Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tässä artikkelissa, me suunniteltu kvantitatiivisen mallin biologisia kalvoja mukaan laskeuman Planar lipidimembraaneihin vankkaan alustoille (kutsutaan tuettu kalvoja), ja immobilisoitua biotinyloitua oligomeerien hyaluronihappoa (oligo-HA, 6-8 disakkaridiyksiköt pituus), jolloin kalvon pinta kautta neutravidiini silloittajia. Ohjaamalla koottavien biotinyloitua lipidin ankkurit, keskimääräinen etäisyys oligo-HA-molekyylejä kalvon voitaisiin ohjata nm tarkkuudella. Tarttumista ja motiliteetti haiman adenokarsinooma soluissa, jotka ilmentävät eri silmukoitumisvarianttia HA-sitovan solun pinnan reseptoriin CD44 seuraavilla pinnoilla tutkittiin kvantitatiivisesti. Yhdistelmä merkkivapaalla, nopeutus kuvantaminen elävien solujen ja tilastollinen analyysi viittaa siihen, että staattinen morfologia (globaali muoto ja solun tukirangan remontin) soluja, niiden stokastinen morfologiset dynamiikkaa, ja todennäköisyys suunnatun liikkeen heijastavat metastaattisen käyttäytymistä syöpä soluja.

Citation: Kaindl T, Rieger H, Kaschel LM, Engel U, Schmaus A, Sleeman J, et al. (2012) ajallisesti ja kuviot haimasyövän soluja, jotka ilmentävät CD44-isoformien tuettujen Kalvot näyttäminen Hyaluronic Acid oligomeerien Arrays. PLoS ONE 7 (8): e42991. doi: 10,1371 /journal.pone.0042991

Editor: David Holowka, Cornell University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 7. 2012 Hyväksytty: 17 heinäkuu 2012; Julkaistu: 14 elokuu 2012

Copyright: © Kaindl et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Helmholtz Association puitteissa ”biorajapinta” ohjelma. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

viime vuosina, CD44 on tullut tärkeä välittäjä ja soluväliaineen vuorovaikutuksia, joka yhdistää signalointi aktiivisuutta kasvutekijän reseptorien kautta co-reseptorin toiminnan [1]. Expression of CD44-geenin aiheuttaa perheen transmembraani- glykoproteiineja, joiden molekyylipaino on erittäin heterogeeninen (MW 80-200 kDa), koska vaihtelevan N- ja O-kytketty glykosylaatio ja vaihtoehtoisen silmukoinnin [2], [3], [4] . Erityisesti, lisäämällä jopa 10 variantti eksonit aikana vaihtoehtoisen silmukoinnin CD44 transkriptin tuo laaja vaihtelu ekstrasellulaariseen kalvoon proksimaalinen proteiinin alueelle, [5], [6], [7]. Nämä variantti eksoni sisältävät isoformit kutsutaan CD44v, toisin CD44s, joka ei sisällä näitä variantti eksonit.

vuorovaikutusta CD44 kanssa soluväliaineen glykosaminoglykaani hyaluronaania (HA) on kaikkein tutkittu intensiivisesti vuorovaikutuksen CD44 proteiini [8]. Tämä vuorovaikutus säännellään useilla tasoilla, mukaan lukien glykosylaatio [4] ja klusterointi CD44, jota edistetään sisällyttämällä variantin eksoni-koodatut sekvenssit [9]. HA syntetisoituu suurimolekyylipainoinen polymeeri, joka koostuu vuorotellen alayksikön N-asetyyliglukosamiinin ja glukuronihapon [10]. Kasvaimen kasvun aikana, ja tulehdus, hajoamista HA voidaan parantaa, jolloin kertyminen pieniä HA oligosakkarideja, jotka aiheuttavat biologisia aktiivisuuksia ei näytteillä korkean molekyylipainon HA [11]. Kaksi HA sidosmotiivia solunulkoisen osan CD44-proteiinin välittävät sen vuorovaikutusta HA [12]. CD44 sitoutuu vähintään HA hexasaccharide [13], ja signalointi kautta CD44 voidaan säädellä koko HA [1].

