kuvattu. Rikastus eksosomi merkki CD81 valmistetuissa jakeet vahvistettiin immunoblottausanalyysillä (katso Menetelmät S1 ja kuva S1).

valmistaminen yhteensä exosomal RNA

eksosomi jae valmistetaan seerumista sekoitettiin 750 ui Trizol-LS-reagenssia (Invitrogen), ja vesipitoinen faasi kerättiin lisäämällä kloroformia. Sen jälkeen kun etanolin lisääminen vesifaasiin, kokonais-RNA puhdistettiin käyttäen RNeasy Mini Spin -pylväitä (Qiagen). RNA Näyte kuivattiin käyttämällä speed-vac keskipako- keskitin (Savant), ja sitten liuotettiin 10 ul: aan nukleaasitonta vettä. Pitoisuus RNA määritettiin käyttäen NanoDrop spektrofotometrillä (Thermo Scientific) ja Quanti-iT RiboGreen RNA Assay Kit (Invitrogen). Laatu RNA analysoitiin käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer ja pieniä RNA siruja (Agilent Technologies).

miRNA mikrosiruanalyysi

Yhteensä RNA: iden eksosomi fraktioista leimattiin PCP-Cy3 käyttäen Agilent miRNA leimausreagenssista, ja sitten hybridisoidaan ihmisen miRNA oligonukleotidi mikrosiru (8 x 15 K, versio 3.0, Agilent Technologies), mukaan valmistajan ohjeiden. Hybridisaation jälkeen array pestiin Geenien ilmentyminen Wash Buffer kit (Agilent Technologies) ja skannataan käyttäen Agilent DNA-siru skanneri. Sen jälkeen numeerinen muuntaminen raakadatan käyttämällä Feature Extraction Software (versio 10.7, Agilent Technologies), transformoidut Aineisto analysoitiin GeneSpring GX -ohjelma (versio 12.5, Digital Biology). Signaali voimakkuudet läiskät microarray normalisoitiin kokonais- signaalin voimakkuuden array ja näytetään prosentteina. Mirna microarray data on talletettu NCBI Gene Expression Omnibus tietokantaan liittyminen koodi GSE40247.

qRT-PCR

Exosomal miRNA olivat käänteistranskriptio käyttäen MultiScribe käänteistranskriptaasia (Life Technologies) ja miRNA- alukkeita. MiRNA kvantifioitiin reaaliaikaisella PCR: llä käyttäen TaqMan microRNA sarjat (Life Technologies) ja 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems), mukaan vakioprotokolla [21]. Vertaileva syklin kynnys (Ct) käytettiin arvioimaan suhteellisen herkkyystason kunkin miRNA näytteessä, joka määritettiin käyttämällä 2

-ΔΔCT menetelmä [22]. In qRT-PCR kokeissa miR-451 käytettiin sisäisenä standardina, koska se oli havaittavissa kaikissa näytteissä ja sen normalisoitu intensiteetit eivät merkittävästi eroa HC ja CRC seerumin eksosomeiksi (

P

0,05).

tilastollinen

kaksipuolisen pariksi Opiskelijan

t

-testi tai Welchin

t

-testi käytettiin määrittämään tilastollisen merkityksen erojen microarray signaali intensiteettiä. Hierarkkinen klusterointi analyysi aineisto kaikkien miRNA profiilien suoritettiin käyttäen Wardin menetelmällä. Vastaanotin toimii (ROC) käyrä ja käyrän alla oleva ala analysoitiin arvioimaan mahdollisuutta käyttää valitun miRNA-suhde diagnostisena markkerina CRC. Korrelaatiokertoimet exosomal miRNA profiilien välillä solulinjojen ja tasojen CA19-9, CEA, ja exosomal miRNA potilaan seerumissa ehdokkaaksi CRC markkereita määritettiin monimuuttuja-analyysi. Nämä analyysit suoritettiin käyttäen JMP9 ohjelmistoa. Jonckheere-Terpstra testi (SPSS-ohjelmiston, versio 18) käytettiin määrittämään korrelaatio CRC kasvain /node /etäpesäke (TNM) vaiheista ja miRNA tasolla.

