Krooninen sairaus

tiivistelmä

NEDD4 perhe E3 ubikitiinipromoottori ligaasit sisältää yhdeksän jäsentä. Jokainen on modulaarinen proteiini, joka sisältää N-terminaalisen C2-domeenin solun localization, kahden ja neljän Keski WW verkkotunnuksia substraatin tunnustamista, ja C-terminaali, katalyyttinen hect domeeni, joka on vastuussa katalysoimaan ubiquitylation reaktion. Tämän perheen jäsenet tiedetään vaikuttavan väyliä keskeinen patogeneesiin peräsuolen syöpä, mukaan lukien WNT, TGFp, EGFR, ja p53 polkuja. Äskettäin

NEDD4

mRNA oli kuitenkin yli-ilmentynyt kolorektaalisyövässä, mutta kasvain vaiheessa ei pidetty analyysissä. Ilmentäminen muiden perheenjäsenten ei ole tutkittu kolorektaalisyövässä. Tässä me määritellään ilmaus kuviot kaikkien yhdeksän NEDD4 perheenjäseniä 256 potilasta, joilla oli sairaus vaihtelee premaligni adenooma vaiheeseen IV peräsuolen syövän.

NEDD4

mRNA lisääntyi merkittävästi kaikissa vaiheissa peräsuolen syöpä. Sen sijaan

NEDD4L

mRNA, lähinnä homologi

NEDD4

, oli pisimmälle vaimentua perheenjäsen, ja merkittävästi vaimentua kaikissa kasvain vaiheissa. Olemme myös löytäneet NEDD4L proteiini oli merkittävästi vähentynyt western blottauksella kolorektaalisyövässä näytteissä verrattuna viereiseen normaaliin limakalvolle. Lisäksi NEDD4L, mutta ei katalyyttisesti aktiivinen NEDD4L, esti kanoninen WNT signalointia tai alapuolelle β-kateniinin

in vitro

. Nämä havainnot viittaavat siihen, että NEDD4L voi olla kasvain tukahduttava rooli peräsuolen syöpä, mahdollisesti estämällä kanonisen WNT signalointi.

Citation: Tanksley JP, Chen X, Coffey RJ (2013) NEDD4L Onko vaimentua kolorektaalisyövässä ja estää Canonical WNT Signaling. PLoS ONE 8 (11): e81514. doi: 10,1371 /journal.pone.0081514

Editor: Chunming Liu, University of Kentucky, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 23 lokakuu 2013; Julkaistu: 28 marraskuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoittajat: Jarred Tanksley tukivat NCIP5095103, RO1CA46413, ja GM007347. Xi Chen tukivat RO1CA158472. Robert J. Coffey tukivat NCIP5095103 ja RO1CA46413. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä Yhdysvalloissa esiintyvyys, ja toinen vain keuhkosyövän kuolleisuuteen, aiheuttaen noin 50000 kuolemantapausta vuodessa [1]. Prosessi tuumorigeneesiä satunnaista CRC tyypillisesti alkaa inaktivoivan mutaation

adenomatoottisen polypoosin coli (APC) B-geeni, joka johtaa poikkeavaan aktivointi kanoninen WNT signalointireitille [2]. Muissa tapauksissa, on usein mutaatio

CTNNB1

, joka koodaa β-kateniinin [3]. Tuloksena kaikkien näiden mutaatioiden on vähenemisen tai häviämisen solun kykyä kohdistaa oikein sytoplasminen β-kateniinin ja multi-proteiinin E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla, beeta-transdusiini toista sisältävä proteiini (β-TRCP), jossa poly-ubiquitylates β kateniinin, ja tavoitteet sen proteasomia heikentymisen [4]. Sen sijaan, β-kateniinin kerääntyy tumaan, ja kumppaneiden kanssa TCF /LEF transkriptiotekijän ajaa transkription ohjelma, joka lopulta johtaa neoplasia. Tässä tilanteessa on solun kyvyttömyys hallita tasojen β-kateniinin kautta ubiqitin-välitteinen hajoaminen, joka edistää tuumorigeneesiä. Kuitenkin prosessi ubiquitylation kokonaisuudessaan ajatellaan voimistuvan syövän, joka on johtanut käytön proteasomiestäjät CRC hoidossa [5].

