Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

Aldehydi (ALDH) ilmentävien solujen on luonnehdittu hallussaan kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia. Arvioimme ALDH + munasarjasyövän kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia ja niiden rooli platinaa vastarintaa.

Methods

isogeenisiin munasarjasyövän solulinjoissa platinan herkkyys (A2780) ja platina kestävät (A2780 /CP70) kuin sekä vesivatsoja munasarjasyöpä potilasta analysoitiin ALDH + virtaussytometrialla määrittää sen yhdistyksen platinaa vastarintaa, toistuminen ja selviytymistä. Vakaa shRNA Knockdown mallina ALDH1A1 käytettiin määrittämään sen vaikutus syövän kantasoluja kaltaisia ​​ominaisuuksia, solusyklin tarkastuspisteitä, ja DNA: n korjaus välittäjiä.

Tulokset

ALDH tila korreloi suoraan platinaa vastarintaa perus munasarjasyöpä näytteestä saatujen askites. Potilaat, joilla ALDH

HIGH näy merkittävästi pienempi ilman taudin etenemistä kuin potilaiden ALDH

LOW soluja (9 vs. 3 kuukautta, vastaavasti p 0,01). ALDH1A1-Knockdown merkittävästi heikennetty klonogeeniset potentiaalia, PARP-1-proteiinin tasot, ja käänteinen luontainen platinaa vastarintaa. ALDH1A1-Knockdown johti dramaattiseen pieneneminen Klf4 ja p21-proteiinin tasot mikä johtaa S ja G2 vaihe kertymistä soluihin. Kohonneita S ja G2 solut osoittivat lisääntyneen ilmentymisen lisääntymään stressi liittyy Fanconin anemia DNA korjaukseen proteiineja (FANCD2, FANCJ) ja replikointi tarkistuspisteen (pS317 Chk1) vaikutti. ALDH1A1-Knockdown aiheuttama DNA-vaurioita, osoituksena vankka induktion γ-H2AX ja BAX välittämää apoptoosia, jossa merkitsevää BRCA1 ilmaisua, mikä viittaa ALDH1A1 riippuva säätely solusyklin tarkastuspisteitä ja DNA korjausverkostoja munasarjasyövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja.

Johtopäätös

Nämä tiedot viittaavat siihen, että munasarjasyöpä soluja, jotka ilmentävät ALDH1A1 saa pitää platina vastarintaa muuttunut säätely solusyklin Checkpoint ja DNA korjaus verkon signalointi.

Citation: Meng E, Mitra , Tripathi K, Finan MA, Scalici J, McClellan S, et ai. (2014) ALDH1A1 Ylläpitää munasarjasyöpä Stem Cell-Like Properties by Altered asetuksella Cell Cycle Checkpoint ja DNA korjaus Network Signaling. PLoS ONE 9 (9): e107142. doi: 10,1371 /journal.pone.0107142

Editor: Robertus AM. de Bruin, University College London, Iso-Britannia

vastaanotettu: toukokuu 13, 2014; Hyväksytty: 07 elokuu 2014; Julkaistu: 12 syyskuu 2014

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Data Saatavuus: Kirjoittajat vahvistaa, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat naistentautien Syöpäsäätiön Sherri n From Whisper on Roar, Naisten Moottoripyörä Foundation Munasarjojen Cancer Research Award ja The Eleanor Ruth Frenkel rahasto Munasarjojen Cancer Research (RPR); NIH apurahan R01GM098956, ja Abraham Mitchell Endowment avustus (K.P.). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on kaikkein vaarallisin kaikista gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia, jotka vaikuttavat yli 22000 naisten elämä vuosittain pelkästään Yhdysvalloissa. Vaikka suurin osa munasarjasyöpä potilaiden saavuttaa täydellisen alustava kliininen vaste sytoreduktiivisen leikkausta seuraa yhdistelmä kemoterapiaa, useimmat kokevat uusiutumisen ja valitettavasti periksi taudin etenemiseen [1]. Vital ennuste munasarjasyöpä potilaiden taudin vaihteleva herkkyys platinaa aineita. Vaikka jatkumo, potilaat ovat stratifioituna sairautensa alkuperäinen vastaus platinaa kemoterapiaa joko ”platina-herkkä” tai ”platina kestävä” määritellään pituus uusiutumisen väliajan. Tämä spektri on erittäin ennustettavissa kliinisen päätepisteet kun syöpä uusiutuu, menestys kirurgian ja /tai kemoterapiaa at toistuminen, ja potilaan eloonjäämiseen.

