Krooninen sairaus

tiivistelmä

Poikkeava ilmentyminen miR-96 eturauhassyövässä on aiemmin raportoitu. Kuitenkin rooli ja vaikutusmekanismi miR-96 eturauhassyövässä ei ole määritetty. Tässä tutkimuksessa ja ennustavia ominaisuudet miR-96 ekspressiotasot tutkittiin qRT-PCR kahdessa hyvin dokumentoitu eturauhassyöpää ikäryhmät. MIR-96 ilmentyminen havaittiin olevan huomattavasti suurempi eturauhassyöpäpotilailla ja korreloi WHO luokka, ja pieneni elinaika; potilailla, joilla on alhainen miR-96 eli 1,5 vuotta pidempi kuin potilailla, joilla on korkea miR-96 tasoja. Terapeuttista potentiaalia tutkittiin lisää in vitro, mikä osoittaa, että kohdunulkoinen tasot miR-96 parantaa kasvua ja solujen lisääntymistä eturauhassyöpäsoluissa, mikä tarkoittaa, että miR-96 on onkogeenisiä ominaisuuksia tässä ympäristössä. Osoitamme, että miR-96 ilmentyminen vähentää transkriptin ja proteiinin tasot FOXO1 sitoutumalla yhteen kahden ennustetun sitoutumiskohdat FOXO1 3’UTR-sekvenssi. Estämällä tämän sitoutumiskohdan esti täydellisesti kasvua lisälaite välittämää miR-96. Tämä havainto tukee suuri ulkoinen eturauhassyöpä potilas kohortti jossa miR-96 ilmentyminen korreloi käänteisesti FOXO1 ilme. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että miR-96 on avainasemassa eturauhassyövässä solujen lisääntymistä ja voi parantaa eturauhassyövän etenemistä. Tätä tietoa voitaisiin käyttää kehittämään uusia terapeuttisia välineitä eturauhasen syöpä.

Citation: Haflidadóttir BS, Larnen O, Martin M, Persson M, Edsjö A, Bjartell A, et al. (2013) lisääntymisen merkkejä miR-96 Parantaa Cellular leviämisen syöpäsolujen kautta FOXO1. PLoS ONE 8 (8): e72400. doi: 10,1371 /journal.pone.0072400

Editor: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia

vastaanotettu: 17 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 10. heinäkuuta 2013 mennessä; Julkaistu: 12 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Haflidadóttir et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus näihin tuloksiin johtanut on saanut rahoitusta Euroopan unionin seitsemännen puiteohjelman (FP7 /2007-2013) avustussopimuksen nro 201438, Ruotsin tiedeneuvosto, Gunnar Nilssons Cancer Foundation, Jeanssons perusta ja Gyllenstiernska Krapperups perusta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisin syöpä Euroopan ja Pohjois-Amerikan miesten ja yksi tärkeimmistä syistä syöpään liittyvien kuolemien [1]. Vaikka rajoittuu eturauhanen, syöpä on parannettavissa joko prostatektomia tai sädehoito [2]. Koska kasvain edetessä, se kehittää kykyä hyökätä ympäröivään kudokseen, aiheuttaa angiogeneesiä, ja etäispesäkkeitä. Androgeenideprivaatio hoito, joko kemiallisia tai kirurgisen kastraation, on kultakanta kohtelu kehittyneitä Eturauhassyövän. Tämä hoitovaihtoehto aiheuttaa merkittäviä kliinisiä regressio melkein kaikilla potilailla [3,4]. Kuitenkin suurin osa kasvaimista tulevat kastraatio kestävä ja jatkaa kasvua 12-18 kuukautta ja toistuva kasvaimia vain lievittävä hoidot ovat käytettävissä. Selviytyäkseen ja jatkaa kasvua androgeenin köyhdytettyä ympäröivä, solut on joko mukautettava androgeenireseptorin (AR) kautta tai aiheuttaa vaihtoehtoisia selviytymistä ja kasvua polkuja. Mekanismit mukauttaminen AR voidaan lisätä ilmentymisen AR, lisääntynyt paikallinen tuotanto androgeenien, yliherkkyys tai konstitutiivisesti aktiivinen typistettyjä muotoja AR, vapaita, ja /tai ligandi riippumattoman aktivaation kautta kinaasi cross-talk. PCA vapautettu microRNA (miRNA) ilmentyminen on raportoitu [5-7] ja miRNA uskotaan edistää kasvaimen etenemistä kautta niiden osallistumista solujen lisääntymisen, apoptoosin, invaasio, etäpesäke ja kastraatio kestävyys puhkeamista [tarkistetaan 8-10]. Me ja muut ovat aiemmin osoittaneet, että miR-96 tasot ovat yläreguloituja PCa [5,7,11], ja että se on myös erittäin ilmaistu useissa muissa syöpätyypeissä, mukaan lukien lymfooma, maksa-, rinta-, munasarja-, keuhko-, paksusuoli-, kivesten ja kolorektaalisyöpä [5,12]. miR-96 on ehdotettu toimimaan oncomiR säätö- proliferaatiota ja DNA: n korjaukseen [13], mutta myös tuumorisuppressorina apoptoosin indusoimiseksi haiman soluihin [14]. Rintasyövän, miR-96 edistää solujen lisääntymistä kohdistamalla tuumorisuppressorigeenin Forkhead laatikko O transkriptiotekijän, FOXO3a, ja sykliini-riippuvaisen kinaasin estäjät p27