Ubiquitylation on peräkkäinen, kolmivaiheinen prosessi, jonka E1, E2 ja E3 ubikitiini-ligaasia, joka johtaa kovalenttinen sidos ubikitiinipromoottori (s), 76 aminohapon proteiinia, joka Lys jäännös (t) substraatti tai kohdeproteiinin. Se on keskeinen solun homeostaasin ensisijaisesti kohdistamalla proteiineja proteasomia tai lysosomiin varten hajoamisen kautta kiinnitys ubikitiinipromoottori ketjujen (poly-ubiquitylation). Kuitenkin ubiquitylation on myös osoitettu olevan tärkeitä rooleja kaupan, lokalisointi, ja aktiivisuus proteiinien, erityisesti silloin, kun on lisätty vain yksi ubiquityl ryhmä, jota kutsutaan mono-ubiquitylation [6]. Kohdistaa spesifisyys on ensisijaisesti toimittanut E3 ligaasit, jotka katalysoivat viimeinen vaihe ubikitiinipromoottori kiinnitys. Ihmisen perimässä, on yli 600 E3 ligaaseina versus noin 30 E2S ja kaksi E1s. Tietty E3 voi olla useita tavoitteita, ja voi aktivoida tai estää useiden solun signalointireittien [7]. On olemassa kaksi suurta perheet E3S: todella mielenkiintoisia New Gene (RING) perhe, joka käsittää 95% kaikista E3S, ja homologinen E6-AP karboksiterminaalipäästä (hect) perhe, joka sisältää loput 5% [8].

NEDD4 perhe hect-tyyppinen E3S sisältää yhdeksän jäsentä [9]. Jokainen jäsen on modulaarinen proteiini, jolla on N-terminaalin C2 domain, toinen tai neljän Keski WW verkkotunnuksia, ja C-terminaali, katalyyttinen hect domain. WW verkkotunnukset ovat vastuussa tavoitevaihtoehdon ja vuorovaikutuksessa neljän aminohapon motiivi (PY motiivi, PPXY) vuonna kohdeproteiiniin, kun taas C2 domain tukien oikea sijainti solussa. Hect verkkotunnus on vastuussa rekrytoida E2, joka toimii kantajana ubikitiinipromoottori ja sitä taivuttaa ubikitiinipromoottori kohde Lys jäännöksen, prosessi, joka vaatii aktiivista päällä Cys-tähteen. Perustajajäsenistä tämän perheen jäsen, NEDD4, on äskettäin osoitettu olevan yliaktiivista CRC, ja edistää leviämisen CRC-solujen

in vitro

, vaikka mekanismi on edelleen epäselvä [10]. Tämän lisäksi tutkimuksessa ei ole tietoa ilmaus kuviot NEDD4 perheen CRC. Huomattavaa on, että monet NEDD4 perheenjäsenten on todettu kohdistaa proteiineja, jotka ovat olennainen toimijoita polkuja uskotaan olevan tärkein synnyssä ja etenemisessä CRC.

Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet määrittämään mRNA ilmaisun tasot kunkin yhdeksän NEDD4 perheenjäsenten kasvainten suuri kohortti yksilöitä, joilla peräsuolen kasvain. Huomasimme, että

NEDD4

on pisimmälle ilmen- tymisen lisääntymisen perheenjäsen. Yllättäen

NEDD4L

, joka jakaa suurin sekvenssihomologia

NEDD4

, oli pisimmälle vaimentua perheenjäsenen CRC. Varmistimme downregulation NEDD4L proteiinitasolla ihmisen CRC näytteissä. Äskettäin NEDD4L osoitettiin hajottavan DVL2, estäen siten WNT signalointia, joka määritetään vähentämällä TOPFlash toimintaa [11]. Olemme myös havainneet, että NEDD4L estää TOPFlash aktiivisuus tai alapuolelle β-kateniinin. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että NEDD4L on potentiaalia toimia tuumorisuppressorina CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki ihmisen käytettyjen näytteiden meidän käsikirjoitus kerättiin ja analysoitiin sopusoinnussa protokollan hyväksymän Institutional Review Boards Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, ja Moffitt Cancer Center, Tampa, FL. Näytteet Tässä julkaisussa käytetty on kuvattu aiemmin [12], [13]. Tulokseksi saadut tiedot analysoitiin anonyymisti.