on epäyhtenäistä syövän, eivät kaikki solut sisällä maligniteetti olisi olettaa olevan resistenttejä kemoterapiaa. Syöpä kantasolut (CSCS) teoria esittää, että nämä resistenttien solujen kattavat vain vähemmistö solujen syöpä, mutta on yksin vastuussa pitkän aikavälin uusiutumisen [2]. Siten riippumatta alkuperäisen hoitovaste, jos kemoterapia ei hävittää nämä kestävät CSCS, niin syöpä uudistua ja toistuminen tai sairauden etenemisen tapahtuu. Tunnistaminen Näiden resistenttien solujen ja määrittämällä niiden luontaisia ​​molekyylitason reitit ovat ensiarvoisen löytää tehokkaampia hoitomuotoja kehitettäessä [3]. Näin ollen yksi strategia parantaa onnistumisen munasarjasyövän hoito on parantaa CSCS herkkyys platinaa aineita. Voittaminen platinaa vastus olisi tärkeää hoidettaessa munasarjasyöpää kanssa mahdollisia etuja tehostetun hoitovasteen pitempään selviytyminen, ja lisää parannuskeinoja.

Äskettäin aldehydi (ALDH) aktiivisuus on osoitettu olevan erittäin houkutteleva CSCS merkki monissa syövissä, kuten keuhko- [4], rintojen [5], eturauhas- [6], kilpirauhasen [7], pään ja kaulan alueen syöpä [8], ja munasarjasyöpä [9] – [12]. ALDH perhe koostuu sytosolin isoentsyymien hapettavat solunsisäisen aldehydien, mikä edistää hapettumista retinolia retinoiinihappo- alussa kantasolujen erilaistumista [4]. Ihmisen ALDH Yläheimo koostuu tällä hetkellä 19 tiedossa oletettavasti funktionaalisia geenejä 11 perhettä ja 4 subfamilies erottuva kromosomipaikoissa. Valtavan ALDH perheiden ja subfamilies, ALDH1A1 on ollut voimassa merkki useiden pahanlaatuinen kudosten. Se pitää houkutteleva eroa paitsi että mahdollinen merkkiaine stemness mutta mahdollisesti pelissä rooli biologiassa kasvaimeen aloittamista solujen samoin [13]. Lisäksi ALDH1A1 subpopulaatio oli osoittanut liittyä chemoresistance munasarjasyöpää sairastavilla potilailla [9], [14].

Viimeaikaiset tutkimukset rintasyövän malleissa osoitti mielenkiintoinen suhde BRCA1 ja kantasolujen erilaistumista [15], [16]. BRCA1 on myös osoitettu olevan tärkeä rooli rintarauhaskudokseen erilaistumiseen säätelemällä Notch signalointi ja kasvaimen vaste anti-hormonaalisen hoidon [14]. Erityisesti käänteinen suhde ALDH1A1 ilmaisun ja BRCA1 on huomionarvoista yhteydessä opiskelu syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja ja chemoresistance. BRCA1 on merkittäviä rooleja suojelussa genomin poikkeavasta DNA vaurioita, ja mutaatioita tai poisto tässä geenissä johtaa genomiin epävakauden ja lisääntyneen rinta-, munasarja- ja muut syövät [17]. Vastauksena DNA vaurioita sitä nopeasti paikantuu sivustoja kaksinkertaisen säikeen katkoksia (DSB) ja välittää useita signalointi vasteita kuten solusyklin tarkastuspisteitä ja valinta DNA korjaukseen liittyvä reitti korjata nämä vauriot [17] – [19]. Kuitenkin BRCA1 tila ja ALDH + munasarjasyöpä kantasoluja kaltaisia ​​soluja huolto sekä vastustuskyky kemoterapia ei ole tutkittu.

osoittaa, että ALDH + fenotyyppiä hallussaan CSC ominaisuudet tehostetun hyökkäyksen, pesäkkeiden muodostumista, ja kantasolujen merkkiaineita. Erityinen ALDH1A1 isotyypin näyttää olevan vastuussa ALDH välittämän platinaa vastarintaa sekä kliinisesti sekä

in vitro

malleja. Tuloksemme tukee ALDH1A1 välittämä platinaa vastus mekanismin munasarjasyövän kautta muuttuneeseen sääntely solusyklin Checkpoint ja DNA korjaus verkon signalointi.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja Cultures

A2780 ja isogeenisen sisplatiini kestävä A2780 /CP70 solulinja, kuten aiemmin on kuvattu [20].