Kip1 ja p21

CIP1 [15]. miR-96 on osoitettu myös kohdistaa FOXO1 endometriumin [16], rintojen [17], hepatosellulaarisen syövän soluihin [18] ja Hodgkinin lymfooma [19]. Forkhead laatikko O proteiineja FOXO1, FOXO3a, FOXO4, ja FOXO6 ovat transkriptiotekijät liittyvät biologisissa prosesseissa, kuten DNA-vaurioiden korjaamiseen [20], solusyklin [21,22] ja apoptoosin [21,23]. FOXO1 tuumorisuppressori sijaitsee 13q41, alue on usein poistettu PCa ja muiden syöpien, ja sekä ydin- FOXO1 ja transkriptin tasot on osoitettu olevan vähentynyt PCa [24,25]. Fosfataasi ja tensin homologi (PTEN) on usein menetetään eturauhassyövässä [26,27], joka myös johtaa menetykseen tai toiminnan heikkenemisen loppupään efektorien kuten FOXO1 [21]. FOXO1 on osoitettu lisäävän apoptoosia [17,21] ja vähentää proliferaatiota [17,21]. PCA soluissa sanottuna FOXO1 indusoi apoptoosia ja solukierron pysähtymisen [21,28], ja on myös osoitettu olevan osa sääntelyn takaisinkytkentäsilmukan kanssa AR PCA. FOXO1 tukahduttaa sekä androgeeniriippuvaisten ja androgeenistä riippumaton aktiivisuus AR [24,29,30], ja AR estää DNA: ta sitovaa aktiivisuutta FOXO1 muodostamalla proteiini-proteiini-kompleksi FOXO1, mikä tekee FOXO1 pysty indusoimaan apoptoosia ja solujen sykli pidätys [30].

Näin ollen meidän hypoteesi, että PCA, miR-96 toimivat täten oncomiR, joka vaikuttaa syövän etenemiseen. Tässä tutkimuksessa ennustetyöväline ominaisuudet miR-96 analysoitiin kaksi ikäluokat Eturauhassyövän potilaiden ja ilmaisun korreloi kliinisten parametrien. Vaikutus miR-96 solujen kasvua ja lisääntymistä arvioitiin

in vitro

ja FOXO1 tunnistettiin välittömänä kohteena miR-96 PCA soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka selvitys

Eettinen hyväksyntä kaikille näytteille kuvattujen on saatu ”Regionala etikprövningsnämnden i Lund” (paikallinen eettinen Review Board Lund, Ruotsi), hyväksyntä #: LU909-03 ja henkilötiedot anonymisoidaan. Eettisen toimikunnan luopua tarvetta kirjallisen suostumuksen ja niiden ehdotus tiedot tutkimuksesta, joka sisältää ohjeita opt-out menettely julkaistiin kaikissa suurimmissa paikallisissa sanomalehdissä. Noudatamme Helsingin julistuksen ja tietosuojadirektiivin.

Potilasnäytteet

Kohortti 1, aiemmin kuvattu [31,32] ja taulukossa S1, käytettiin analysoimaan miR-96 lauseke . Se koostuu kudosnäytteitä kerätään höyläysleikkaus eturauhasen (tärpätti), kerätty 1990-1999 Malmössä. Lyhyesti, materiaali kiinnitettiin 4% puskuroidussa paraformaldehydillä ja parafiiniin. Näytteet arvostellaan WHO: n mukaan standardin ja diagnoosi perustui histopatologinen diagnoosi satunnaisesti valitun tapauksissa todisteita eturauhasen adenokarsinooma 50 potilasta ja eturauhasen hyvänlaatuinen liikakasvu (BPH) (eli ei todisteita PCA) toisessa 25 miestä. Läsnäolo PCa ja määrän arviointi (%) syöpäsolujen tehtiin käyttämällä kohdat vieressä, joita käytetään miRNA analyysit [31]. Yksi (1/50) syöpä näyte ei todettu sisältävän PCA viereisen osan ja jätettiin pois lopullisesta keräämiseen. Ikäryhmä klo TURP oli 63-89, ja keskiarvo on 76 vuotta miehillä diagnosoitu syöpä, ja 56-86, ja keskiarvo 71 vuotta miesten BPH. Kohortti 2 koostuu 93 formaliinilla parafiiniin upotetut (FFPEs) kudoksiin saadaan radikaali prostatectomies, porrastettu WHO ja Gleason. Näytteet kerättiin Malmö Hospital 1999-2002 ja niitä on kuvattu taulukossa S2. Ikäryhmä klo eturauhasen oli 48-73 ja keskiarvo oli 62 vuotta. Asianmukaiset eettinen hyväksynnät on saatu eettisen komitean, Lundin yliopisto ja olemme noudattaneet Helsingin julistusta.