Ihmisen kudosnäyte mikrosiruanalyysi

yhteensä 250 ihmisen CRC kudosnäytteitä kerättiin VUmc (N = 55) ja MCC (N = 195). Näistä CRC näytteistä 33 oli vaihe I (13,2%), 76 vaihe II (30,4%), 82 vaihe II (32,8%), ja 59 vaiheen IV (23,6%). Vieressä normaali kudos kerättiin MCC kymmenestä näistä potilaista. Näistä kaksi kerättiin I vaihe, viisi vaiheen II, ja kolme vaiheen III potilaista. Lisäksi kuusi adenoomia kerättiin MCC. Näytteet Tässä julkaisussa käytetty on kuvattu aiemmin [12], [13]. RNA näiden kudosten saatiin ja hybridisoidaan Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChip- Expression Array. Seuraavat koettimet analysoitiin:

NEDD4

(213012_at),

NEDD4L

(237498_at, 241396_at, 212445_s_at, 212448_at),

WWP1

(212637_s_at, 212638_s_at),

WWP2

(1552737_s_at, 1554580_a_at, 204022_at, 210200_at),

ITCH

(209743_s_at, 209744_x_at, 217094_s_at, 235057_at, 239101_at),

SMURF1

(1559426_at, 212666_at, 212668_at, 215458_s_at, 232665_x_at ),

SMURF2

(205596_s_at, 227489_at, 232020_at),

NEDL1

(210331_at, 215584_at), ja

NEDL2

(232080_at, 243080_at). Neljä spesifisiä koettimia

NEDD4L

, olemme keskittäneet huomiomme 212445_s_at koska se koodaa osaa transloitu. Kolme neljästä NEDD4L koettimet merkittävästi vaimentua samalla tavalla, kun taas yksi (237498_at) määrä pysyi ennallaan etenemiseen.

Potilaat VUmc ryhmässä oli mediaani seuranta 50,2 kuukautta, jossa on vähintään seuraavat up 0,4 kuukautta ja enintään 111,3 kuukautta. Ne, MCC ryhmässä oli seuranta-ajan mediaani 44,7 kuukautta, jossa on vähintään 0,92 ja enintään 142,8 kuukautta. Kaikki nämä näytteet kerättiin ja analysoitiin sopusoinnussa protokollan hyväksymän Institutional Review Boards sekä VUmc ja MCC.

Western blot-analyysi

CRC kudosten ja viereiset normaalit paksusuolen limakalvo kerättiin 20 yksilöt kirurgisen resektion at VUmc ja jäädytettiin nestetypessä. Näytteet hajotettiin sitten 8 M ureaa, käsiteltiin ultraäänellä ja sentrifugoitiin 14000 rpm: ssä. Supernatantti poistettiin, ja proteiini kvantitoitiin mittaamalla absorbanssi 280 nm: ssä. Näytteet ajettiin sitten 7,5% polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Kalvot blotattiin anti-NEDD4L (1:2000) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) ja anti-α-tubuliinin (1:2000) (TUUBA) (Calbiochem, San Diego, CA) vasta-aineita, ja havaitaan käyttämällä asianmukaisia ​​HRP konjugoitua toissijainen vasta-aineet ja kemiluminesenssi menetelmällä. Intensiteetit jälkeen blotit kvantifioida käyttämällä ImageJ ohjelmistoa, ja analysoitiin.