HA ja CD44 ovat molemmat sekaantuneet säätelyyn kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden [4], [14], [15]. Kertymistä HA liittyy huono prognoosi potilaalle ja on esitetty lisäävän kasvainten leviämisen, invaasio ja angiogeneesi muun muassa [8]. Lisäksi ilmaus eri isomuotoja CD44 on liittynyt huonoon ennusteeseen useilla eri kasvaintyypeille [14], ja tutkimukset eläinmalleissa ovat osoittaneet varten toiminnallista roolia CD44 isomuotojen etäpesäkkeitä [16]. Tärkeää on, että vuorovaikutusta CD44 ja HA on liittynyt kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden [17], [18]. Kuitenkin ristiriitaisia ​​tietoja myös olemassa. Joissakin yhteyksissä kertymistä HA pienenee kasvainten muodostumiseen [19], [20], [21], [22], kun taas ilmaisun hyaluronidaaseista, entsyymejä, jotka hajottavat HA, voi korreloi kasvaimen etenemistä [23]. Samoin ilmaus joidenkin isomuotojen CD44 erityisesti syöpätyyppien voi korreloi hyvän ennusteen [15], ja tukahduttaa etäpesäke eläinmalleissa [24]. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että ymmärrettäisiin paremmin CD44 vuorovaikutuksessa HA on selittää merkitystä näiden monimutkainen kasvaimen etenemiseen ja etäpesäkkeitä, mikä puolestaan ​​tunnistaa uusia reittejä terapeuttiseen interventioon.

Rotan haiman kohdunkaulan malli BSp73 [25] on hyödyllinen malli analysoimiseksi sekä etäpesäkkeiden edistävää toimintoja CD44 sekä vuorovaikutus CD44 ja HA. BSp73AS solulinja (kutsutaan 1AS seuraavassa tekstissä) on heikosti metastaattinen, ilmaisee CD44s mutta vain hyvin pieni endogeenisten tasojen CD44 variantteja, ja sitoutuu heikosti immobilisoituun HA [26]. Transfektio näiden solujen CD44v4-V7, silmukointivarianttia löytyy erittäin metastaattinen soluissa tuotettu solulinja ASpSV14 joka on erittäin metastaattinen rottamalleissa [16]. Ekspression CD44v4-V7 proteiini edistää myös sitoutumisen ASpSV14 solujen HA säänneltyjen ryhmittely CD44v4-V7-proteiinia [9]. R44L pistemutaatio N-terminaalinen HA sitova motiivi on CD44v4-V7-proteiini tekee proteiinin kyennyt sitoutumaan HA, kun taas K162A, R166A kaksinkertainen pistemutaatio muissa HA sitova motiivi CD44v4-V7 johtaa alennettuun HA sitomiskyky verrattuna villityypin CD44v4-v7-proteiinia [26]. Niinpä 1AS solut ektooppisesti ilmentävät R44L CD44v4-V7 proteiini (AS-R44-solut) eivät sitoudu HA, kun taas 1AS solut ektooppisesti ilmentävät K162A, R166A CD44v4-V7 proteiini (AS-K162R166 solut) osoittavat vähennetään sitoutuminen HA verrattuna ASpSV14 soluihin [26].

Käyttämällä näitä neljää solulinjat, suunnittelimme kokeita tutkia vuorovaikutusta CD44 kanssa juuri tilallisesti tilata HA määritelty pituus (6-8 disakkaridiyksiköistä). Tarkemmin sanottuna tarttuvuus ja motiliteettia rotan haiman syöpäsoluja ilmaista erilaisia ​​CD44 isoformeja tutkittiin määritellyillä sivusuunnassa tiheydet HA. Sen sijaan, että ei-spesifinen physisorption tai kovalenttisen oksastuksen oligo-HA-molekyylien muovipinnoille, me ankkuroitu biotinyloitu oligo-HA-molekyylien kautta neutravidiini silloittajia pinnalle tasomaisen lipidimembraaneihin (niin kutsuttu ”tuettu kalvoja” [27], [ ,,,0],28]), joka sisälsi biotinyloitu lipidien ankkureita. Tämän ansiosta ei-spesifinen adheesio solujen avulla pitkän kantaman Van der Waalsin vetovoima on minimoitava, ja keskimääräinen etäisyys ankkuroitu HA molekyylien muodosta voidaan säädellä kuluessa nm tarkkuus [29]. Käyttämällä yhdistelmää Aikaintervallitallennuksen kuvantaminen solujen merkkivapaalla mikro-interferometria (RICM) [30], [31] ja tilastollinen analyysi [32], voisimme kvantitatiivisesti arvioida vahvuus soluadheesiota, stokastinen dynamiikka solun morfologia, ja pysyvyys ja nopeus solun liikkuvuus.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

1,2-dioleoyyli-sn-glysero-3-fosfokoliinia (DOPC) ja 1 , 2-dioleyyli-sn-glysero-fosfo-etanoliamiini-3-N- (cap biotinyyli) (biotiini-DOPE) hankittiin Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA), ja deglykosyloituneet neutravidiini Invitrogen (Karlsruhe, Saksa) . Pitkälle punainen fluoresoiva DNA väriainetta DRAQ5 peräisin biostatus rajallinen (Leicestershire, UK) käytettiin värjäämään solutumien, ja Alexa Fluor 488 phalloidin (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa) käytettiin visualisointiin aktiinisytoskeletonin. Tarttuvuus määritykset suoritettiin pohjaton muovi nestevirtauskomponenttien kanavia (μ-dia I) ibidi (München, Saksa) sinetöity mikroskooppisen luokan 25 x 75 mm