Soluviljely ja transfektio

PCa solulinjoissa 22Rv1, LNCaP klooni FGC, DU145 ja PC3 saatiin American Type Culture Collection ja Vcap ja PNT2 solulinjat saatiin European Collection of Cell Culture. Soluja viljeltiin mukaan toimittajan suositusten. Solut transfektoitiin lyhytaikaisesti miRIDIAN microRNA Mimic (C-300514-07, 80nm koetin, Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE) ja rinnakkain; solut transfektoitiin miRIDIAN microRNA Mimic negatiivinen kontrolli (CN-001000-01-05). Inhiboimaan endogeenisen miR-96, solut transfektoitiin miRCury LNA estäjien (100 nM koetinta, Exiqon A /S, Vedbaek, Tanska), miR-96-estäjä (Cat. No. 410467-00) ja samanaikaisesti negatiivinen kontrolli A (Cat . no. 199004-00). Solut transfektoitiin käyttäen Oligofectamin reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA).

eristäminen RNA

RNA erillään PCA ja BPH kudosnäytteiden kohortissa 1 on aiemmin kuvattu [31]. Lyhyesti, RNA eristettiin 20 pm osien 75 formaliinilla parafiiniin upotettuja (FFPEs) eturauhasen kudosnäytteitä. Pieni RNA: t uutettiin hieman muunnellun protokollaa mirVanaTM miRNA Isolation Kit (Ambion); näytteet deparaffinised ksyleeniuutolla käsittely ja pilkottu proteaasin ennen orgaaninen uutto. Pesun jälkeen suodatin sisälsi pieniä RNA-näytteet oli DNaasia käsitelty (RECOVERALL-, Ambion), ja pestiin jälleen. In kohortti 2, kokonais-RNA uutettiin eturauhasessa ytimet (1-4mm). Kokonais-RNA uutettiin mukaisesti modifioidun protokollan

mir

Vana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion), kuten on kuvattu Hagman et ai. [31]. RNA mitattiin käyttäen NanoDrop (ND-1000, Spektrofotometri, Thermo Fisher Scientific Inc.). RNA uuttamalla 27 ihmisen kudoksista eri alkuperää on kuvattu aiemmin [33]. Solulinjoista, kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol-reagenssin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen), ja käsiteltiin DNaasi (Promega Biosciences, San Luis Obispo, CA). RNA-pitoisuus mitattiin käyttämällä NanoDrop. Ulkoisten validointi välisen korrelaation miR-96 ja FOXO1 transkriptipitoisuuksissa analysoimme ulkoisen microarray datasarjan Taylor et al. muodostavat 110 eturauhassyöpä kudosnäytteitä ja 28 ei-pahanlaatuisia vieressä hyvänlaatuista eturauhasen kudosnäytteitä [34] (GEO hakunumero GSE21036).

Käänteiskopiointireaktio ja qRT-PCR

miRNA tasojen määrä by TaqMan Micro-RNA Analyysit protokolla (Applied Biosystems, Foster City, CA) valmistajan ohjeiden pienin muutoksin. Lyhyesti, 5 tai 10 ng pieniä RNA: t käänteisesti transkriptoidaan miR-96 spesifisiä alukkeita (määritys nro. 000186). RT-tuote monistettiin 10 ul reaktiot qRT-PCR 384-kuoppalevyille on 7900 HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Näytteet ajettiin neljänä rinnakkaisena, ja kvantifiointi suoritettiin vertaileva Delta Ct menetelmällä. Log

2-muunnosarvolohko normalisoitiin jakamalla kanssa geometrinen keskiarvo 3 taloudenhoito geenit RNU48, RNU66 ja U47 tutkimuksessa potilaan näytteitä. Tutkimuksessa miR-96 ilmentymistä kudoksissa eri ihmisestä peräisin ja PCa solulinjat geometrinen keskiarvo RNU48, RNU66, RNU24 ja RNU44 käytettiin. Ekspression FOXO1 (aluke: Hs01054576m1) solulinjoissa ja sen jälkeen miR-96 yli-ilmentyminen in 22Rv1 solujen keskiarvo GAPDH (Hs02758991_g1), ja PGK1 (Hs9999906) käytettiin kontrollina. Nämä siivouspalveluista geenit toimi myös kontrollina RNA eheyden. Yhdessä käänteisen transkription ja qRT-PCR, joka on ei entsyymiä negatiivinen kontrolli ja templaattia sisältämättömään verrokkiin ajettiin pois PCR saastumisen ja genomi-DNA.