TOPFlash määrityksessä

Transfektiot suoritettiin käyttäen Metafectene (Biontex, San Diego, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. HEK293-solut (2 x 10

5) maljattiin 12-kuoppaisille lautasen, annetaan kiinnittyä, ja transfektoitiin seuraavana päivänä 0,1 ug kutakin plasmidia. Seuraavia plasmideja käytettiin: TOPFlash reportteri plasmidi, FOPFlash toimittaja plasmidi, pcDNA3.1, NEDD4L (KIAA0439) (Addgene plasmidi 27000), ja NEDD4L (C A) (Addgene plasmidi 27001) [14]. , Jotka sisälsivät villityypin (wt) β-kateniinin ja mutantti β-kateniinin (ΔN89) olivat lahja Ethan Lee Vanderbilt University. Päivä transfektion jälkeen väliaine poistettiin, ja seerumitonta alustaa, joka sisälsi 20 ng /ml WNT3A ja 100 ng /ml R-spondin (Vanderbilt Antibody ja proteiini resurssin) lisättiin. Seuraavana päivänä solut hajotettiin ja käsitelty sopusoinnussa lusiferaasimääritystä Kit (Promega, Fitchburg, WI). TOPFlash aktiivisuus normalisoitiin FOPFlash toimintaa, ja taita-aktivaatio määritettiin normalisoimalla ja TOPFlash ja FOPFlash aktiivisuus stimuloimattomissa soluissa. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena vähintään kolme kertaa.

NEDD4L knock-down

Lentivirusvektorikonstruktit plasmideja, jotka sisältävät shRNA (Open Biosystems, Huntsville, AL) vastaan ​​ihmisen

NEDD4L

transfektoitiin HEK293-soluihin käyttäen Metafectene. Seuraavana päivänä lisättiin tuoretta väliainetta. Seuraavana päivänä väliaine suodatettiin (0,45 pm suodattimia). Tartuttaa DLD-1 ja RKO-solujen, 2,0 x 10

5 solua maljattiin kuhunkin kuoppaan 6-kuoppalevylle, ja infektoitu lentiviruksen. Kahden päivän kuluttua GFP: n ilmentymisen havaittiin, ja infektoidut solut valittiin puromysiinin kanssa (5 ug /ml), ja lajitellaan GFP: n ilmentymisen. Tehokkuus knock-down määritettiin NEDD4L western blottauksella.

Tilastollinen

Jos haluat vertailla ilmentymistason kukin koetin normaalin, adenooma, ja syöpä kudosnäytteet, Wilcoxonin rank sum test käytettiin [12], [13]. Määrittämään suhteelliset proteiinin tasot, NEDD4L proteiinin tasot normalisoitiin TUUBA tasolle, log-transformoituja, ja verrattiin käyttäen parillista t-testiä. Kaplan-Meier eloonjääminen analyysi suoritettiin microarray aineisto, jotta voidaan määrittää tautikohtaisia ​​selviytymistä. Tautikohtaiset eloonjääminen määriteltiin dokumentoitu syöpään liittyvän kuoleman [12]. Merkitys tasot TOPFlash reportterimääritys kokeessa määritettiin käyttämällä Studentin t-testiä.

Tulokset

Expression tasoilla NEDD4 perheenjäsenten CRC

yhdeksän jäsentä NEDD4 perhe E3 ubikitiinipromoottori ligaasit ovat modulaarisia proteiineja (kuvio 1). Kuten Kokonaisuutena NEDD4 perhe tiedetään olevan osallisena säätelyssä useita proteiineja ja polkuja, jotka ovat keskeisiä kehittämisen CRC. Taulukko 1 on koottu tunnettujen substraattien, signalointi vaikuttavia reittejä, ja ekspressiotasot erilaisissa syövissä kaikkien NEDD4 perheenjäseniä. On korkea sekvenssihomologia keskuudessa perheenjäseniä, mikä selittää jaetun tavoitteet monien perheenjäseniä. On kuitenkin olemassa myös esimerkkejä eri perheenjäsenten on vastakkaiset vaikutukset samalla signalointireitin. Esimerkiksi, NEDD4 aiheuttaa downregulation SMAD1 ja CBL, joka estää luun morfogeneettinen proteiini (BMP) signalointi ja aktivoi epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) signaloinnin, vastaavasti [15], [16]. Toisaalta, NEDD4L vaikutukset transformoiva kasvutekijä-β (TGF) signalointia, mutta ei BMP signalointia kautta hajoamista Smad 2 ja 3, ja tyypin I TGF-reseptoriin, ja kumotaan EGFR signalointi ubikitiinipromoottori-välitteinen hajoaminen aktivoitu Cdc42 kinaasi 1 (ACK1) [14], [17], [18]. Lisäksi NEDD4 on osoitettu säätelevät vaimentaen tuumorisuppressorigeenin PTEN [19]. Kuitenkin NEDD4 osoitettiin edistämään leviämisen CRC-solujen