Tulokset

tunnistetiedot exosomal miRNA että ovat koholla CRC tekijänä mikrosiruanalyysillä

microarray-seulontaa käytettiin havaitsemaan miRNA tasolle exosomal jakeet seeruminäytteiden CRC ja HC potilaita sekä elatusaineet normaalista paksusuolen-solulinjaa ja viisi erilaista ihmisen paksusuolen syövän solulinjat. Kuvio 1 esittää yleiskuvan seulonnasta käytetty. Eksosomi rikastettu fraktiot valmistettiin käyttämällä vaiheittaista sentrifugoimalla-ultrasentrifugoimalla menetelmällä, kuten on esitetty kuviossa S1A. Rikastuminen pieniä RNA: n ja CD81 on eksosomi fraktiot varmistettiin kapillaarielektroforeesilla ja immunoblot-analyysillä, vastaavasti (kuviot S1B-D). Monimuuttuja-analyysissä ja korrelaatiopisteet microarray data osoitti toistettavasti todeta exosomal miRNA vuonna riippumattomasta kokeesta ja korrelaatioita miRNA Vertailu eri syövän solulinjoissa (kuvio S1E ja taulukko S1). Exosomal miRNA profiilit viiden koolonsyöpäsolulinjoissa ja FHC solulinja erosivat endogeeninen solu miRNA profiileja (kuvio S1F).

miRNA profiilit eksosomi jakeet seeruminäytteiden 88 ensisijainen CRC potilaiden (mukaan lukien TNM kliiniset vaiheet I, II, III a, b, ja IV) ja 11 HC määritettiin käyttäen mikrosiruja. Ominaisuudet potilaiden ja exosomal miRNA havaittiin kussakin ryhmässä on esitetty taulukossa 1. Kaikkiaan 164 miRNA havaittiin kaikissa seeruminäytteistä tutkittiin (kuvio S2A) ja 69 miRNA ilmaistiin merkitsevästi korkeammilla tasoilla CRC potilailla kuin HC (

P

0,05) (kuviot S2B ja S2C, taulukko S2). Analyysi exosomal miRNA profiilit elatusaineet viidestä eri koolonsyöpäsolulinjoissa ja normaalin paksusuolen epiteelin FHC soluja, osoitti, että 52 miRNA erittyi merkitsevästi korkeammilla tasoilla kaikkien viiden koolonsyöpäsolulinjoissa kuin päässä FHC solut (kuviot S3A ja S3B, Taulukko S3).

vertailu 69 sääteli miRNA CRC potilaista ja 52 sääteli miRNA päässä koolonsyöpäsolulinjaa paljasti, että 16 miRNA olivat läsnä molemmissa ryhmissä (kuvio 2 ): let-7a, miR-1224-5p, miR-1229, miR-1246, miR-1268, miR-1290, miR-1308 miR-150, miR-181B, miR-181d, miR-1915 asennuspalveli- 21, miR-223, miR-23a, miR-483-5p, ja miR-638. Endogeenisen ilmentymisen määriä näitä miRNA sitten mitattiin FHC ja koolonsyöpäsolulinjoissa, sekä paksusuolen syövän ja sovitettu ei-syöpäkudoksiin neljä potilasta lisää. Lukuun ottamatta miR-181d, joka oli merkittävästi säädelty sekä syövän solujen ja kudosten mikään näistä miRNA ilmennettiin syöpäsoluissa (kuvio S3C) tai syöpäsolulinjoissa (

P

0,05 ) (Kuva S3D) on huomattavasti korkeampi kuin sovitetun ei-syöpä kudoksiin tai FHC solulinjan, vastaavasti. Nämä tulokset osoittavat, että eritys miRNA ei ole riippuvainen niiden solujen ilmentymisen tasoja ja viittaavat siihen, että säädelty endogeenisen miRNA syöpäsoluissa eivät välttämättä ole substraatteja eksosomi-välitteisen eritystä. Paksusuolen syövän solut näyttävät erittämään osajoukko miRNA solunulkoisiin tiloihin kautta eksosomeiksi.

Seerumin exosomal miRNA tasoilla 11 HC (sininen) ja 88 CRC potilasta (punainen) eri TNM vaiheissa (I-IV). Signaali-intensiteetit normalisoitiin koko signaalin intensiteetti microarray. Vaakasuorat viivat osoittavat keskimääräistä normalisoitu signaalin intensiteettiä kullekin ryhmälle. Tilastollisesti merkitseviä eroja määritettiin Welchin

t

-testissä.

suhde seerumin exosomal tasot 16 miRNA ja kliinisissä vaiheissa paksusuolen syöpä

Seuraavaksi olemme analysoineet suhde 16 yleisesti ylöspäin säädelty miRNA ja kliinisen vaiheen CRC erottamalla CRC potilaiden perusteella niiden TNM vaiheessa. Kunkin miRNA, mitään merkittävää korrelaatiota (

P

0,05) välillä exosomal taso ja kliinisessä vaiheessa taudin tunnistetaan Jonckheeren-Terpstra testi (kuva S4).

