Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä biomarkkereita helpottavat seulonnan ja varhaisen havaitsemisen, mutta tunnetaan vain muutama syöpätyyppeihin. Osoitimme periaate asiakkuutta kasvainten erittää seerumin biomarkkeri käyttäen systeemisesti geeninviejävektorille joka kohdentuu kasvaimia valikoivaan ekspression suunniteltu kasetin. Me hyödyntää kasvainta valikoivan replikaation ehdollisesti Replikoitumattoman Herpes simplex -viruksen (HSV) yhdistettynä replikointi riippuva myöhään viruksen promoottori saavuttaa kasvaimeen valikoiva biomarkkereiden ilmentymisen esimerkkinä geeninviejävektorille. Virusreplikaation, sytotoksisuus ja biologisten merkkiaineiden tuotanto olivat alhaiset lepotilassa normaalin ihmisen esinahan keratinosyyteissä ja korkea syöpäsoluissa

in vitro

. Laskimonsisäisen injektion jälkeen viruksen 90% kasvainta kantavien hiirten korkeampi biomerkkiaineen kuin ei-kasvain-hiirille, ja kun ruumiinavaus, havaitsimme viruksen yksinomaan tuumoreissa. Strategiamme pakottaa kasvainten erittää seerumin biomarkkereiden voisi olla hyötyä syövän seulonta korkean riskin potilailla, ja mahdollisesti seurantaan hoitovaste. Lisäksi, koska onkolyyttisten vektoreihin kasvainspesifin geenikuljettimia ovat sytotoksisia, ne voivat täydentää meidän seulontastrategia kuin ”theragnostic” agentti. Syöpäseulontatestit lähestymistapa esitellään tässä työssä esitellään paradigman muutos hyödyllisyys geeninjakelumenetelmät jota ennakoida parannetaan vaihtoehtoisilla vektoreiden kohdentamalla geenin toimitus- ja ilmaisun kasvaimia. Jalostamalla tämä lähestymistapa tuo tullessaan uuden aikakauden kliinisen syövän seulontaa, jotka voidaan toteuttaa kehittyneiden ja kehittymätön maailma.

Citation: Browne AW, Leddon JL, Currier MA, Williams JP, Frischer JS, Collins MH, et al. (2011) syöpäseulonnoista systeeminen anto geeninviejävektorille koodaus Kasvain-Selective eritettävän biomarkkereiden Expression. PLoS ONE 6 (5): e19530. doi: 10,1371 /journal.pone.0019530

Editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Kanada

vastaanotettu: 1 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 31 maaliskuu 2011; Julkaistu: toukokuu 11, 2011

Copyright: © 2011 Browne et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat CancerFree Kids Pediatric Cancer Research Alliance (AWB) ja NIH palkinto 1R01-CA114001-01A2 (TPC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

varhainen syövän havaitseminen on välttämätöntä parantaa paranemisasteet koska syöpä vaiheessa ennustaa ennustetta. Syöpään liittyvä veren biomarkkerit on tunnistettu muutamia syöpiä kuten prostataspesifisen antigeenin (PSA) eturauhassyövässä ja alfafetoproteiini tiettyjen maksa ja ituradan syövät. Biomarkkerit ei ole tunnistettu useimpien lapsipotilailla syöpien ja monet aikuisten syövät. Uudet innovaatiot systeemisiä geenisiirron nostaa mahdollisuus selektiivisesti tuottaa ja aktivoivat geenit koodaavat helposti havaittavia biomarkkerit syöpäsoluihin, jotka eivät tuota tiedetä seerumin biomarkkereita. Olemme pyrkineet kehittämään prototyyppiä syövän seulonta strategiaa, jossa geneettinen tieto, joka koodaa yleinen seerumin biomarkkeri syövän olisi ruiskuttaa potilaaseen systeemisesti, toimitettu ja ilmaisi sisällä kasvainsolujen kasvain-valikoivasti. Kasvaimet olisi käytännössä pakko erittää seerumin biomarkkereiden, jota voitaisiin sitten mitata verestä tai virtsasta seulontatestinä taas kasvaimettomina potilaiden osoittaisi mitään tai vain vähäistä biomarkkereiden systeemisen annon geeninviejävektorille (Fig. 1a).

(a) vaiheet syövän seulonnasta ovat seuraavat: 1) Cancer kohdistamisen Herpes simplex -viruksen (HSV) ruiskutetaan systeemisesti. 2) Tekniset HSV replikoituu selektiivisesti kasvaimissa samalla poistetaan tervettä ei-syöpä kudoksiin. 3) biomarkkereiden selektiivisesti tuotetaan kasvaimia. 4) verinäytteet ja analysoitiin biomarkkereiden tasoilla. 5) Seerumin eksogeenisesti toimitetun biomarkkereiden ovat korkeammat kasvaimen kantavien hiirten kuin terve kasvaimettomina hiirillä. (B) Gene karttoja villityypin HSV ja uusia yhdistelmä-RQ-M38G.