Cell numero ja solujen kasvua

Cell numero laskettiin kolmena rinnakkaisena näytteiden transfektoitu miR-96 matkivat verrattuna negatiiviseen kontrolliin neljä ajankohtina, 2, 3, 4 ja 5 päivää transfektion jälkeen. Solut trypzinised ja laskettiin Burknerin kammioon. Sulforodamiini B (SRB) määritystä käytettiin mittaamaan solujen kasvua epäsuorasti värjäämällä proteiinin kokonaismäärästä transfektoitujen solujen miR-96 jäljittelee verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu negatiivisena kontrollina. Solut kiinnitettiin jääkylmässä 10% Trikloorietikkahappo ja värjättiin 0,4% SRB (S9012-5G Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) 1% etikkahapossa 15 minuutin ajan. Sitoutumaton SRB pestiin pois 1% etikkahappoa. Sitoutunut SRB liuotettiin 10 mM Tris-emästä, ja absorbanssi luettiin 490 nm: ssä käyttäen ELx808 IU Ultra Microplate Reader (Biotek Instruments, Inc., Winooski, VT). Solut transfektoidaan miR-96 jäljittelee kerättiin 72-120 h transfektion jälkeen, DU145 solut otettiin talteen 72 tuntia transfektion jälkeen, PC3-solut 96 tuntia ja 22Rv1 solujen 120 h transfektion jälkeen.

Solulisääntyminen

transfektoidut solut miR-96 tai negatiivinen kontrolli (kolmena kappaleena) inkuboitiin 5-bromi-2 deoksiuridiini (BrdU, GE healthcare, Wauwatausa, WI) laimennoksena 1: 1000 normaalissa kasvualustassa. 1 tunnin jälkeen solut trypsinoitiin, pestiin PBS: llä ja laskettiin Burknerin kammiossa. Solut kiinnitettiin jääkylmässä 70% etanolia. Kiinnitettyjä soluja inkuboitiin 2 M HCI, joka sisältää 0,2 mg /ml pepsiiniä 20 minuutin sulattaa solun proteiineja. Pesun jälkeen näytteitä inkuboitiin estopuskurilla (1% BSA, 0,5% Tween-20 PBS: ssä). Näytteitä inkuboitiin Alexa Fluor® 488 merkitty BrdU hiiren monoklonaalinen vasta-aine (klooni MoBU-1) (Cat. No. B35139 Invitrogen) pitoisuutena 1:60 estopuskurissa ja inkuboitiin RT: ssä 1 h sekoittaen varovasti. Näytteet pestiin PBS: llä ja inkuboitiin 5 ui 7-AAD elinkykyyn Solution (Cat. No. 559925, BD, Franklin Lakes, NJ) PBS: ssä, pimeässä yön yli 4 ° C: ssa solut analysoitiin CyFlow ® Space Partec virtaussytometrillä.

Western blot

Protein lysaatit kolmen biologisen triplikaatit kerättiin käyttämällä M-PER Nisäkkäiden Protein Extraction Reagent (Pierce Scientific, Thermo Fisher Scientific Inc.), johon oli Halt

TM proteaasiestäjäseostabletit (1: 100), (Thermo Fisher Scientific Inc. Cat. no. 87785) ja 0,5 mM EDTA: ta. Proteiinipitoisuus mitattiin Nanodrop ja saman määrän proteiinia näytteistä ladattiin NuPAGE

®Novex 4-12% Bis-Tris esivalettuja geelejä (Cat. No. NP0321BOX, Life Technologies, Carlsbad, CA). Proteiinit siirrettiin Immobilon

®-P Transfer Membrane, PVDF (Cat. No. IPVH00010, EMD Merck Millipore Corporation, Billerica, MA). Membraanit inkuboitiin FOXO1 (C29H4), Rabbit monoklonaalinen vasta-aineen konsentraatio 1: 500 (# 2880, Cell Signaling Technology Inc, Danvers, MA). GAPDH (GAPDH, hiiren monoklonaalinen, MAB374, Merck Millipore, Billerica, MA), käytettiin loading ohjaus. Signaalit HRP kytketty vasta-aineet syntyvät ECL

TM Prime Western blotting Detection Reagent (RPN2232 GE Healthcare) ja havaita käyttämällä CCD-kamera (LAS-3000, Fujifilm, Tokio, Japani) ja ChemiDoc ™ MP Imaging System (Bio -Rad Laboratories, Hercules, CA). Juovien voimakkuudet kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmiston ja normalisoitiin GAPDH.