Down -regulation kahdeksan miRNA poistamisen jälkeen primaaristen kasvainten

sen määrittämiseksi, onko 16 yleisesti ylöspäin säädelty miRNA peräisin syöpäsoluja, microarray analyysejä käytettiin määrittämään määriä näitä miRNA in eksosomi fraktiolla Hyväksytty seerumin kerätyt näytteet kirurgisen resektion jälkeen primaaristen kasvainten (n = 29 potilasta). Ekspressiotasot kahdeksan miRNA väheni merkitsevästi (

P

0,05) poistamisen jälkeen primäärikasvaimissa (kuvio 3 ja taulukko S4): let-7a, miR-1224-5p, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223, ja miR-23a. Nämä tulokset viittaavat siihen, että nämä kahdeksan miRNA voidaan johtaa eksosomeiksi erittävät syöpäsoluja ja että niiden pitoisuudet saattavat heijastaa paksusuolensyöpä potilaan asemaan.

(A) sirontakuvaajaan 16 yleisesti ylöspäin säädelty seerumin exosomal miRNA CRC potilailla (n = 29) ennen (Pre) ja jälkeen (Post) kirurginen poisto kasvaimet. Otosjoukko sisältyy vaihe I (n = 6), vaihe II (n = 6), vaihe III (n = 5), vaihe IIIb (n = 9), ja vaihe IV (n = 4) potilaalla. Tiedot edustavat keskiarvoa normalisoitu signaali-intensiteetit (%). Punaiset pisteet osoittavat kahdeksan miRNA jotka olivat merkitsevästi alassäädetty jälkeen kasvaimen resektion: let-7a, miR-1224-5p, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223, ja asennuspalveli- 23a. (B) Yksittäiset muutokset seerumissa eksosomi tasot kahdeksan alassäädetty miRNA CRC potilailla (n = 29) ennen (Pre) ja jälkeen (Post) kirurginen poisto kasvaimet. Tilastollisesti merkittäviä eroja keskimääräisen Pre arvot ja keskimääräinen Post arvot määritettiin pariksi Studentin

t

-testaukset.

Mahdolliset seerumin eksosomi miRNA sovellettavaksi diagnostisia biomarkkereita

Voit arvioida niiden teho mahdollisina diagnostisia markkereita, cut-off-arvot kahdeksan miRNA jotka olivat säädellään ylöspäin paksusuolensyöpä ja alassäädetty jälkeen kasvaimen resektion analysoitiin käyttäen ROC käyrä (kuva 4). Todellinen positiivinen hinnat miR-1246 ja miR-23a tunnistamiseksi 88 CRC potilaat olivat 95,5% ja 92,0%, tässä järjestyksessä; Näiden miRNA oli myös alhainen vääriä positiivisia hinnat tunnistamiseksi 11 HC (9% ja 0%, tässä järjestyksessä). Todellinen positiivinen hinnat miR-21, miR-150, let-7a, miR-223, miR-1224-5p, ja miR-1229 tunnistamiseen CRC olivat 61,4%, 55,7%, 50,0%, 46,6%, 31,8% ja 22,7%, tässä järjestyksessä; väärien positiivisten määrien näitä miRNA vaihteli 0%: sta 9% (kuvio 4). On huomattava, että yhdistetty käyttö 8 miRNA ei näytä diagnostinen teho kuin MIRS-1246 ja -23a (tietoja ei ole esitetty). Vertailun vuoksi herkkyydet CEA ja CA19-9, jotka ovat tunnettuja biomarkkerit CRC, olivat 30,7% ja 16,0%, vastaavasti. Monimuuttuja-analyysissä ei osoittanut korrelaatiota välisiä kahdeksan valitun miRNA seerumin eksosomeiksi ja seerumin CEA ja CA19-9 (taulukko S5). Siksi meidän arvioidaan uudelleen ekspressiotasoja kahdeksan miRNA seerumin eksosomeiksi by qRT-PCR analyysejä ylimääräinen näyte joukko, joka oli mukana kahdeksan HC, seitsemän vaiheen I CRC potilasta, ja kuusi vaihe II CRC potilasta (taulukko S6). Tasot seitsemän miRNA, nimittäin anna-7a, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223, ja miR-23a, olivat merkittävästi korkeammat seerumin eksosomeiksi CRC potilaista kuin tuonti HC (

P

0,05) (kuva 5). Tilastollisesti merkitsevää ekspressiotasot näistä miRNA olivat jopa havaittiin varhaisessa vaiheessa (TNM I) CRC näytteistä (kuvio S5). Nämä tulokset viittaavat siihen, että seerumin exosomal miRNA voi olla hyödyllinen varhaisessa havaitsemisessa ensisijaisen CRC.