eksogeenisesti annetun geenikoodattuja biomarkkerit vaativat kasvaimeen kohdennettua geenin toimitus- ja /tai ilmaisun. Pien- molekyylit ja hiukkaset kasvaimia voidaan saavuttaa passiivisen Enhanced läpäisevyys ja säilyttäminen (EPR) [1], [2], [3], ligandi-ohjattu aktiivinen kohdentaminen [4], [5], [6], [7 ], kasvaimen mikroympäris- riippuvainen kohdistaminen [8], [9], [10], tai niiden yhdistelmää kunkin [11]. Virukset ovat luonnollisesti esiintyviä nanohiukkasten optimoitu tuottamaan geneettisen informaation viemiseksi kohdesoluihin. Suuri etu virusten yli ei-virusvektorit DNA toimitus on niiden luontainen mieltymys replikaatiota kasvaimia ja seurauksena vahvistusta signaalin.

Herpes simplex -viruksen (HSV) tyypin 1 on malli geeninviejävektorille, koska se voi tartuttaa monenlaisia ​​ihmisen solutyyppejä, transduce sekä jakamalla ja lepotilassa olevat solut tehokkaasti, voidaan muokata ilmentämään siirtogeenin tuotteita, hyväksy siirtogeenien vetämänä heterologiset tai homologiset promoottorit, on epigenomic, on skaalautuva tuotanto, ja voi turvallisesti ohjata viruslääkkeiden [ ,,,0],12]. Valikoiva mutaatioita HSV geenit johtavat syöpään valikoiva virusreplikaation. Mutaatio HSV koodaavat geenit ribonukleotidireduktaasiin suurta alayksikköä (ICP6 /U

L39) ja myöhään viruksen proteiini ICP34.5 (γ

134,5) rajoittaa vankka virusreplikaation kasvaimiin [13], [14], [ ,,,0],15], [16], ja niiden on osoitettu olevan turvallinen kliinisissä tutkimuksissa. Aktivointi tiukan myöhään viruksen U

L38 geeni on riippuvainen edeltävän peräkkäisen aktivoinnin välittömän varhaisen ja varhaisen virus- geenien ja solujen transkriptiotekijöiden [17] ja U

L38 promoottori (U

L38p) on osoitettu valikoivasti aktivoida syöpäsoluissa yhteydessä replikaatiokompetentin γ

134,5

– /- HSV-mutantit [18]. Riippuvuus myöhään geenin ilmentymisen aktivoitaessa aikaisten geenien tekee U

L38p vahva ehdokas toimituksen siirtogeenien syöpäsoluihin valikoiva ilmentyminen yhteydessä kaksinkertainen mutantti HSV puuttuu ICP6 ja γ

134,5.

Olemme kehittäneet HSV malliesimerkkinä geeninviejävektorille indusoimiseksi biomarker eritystä valikoivasti kasvaimia. Toiset ovat sisällyttäneet geenit koodaavat eritettävän biomarkkerit on onkolyyttisiä virusten toimittajat viruksen toimintaa [19], [20], [21], [22] ja geenikasetteja ei-invasiivisia seuranta virus- toimitetaan geenejä [23]. Natrium-jodidi symporter kooditettuja onkolyyttisiä viruksia helpottavat myös isotooppilääketieteen kuvantamisen ja hoitoa tartunnan kasvaimissa [24], [25]. Äskettäin Gaussia lusiferaasi (Gluc) tunnistettiin ja kehitettiin uusia tehokkaita reportterimolekyyli [26], joka on helposti erittyy soluista tehden hyödyllinen sekä

in vitro

ja

in vivo

joissa ilmaus kinetiikka ovat kiinnostavia. Käytimme gluc näytteenä biomarkkeri tämän periaatteen todiste koska gluc on 1000 kertaa kirkkaampi kuin muut lusiferaasien, on herkempi kuin eritettävän AFOS, ja on havaittavissa veressä ja virtsassa

in vivo

[27], [ ,,,0],28]. Käyttämällä suunnattu rekombinaation lähestymistapa [29] me valmistimme HSV mutantti, RQ-M38G, jossa gluc valvonnassa myöhään viruksen promoottori U

L38 (Fig. 1b).

pyrittiin arvioimaan meidän suunniteltu virus- geeninviejävektorille eläinmalleissa usean eri kasvainten tyyppiä muodostetaan eri paikoissa: vatsaonteloon, ihon alle, lihakseen ja potilaalle tehdä intrarenal kasvaimia. Systeemisen injektion meidän geeninviejävektorille (RQ-M38G) vereen kasvaimen kantavien hiirten, havaitsimme RQ-M38G tuottavien syöpäsolujen riippuva sytotoksisuus ja biologisten merkkiaineiden tuotantoa. Totesimme myös useita tapauksia, joissa RQ-M38G pystyi pakottamaan mikroskooppisen kasvaintaakat tuottamaan havaittavissa veren biomarkkereiden. Nämä kokeelliset tutkimukset osoittivat periaatetta havaitsemaan kasvaimia pakottamalla heidät ilmaista eritettävän biomarkkereiden.