in vitro

, riippumaton vaikutusta PTEN tasoilla [10].

yhdeksän jäsentä NEDD4 perhe ovat modulaarisia proteiineja. Niiden N-pää, jokainen on C2 verkkotunnuksen, joka on rooli asianmukaisesti solusijaintipaikasta. Keskiosa kunkin proteiini sisältää kaksi ja neljä WW domeenit, jotka ovat vastuussa kohteena tunnustamista. WW domeenit ovat 20-23 aminohapon, Trp-pohjainen motiiveja, jotka tunnistavat PY-motiiveja (PPXY, LPXY), sekä joitakin fosfo-Ser- tai fosfo-Thr-pohjainen motiiveja. C-terminus on hect verkkotunnuksen, joka suoraan konjugaatit ubiquityl osan kohdeproteiiniin. Perheen jäsenet ryhmitellään nimen ja homologia. ITCH on tiiviimmin homologinen WWP1 ja 2 kuin muut perheenjäsenet.

Sen määrittämiseksi mahdollisen roolin NEDD4 perheen aloittamiseen tai etenemisen CRC, me altistetaan 250 CRC potilaan kasvain näytteitä eri vaiheista, kuusi adenooma näytettä, ja 10 vieressä normaali näytteiden mikrosiruanalyysi, huomata kuinka ilmaus kunkin perheenjäsenen muuttaa etenemisen (kuvio 2A). Mielenkiintoista, tiiviisti homologinen pari

NEDD4

ja

NEDD4L

olivat vastakkain säänneltyä (kuvio 2B, C).

NEDD4

(213012_at) tiettyjä kehityssuuntia ylöspäin klo adenooma vaiheessa, mutta oli merkittävästi kohonnut 1 vaiheessa CRC ja pysyi merkittävästi koholla aikana syövän etenemiseen. Kääntäen,

NEDD4L

(212445_s_at) ilmentyminen väheni, analyyseihin alaspäin adenoomien ja väheni huomattavasti kaikissa vaiheissa CRC (kuvio 2C).

(A) Ilmaisu Kaikkien yhdeksän NEDD4 perhe jäseniä tutkittiin CRC microarray profilointia. Kuvassa on keskimääräinen kertamuutosta kaikkien koettimien kunkin yksittäisen geenin Nl (N = 10), Ad (N = 6), CA1 (N = 33), Ca2 (N = 76), Ca3 (N = 82) ja CA4 (N = 59). (B)

NEDD4

(213012_at) on pisimmälle voimistunut jäsen NEDD4 perheen CRC. (C)

NEDD4L

(212445_s_at) on pisimmälle vaimentua jäsen NEDD4 perheen CRC. Nl = normaali, Ad = adenooma, ja Ca1-4 = CRC, vaihe I-IV. * P 0,05.

NEDD4L proteiini vähentynyt CRC

Koska transkriptipitoisuuksissa tietyn geenin eivät aina korreloi proteiinin tasot, me seuraavaksi selvitettävä, lasku

NEDD4L

mRNA-tasot johtivat vähenemiseen NEDD4L proteiinia. Tätä varten suoritimme western blot-analyysi ihmisen CRC ja viereisen normaali kudosnäytteitä 20 käyttävillä potilailla kudos kerätään Vanderbilt University Medical Center (kuvio 3A, B). Havaitsimme merkittävän laskun NEDD4L proteiinin tasot (~42%) ihmisen CRC verrattuna normaaliin kudokseen, joka on löytää sopusoinnussa mikrosiruanalyysi.