Kohdesivusto salpaajat

On kaksi ennustettu sitoutumiskohdat miR-96, FOXO1 3′-alue (3’UTR) at sijainti 264-271 ja 2139-2146 (Targetscan Human, Release 6.2, kesäkuu 2012). Kohdepaikan salpaajien suunniteltu sitoutumaan ennustetun sitoutumiskohdat ja useita emäksiä sekä sivustojen sitoutumiskohdat (kuvio S1). BLO_FOXO1_miR96-1: TTACT + TCAC + GGT + TTGAGTG ja BLO_FOXO1_miR96-2: CTTGAAC + CAC + GGT + TTCATGA. + On edessä ”Lukittu Nukleiinihapot” (LNA

TM) DNA-sekvenssit (Exiqon A /S, Vedbaek, Tanska). Kohdesivustoa salpaajien kotransfektoitiin MIR-96 matkivat (100 nmol) kolmessa eri pitoisuuksina, 300 nM, 600nm tai 1 uM. Proteiini tasot FOXO1 kvantitoitiin käyttäen western blot -analyysiä. Kasvu mitattiin käyttämällä SRB-määritys transfektion jälkeen miR-96 matkivat ja 600 nm: ssä kohde-sivuston salpaajien.

Tilastollinen analyysi

Tulokset analysoitiin käyttäen Graphpad Prism 5 ja tilastollinen merkitsevyys laskettiin käyttäen paritonta , kaksisuuntainen t-testi, ellei muuta mainita ja p 0,05 pidettiin merkittävänä. Cuzick trendi testiä käytettiin analysoimaan suuntaus miR-96 ilmentyminen WHO I, II ja III kohortin 1. selviytyminen analyysi Log-rank (Mantel-Cox) testiä käytettiin. Spearmanin listalla korrelaatio käytettiin analysoimaan korrelaatio miR-96 ilmentää PSA-tasot potilaan kohortin 1 sekä FOXO1 tasolle ulkoisen aineisto.

Tulokset

miR-96 ilme korreloi kliiniset parametrit

tasot miR-96 on aikaisemmin havaittu olevan huomattavasti suurempi PCA kudoksessa kuin ei-PCa kudosten kohortissa 1 [11]. Tässä ennustetekijöiden ominaisuudet miR-96 tasot, mitattuna qRT-PCR RNA uutetaan FFPE eturauhaskudokset, tutkittiin. Kliininen ominaisuudet kohortin 1 on perusteellisesti kuvattu aiemmin [31,32], mutta lyhyempi versio voidaan nähdä taulukosta S1. Löysimme miR-96 tason olevan alhaisin BPH (non-PCA) ja lisääntyä WHO luokka, mediaani miR-96 ilmentyminen BPH = 0,1150, WHO I = 0,1368, WHO II = 0,1767, WHO III = 0,2969 (p mediaani miR-96 ilmentyminen WHO I = 1.620, WHO II = 1.610, WHO III = 2,205. On vain 6 miehiä WHO I ryhmään, mutta jos WHO I ja II yhdistetään, miR-96 tasoa WHO III on merkittävästi korkeampi (p = 0,0414) (kuvio 1 B). Kliiniset ominaisuudet kohortin 2 on esitetty taulukossa S2. Lisääntynyt miR-96 ilmentyminen korreloi lisääntynyt PSA tasot potilaiden näytteitä kohortin 1 (kuvio 1 C). Kaplan-Meier-analyysi potilaan eloonjäämiseen in kohortissa 1 tehtiin perustuu miR-96 ekspressiotasot. Alin ilmaus neljänneksellä verrattuna voimakasta ilmentymistä kolme neljäsosaa potilaan näytteitä, merkittävästi jakaa PCA potilaita suuri riski (mediaanielossaolosta 3 vuotta) ja matalan riskin potilailla (eloonjäämismediaani 4,5 vuotta) (p = 0,0389, log-rank-testi ), jossa riskisuhde 2,2 (95% CI 1,040-4,463), katso kuva 1D. Koska kohortti 2 on uudempi kohortti analyysit selviytymistietoa päätepiste ei ole mahdollista vielä.

. miR-96 ilmentyminen potilaan näytteitä kohortissa 1 on alhaisin BPH (ei-PCA) näytteet ja kasvaa merkittävästi korkeampi WHO laadut PCA näytteistä (Cuzick trendi testi p 0,0001). Kun BPH näytteet eivät kuulu, kasvu PCA näytteissä yksin on edelleen merkittävä (Cuzick trendi testi, p = 0,0498). B. kohortti 2, miR-96 ilmentyminen on huomattavasti suurempi PCA potilailla näytteiden luokittelua WHO III verrattuna potilaan näytteitä luokitusta WHO I ja WHO II yhteensä (t-testi, p = 0,0414). C. Lisääntynyt PSA-pitoisuudet korreloivat lisääntynyt miR-96 ekspressiotasot potilaan näytteitä kohortin 1 (p = 0,0002, Spearman r = 0,4528). D. Kaplan-Meierin käyrä selviytymisen suhteessa miR-96 ilmentyminen kohortissa 1. potilasryhmälle korkean miR-96 tasot (yhtenäinen viiva) on eloonjäämismediaani 3 vuoden ja ryhmä alhainen miR-96 tasot (pisteviiva) on eloonjäämismediaani 4,5 vuotta. Riskisuhde on 2.2. X-akselit näkyy kerran vuosiin ja Y-akselien näyttää prosentteina eloonjäämisen (Log rank (Mantel-Cox) testi p = 0,0389).