Tulokset

In vitro

luonnehdinta mutantti HSV RQ-M38G

RQ-M38G-välitteisen gluc transduktion, replikaatio ja sytotoksisuus testattiin infektoimalla erilaisia ​​solutyyppejä eri viruskonsentraatioiden ja arvioidaan gluc tasoilla elatusaineissa (Fig. 2a, Fig. S1), viruksen genomin kopioluvun (Fig. 2b, Fig. S2) ja sytotoksisuus (Fig. 2c, Fig. S3) päivinä 2, 4 ja 6 infektion jälkeen. Solunjakautumista riippuva sytotoksisuus havaittiin jäljittelevän ihmisen esinahan keratinosyyteissä (HFK-r), kun sytotoksisuus vaimenee tai poissa eriytetty /lepotilassa ihmisen esinahan keratinosyyteissä (HFK-q) (Fig. S3). Vero, joka on Afrikkalainen vihreän apinan munuaisen solulinjassa, joka on tunnettu salliva HSV lisääntymään, osoitti korkea gluc ilmaisun ja RQ-M38G lisääntymään seuraavien pieniannoksisen RQ-M38G infektion (MOI = 0,001, 1-viruksen 1000 solua).

(a) Gaussia lusiferaasi (gluc) ilmentymistä, (b) virusreplikaation, ja (c) sytotoksisuutta seuraavat infektion Vero-soluja ja paneeli ihmisen kasvaimen solulinjojen RQ-M38G (MOI = 0,001).

arvioitiin ilmentymistä, viruksen lisääntymisen ja sytotoksisuus seuraava RQ-M38G infektio 5 ihmisen kasvainsolulinjoissa. SK-NEP_Luc (Ewingin sarkooma) osoittivat kohonnut gluc ilme, viruksen lisääntymisen ja sytotoksisten alttius samanlainen Vero-soluissa. Osteomet (Osteosarkooman), STS26T_dsRed (MPNST), ja S462.TY (MPNST) kukin osoitti pienempi herkkyys kaikissa kolmessa määrityksissä. Lopuksi arvioitiin sytotoksisuus 3 vakiintunut hiiren kasvainmalleissa johdettu C57 /BL6-tausta (Fig. S3) ja useita spontaani hiiren kilpirauhasen tai pienisoluisen keuhkosyövän linjojen tuottamat Yhteiskäyttäjä (tuloksia ei ole esitetty). HGF116 (rabdomyosarkooma) oli ainoa solulinjan osoittaa mitattavissa sytotoksisuuden, mutta vain korkealla viruksen annos (MOI = 1, 1 tarttuva virus solua kohti). Nämä tiedot tunnistettu SK-NEP_Luc kuin ensisijainen tavoite

in vivo

seulonta käyttäen RQ-M38G taas muut ihmisen tuumorisolulinjat ennustettiin olevan vähemmän vastaanottavaisia ​​seulonnasta RQ-M38G.

systeeminen anto RQ-M38G tunnistaa kasvaimen läsnäolo

Testasimme soveltuvuutta RQ-M38G kuin geeninviejävektorille pakottaa kasvainspesifisen erityksen biomarkkereiden systeemisten RQ-M38G hiirillä ja ilman kasvaimia . Yksitoista hiiriin injektoitiin ortotooppisesti 10

6 SK-NEP_Luc solujen niiden munuaisten subcapsule. Kasvain-istutettiin hiirien ja ohjaus kasvain-free-hiiriin sen jälkeen injektoitiin suonensisäisesti (i.v.) ja 1,2 × 10

7 pfu RQ-M38G 5 viikkoa kasvaimen istutuksen jälkeen. Päivinä 1, 4 ja 7 seuraavasti virus injektion hiiret kuvattiin tunnistaa tulikärpäsen lusiferaasi-positiivisia kasvaimia ja kerättiin verinäytteitä silmäkuopan takaa silmän verta ja määritettiin seerumin gluc (Fig. 3a).

In vivo

kuvantamisessa tunnistettu 10 ulos 11 hiiret, jotka saivat kasvainsolun injektioita oli muodostunut kasvaimia (Fig. 3b). Yksi hiiri (# 9) koskaan muodostivat kasvain ja yksi hiiri (# 11) oli kasvain, joka oli tuskin havaittavissa. Kaikissa hiiret, joissa kasvain taakka oli ilmeinen (9 out of 11), seerumin gluc tasot olivat 15- ja 440-kertaa suurempi kuin kasvaimettomina hiirissä, kun taas seerumin gluc kahdesta muusta hiiret jäivät ohjaus hiiren seerumia gluc tasoja (kuvio. 3). Siksi RQ-M38G systeemisesti aiheuttavan biomarkkereiden tuotanto johti herkkyys 90%: SK-NEP_Luc kantavien hiirten. Samanlaisia ​​tuloksia kasvaimia eri anatomisia sivustoja (Kuva. S4).