(A) NEDD4L tasot määritettiin western blotting CRC (Ca ) ja vieressä normaali (Nl) limakalvon kahdestakymmenestä yksilöitä. Tasot normalisoitiin TUBA ja Nl verrattiin Ca. NEDD4L merkittävästi vaimentua (~42%) vuonna CRC (* p 0,05). Data esitetään laatikossa ja hiuksenhienosti juoni muodossa. Linjat yhdistävät datapisteet osoittavat suhteellista NEDD4L tasot tietyssä Nl-Ca sovitettu pari. Punainen tarkoittaa laski NEDD4L tasoa Ca, kun taas musta merkitsee lisäystä. (B) lysaatit syntyvät Nl-Ca pareittain blotattiin varten NEDD4L ja TUBA. Kuvassa on neljä edustavia pareja.

vieressä pyrittiin määrittämään, onko NEDD4L ekspressiotasoja korreloivat tautikohtaista selviytymisen meidän kohortin potilaista. Vertasimme selviytymisen potilaiden korkeimman neljännekseen NEDD4L ilmaisun kanssa, jotka ovat alimmassa neljänneksessä (kuva 4). Olemme havainneet, että niillä potilailla, joilla on korkein NEDD4L ilmaisua esillä pidempi tautikohtaisia ​​selviytyminen kuin potilailla, joilla on alhaisin ekspressiotasot. Tämä ero, ei kuitenkaan tilastollisesti merkitsevä (p = 0,079).

tautikohtaista selviytymisen CRC potilailla, joilla on korkein ja alin NEDD4L ilmentymistä verrattiin käyttämällä Kaplan-Meier-analyysi. Ne potilaat, joilla kasvain näytteet korkeimman neljännekseen NEDD4L ilmaisun osoitti suuntauksena pidemmän tautikohtaisia ​​selviytyminen yli 60 kuukauden ajan. p = 0,079.

NEDD4L tukahduttaa kanoninen WNT signalointi

alentuminen NEDD4L ilmaisun CRC viittaa mahdollisuuteen, että NEDD4L soittaa kasvain heikentävän rooli CRC. Koska keskeisyys kanoninen WNT signaloinnin aloittamiseen ja etenemisessä CRC, me tutkimme, NEDD4L voi estää kanoninen WNT signalointi suorittamalla TOPFlash reportterimääritys, joka mittaa kanoninen WNT aktiivisuus fuusioimalla TCF /LEF vastaus elementtejä tulikärpäsen lusiferaasireport-. NEDD4L esti TOPFlash aktiivisuutta, kun kanoninen WNT signalointi aktivoitiin lisäämällä WNT3A ja koaktivaattori, R-spondin (kuvio 5A). Inhibitio näyttää olevan riippuvainen kyvystä NEDD4L on ubiquitylate kohdeproteiinit, katalyyttisesti inaktiivinen muoto NEDD4L, joissa aktiivinen päällä Cys mutatoitiin Ala-[NEDD4L (C A)] ei havaittu inhibitiota TOPFlash aktiivisuuden ( kuvio 5A) [20]. Nämä tulokset tukevat viimeisten tietojen mukaan NEDD4L estää WNT opastinjärjestelmillä ubiquitylating ja kohdentamalla DVL2 että proteasomin heikentymisen [11]. Olemme kuitenkin myös havainneet, että NEDD4L esti kanoninen WNT signalointia, kun paino- tai mutantti (ΔN89) β-kateniinin käytettiin aktivaattorina (kuvio 5B), mikä viittaa siihen, NEDD4L estää WNT signalointi alavirtaan DVL läsnä mutantin APC tai CTNNB1.