2 lasia diat Menzel (Braunschweig, Saksa). Kaikki muut kemikaalit on P.A. laatu ostettiin Sigma-Aldrich (Ulm, Saksa), ellei toisin ilmoiteta. Koko tämän tutkimuksen, de-ionisoitua ultrapuhdasta vettä (Genpure, TKA Niederelbern, Saksa) käytettiin valmistamiseksi kaikkien puskuriliuoksia.

Micro-interferometria kuvia 1AS solujen tuettu kalvoja näytetään (A) poly-HA: n ja (B) oligo-HA keskimäärin etäisyydeltä

d

~ 5,5 nm

t

= 2 h. Mitta-asteikko: 8 um.

osa 1AS solut kiin- ilmoitettu tuettuja kalvoja graafisesti ajan funktiona. Kolme kalvot tutkittiin olivat puhtaita DOPC kalvoja (musta viiva), ja kalvot näytetään oligo-HA osoitteessa

d

~ 11 nm (vihreä viiva) ja

d

~ 5,5 nm (sininen viiva).

HA Näytteiden esikäsittely

Hyaluronihappo polymeeri (poly-HA) ostettiin Sigma-Aldrich (Ulm, Saksa). Hyaluronihappo oligomeeriä (oligo- HA, GE Healthcare, Heidelberg, Saksa) valmistettiin entsymaattisen hajoamisen naudan kiveksen hyaluronidaasilla [33] ja fraktioinnin ÄKTA purifier (GE Healthcare, Heidelberg, Saksa) saadakseen oligomeerien 6-8 disakkaridiyksiköistä pituudessa. Immobilisaatiota kalvon pintaan nähden, sekä poly- ja oligo-on muutettu kytkemällä (+) – biotiinihydratsidiin (Sigma-Aldrich, Neu-Ulm, Saksa) [34], [35].

HA pinnankäsittely

ennen liimausta lasisubstraatin puhdistettiin käyttämällä modifioitua RCA-protokollaa [36]. Erityisesti substraatit sonikoitiin 5 min asetonissa, etanolissa, metanolissa, ja vedellä, sitten upotettiin liuokseen, jossa oli H

2O

2 (30%) /NH

4OH (30%) /H

2O (01:01: 5 tilavuuden mukaan), ja sitä sonikoitiin 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, ennen kuin liottamalla vielä 30 min 60 ° C: ssa. Sen jälkeen, ne on intensiivisesti huuhdeltiin vedellä, kuivattiin 70 ° C: ssa, ja varastoidaan tyhjiöön. Lipid seoksia eri moolisuhteissa biotiini-DOPE ensin alttiiksi typpivirtauksessa, ja sitten pidetään tyhjökammiossa 25 ° C: ssa 12 h. Sen jälkeen keskeyttämisestä kuiva lipidikalvot deionisoidussa vedessä, pieni unilamellaarivesikkeleitä (SUV) valmistettiin sonikoimalla jonka kärki sonikaattoria (Misonix, New York, USA) 30 minuutin ajan 1,0 W. Tuetut kalvot valmistettiin laskeuman SUV suspensioiden puhdistetuilta alustoille. 20 minuutin kuluttua inkuboinnin kammiot tiiviisti huuhdeltiin deionisoidulla vedellä poistamaan jäljellä rakkulat. Keskimääräinen etäisyys lipidejä ankkureita (biotiini-DOPE) ja siten etäisyyttä HA molekyylit voidaan arvioida mooliosuus biotiini-DOPE χ

b-DOPE ja alaa lipidien (

lipidejä ~ 60 Å

2 [37]), kuten. Seuraavassa vaiheessa, kalvo inkuboitiin neutravidiini-liuosta (1 ug /ml, ja deionisoitua vettä) 20 min. Jälkeen intensiivisen huuhtelun, vesiliuosta biotinyloitua HA: n (0,4 mg /ml) injektoitiin kuhunkin kammioon lasilevyille ja inkuboitiin 20 min. Lopuksi näytteet pestiin esilämmitettyä soluviljelyalustaan ​​ja pidettiin 37 ° C: ssa ennen tarttumista kokeissa.

RICM kuvia (vasemmalla) ja konfokaali- fluoresenssikuvia (keskellä ja oikealla) ( A) 1AS soluja (B) AS-K162R166 soluja (C) ASpSV14 soluja, ja (d) AS-R44 soluja inkuboitiin tuettu kalvoja näytetään oligo-HA osoitteessa

d

~ 5,5 nm: ssa 4 tuntia. Kiinnityksen jälkeen DNA ja aktiini värjättiin DAPI ja Alexa 488 phalloidin.