(a) aikakäyrä gluc ilmentymisen munuaisten subcapsule (RSC) SK-NEP_Luc-laakeri ja kasvaimettomina hiiriin ruiskutettiin systeemisesti 1,2 × 10

7 pfu tai RQ-M38G. Numerot legenda edustaa yksittäisistä hiiristä. (B) gluc ilmaisun ja

in vivo

kuvantamiseen SK-NEP_Luc kantavien hiirten neljä päivää systeemisen injektion 1,2 x 10

7 pfu RQ-M38G. Seerumin gluc tasot injektoitujen hiirten kasvaimen ja ohjaus, jotka eivät saaneet kasvaimen injektiota (pylväskaavio), ja

in vivo

lusiferaasi kuvantamiseen hiirillä, jotka saivat kasvainsolujen injektioita.

sijainnin määrittämiseksi RQ-M38G kudoksissa seuraavissa iv injektio ja vahvistavat, että seerumin gluc signaali ilmaistaan ​​kasvaimia eikä normaalia elimet, elimet kerättiin hiiriltä 7 päivää virusinfektion ja alistettiin immunofluoresenssimenetelmällä varten GFP: n ilmentymisen ja kvantitatiivinen PCR virusten genomien. Vain kasvaimet osoitettu GFP: n ilmentymisen sekä ohjaus (tuloksia ei ole esitetty), ja kokeellisen hiirissä (Fig. 4a), injektoitiin systeemistä RQ-M38G. Kvantitatiivinen PCR viruksen genomin kopiota näkyy sama jakauma viruksen kasvaimen kantavien hiirten, kuten nähtiin GFP: n ilmentymisen, jossa virus: sta oli ainakin 2100-kertainen kasvaimia kuin terveiden kudosten (Fig. 4b). Immunofluoresenssi ja qPCR osoittavat, että virusinfektio vallitsevia kasvaimessa ollessaan vähäinen terveillä kudoksissa. Näin ollen, systeemisesti RQ-M38G onnistuneesti tunnistettu läsnä SK-NEP_Luc kasvaimet pakottamalla kasvaimia tuottaa eritettävän biomarkkereiden. Osoitimme samanlaisia ​​havaintoja kasvain malleja, jotka ovat vähemmän alttiita virusinfektion ja mallien pahanlaatuisten ääreishermoston tuppi kasvain (sekä ihonalainen ja vatsaonteloon sijainnit) ja osteosarkooma (kuviot S5, S6, S7).

(a) GFP immunof- SK-NEP_Luc kantavien hiirten kanssa ja ilman systeemistä viruksen annon. Hiiret, jotka saivat virus (# 1 ja # 2) oli selektiivinen GFP: n ilmentymisen kasvaimen, kun taas hiiret, jotka saivat ei-virus (o Virus Control) osoitti globaalin GFP-kielteinen. Asteikko bar = 15 mikronia. (B) bioleviäminen viruksen hiirten SK-NEP_Luc kasvaimet systeemisen annostelun jälkeen määritettynä qPCR viruksen genomeja.

induktio gluc ekspression kasvaimissa kasvaimensisäisiä virus injektiona

selkeää eroa ei havaittu SK-NEP_Luc ja kolme muuta kasvainmuodoista testattu jossa jokainen osoitti alempi

in vitro

sytotoksisuuteen ja gluc ilme yhdistettynä alempi biomarkkereiden ilme

in vivo

. Sen selvittämiseksi, onko tuottaa suurempia annoksia viruksen kasvaimia voisi lisätä

in vivo

biomarkkerina ilmaisua, me annettiin RQ-M38G suoraan kasvaimiin kasvaimensisäisiä injektion malleja S462.TY ja Osteomet.

Hiiret laakeri ihonalainen kylki Osteomet kasvaimet yli 200 mm

3 injektoitiin 1,9 x 10

5 pfu virusta. Verinäytteet otettiin ja analysoitiin gluc kunakin ajankohtana (Fig. S7A), kun taas kaksi hiiret tapettiin kunakin ajankohtana ja analysoitiin viruksen genomi kopioita qPCR (Fig. S7b). Seerumin gluc veren hiirten kasvaimia injektoitiin RQ-M38G oli suurempi kuin gluc tasot ohjaus infektoimattomissa hiirissä, ja lisäämällä gluc ajan jäljittää profiilin samanlainen virus kopioluku kasvaimia. Vaikka 4000-kertainen genomivahvistuksen kasvaimissa, seerumin gluc nousivat vain 10-kertainen yläpuolella infektoitumattomien valvontaa. Kasvaimensisäistä injektio 8 x 10

3 pfu tai 8 x 10

7 pfu virusta toistui S462.TY kasvaimia kasvaimia olivat suurempia kuin 500 mm

3. Neljän päivän kuluttua i.t. injektio seerumin gluc tasot analysoitiin kuten piirretty kuvassa. S8. Kaikki hiiret, jotka saivat kasvaimensisäistä injektion viruksen osoittivat korkeampia gluc tasoilla kuin kasvaimettomina valvonta ilman merkittävää eroa gluc pitoisuutena alhaisen annoksen ja 10000-kertainen korkea virus annoksen, mikä viittaa kyllästyminen matalalla annoksella (ainakin kautta kasvaimensisäisenä reittiä).