(A) NEDD4L estää TOPFlash aktiivisuutta HEK293-soluissa verrattuna tyhjän vektorin (CTL) tai katalyyttisesti aktiivinen NEDD4L [NEDD4L (C A)]. WNT3A (20 ng /ml), ja R-spondin (100 ng /ml) käytettiin aktivoimaan kanoninen WNT signalointia. (B) Kun kaksi erilaista β-kateniinin konstrukteja, β-kateniinin (wt) ja β-kateniinin (ΔN89), käytetään aktivoimaan kanoninen WNT signalointia vähennetään merkittävästi TOPFlash vaikutus havaittiin, kun läsnä oli NEDD4L yli-ilmentymisen, verrattuna tyhjän vektorin tai NEDD4L (C A). Kaikki tulokset on normalisoitu FOPFlash toimintaa. * P 0,05.

laajentaa tätä työtä, tutkimme kasvua vaikutuksia kaatamalla endogeenisen NEDD4L kahdessa ihmisen CRC solulinjoista, DLD-1 ja RKO. DLD-1 solut sisältävät lyhennetty mutaation

APC

, kun taas RKO solut joilla ei ole mutaatio

APC

eikä

CTNNB1

, mutta on inaktivoiva mutaatio

NKD1

, indusoituva negatiivinen säätelijä WNT signalointi [21]. Knock-down varmistettiin western blottauksella (-80%), (tietoja ei ole esitetty). Mittasimme kasvu muovi ja pehmeä agar ja kollageenia. Havaitsimme mitään merkittäviä eroja kasvun solujen NEDD4L knock-down verrattuna salattu valvontaa (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi NEDD4L knock-down ollut vaikutusta kasvaimen kokoon nude mouse ksenografteissa (tuloksia ei ole esitetty).

Keskustelu

Tämä tutkimus suoritettiin alkaa ymmärtää, jos on olemassa rooli jäsenet NEDD4 perheen E3 ubikitiinipromoottori ligaasit CRC. Yhdeksän jäsentä käsittävät tämän perheen, ja jokainen on osoitettu vaikuttavan ainakin yhden solureiteillä keskeinen taudin alkamisen ja etenemisen CRC. Useat jäsenet on osoitettu olevan väärin säädellystä useissa eri syövissä. Kuitenkin järjestelmällinen arviointi ekspressiotasoja kaikkien perheenjäsenten ihmisen CRC ei ole aiemmin tehty. Erityisesti

NEDD4

-mRNA viime aikoina osoittanut voimistuvan vuonna CRC, mutta tämä analyysi ei pitänyt vaiheessa CRC, tai sisältävät adenoomia [10]. Tunsimme, että ensimmäinen askel alussa ymmärtää tämän perheen E3S CRC oli tutkia ekspressiotasot jokaisen perheenjäsenen CRC suuresta kohortin potilaista. Päätimme suorittaa analyysimme kaikissa vaiheissa, mukaan lukien adenoomia, koska on olemassa yleisesti muutoksia vastaavia reittejä samankaltaisissa aikana CRC etenemisen [2]. Jotkut näistä reiteistä on eri tehtävät eri vaiheissa. Esimerkiksi TGFp reitti on tuumorisuppressorina alussa CRC, mutta edistää etenemistä ja etäpesäkkeitä myöhemmin [22].

Tässä arvioimme kuinka ilmaisua kunkin NEDD4 perheenjäsenen muuttuu etenemistä adenooma vaiheeseen IV CRC. Pisimmälle voimistunut perheenjäsen oli

NEDD4

, sopusoinnussa edellä mainittujen havaintojen [10]. Me mennä osoittamaan, että säätely tapahtuu aikaisin CRC (vaihe I), ja säätelyä on säilytettävä etenemistä. Pisimmälle vaimentua perheenjäsenen meidän data asetettiin

NEDD4L

. Löysimme tämän yllättävä, sillä NEDD4L jakaa korkeimman sekvenssihomologia NEDD4, ja sen on osoitettu olevan merkittävää päällekkäisyyttä NEDD4 kohde valinta [7]. Äskettäin NEDD4L proteiinin tasot osoitettiin vaimentua mahasyövän, ja ne potilaat, jolla on pienin ekspression immunohistokemiallinen analyysi oli huonompi ennuste [23]. NEDD4L on myös todettu olevan sekä voimistuvan ja vaimentua eturauhassyövässä, lisääntynyt invasiivisia sappirakon syöpäsoluissa, ja vaimentua enemmän aggressiivinen pahanlaatuisen gliooman [24] – [27]. Näiden eri havainnot eivät ole odottamattomia, koska suuri osa tavoitteista ja solujen signalointireittejä joihin NEDD4L on todettu toimivan.