miR-96 ilmentyminen kudoksissa ja solulinjoissa

miR-96 ilmentyminen mitattiin kudosnäytteistä eri alkuperää ja kuudessa PCa solulinjoissa (22Rv1, LNCaP, VCAP, DU145, PNT2 ja PC3). Kun kudosnäytteet, korkea miR-96 ekspressiota havaittiin lisäkives, veren, lisämunuaiset ja eturauhasen. Tasot PCA solulinjoissa olivat korkeammat kuin normaalissa eturauhasessa, korkein ilmaisun PC3 ja pienin DU145 soluissa (kuva 2).

miR-96 ekspressiotasot ihmisen kudosnäytteistä (mustat palkit ) ja PCa solulinjat (raidallinen pylväät) mitattiin qRT-PCR ja normalisoitu geometrinen keskiarvo RNU48, RNU66, RNU24 ja RNU44. Korkein ekspressio nähtiin solulinjoissa ja eturauhasen (nuoli) oli korkea ekspressio verrattuna muihin kudoksiin.

miR-96 lisää solujen lukumäärä ja solujen kasvua PCa soluihin solujen lisääntymistä

Jatkoimme tutkia biologisen roolin miR-96 PCA soluissa

in vitro

. Ektooppinen ilmentyminen miR-96 eri eturauhassyövän solulinjoissa lisääntynyt solujen kasvua mitattuna SRB-määritys; in DU145-soluja (p = 0,0006), 22Rv1 solujen (p = 0,0061) ja PC3-solujen (p = 0,0211) (kuvio 3A, B ja C vastaavasti). On kuitenkin huomattava, että estämällä miR-96 kanssa miRCury LNA estäjien DU145, PC3 tai 22Rv1 ei aiheuttanut muutoksia solujen kasvua mitattuna SRB (tuloksia ei ole esitetty). Vaikutus miR-96 solujen kasvuun vastasi vaikutusta solujen lukumäärä DU145-solujen, mitattuna solussa laskenta. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-96 lisää merkittävästi solumäärät neljä (p = 0,0316) ja viisi (p = 0,0396) päivää transfektion jälkeen (kuvio 3D). Tämä on osoitettu johtuvan proliferaation lisääntymisen, kuten kohdun ilmaus miR-96 lisäsi merkittävästi BrdU on DU145 verrattuna negatiiviseen kontrolliin (p = 0,0091) (kuvio 3E). Emme havainneet merkittävää muutosta solut G1, G2 tai S-vaiheen solujen välillä transfektoitu miR-96 ja negatiivisen kontrollin.

ektooppinen ilmentyminen miR-96 nousu solujen kasvua PCA soluissa. A. DU145 solut (p = 0,0006). B. 22Rv1 solujen (p = 0,0061). C. PC3-solut (p = 0,0211). Kasvu mitattiin käyttämällä SRB-määritystä. D. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-96 lisääntyy solujen lukumäärän DU145 soluissa neljä (p = 0,0316) ja viisi (p = 0,0396) päivää transfektion jälkeen. E. leviämisen lisääntyy merkittävästi DU145 soluissa, kun yli-ilmentymisen miR-96 (p = 0,0091), mitattuna käyttäen BrdU ja 7-AAD virtaussytometrillä. Keskimääräinen edustaa pystyviiva ja virhepalkkeja osoittaa keskivirhettä. Tulokset analysoitiin käyttäen paritonta, kaksisuuntainen t-testi.

miR-96 yli-ilmentyminen vähentää FOXO1 mRNA ja proteiini tasoilla

Kuten on esitetty muissa syöpätyypeissä, että miR -96 voi säädellä FOXO1 tasoja ja FOXO1 on kuvattu proliferaation inhiboimiseksi tämä selittää proliferatiivinen fenotyypin miR-96. Siksi lähti vaikutuksen tutkimiseksi miR-96 FOXO1 PCA soluissa. Ensin tutkittiin endogeenisen FOXO1 tasot eturauhasen solulinjoissa. Korkein ilmentymä FOXO1 havaittiin 22Rv1 ja PC3 ja pienin DU145 soluissa (Kuva. 4A). Valitsimme 22Rv1, LNCaP ja DU145 mallijärjestelminä. Yli-ilmentävät miR-96 vähensi merkittävästi FOXO1 proteiinin tasot 22Rv1 solujen (p = 0,0065), LNCaP-solujen (p = 0,0030) ja DU145-soluja (p = 0,0082) (Fig. 4B). FOXO1 tasot ovat myös vähentynyt upon miR-96 yliekspressio VCAP soluissa (p = 0,0096), vaikka endogeeninen tasot FOXO1 ovat alhaiset tässä solutyypin (Fig. 4B). Koska pienentävä vaikutus miR-96 FOXO1 oli voimakkainta 22Rv1 soluissa, päätimme tutkia FOXO1 transkriptio tasolle tässä solulinjassa. Olemme havainneet, että miR-96 yliekspressio alensi merkittävästi FOXO1 mRNA-tasoja in 22Rv1 solujen (p = 0,0341) (Fig. 4C). Tämä ei kuitenkaan ollut yhtä jyrkkä kuin vaikutus proteiinien tasoja, mikä osoittaa, että miR-96 toimii sekä hajottamalla FOXO1 transkriptio ja estämällä proteiinin translaation. FOXO1 sisältää kaksi