biomarkkereiden herkkyys

Pieneläinten malleja käytetään havaita minimaalinen kasvaintaakat läsnä teoreettinen skaalautuvuus haasteita käännettäessä havainnot ihmisen mittakaavassa käytännöllisyys. Näihin haasteisiin olemme pyrkineet arvioimaan teoreettinen toteamisrajat meidän biomarker perustuu

in vitro

määrityksessä ja havaita pieniä kasvaintaakat

in vivo

3 menetelmillä: IVIS luminesenssikuvantamisessa, virusvälitteiseltä gluc ilmaisu seerumissa ja post mortem histologinen analyysi. Veritilavuus on hiiri on noin 2 ml (8%: a 25 g koko kehon paino [30]). Pyöreät SKNEP-Luc kasvain koostuu 10

6 solua määritettiin 1,83 mm halkaisijaltaan mittaamalla tilavuutta on sentrifugoidaan näyte yhtä monta solujen, olettaen pienet kasvaimet koostuvat pääasiassa syöpäsoluja. Kymmenen 1000000 solut maljattiin 2 ml soluviljelyalustassa ja co-tartunnan RQ-M38G MOI 3 varmistaa, jokainen solu olisi tartunnan. Kaksi päivää infektion jälkeen solujen kasvatusliuos kerättiin ja analysoitiin gluc pitoisuus. Virus-välitteisen Gluc ilmaisua voitaisiin luotettavasti ratkaista samanaikaisesti transdusoimalla 1000 solua, joka vastaa suunnilleen pallomainen kasvain läpimitaltaan 183 mikronia (Fig. S9).

Ewingin sarkooma kasvaimia (SKNEP-Luc) erikokoisia perustettiin 11 hiiret ruiskuttamalla 10

6 solua vasempaan munuaisten subcapsularly 3 hiirten ryhmissä 3 peräkkäistä viikkoa. Hiiret kasvaimia, jotka olivat kehittäneet yli 2, 3 ja 4 viikkoa ja 4 kasvaimettomina ohjaus hiiriä infektoitiin systeemisesti 1 x 10

7 pfu RQ-M38G. Neljä päivää infektion jälkeen hiiret kuvaamisen kautta IVIS, verinäytteet kerätään gluc kvantitoimiseksi, ja hiiret tapettiin histologista kasvaimen koon.

In vivo

Imaging lusiferaasiekspressio paljasti hiiret Baring kasvaimia hyvinkin erilainen kooltaan aikaan infektion ja uhri (äärimmäiset esimerkit kuvassa. 5a). Seerumin gluc pitoisuus kasvaimen kantavien hiirten 4 päivää infektion jälkeen paljasti gluc pitoisuudeltaan yli samalla tartunnan kasvaimettomina ohjaus hiirillä (Kuva. 5b). Histologinen arviointi kasvainten kunkin hiiren paljasti makroskooppinen kasvain ja mikroskooppisen kasvainkeskusten hiiren

i

ja

ii

vastaavasti (Fig. 5c).

a)

in vivo

kuvantamiseen kaksi hiirtä (

i

ja

ii

) kanssa hyvin erilaisia ​​SKNEP-Luc kasvaintaakat. b) Seerumin gluc pitoisuus hiiri i, ii ja neljä kasvaimettomina ohjaus hiirillä 4 päivää systeemisen infektion 1 x 10

7 pfu RQ-M38G. c) hematoksyliinillä ja eosiini makroskooppisen kuvia kasvaimen omaavien munuaiset (T = kasvain, mittakaava baareja = 1 mm) ja sisäkkeet mikroskooppisen kasvainpesäkkeitä munuaisperuskudoksen hiiren

ii

(asteikko bar = 200 um).

keskustelu

Olemme kehittäneet uudenlaisen syövän seulonnasta jolloin kasvaimet ovat pakotettuja erittää biomarkkereiden. Olemme kehittäneet ehdollisesti Replikoitumattoman HSV, RQ-M38G, valikoivasti pakottaa kasvainsoluihin erittämään Gaussia lusiferaasia osoitus tästä seulontastrategia. Kasvain eläimille annetaan laskimoon RQ-M38G ilmaistuna korkeampi biomarkkereiden verrattuna kasvaimettomina eläimiä, jotka osoittivat vain vähän, tausta ilme. Hyödyllisyyttä rQM-38G seulontaan näytti olevan funktio kyky tietyn kasvaimen tukea HSV replikaatiota. Riippumatta kasvaimen tyypin tai sijainnin, kasvain seulonta RQ-M38G oli erittäin herkkä kasvain läsnäoloa.

kriittinen ominaisuus syövän seulonta on kyky havaita pieniä kasvaimia, lopulta ihmisiin. Yksi

a priori

huolenaihe oli, että pienet kasvaimet voivat liittyä vähemmän verisuonten pinta-ala käytettävissä HSV merkintä. Tämä ongelma ei näytä olevan rajoituksen hiirillä, koska joissakin mallien pystyimme havaitsemaan kasvaimia niin pieni kuin 4-5 mm halkaisijaltaan (50 mm

3) ja toisessa mallissa havaitsimme mikroskooppisen kasvaintaakkaa . Skaalautuvuus ihmiselle (suurempia veren tilavuutta) on vaikea ennustaa, mutta joidenkin arvioiden ovat mahdollisia.