Äskettäinen raportti osoitti, että NEDD4L estää sekä kanoninen ja ei-kanoninen WNT signalointireitteihin by ubiquitylating DVL2 ja kohdistaminen sen proteasomia hävitettäviksi [11]. Täällä, huomasimme, että NEDD4L voivat myös estää kanoninen WNT signalointi tasolla, tai alavirtaan, β-kateniinin. Tämä on toisin kuin edellä mainitussa paperia, jossa tutkijat osoittivat, että NEDD4L ei inhiboi TOPFlash kun signalointia oli aktivoidaan β-kateniinin mutantti (S37A). Heidän tutkimuksessaan isoformia 2 NEDD4L (NM_001144964.1) käytettiin, kun taas käytimme eri NEDD4L isoformin (KIAA00439). Nämä kaksi cDNA: t eroavat toisistaan ​​niiden N-terminaalisessa päässä; konstruktilla käytetään tutkimuksessamme on ylimääräinen 141 aminohappotähdettä välittömään N-päässä, joka muuttaa C2-domainista ja 20 vähemmän jäämiä segmentin edeltävän toisen WW verkkotunnuksen. Tämä saattaa osaltaan differentiaaligeometriaan lokalisointi tai alustan kohdistaminen. Lisäksi, eri β-kateniinin konstruktit testattiin; käytimme p- ja mutantti β-kateniinin (ΔN89), ja, että aikaisemmassa raportissa, β-kateniinin (S37A) käytettiin.

Huomasimme, että kaatamalla endogeenistä

NEDD4L

kaksi CRC riviä ei ollut vaikutusta kasvuun. Tämä voi johtua siitä, että näissä solulinjoissa on jo kehittynyt mekanismi voittaa kasvua estäviä vaikutuksia NEDD4L, tai että solut ovat jo saavuttaneet endogeenisen vähentäminen NEDD4L ilmentymisen tason alapuolelle, joka on tarpeen kasvun esto. Jatkotutkimuksissa puututaan tähän yliekspressiolla paino- NEDD4L on akku CRC linjat. Viime kädessä, voi olla tarpeen luoda hiirimallissa, jossa NEDD4L lyödään pois aikaisessa vaiheessa tumorigeneesin.

Yhteenvetona olemme tutkineet mRNA ilmaus NEDD4 perheen E3 ubikitiinipromoottori ligaasit isossa kohortti yksilöiden peräsuolen kasvain. Pisimmälle voimistunut jäsen on

NEDD4

, joka on aikaisemmin osoitettu tehostavan proliferaatiota ihmisen CRC-solujen

in vitro

[10]. Pisimmälle vaimentua jäsen on

NEDD4L

. Yhteisymmärryksessä aiempien tulosten kanssa, NEDD4L yliekspressio HEK293-soluissa esti kanoninen WNT signalointi [11]. Tässä osoitamme myös, että NEDD4L estää WNT signalointi tai sen myötävirtaan β-kateniinin, joka on tärkeä yhteydessä yleisin aktivoivan mutaation kanoninen WNT signalointi, joita löytyy CRC. Siksi ehdotamme, että NEDD4L voi toimia tuumorisuppressori CRC estämällä kanonisen WNT signalointi.

Kiitokset

Tekijät haluavat tunnustaa Bruce Aronow, Dan Ayers, Tim Yeatman, ja Josh Smith niiden apua tietojen analysointi, ja Jim Higginbotham hänen apua virtauksen lajittelu. Kirjoittajat myös kiittää Emily Poulin hänen editointiavun.