Signaalin voimakkuudet miRNA näkyvät prosenttiosuuksia signaalin voimakkuutta. Cut-off-arvot kahdeksan miRNA jotka olivat säädellään ylöspäin paksusuolensyöpä ja alassäädetty jälkeen kasvaimen resektion analysoitiin käyttäen ROC käyrä. Mustat laatikot osoittavat potilaalla cut-off-arvo biomarkkerit tai miRNA tasoilla. Normalisoidut intensiteetit huomaamaton miRNA seerumin eksosomeiksi laskettiin 0.

Box-ja-hiuksenhienosti tontit ekspressiotasoja kahdeksan valitun miRNA riippumattomalla joukko HC (n = 8) ja CRC primaarisessa kasvain (n = 13). Tilastollisesti merkittäviä eroja HC ja CRC aineistoja määritettiin Welchin

t

-testaukset. Vertaileva syklin kynnys (Ct) menetelmää käytettiin määrittämään tasojen exosomal miRNA HC ja CRC-potilailla. Suhteellinen suhde laskettiin käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmällä. Ct-arvo miR-451 käytettiin sisäisenä standardina. Kukin tietopiste normalisoitiin edustava HC näytteestä.

Keskustelu

Äskettäin miRNA ovat herättäneet suurta kiinnostusta keinona analysoida molekyyli- reittejä osallisina syövän kehittymisessä ja etenemisessä. Sen lisäksi, että niillä on tärkeä solun toimintoja, on mahdollista, että eritetyn miRNA upotettu eksosomeiksi voivat olla diagnostisia biomarkkereita syövän havaitsemiseen. Tässä laajat analyysit exosomal miRNA profiilien tunnistettu 16 miRNA, jotka ilmentyvät merkittävästi korkeammat tasot paksusuolen syöpäsolulinjoissa ja seeruminäytteistä CRC potilailla kuin normaali paksusuolen peräisin olevia soluja ja seeruminäytteistä HC, vastaavasti. Endogeeninen ekspressiotasot useimmat näistä miRNA ei ole säädelty syöpäsolulinjoissa ja syöpäsoluissa, mikä viittaa siihen, että exosomal eritystä miRNA ei riipu solujen ekspressiotasoja. Toisaalta, miR-181, joka on yhteydessä riippuvainen syöpään liittyvän miRNA [23], [24], osoittaa ainoastaan ​​säädelty solu- ja exosomal ekspressiotasot syöpäsolulinjoissa ja kliinisistä näytteistä, mikä viittaa siihen, mielenkiintoinen hypoteesi, että funktio of exosomal miR-181 saattaa olla mukana paksusuolensyöpä kehittymistä ja etenemistä.

seerumissa exosomal tasot kahdeksan näistä 16 miRNA olivat huomattavasti alassäädetty jälkeen kirurginen resektio ensisijainen kasvaimia, mikä viittaa siihen, että nämä miRNA erittyvät kasvainsoluja. Kuitenkin, emme sulje pois mahdollisuutta, että nämä miRNA erittyvät muista soluista, mukaan lukien immuuni- ja tulehdussoluja, joita esiintyy sattumalta on ensisijainen vaurioita kudokseen. Lopuksi CRC-liittyvä kohoumat exosomal tasojen seitsemän miRNA tasojen (let-7a, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223, ja miR-23a) todensi qRT-PCR mikä osoittaa, että nämä miRNA voivat olla sopivia biomarkkerit havaita paksusuolen syöpiä. Korkea herkkyydet ja erityispiirteet näiden exosomal miRNA määrittää ROC-analyysi (kuva 4) tukee niiden käyttöä diagnostisina biomarkkereita.

exosomal tasot seitsemän valitun miRNA eivät olleet riippuvaisia ​​kliinisessä vaiheessa CRC (kuva S4 ). Todellakin, miR-23a ja miR-1246 osoitti korkea herkkyydet vaiheen I näytteitä 95% ja 90%, vastaavasti. Vertailun vuoksi herkkyyksiä CA19-9 ja CEA vaiheen I CRC ovat vain 10 ja 15%, vastaavasti. Lisäksi qRT-PCR osoitti toistettavasti todeta näiden miRNA korkeilla tasoilla riippumaton sarja seerumin eksosomeiksi portaan I CRC potilasta (kuva S5). Nämä havainnot viittaavat siihen, että nämä miRNA soveltuvat biomarkkereita havaitsemiseen varhaisessa vaiheessa CRC. Kuitenkin lisävalidointia tarvitaan tukemaan tätä ehdotusta.