In vitro

arviointi yhä enemmän SKNEP-Luc kasvainsoluja osoittaa, että infektoimaan niin vähän kuin 1,000 solujen määrän soluviljelyalustassa sama kuin hiiren veren tilavuus saannot havaittavissa gluc eritystä. Näin ollen, samanaikainen ekspressio gluc peräisin 1000-solujen milloin tahansa hiiri on teoreettisesti havaittavissa. Näissä olosuhteissa infektoimaan 10% soluista on kasvaimen, jonka halkaisija on 400 um (10

4-solut) olisi havaittavissa hiiri. Kun skaalattu hiiren ihmisen teoreettinen toteamisraja on kasvanut suhteessa 1:2600 (25 mg mouse:65 kg ihminen) ja laimentamalla biomarkkerin on suurempi keskimääräinen ihmisen veren tilavuus on 4,7 L. Käyttämällä näitä numeroita, teoreettinen toteamisraja kun infektoimaan 10% soluista on kasvain on muuttunut 394 um halkaisijaltaan massa hiiri on 1-4 mm: n kasvaimen halkaisija ihmisen. Jos vain 1% kasvainsolujen transduktoitiin virus, kasvaimet niin pieni kuin 8,5 mm halkaisijaltaan saattaa silti olla havaittavissa käyttäen näitä laskelmia. Tämä herkkyys viittaa hyvät mahdollisuudet tunnistaa minimaalinen kasvaintaakat vaikka skaalataan ihmisen mittasuhteet.

kyky seulonnan strategian paljastaa kasvaimia riippuu viruksen tekijöistä, kasvaimen mikroympäristössä, ja biologisten merkkiaineiden havaitsemiseen rajoituksia, joista kukin voi olla tehostettu reaalimaailman käytännöllisyys. Tässä käytimme kaksinkertaisesti heikennetty HSV toteuttaa kasvainspesifin transduktio ja geeniekspressiota. Tällaisia ​​vektoreita on jo dokumentoitu olevan turvallisia ihmisten käyttöön [31]. Vaihtoehtoinen viruksia yhdellä tai vähemmän heikentäviä mutaatioita osoitettava suurempaa onkolyyttisten kapasiteetti ovat myös jo kliinisissä tutkimuksissa (esim HSV1716, katso www.clinicaltrials.gov, NCT00931931). Kytkimen tämä seulonta strategiaa vähemmän heikennettyjä viruksia todennäköisesti monipuolistaa hyödyllisyys joukossa erilaisia ​​kiinteitä pahanlaatuisia kasvaimia sekä parantaa terapeuttista komponenttia. Aineita, jotka ovat samanaikaisesti sekä diagnostisia ja terapeuttisia on puhuttu ”theragnostic.” On mahdollista strategiaamme voitaisiin edelleen tarkentaa käyttämällä vakaampi syöpää riippuvainen promoottori ajaa biomarkkereiden ilme. Parannettu vektori toimitus kasvain voi myös saada aikaan käyttämällä kohdennettua tuumoreihin pienimolekyylisiä ja nanohiukkasten otto-lisälaite strategioita kuten äskettäin kuvattu, jossa käytetään sisäistää RGD-peptidien [8]. Mahdolliset kaupallistaminen meidän ehdotetun seulontastrategia hyötyisivät biomarkkerit, jotka ovat jo yleisessä käytössä, kuten βHCG (raskaustesti), PSA (eturauhassyöpä) ja αFP (maksa ja sukusolujen maligniteetteja). Biomarkkereiden määrityksen herkkyys yhteydessä tämän seulonnan strategia voi silti parantaa eksponentiaalisesti on toteutettu mikrofluidinen teknologioita [32], [33], [34], [35].

Merkittävä huolenaihe prototyyppiseen syöpä seulontamenetelmä kehitetty tässä työssä on kehittää immuunivasteen geenin Delivery agent tai transdusoiduissa biomarkkereiden jotka estäisivät toistuvaa käyttöä seulontatyökalun. Edellinen työ kentällä on osoittanut, että pre-immunisoiduista eläimistä silti kokea terapeuttinen hyöty HSV, kun teho ylläpidettiin [36]. Koska 80%: lla väestöstä on altistunut HSV, toteuttamisessa havaitsemisstrategiaa HSV riippuu tehoa suunniteltu HSVs annettiin immunokompetenteista henkilöillä, jotka ovat aikaisemmin altistuneet villityypin HSV-kantoja.