Cell Adhesion Kokeet

1AS, ASpSV14, AS-R44 ja AS-K162R166 soluja viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [26], [38]. Solut kerättiin trypsination ja myöhemmin uudelleen suspendoitiin esilämmitetyssä RPMI 1640 tiheydeksi 1,75 x 10

7 solua /ml. 0,2 ml: n annos solususpensiota injektoitiin kuhunkin kammioon lasilevyille ja pidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Noninvasiivinen solujen kuvaamiseen suoritettiin käyttäen heijastus häiriöitä kontrasti mikroskopia (RICM) kantaa Axiovert 200 käännettyä mikroskooppia (Carl Zeiss, Göttingen, Saksa) varustettu PlanNeofluar 63 x /1,25 Antiflex öljy-immersio-objektiivi. Laskea alueen solu-kalvokontaktikohdan, kuvat ovat tallentuneet kanssa Orca ER CCD-kamera (Hamamatsu Photonics, Herrsching, Saksa). Sen jälkeen, kun on vähennetty taustan, että kuvat ovat binarized määrittämiseksi reunaan liimavyöhyke. Osa liittynyt solujen määritettiin normalisoimalla solut noudatettava RICM (liimattu solut) kokonaan soluja vastaavassa vaiheessa kontrastia kuvia. Solut ajasta riippuva tietojen hankinta inkuboitiin myös RPMI 1640 solun elatusaineessa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Kuvat otettiin kiinteässä asennossa aikajakson 10 min ja 15 min 20 h. Louhinnan jälkeen solu- ääriviivan kustakin binary kuvan, painopisteen uutettiin ja käytettiin dokumentointia solun tilavuus ja ääriviiva analyysi. Molemmat arvot, tartunta-alueella

ja solu- ääriviivan pituus

L

, käytettiin laskennassa dimensioton kiertomuuttoa. Elongaatiotekijä edelleen pääteltiin suhde kohtisuoraan pieniä suuria akseleita, ja siten johtaa myös dimensioton välillä 1 ja 0.

(A) snap laukaus ASpSV14 solun oligo-HA -functionalized kalvo (

d

~ 5,5 nm,

t

= 9 h) vangiksi RICM. Kehäreunan solun määritettiin kontrasti pikseli-intensiteetin. (B) amplitudi vaihtelun amplitudi funktiona on

θ

. on keskimääräinen radiaalinen etäisyys yli

θ

= 0-360 °. (C) amplitudi kartta funktiona kulman

θ

ajan (

t

= 140-1000 min). (D) Autokorrelaatiofunktio vastaava amplitudi karttaa paneelissa (C).

Tulokset

tarttuminen 1AS on poly- ja Oligo-HA lieassa Tuetut Kalvot

Jos haluat vertailla HA sitova ominaisuudet 1AS solujen ja niiden johdannaiset, ensin tarkasteltiin kykyä 1AS noudattaa HA lieassa tuettuja kalvoja. Kuvassa 1 esitetään edustavat RICM kuvat 1AS solujen sitovia 2 h poly-HA ja oligo-HA kytkettyinä keskimäärin molekyylien välistä etäisyyttä

d

~ 5,5 nm. Tässä tutkimuksessa keskimääräinen molekyylien välinen etäisyys

d

voidaan ohjata molaarinen konsentraatio vapaasti diffuuseissa ankkurointia molekyylien tuettu kalvo. Kuten esitetty kuviossa 1, 1AS solut osoittivat lausutaan levittää molemmille pinnoille. Keskimääräinen ennustettu alueilla noudatetaan solujen kalvoilla funktionalisoitu poly-HA ja oligo-HA laskettu kuviosta 2A ja kuvio 2B olivat vertailukelpoisia,

poly = 480 um

2 ja

oligo = 560 um

2, vastaavasti. Kontrollikokeissa 1AS solut osoittivat lähes mitään merkkiä tarttuvuus puhdasta DOPC kalvoja (kuvio 1 C), mikä vahvistaa spesifisyys tarttuvuus HA pinnoille.

edustaja amplitudi kartat (A) 1AS ja (B) ASpSV14 solut piirretään funktiona

θ

aikana kirjattu alkuvaiheessa soluadheesiota (

t

= 0-200 min). Vastaava autokorrelaatiofunktiot ja 1AS ja ASpSV14 on esitetty paneeli (C) ja (D), tässä järjestyksessä.