Äskettäinen raportti osoitti, että let-7a ilmentyy korkeilla tasoilla eksosomeiksi erittyvät seerumista glioblastooma kasvainsolujen [15]. Lisäksi, miR-1246 on havaittavissa koko seeruminäytteistä, pikemminkin kuin eksosomi jakeet, ruokatorven syöpäpotilailla [25]. Mittasimme myös päästää 7a, miR-1224-5p, ja miR-150 tasot kasvatusalustaa haiman solulinjojen ja totesi, että tasot olivat samanlaisia ​​kuin erittää viisi koolonsyöpäsolulinjoissa (tietoja ei esitetä), mikä viittaa siihen, että nämä miRNA yleisesti erittyy eri syöpäsoluja. Useat raportit ovat ehdottaneet käyttö kiertävän miRNA kokonaan plasma tai seerumi, kuten miR-141, miR-21, miR-221, miR-29, ja miR-92a, diagnostisia biomarkkerit CRC [26] – [30]. Nämä miRNA osoitettiin näyttää herkkyyteen ja erityispiirteet verrattavissa paksusuolen syövän markkereita käytössä. Varsinkin miR-141, miR-221, ja miR-21 raportoitu olevan säädellään ylöspäin syövän kudoksissa [31] – [33]; koko miRNA asettaa kokonaan plasmasta tai seerumista voi sisältää endogeenisen solun miRNA peräisin rikki tai verenkierrossa olevia kasvainsoluja [34], [35], mikä voi selittää sen, miksi miR-141, miR-221, ja miR-21 on huomattavan korkea kokonaan seerumi tai plasma näytteitä syöpäpotilailla. Lisäksi, seerumin /plasman miRNA, jotka eivät liity rakkulat, raportoitiin osoittaa ero stabiilisuus hoitoa RNaasi A: [36], mikä viittaa siihen, että exosomal miRNA ovat edullisempia kuin biologisten näytteiden kehittämiseksi diagnostisten biomarkkereita, koska niiden vakauden seerumissa /plasma. Itse asiassa, tässä esitetyt tulokset osoittavat, että exosomal miRNA tasot heijastavat myös syöpää laakeri asema ja patologisia muutoksia potilailla. Eksosomit ovat aktiivisesti vapautuu syöpäsolujen ja niiden ainesosista riippuvat solu, josta ne ovat peräisin. Todellakin, syöpäsolut voivat käyttää vielä tuntemattoman mekanismin upottaa osajoukko miRNA osaksi eksosomeiksi.

Yhteenvetona yrityksiä on viime aikoina tehty käyttämään miRNA seerumissa tai plasmassa diagnostinen biomarkkerit erilaisten syöpien [37] ; kuitenkin, tällä hetkellä ei ole yhteistä näkemystä, joka miRNA tulisi valita markkereina. Ainutlaatuiset ominaisuudet eksosomeiksi mukaan lukien niiden kyky upottaa erityisiä miRNA, niiden vakautta liikkeessä, niiden toistettavissa havaitsemista ja, mikä tärkeintä, se seikka, että ne heijastavat ominaisuudet syöpäsolujen voi tekevät niistä käyttökelpoisia kehittämiseen erittäin herkkä diagnostisten strategioiden nopeaa ja ei-invasiivisia seurantaa patologinen tila syöpäpotilailla.

tukeminen Information

Kuva S1.