In vitro

seulonta hiiren kasvainsolulinjoilla paljasti, että kaikki hiiren linjat testasimme näytteillä huomattavasti vähemmällä alttiutta infektioille meidän heikennetyn mutantin virus, par normaaleissa lepotilassa ihmisen soluissa. In vivo -malleissa HGF116 osoittanut mitään virusta herkkyys seuraavat i.t. tai i.v. injektio. Niinpä emme pysty arvioimaan meidän syövän seulonta strategiaa käytettäessä immunokompetenteilla mallia kunnes tunnistaminen hiiri malleja, jotka ovat alttiimpia ihmisen HSV. Tämän strategian toteuttaminen voi kehittyä ei-virus- vektorit [37] tai virusvektoreita naamioitu liposomeihin [38].

haaste koko väestöön syövän seulonta on kehittää kliinisiä määrityksiä, jotka ovat verotuksellisesti käytännön, universal poikki kirjo syöpätyyppien, ja helppo toteuttaa. Lääkärintarkastus, kun taas edullinen, usein ei tunnista syöpäsairauksia jotka ovat syviä tai oireettomia. Imaging hyötyy suuri herkkyys, mutta ne eivät aina erotella epäspesifinen tai hyvänlaatuinen massojen pahanlaatuinen sairaus (esim keuhko kyhmyjä voi olla granulooma tai syöpä), on taloudellisesti haastava ja vaikea laajasti toteuttaa. Kun tunnistaminen asianmukaisten biomarkkereiden, syövän seulonta saattaa olla taloudellisesti kannattavaa automaattisten Vierianalytiikka (Poct) tekniikat (www.i-stat.com, www.biosite.com, www.siloambio.com [39]).

Tämä työ osoittaa periaate asiakkuutta ilmentymisen eritettävän siirtogeenin syövän käyttäen systeemisesti geeni välittäjäohjelmana biomarkkerina seulomiseksi tuumorin läsnäolon. Romaani seulonta ehdottamaa periaatetta ja osoitettu tässä työssä voisi pitää välittömiä seurauksia potilaille, joilla tiedetään olevan syöpää riskejä, kuten geneettinen taipumuksia (BRCA-1, NF1 mutaatioita) tai potilaille, joilla on ollut syöpä, joilla on suuri riski toistumisen. Lopulta eksogeenisesti syövän kohdistaminen geeni välittäjäohjelmana (tarttuva tai ei) voi pakottaa mitään maligniteetti erittämään biomarkkereiden ja voitaisiin käyttää Universal ensimmäinen askel koko väestöön syövän seulontaa. Vaikutus Tämän lähestymistavan mullistaa teknologiaa syövän havaitsemiseen teollisuusmaiden ja kehitysmaiden jossa kuvantaminen ja koepalan diagnostiikkaohjelmien välttämättä ole yhtä helposti saatavilla.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja virukset

Ihmisen tuumorisolulinjat on kuvattu aikaisemmin [40], [41], tai hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), lukuun ottamatta SK-NEP_Luc, joka oli ystävällinen lahja Jason Frischer (CCHMC, Cincinnati, OH). Soluja kasvatettiin DMEM: ssä tai McCoys 5A-alustassa (ATCC, SK-OV-3, SK-NEP_Luc) 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone, Logan, UT), ja penisilliiniä /streptomysiiniä (Life Technologies, Carlsbad, CA). Hiiren C57 /BL6 solulinjoilla LLC

GFP [42] (Lewisin keuhkokarsinooma) ja B16-BL6 (melanooma) olivat ystävällisiä lahjoja Joe Palumbo (CCHMC, Cincinnati, OH) ja HGF116 (rabdomyosarkooma) oli peräisin geneettisesti hiiri. Ensisijainen ihmisen esinahan keratinosyyteissä (HFK) oli ystävällinen lahjoitus Susa Wells (CCHMC, Cincinnati, OH), kasvatettiin EpiLife Media (Cascade Biologics, Portland, OR) ja erilaistuneet lepotilassa keratinosyytit 10% FBS ja 1 mmol /L CaCl

2 [43].

RQ-M38G rakennettiin seuraavasti: U

L38 promoottori eristettiin HSV rRp450 PCR: llä käyttäen alukkeita, joiden on aiemmin [18], joita on muokattu sisältämään 5 ’ Bglll- ja 3 ’Hindlll (F1, R1 taulukossa S1) ja kloonattiin Bglll ja Hindlll pCMV-gluc (Invitrogen), joka korvaa CMV-promoottori. U

L38p-Gluc kasetti monistettiin PCR: llä pU

L38p-Gluc, jossa sisällyttäminen 5’SpeI ja 3 ’EcoRI: llä ja kloonattiin Spel-EcoRI-kohtiin ”HSV-Quick” shuttle-plasmidi, pT-OriSIE4 /5 [29] (ystävällinen lahjoitus Yoshinaga Saeki, Ohio State University, Columbus, Ohio), jossa Oris (E4 /5 Kpnl fragmentti oli poistettu. saatu plasmidi, pT-U

L38p-gluc, käytettiin HSVQuick BAC järjestelmä tuottaa RQ-M38G [29]. Alukkeet PCR-analyysiä ja sekvensointi on esitetty taulukossa S2. virukset lisättiin, ja titrattiin [44] plakkitestillä Vero-soluissa. Cell sytotoksisuus määritettiin 96-kuoppaisille kudosviljelylevyille käyttämällä modifioitua MTS /PMS-määritys (Promega, Madison, WI).