analyysi tartunta-alueen, venymä ja pyöreyden laskettu yhdeksän soluja (taulukko 1) ehdottaa, että 1AS solut leviävät isotrooppinen molemmin poly-HA ja oligo-HA pintoja. Itse alueilla tarttuu tiukasti tunnistetaan alhainen pixel intensiteettiä (tyypillisesti erotusetäisyyttä alle 10 nm [39]) löydettiin lähellä solun reuna. Yhteenvetona toteamme, että oligo-HA sekä poly-HA voi toimia ligandeja varten 1AS soluja. Kuten havaitaan eroa sitoutumisen 1AS solujen poly-HA ja oligo-HA pintoja, että myöhemmissä kokeissa käytimme yksinomaan oligo-HA kokojakauma on kapea (6-8 disakkaridi toistuvaa yksikköä).

(A) Amplitudi kartta edustavien 1AS ja (B) ASpSV14 solujen piirrettävä funktiona

θ

kirjattu jälkeen vakaiden tarttuvuuden (

t

= 600-1000 min). Vastaava autokorrelaatio 1AS ja ASpSV14 solut on esitetty paneeli (C) ja (D), tässä järjestyksessä. Kolme RICM raaka kuvat on esitetty (E) 1AS ja (F) ASpSV14 solut eri aikapisteissä. Mittaviivat: 10 pm.

aste solun muodonmuutoksen vain yhdestä tyypillisestä 1AS cell (musta viiva) ja ASpSV14 solu (sininen viiva) suhteen suuntaan solun liikkuvuus.

Seuraavaksi tutkittiin, kuinka väli kytkettynä HA oligosakkaridien vaikuttaa sitoutuminen 1AS solujen näille pinnoille. Osuus 1AS solujen kiinni oligo-HA tukee kalvoja eri keskiarvon välinen etäisyys oligo-HA-molekyylien arvioitiin ajan funktiona. Silmiinpistävän, vain pieni muutos

d

5,5 nm 11 nm johti merkittävä ero sekä kinetiikkaa ja tehokkuutta soluadheesiota (kuvio 2). At

d

~ 11 nm, 1AS soluja tarvitaan 90-120 min päästä saturaatiorajat kitka- (40-50%), kun taas

d

~ 5.5 nm samalle solujen ainoa 30-60 min vaadittiin saavuttaa huomattavasti korkeampi kylläisyys taso tarttuvuus ( 80%). Nämä tulokset viittaavat siihen, että spesifinen adheesio on 1AS solujen oligo-HA on erittäin herkkä spatiaalisen esittely oligo-HA-molekyylien tuettu kalvojen tasolla nm yksityiskohdat.

Seuraavaksi tarkastellaan kykyä 1AS solujen ilmaista erilaisia ​​CD44 isoformit sitoutumaan oligo-HA lieassa tuettu kalvoille

d

~ 5,5 nm: ssa 4 tuntia. Näissä olosuhteissa, RICM ja konfokaali- fluoresenssi- kuvat saatiin 1AS soluja, AS-K162R166 solut, ASpsV14 soluja, ja AS-R44-soluja (kuvio 3). Samanaikaisesti olemme suorittaa ohjaus kokeissa kaikki neljä solutyypeissä tutkia kiinnittymisen puhdasta DOPC kalvoja, ja vahvisti, että ei-spesifinen adheesio on mitättömän pieni (alle 10%) kaikkien solutyyppien (tietoja ei esitetty). Ennen kuvantamisen, solut kiinnitettiin ja aktiinin ja DNA värjättiin Alexa 488 phalloidin ja DRAQ5, vastaavasti. Kunkin solulinjan, välillä 30-90 solut analysoitiin, ja vähintään viisi solut valittiin konfokaalimikroskopialla. Edustavia esimerkkejä on esitetty kuviossa 3. 1AS soluja ryhtyä viisikulmainen tai heptagonal muoto, ja niillä isotrooppisemman leviää kuin AS-K162R166 ja ASpsV14 soluja (kuvio 3A). Sen sijaan, AS-R44-solut pysyivät lähes pallomainen (kuvio 3D), ja RICM kuva ei havaittu merkkejä merkittävää tarttumista näiden solujen kalvon (kuvio 3D, vasen palsta).

läsnäolo tiheä meshwork reuna-aktiini ja muodostumista stressin kuitujen havaittiin vanhempien 1AS solut on liittynyt soluja, jotka eivät ole liikuteltavia [40]. Toisaalta, AS-K162R166 soluissa (kuvio 3B) ja ASpSV14 soluja (kuvio 3C) soluissa näkyy ominaispiirteet hyvin liikkuvia, vaeltavien solujen, kuten tiheä lamellipodial aktiini on levittää edessä (osoitettu nuolilla), ja stressi kuituja pitkin pääakselia soluihin. On huomattava, että alalla tartunta on vertailukelpoisia 1AS, AS-K162R166 ja ASpSV14 soluja, vaikka merkittäviä eroja solujen morfologia välillä 1AS solujen ja niiden CD44v4-V7-ilmentävät AS-K162R166 ja ASpSV14 johdannaisia ​​(kuvio S1).