ALDEFLUOR määritys ja Fluoresenssi-solulajittelun

eristämiseksi solupopulaation, joilla on korkea ALDH entsymaattinen aktiivisuus, ALDEFLUOR iinianalyysikitissä (StemCell Technologies Inc.) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Jälkeen trypsiinikäsittelyllä, solut suspendoitiin ALDEFLUOR määrityspuskuriin, joka sisälsi ALDH entsyymisubstraatin BODIPY-aminoasetaldehydi (BAAA), ja inkuboitiin 37 ° C: ssa noin 40 minuuttia. Solut värjättiin käyttäen identtisiä olosuhteita erityisten ALDH-inhibiittoria, diethylaminobenzaldehyde (DEAB), joka toimii negatiivisena kontrollina. Virtaussytometria lajittelu suoritettiin käyttäen BD Bioscience Aria II Sorp solulajittelijalla.

Syöpää Ominaisuudet

Lajittelun jälkeen ALDH fenotyyppien (ALDH + vs. ALDH-), matrigeelin invaasio ja pehmeä agar pesäkkeiden muodostumisen määritykset suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [21]. Vaikutuksen arvioimiseksi kemoterapian kolonioiden muodostumista, soluja käsiteltiin tuoreella liuoksella, jossa on 20 uM karboplatiinin lisätään 3-4 päivän välein. Näkyvä pesäkkeet ( 50 solua) laskettiin viiden satunnaisesti valitun 40X mikroskooppikentäs- kuhunkin kuoppaan.

CellTiter-Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys

Lajiteltu A2780 /CP70 solut maljattiin tiheydellä 4000 solua per kuoppa 96-musta levy, jossa kirkas pohja (Corning, NY, USA). Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla karboplatiinin jopa 72 tuntia. 24, 48 ja 72 tuntia, 100 ui CellTiter-Glo-reagenssia (Promega) kuoppaa kohti lisättiin, inkuboitiin 10 minuuttia huoneen lämpötilassa ja luminesenssi tallennettiin Synergy H4 Hybrid Reader (BioTek).

reaaliaikainen Kvantitatiivinen RT-PCR

reaaliaikainen Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [21]. Alukkeita ja koettimia varten TaqMan-järjestelmä valittiin Applied Biosystems verkkosivuilla [BMI1 määritys ID: Hs00180411_m1, c-myc määritys ID: Hs00905030_m1, Kruppel kaltainen tekijä 4 (Klf4) määritys ID: Hs00358836_m1, Oct3 /4 määritys ID: Hs01009568_m1, S100 kalsiumia sitova proteiini A1 (S100A1) määritys ID: Hs00984741_m1, ALDH1A1 määritys ID: Hs00946916_m1, CDKN1A (p21) määritys ID: Hs00355782_m1, sisäisen valvonnan glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi määritys ID: Hs99999905_m1]. Suhteellinen ilmentyminen mRNA tasoilla BMI1, c-myc, Oct3 /4, Klf4, S100A1, ALDH1A1, p21, laskettiin käyttäen ΔΔCt menetelmää ja normalisoinnin GAPDH.

Lentivirusvektorikonstruktit shRNA Vector transfektio

Kuusi eri pGIPZ Lentivirusvektorikonstruktit shRNA glyserolikantaliuoksia vastaan ​​ALDH1A1 ja yksi negatiivinen kontrolli shRNA (Thermo Scientific) transfektoitiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. A2780 /CP70-solut maljattiin tiheydellä 2 x 10

5 solua per kuoppa 6-kuoppaiselle levylle 18-24 tuntia. Kunkin hyvin, 2 ug shRNA plasmidi-DNA: ta (pGIPZ) transfektoitiin A2780 /CP70 käyttäen pidätys-In-reagenssia (Thermo Scientific, USA). Puromysiinin (0,8 ug /ml) käytetään valitsemaan transfektoiduista soluista. Optimoinnin jälkeen, ALDH1A1-pudotus tehokkuutta yksittäisten shRNAs arvioitiin käyttäen reaaliaikaista kvantitatiivista PCR: ää ja Western Blot. Vektori 398453 osoitti tehokkain transfektion yli 95% pudotus tehoa ALDH1A1 ja käytettiin kaikkiin shRNA pudotus kokeissa.