valmistus eksosomi fraktiolla seerumista tai solujen elatusaineesta. (A) yleiskatsaus eksosomi-rikastustoimenpiteen. (B) immunoblot-analyysi CD81-tasoja ihmisen seerumeissa ennen eksosomi-rikastus ja ennen (kaista 2) tai sen jälkeen overnsight säilyttää 4 ° C: ssa (kaistat 5 ja 6), -20 ° C: ssa (kaistat 7 ja 8), ja – 80 ° C: ssa (kaistat 9 ja 10). Naudan sikiön seerumia (FBS) ennen (kaista 1) ja sen jälkeen, kun on säilytetty yli yön 4 ° C: ssa (kaistat 3 ja 4) käytettiin kontrollina. Eksosomi rikastettu fraktio valmistettiin sitten 1 ml seerumia käyttäen ultrasentrifugaatiota kuvatun menetelmän osassa Materiaalit ja menetelmät (kaista 11). Viisi mikrolitraa kutakin seeruminäytettä, tai 300 ng rikastettu fraktio ladattiin 10-20% gradientin SDS-polyakryyliamidigeelillä. CD81, joka on eksosomi markkeri käyttämällä spesifistä vasta-ainetta. (C) havaitseminen pienten RNA osa solun koko RNA: iden (endogeenisten) ja exosomal RNA: t (exosomal) peräisin HCT116 soluista (30 ng kutakin). RNA: t ladattiin 5-150 nt pieniä RNA siruja (Agilent) ja kapillaarinen elektroforeesi käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer. Pieni RNA sisältävä jae miRNA oli havaittavissa noin 10-40 nt. Huippu 4 nt edustaa Kokomarkkerina. Täytetty ja avoin nuolet osoittavat 5S tRNA ja pieni rRNA, vastaavasti. FU, fluoresenssin yksiköissä. (D) Immunoblot-analyysi CD81: n ilmentymisen seerumittomassa elatusaineessa ja HCT116-soluja ennen ja jälkeen eksosomi-rikastamiseen. Määritetyn proteiinin näytteitä solupelletistä, viljelyalusta, ja eksosomi fraktiolla tehtiin immunoblot-analyysi käyttäen vasta-aineita kohdistettu CD81 tai anti-γ-tubuliinin, edustaja solunsisäistä proteiinia. Kaistat 1-4, solupelletti; kaistat 5-7, seerumittomassa elatusaineessa; kaistat 8-10, eksosomi rikastettu fraktio. (E) sirontakaavioissa normalisoidun signaalin intensiteettiä (%) of exosomal miRNA (vasen paneelit) ja endogeeninen solu miRNA (oikea paneeli) osoitettuun solulinjoissa. (F) Hierarkkinen klusterointi endogeenisten ja exosomal miRNA normaalissa FHC solulinja ja viisi ihmisen paksusuolen syövän solulinjat. Tulokset edustavat keskiarvoja normalisoidun signaalin intensiteettiä (%) n = 3 riippumattoman kokeen. Kaikkiaan 489 miRNA olivat havaittavissa kaikissa näytteissä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0092921.s001

(TIF) B Kuva S2.

Microarray-analyysi miRNA profiileista eksosomi rikastettu seeruminäytteistä CRC potilaiden ja HC. (A) Hierarkkinen ryhmittämistä exosomal miRNA näytteissä 11 HC ja 88 CRC potilaat (TNM: vaihe I, n = 20; vaihe II, n = 20; vaiheessa III, n = 20; vaihe IIIb, n = 16; vaihe IV , n = 12). Sininen ja punainen varjostus osoittaa HC ja CRC potilaista. Signaali voimakkuudet kunkin miRNA esitetään prosentteina koko signaalin voimakkuus on jono. Yhteensä 64 miRNA havaittiin kaikissa seeruminäytteistä tutkittiin. (B) Hierarkkinen ryhmittely 69 miRNA joka ilmaistiin merkitsevästi korkeammilla tasoilla CRC potilailla kuin HC (

P

0,05 Welch n

t

-testi). (C) sirontakuvaajaan normalisoidun signaalin voimakkuudet 69 exosomal miRNA jotka olivat säädellään ylöspäin CRC potilailla (y-akseli) verrattuna HC (x-akseli). Tiedot edustavat keskiarvoa normalisoitu signaalin voimakkuudet kunkin miRNA päässä CRC ja HC potilaita.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0092921.s002

(TIF) B Kuva S3.

Microarray-analyysi exosomal miRNA paksusuolen syövän solulinjat ja endogeenisen ilmentymisen tasot miRNA. (A, B) ekspressio tasot 52 miRNA jotka erittää viisi paksusuolen syövän soluja huomattavasti korkeampi kuin päässä FHC solut (

P

0,05). Tiedot edustavat keskiarvoa normalisoitu signaali-intensiteetit, n = 3 riippumatonta microarray kokeiluja.