morfologinen dynamiikka 1AS ja ASpSV14 Cells

Korosta aikakehitystä solumorfologian vastauksena oligo-HA pinnat, ensin uutetaan kehäreunan solujen nopeutus RICM kuvia. Yhteensä viisi 1AS ja seitsemän ASpSV14 solut analysoitiin tällä tavalla. Kuvio 4A esittää edustava esimerkki ASpSV14 solun tuettuun kalvo funktionalisoitu oligo-HA (

d

~ 5,5 nm,

t

= 9 h). Sen jälkeen, kun määrittely kehäreunan solun käyttäen kontrasti pikseliarvot, säteittäinen etäisyys

r

reunan välisen solun (keltainen viiva) ja massakeskipisteen piirrettiin napakoordinaatti- (

r

,

θ

), kuten kuvassa 4B. Täällä,

θ

= 0 määritetään pystysuunnassa laboratoriossa järjestelmässä. Tämän ansiosta voimme seurata suuntaan solun liikkeen ja tunnistaa morfologiset anisotrooppisuudesta solun tietyllä ajan hetkellä

t

. Amplitudi muodon vaihtelun määritellään, missä on keskimääräinen radiaalinen etäisyys yli

θ

= 0-360 °. Piirtämällä merkitty värikoodilla funktiona kulman

θ

ajan

t

(kuvio 4C), dynaaminen morfologisia muutoksia kohdesolussa voidaan kuvata. Lisäksi ajallisesti ja kuviot taakse stokastisen melu morfologisten dynamiikkaa voidaan uuttaa analysoimalla niiden korrelaatiofunktiokin [32]. Autokorrelaatiofunktio amplitudin kartta voidaan laskea: (10) B-

Kuten kuviossa 4D, autokorrelaatiofunktio lasketaan amplitudi kartta (kuvio 4C), viittaa siihen, että solu on lineaarisesti venyttää jopa Δ

t

~ ± 200 min, sopimukset pyöreä ääriviivan klo Δ

t

~ ± 300 min, ja sen jälkeen on lineaarisesti venytetään kohtisuorassa suunnassa jälkeen Δ

t

~ ± 400 min, joka voidaan tunnistaa siirtymä huippukohdat by ~ 90 °.

Kuviot 5A ja 5B ovat amplitudi karttoja edustavien 1AS ja ASpSV14 solujen funktiona on

θ

ja

t

aikana aikaisemmassa vaiheessa tarttuvuuden (

t

= 0-200 min) oligo-HA-funktionalisoitu kalvoilla

d

~ 5,5 nm. Kuten kuviossa on esitetty, molemmat solut osoittavat hyvin vähän poikkeamaa keskiarvosta säteen suunnassa keskustasta massa. Vastaavat autokorrelaatiot ja (C) 1AS ja (D) ASpSV14 osoittavat myös ominainen piirre, mikä viittaa siihen, että sekä metastaattisen ei-metastaattinen solut leviävät isotrooppinen, kun ne ovat aluksi kontaktissa oligo-HA-funktionalisoidun kalvoja. Tämä kokeellinen havainto on yhdenmukainen aiempien raporttien alkuperäisestä leviämisen kondrosyyttien [41] ja fibroblastit [42].

Toisaalta, selkeä siirtyminen dynaaminen solujen morfologia havaittiin jälkeen syöpäsoluja vakaa tarttuvuus. Siirtyminen havaittiin noin

t

= 300 min sekä metastaattisen ASpSV14 ja huonosti metastaattisen 1AS soluja. Siirtymävaiheen jälkeen solut osoittivat selviä eroja amplitudien ja autokorrelaatioita. 1AS solut osoittivat yli 3 eri maksimit vertailukelpoisia amplitudit noin 20 um t = 750 min (kuvio 6A), mikä tarkoittaa, että kiinnittyneen solun kehittynyt kuusikulmion muotoinen. Kuten kuviossa 6A ja 6E osoittaa, että on hyvin vaikeaa erottaa ominaisuus kuvioita vain raaka-amplitudi karttoja, koska morfologiset dynamiikka biologiset solut ovat hyvin stokastisia. Luonnostaan ​​stokastinen melu dynaamisten järjestelmien voittaa laskemalla autokorrelaatiofunktio (yhtälö 1). Kuten kuviossa 6C, kolme vakaa ja voimakas autokorrelaatiohuiput Pyörähdyssymmetrinen klo Δ

θ

max = -120 °, 0 °, ja 120 ° tunnistettiin. Ajallinen autokorrelaation voimakkuuden nopeasti rapistunut varten At ≠ 0 min, mikä viittaa siihen, että 1AS solu pyörii muuttamatta muotoaan.