Gaussia lusiferaasianalyysissä

gluc aktiivisuus arvioitiin 10 ui näytettä kudosviljelmän media tai seerumista kemiluminesenssi määritys [45] koskevasta autoinjecting luminometrissä ruiskuttamalla 50 ui 50 uM koelenteratsiini (Prolume, Pinetop, AZ) kunkin näytteen kolmena kappaleena ja integroimalla signaali 2,5 sekunnin [26].

virus biojakaantumi-

Eläinkokeet oli hyväksynyt Cincinnati lastensairaalassa Institutional Animal Care ja Käytä komitean (eläinten protokolla # 9D12095). 5-6 viikon ikäisiä Balb /c-kateenkorvattomia nude-hiiriä (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) injektoitiin 1-5 miljoonaa soluja. Solut valmistettiin 33% Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA) ja 66%: fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS, pH 7,4) ihon alle (s.q.) injektio ja PBS ainoastaan ​​munuaisten subcapsule (r.s.c) tai vatsaonteloon (i.p.) injektiona. Virusannosten on kuvattu tekstissä. Virus suspendoitiin 100-150 ui PBS: häntälaskimoon injektioita ja 50-100 ui PBS: kasvaimensisäistä injektioita, joka jaettiin 5 jakeet koko kasvain.

Kudospreparointi ja immunofluoresenssilla

kudokset kiinnitettiin, upotettu, ja leikataan 12-mikronin leikkeitä tavanomaisia ​​menettelytapoja käyttäen. Leikkeitä läpäiseviksi 0,2% Triton-X PBS: ssa 10 minuuttia, jumissa 10% normaalia vuohen seerumia 60-90 minuuttia, ja inkuboitiin Kana anti-GFP (# 16901, Millipore /Chemicon, Billerica, MA) 60 minuutin ajan , huuhdeltiin kolme kertaa PBS: llä, ja niitä inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen (vuohen anti-kana FITC, Jackson Immuno- Research, West Grove, PA), huuhdeltiin PBS: llä, ja päällystettiin Fluoromount-G (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA). Kaikki objektilasit, sitten kuvataan kanssa OpenLab Imaging Software (Improvision, Waltham, MA) on ylösalaisin fluoresoiva Zeiss mikroskoopilla.

HSV-genomin kvantitoimiseksi

DNA eristettiin hiiren kudoksista käyttäen Gentra Puregene-DNA-eristys (Qiagen, Valencia, CA) ja mittaamaan NanoDrop 2000 spektrofotometrillä (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen ABI 7500 järjestelmä (Applied Biosystem, Foster City, CA) [46]. Standardit tehtiin puhdistettiin HSV1716 viruksen DNA.

RQ-M38G geenien ilmentyminen ja replikaatio tutkimukset solulinjoissa

Solut infektoitiin 12-kuoppaisilla levyillä 1 tunnin ja korjataan ajoittain ilmoitettu. 100 ui solususpensiota käytettiin mittaamiseen Gaussia lusiferaasin, kun taas jäljelle jäävä solususpensio altistettiin kolme sykliä jäädytys-sulatus ja sentrifugoitiin 20000 x g. Pelletit resuspendoitiin 200 ul PBS: ää. DNA eristettiin käyttäen DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA). Nopea reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen 7900HT nopeasti Real Time PCR System (Applied Biosystem, Foster City, CA). Standardi DNA: ta tai DNA: ta infektoiduista soluista (40 ng) lisättiin 10 ui SYBR Esiseos Ex Taq II Kit (TaKaRa, Otsu, Shiga, Japani), 1,6 ui tymidiinikinaasin alukeseosta (TK 290-F: 5 ’ TCG CGA ACA TCT ACA CCA CAC AAC, TK 400-R: 5 ’CGG CAT AAG GCA TGC CCA TTG TTA; kukin 400 nM), 0,4 ui Rox (TaKaRa) ja PCR-laatua olevaa vettä, lopulliseen tilavuuteen 20 ui per reaktio. PCR oli 1 sykli 95 ° C 30 sekuntia, 40 sykliä 95 ° C: ssa 3 sekunnin ajan, 60 ° C: ssa 15 sekunnin ajan ja 72 ° C: ssa 25 sekunnin ajan.

In vivo

kuvantaminen

Hiiret injektoitiin ip 150 mg /kg D-lusiferiinin (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) ja kuvantaa IVIS200 (Calipur Lifesciences).

tukeminen Information

Kuva S1.