in silico

ennusti sitoutumiskohdat miR-96 (Fig. 5A). Sen tutkimiseksi, onko miR-96 sitoutuu suoraan molempia näitä sivustoja, vaikutus estää kunkin kahden ennustetun sitoutumiskohdista analysoitiin käyttäen kohdepaikkaan salpaajat suunniteltu erityisesti kunkin sitoutumiskohdan (kuva S1) ja ko-transfektoitiin miR-96 jäljittelee in 22Rv1 soluissa. Anti-FOXO1 vasta-ainetta ja vertaamalla juovien voimakkuudet GAPDH, mitään merkittävää kasvua FOXO1 proteiinin taso havaittiin, kun ennustettu sitoutumiskohta 96,1 estettiin, (kuvio 5B). Kuitenkin proteiini-taso nousi merkittävästi, kun toisen sitoutumiskohdan, 96,2 estettiin, käyttäen 6-kertainen pitoisuus esto verrattuna miR-96 matkii (kuvio 5C). Tämä osoittaa, että vaikutus miR-96 oli riippuvainen pääsy toisen sivuston voi vähentää FOXO1 tasoa. Huomionarvoista on myös se, että kun molemmat tavoitteet sivustot salpaajia yhdistettiin vaikutus katosi. Sääntely FOXO1 Lukua tukevat ulkoisessa aineisto 110 PCa potilaista ja 28 ei-pahanlaatuinen hyvänlaatuista eturauhasen kudosnäytteitä [34], olivat miR-96 ilmentyminen kääntäen korreloi ilmentymistä FOXO1 eturauhasen syöpä kudosnäytteet (p = 0,0193 , Spearman, r = -2228), ja ei-pahanlaatuiset kudosnäytteistä (p = 0,0029, Spearman, r = -0,5424) erikseen, sekä silloin, kun kaikki näytteet yhdistetään (p = 0,0013, Spearman, r = -0,2717) (Kuva 6).

. Endogeeninen FOXO1 mRNA-tasot PCA solulinjoissa. mRNA-tasot mitattiin qRT-PCR: llä ja normalisoitiin keskiarvo GAPDH ja PGK1. B. FOXO1 proteiini-arvot ovat selvästi vähentyneet 22Rv1 soluissa (p = 0,0065), LNCaP (p = 0,0030), DU145 solut (p = 0,0082) ja VCAP solut (p = 0,0096), kun miR-96 yli-ilmentymisen. Näytteet osoittavat biologisia kolmena rinnakkaisena ja FOXO1 proteiinin tasot normalisoitiin GAPDH-proteiinin tasot. C. FOXO1 mRNA-tasot ovat merkittävästi vähentyneet 22Rv1 soluissa jälkeen yli-ilmentymisen miR-96 (p = 0,0341). Mitattuna qRT-PCR: llä ja normalisoitiin keskiarvo GAPDH ja PGK1. Virhe palkit osoittavat keskivirhettä.

. On olemassa kahden ennustetun miR-96 sitoutumiskohdat on FOXO1 3’UTR-sekvenssi. Siementen alue kypsän miR-96 ja ennustettu sitoutumiskohdat 3’UTR järjestyksessä on alleviivattu ja lihavoitu. Sijainnit sitoutumiskohdat ovat mukaan Targetscan, (Release 6.2, kesäkuu 2012). B. 22Rv1 solut kotransfektoitiin kolmena rinnakkaisena miR-96 matkivat ja kohdepaikkaan eston sitoutumiskohtaan 96,1 kolmessa pitoisuuksina. FOXO1 proteiinin taso ei lisäänny, kun sitomiskohta 96,1 estettiin. C. Esto sitoutumiskohdan 96,2 6x pitoisuus kohdesivustoa esto verrattuna miR-96 matkivat johti merkittävään lisäystä FOXO1 proteiinin taso (p = 0,0118). FOXO1 proteiinin tasot normalisoitiin GAPDH. Virhe palkit osoittavat keskivirhettä.