Sen sijaan, amplitudi kartta metastaattisen ASpSV14 soluista osoitti kaksi lausutaan maksimia jopa

R

max ~ 11 um (kuvio 6B). Vastaava autocorrelation koostuu kahdesta positiivista korrelaatiota erottaa ~ 180 ° (Δ

θ

max = 0 ° ja ± 180 °), jotka ovat stabiileja pitkiä Δ

t

(kuvio 6D ). Tämä osoittaa, että solu on lineaarisesti venyttää ja siirtää yli 2 h samaan suuntaan. RICM kuvia ASpSV14 solujen Liikkumaton kuva paikoissa (kuvio 6F) kuvaavat liikettä ja venymä solun ennen muuta sen suunta. Tämä havainto on ristiriidassa isotrooppisen leviämistä havaittiin aikaisemmin pistettä (kuvio 5C ja 5D).

Motility of Cancer soluja, jotka ilmentävät CD44s ja CD44v4-V7

Seuraavassa vaiheessa, olemme tutkineet motiliteettia ASpSV14 ja 1AS solujen seuraamalla siirtymä massakeskipisteen, määritetään ennustettu alue pito. Tässä, keskimääräinen nopeus solun määriteltiin siirtymä solun

dx

testatuista ajan välein

dt

= 30 min yhdeksän ASpSV14 solujen ja neljä 1AS soluja. Keskimääräinen nopeus pysyi lähes vakiona sekä solutyypeissä yli 20 h. Keskimääräinen nopeus ASpSV14 soluja,

v

psV14 = 5 ± 0,2 um /h, oli vain hieman suurempi kuin 1AS soluja,

v

1AS = 4 ± 0,2 um /h, missä virheet ovat keskihajonnan keskiarvoista.

päätellä suhdetta suuntaan liikkuvuuden ja elimellisen muutoksen, myös laskettu todennäköisyys kertymäfunktio asteen solun muodonmuutosta ja suunta solun liikkuvuus: (14) B-

Huomaa, että

θ

= 0 on määritelty suuntaan solun liikkuvuus. Nopeudesta ja deformational muutos syöpäsolujen arvioitiin kuusi 1AS ja neljä ASpSV14 soluja. Kuten esitetään kuviossa 7, on selvä merkki tauon symmetria varten vain yhdestä tyypillisestä ASpSV14 solu voidaan tunnistaa erillisenä osa-huippu, joka poikkeaa keskustasta 8 um suuntaan solun liikkuvuus. Tämä on toisin kuin 1AS soluja, joilla on huippu lähellä keskustaa, joka vastaa satunnaisesti, isotrooppisen liikettä. Sekä solulinjoja, histogrammi laskettiin yli 55 solun ääriviivat.

Keskustelu

Vaikka vuorovaikutus CD44 HA on selvästi tärkeämpää syövän [4] rooli näiden molekyylien kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden tarvitsee lisätutkimuksia ymmärrettävä joskus ristiriitaisia ​​tuloksia luonteesta tämän vuorovaikutuksen. Erityisesti analyysi käyttäen määritelty väli HA homogeenisen koko on puuttunut tähän mennessä. Tässä on käytetty HA lieassa tuettuja kalvoja tutkimaan biofysikaalisten parametrien liittyy soluun sitoutumisen HA. Olemme havainneet, että vaikka CD44s ilmentäviä 1AS solujen sidottu yhtä hyvin poly-HA ja oligo-HA pinnat, sitoutuminen oli erityisen herkkä tasaisempaa jakautumista HA. Yhteismarkkinavaiheessa solutasolla, ektooppinen ilmentyminen CD44v4-V7 näissä soluissa eivät muuttaneet alkuperäistä sitoutumalla oligo-HA pinnat, mutta myöhemmin aiheuttama muuttunut solun muotoon ja parannetun vaeltamista samansuuntaisesti.