FOXO1 mRNA-tasot korreloivat käänteisesti Mir-96 ekspressiotasot ulkoisessa aineisto [34]. Aineisto sisältää 110 PCa kudosnäytteitä ja 28 ei-pahanlaatuinen hyvänlaatuista eturauhasen kudosnäytteitä (GEO tulonumero GSE21036) (p = 0,0013; Spearman r = -0,2717).

vaikutus miR-96 solujen kasvua välittyy FOXO1

vieressä lähtivät tutkimaan jos FOXO1 on pääkohde välittää kasvua edistävää miR-96 fenotyyppi eturauhasen soluissa. Mielenkiintoista on, estämällä toisen miR-96 sitoutumiskohta (96,2) on FOXO1 3 ’UTR-sekvenssin kanssa kohdepaikan esto, miR-96 ei voi enää parantaa kasvua DU145-solujen mitattuna SRB-määrityksellä (kuvio 7). Tämä vahvistaa oletusta, että vaikutus miR-96 solun kasvuun edistetään yksinomaan FOXO1. Esto ensimmäinen miR-96 sitoutumiskohta ei laskenut kasvua merkittävästi, mikä vahvistaa entisestään havainto, että miR-96 käyttää toista miR-96 sitoutumiskohta estävän FOXO1.

miR-96 parantaa kasvua DU145 soluissa merkittävästi (p = 0,0005). Estää toisen miR-96 sitoutumiskohta (96,2) on FOXO1 3’UTR-sekvenssin, jossa on kohdepaikan esto poistaa kokonaan vaikutus miR-96 solun kasvuun (p = 0,002). Estää ensimmäisen miR-96 sitoutumiskohta (96,1) ei inhiboida miR-96 solun kasvuun. Solukasvu mitattiin käyttämällä SRB-määritystä. Keskimääräinen edustaa pystyviiva ja virhepalkkeja osoittaa keskivirhettä.

Keskustelu

Korkea miR-96 on havaittu eturauhassyöpä [5,7, 11] ja useat tutkimukset osoittavat, että on tärkeää miR-96 eturauhassyövässä etenemiseen. Tässä tutkimuksessa, osoitamme, että lisääntynyt miR-96 ilmentyminen assosioituu etenemistä sopimusta, sillä miR-96 ilmentyminen kasvaa lisääntynyt WHO arvosana kohortti 1. Tämä ei näy kohortin 2, joka on tasaisempi kohortin radikaalit muodostavat of 63% WHOII. Lisäksi yleinen selviytyminen on huomattavasti lyhyempi potilailla, joilla on korkein miR-96 tasolla. Tämä on myös esitetty miR-96 ilmentyminen keuhkosyövässä potilaan kasvaimen ja seeruminäytteet. MIR-96 ekspressiotaso korreloi huonon jälkeisen selviytymisen [35].

In vitro

, huomaamme, että yli-ilmentyminen miR-96 PCA solulinjoissa johtaa lisääntyneeseen ja kasvua entisestään vahvistaa osallistumista miR-96 PCA etenemistä. Harvat tavoitteita miR-96 on tunnistettu, jotka selittävät vaikutus miR-96 PCa soluissa. Endometriumin [16], rintojen [17] ja maksasolusyövän [18], miR-96: n on osoitettu kohdistaa tuumorisuppressorigeenin FOXO1. FOXO1 on raportoitu laski PCa [24,25] ja inhibition miR-96 voi vaikuttaa tähän. Täällä tunnistamme FOXO1 tavoitteeksi asetettiin miR-96 neljässä eri PCa solulinjoissa sekä korkeat endogeenisten FOXO1 tasot (22Rv1) sekä alhaisen endogeenisen tasoilla (VCAP), mikä osoittaa, että miR-96 on voimakas estäjä FOXO1 proteiinin tuotantoa. Tuloksemme osoittavat, että asetus tapahtuu sekä transkription ja translaation tasolla, kuten mRNA: ta ja vielä enemmän proteiinia taso vaikutti. Että tärkein asetuksen tapahtuvat translaation tasolla voisi olla yksi selitys siihen, että ekspressiotasot miR-96 ja FOXO1 mRNA eturauhasen solulinjoissa korreloivat positiivisesti, jossa alhaisimpia DU145 ja korkein ilme molemmille löytyy PC3-soluja. Hypoteettisesti suuntaus vastaa määrää miR-96 tarvitaan jokaisessa solutyypissä säilyttääkseen alhaisen FOXO1 proteiinin tasot. miR-96 on osoitettu vähentävän mRNA-tasolla ja FOXO1 merkittävästi maksasolukarsinoomassa soluissa ja vähentää proteiinin tasot hieman [18]. Täällä näytämme PCA solulinjassa 22Rv1, että miR-96 sitoutuu vain toiseen kahdesta ennustetun sitoutumiskohta (96,2) 3 ’UTR: FOXO1. Sen sijaan miR-96 sääntelyn rintasyöpäsoluissa osoitettiin olevan riippuvainen pääsy sekä sitoutumiskohtiin [17].