Aikaisemmin olemme osoittaneet, että toisin ASpSV14 soluihin, 1AS solut sitoutuvat erittäin huonosti immobilisoituun HA pinnat [26]. Näissä solu sitoutumismääritykset, imeytymistä HA muovipintoihin käytettiin, jossa ei valvo tiheyttä tai alueellisen jakautumisen HA-molekyylien oli mahdollista [26]. Kuitenkin tässä esillä olevassa tutkimuksessa, molemmat solutyypit sidottu oligo-HA kytkettyinä kalvot, vaikka ASpSV14 solut reagoivat eri kannalta morfologia ja liikkuvuus jälkeen alustavaa sidoksen pintoihin. Huomasimme myös, että sitoutuminen 1AS solujen oligo-HA pinnat vaikutti voimakkaasti väli HA molekyylejä. On siis mahdollista, että alueellisen jakautumisen HA aiemmissa testeissä ei ollut optimaalinen sitoutumiseen 1AS soluja, mutta riittänyt sitoutumiselle ASpSV14 ilmentävien solujen lisäksi CD44v4-V7 proteiinia. Lisätyötä tarvitaan, onko ASpSV14 solut ovat vähemmän herkkiä tasaisempaa jakautumista HA kuin 1AS soluja. Tämä näyttäisi todennäköisesti johtuen kasautumiseen CD44 pinnalla solujen, joka johtaa parantaa HA sitovat ominaisuudet [9].

1AS johdannainen AS-R44 ektooppisesti ilmentää mutantti muoto CD44v4-V7 että ei voi sitoutua HA [26]. Yllättäen, vaikka AS-R44-solut ilmentävät CD44s samanlainen kuin vanhempien 1AS soluja, jotka voivat sitoutua oligo-HA pinnat, AS-R44-solut eivät pystyneet vuorovaikutuksessa näiden pintojen (kuvio 3). Nämä tiedot tämän vuoksi osoittavat, että ei-HA-sitoutumisen mutatoitu muoto CD44v4-V7 voi vaikuttaa HA sitova aktiivisuus endogeenisen CD44s proteiinia. Sopusoinnussa tämän käsitteen, AS-K162R166 solut, jotka ilmentävät mutatoitua muotoa CD44v4-V7, joka on esitetty vain osittain vähentää sitova kyky HA [26] käyttäytyivät samalla sitoutumismäärityksissä on ASpSV14 solut, jotka ekspressoivat villityypin CD44v4- v7 proteiinia.

Under tasaisempaa jakautumista oligo-HA tässä tutkimuksessa käytetyt, keskimääräinen translokaatiota nopeus ASpSV14 solujen (

v

psV14 = 5,0 ± 0,2 mikrometriä /h) oli verrattavissa 1AS soluja (

v

1AS = 4,4 ± 0,2 um /h) yli 20 h, vaikka merkittävää eroa niiden morfologisten dynamiikka (Kuva 6). Kuitenkin analyysi suunnattu solun muodonmuutosta (kuvio 7) osoittaa, että samalla kun 1AS solut vain satunnaisesti siirtyä on oligo-HA pinnalla, ASpSV14 soluilla parannetun suuntaava liikkuvuutta. Nämä erot voivat heijastaa erittäin metastaattinen käytös ASpSV14 solujen

in vivo

verrattuna heikko metastaattisen käyttäytymisen 1AS solujen [7], [16]. Lisäksi, vaikka 1AS solut osoittavat solun tukirangan ominaisuuksia on aikaisemmin yhdistetty liikkumaton soluihin [40], että niiden nopeus havaittiin olevan samanlainen kuin ASpSV14 soluihin viittaa siihen, että nämä ominaisuudet vaan heijastavat dynaamista morfologiset ominaisuudet soluja.

tässä tutkimuksessa käytimme kvantitatiivisesti funktionalisoitu tuettu kalvoja ja tutkittiin tartunta, morfologiset kuvioita, ja liikkuvuuteen haiman adenokarsinooma soluissa, jotka ilmentävät eri CD44-isoformeja. Syrjiä ominaisuus ajallisesti ja kuvioita stokastisen melu dynaamisia solujärjestelmät, otimme käyttöön suhteellisen yksinkertainen mutta suoraviivainen tilastollinen kuva-analyysi kuten autokorrelaatiofunktioista. Aiemmin Maeda et al. tutki morfologia ja suuntautumisen korrelaatio liman multaa

Dictyostelium discoideum

lasi substraattien [32], raportointi, että

D. discoideum

läpikäy stokastinen siirtymiä aikaikkunan 10-20 min. Tuloksemme viittaavat siihen, että morfologinen dynamiikka haimasyöpäsoluissa on paljon hitaampaa, ominaisella aikaikkunoiksi useita tunteja. Tämä voi johtua osittain näkyvä leviäminen ja kiinnittyminen syöpäsolujen välittyy tietyn X-CD44 vuorovaikutukset, ja ne voivat vaatia molemmat tartunta alustaansa (pito) ja peräkkäiset lohkaisu CD44 (release) aikana solumigraation ehdottamalla tavalla aikaisemman tutkimuksessa [43].

dynamiikka ”omalla” hiukkasten houkuttelee yhä enemmän huomiota alan tilastollisen fysiikan kaukana tasapainosta.