Western blot -analyysi

Viljellyt solut kerättiin NP-40-lyysauspuskurissa 10 ul /ml proteaasiestäjäseostabletit (Sigma) ja alistettiin immunoblottauksella analyysi standarditekniikoilla käyttämällä vasta-aineita vastaan ​​ALDH1A1, FANCJ, Klf4 (Sigma-Aldrich), FANCD2, PARP-1, XRCC1, β-aktiini, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), ja p21, fosfo-Chk1 (Ser317), BRCA1-aineita (Cell Signaling Technology).

RT

2 Profiler PCR Array

ihmisen Cancer Drug Resistance Cell Cycle RT

2 Profiler PCR Array (Qiagen, USA) käytettiin profiloida ilmentymistä 84 geenien mukana syöpälääkkeen vastuksen ja solukierron viisi taloudenhoito geenien valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kontrollit genomisen DNA-kontaminaation ja tehokkuutta RT-PCR ja PCR-reaktiot analysoitiin myös. PCR-taulukot suoritettiin käyttämällä Bio-Rad iQ5 reaaliaikainen havaitseminen järjestelmä (Bio-Rad).

Cell Cycle Analyysi virtaussytometria

A2780 /CP70 solut transfektoitiin kontrolli tai shRNAs kohdistus ALDH1A1 käyttäen Lipofectamine 2000 (Life Technologies), ja solut kerättiin ja värjättiin solusyklin analyysi mukaan valmistajan ohjeiden (BD Biosciences). Solut 10

6 suspendoitiin uudelleen 300 ui PBS: ää, ja 700 ui jääkylmää metanolia korjata soluja yön yli -20 ° C: ssa. Solut pestiin kahdesti PBS: llä, ja sen jälkeen värjättiin 500 ul: propidiumjodidilla (BD Bioscience), huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan pimeässä. Solusyklin profiilit analysoitiin virtaussytometrialla.

Apoptosis Assay

A2780 /CP70: llä transfektoitujen solujen negatiivisena kontrollina tai shRNA-ALDH1A1 indusoitiin apoptoosi käsittelemällä 1,0 uM staurosporiini 6 tunnin ajan [22 ], [23]. APC-anneksiini V: n ja 7-AAD värjäys suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kukin ryhmä sisältää kolme isotyyppikontrolleja: unstained solut; solut värjättiin APC anneksiini V yksin; solut värjättiin 7-AAD yksin. Näytteet analysoitiin virtaussytometrialla.

PARP Activity Assay

PARP-aktiivisuus mitattiin käyttämällä HT PARP in vivo Farmakodynaamiset Assay II Kit (Trevigen). Käsittelyn jälkeen 100 uM karboplatiinin 45 minuuttia, A2780 /CP70: llä transfektoitujen solujen negatiivisena kontrollina tai shRNA-ALDH1A1 pestiin kahdesti 5 ml: aan lämmintä (37 ° C) PBS: ssä. Solut kaavittiin 300 pl: aan kylmää solun lyysipuskuria ja inkuboitiin jäillä 15 minuutin ajan. SDS lisättiin näytteisiin, jotta SDS: n loppukonsentraatioksi 1%, ja inkuboitiin 100 ° C: ssa 5 minuutin ajan. Kun näytteitä jäähdytettiin huoneenlämpötilaan, 0,01 tilavuus 100X Magnesium kationin ja 2 ui DNaasi I (2 yksikköä /ul) lisättiin näytteisiin ja niitä inkuboitiin vielä 90 minuuttia 37 ° C: ssa. Kun lyhyt sentrifugointi, supernatantit kerättiin ja polyADP-riboosin (PAR) tasot solu-uutteet kvantitoitiin käyttäen ELISA-menetelmää.

Clinical Correlation

Kaikki osallistujat, jos niiden kirjallinen tietoinen suostumus osallistua tässä tutkimuksessa ja Institutional Review board yliopistossa South Alabama Health System hyväksyi tämän tutkimuksen, samoin kuin lupamenettelyssä. Vesivatsoja 15 peräkkäistä leikkauspotilaiden varten pitkälle IIIC /IV papillaarisen serous munasarjasyöpä sekä 2, joilla on hyvänlaatuinen askites kerättiin ja välittömästi käsitelty suorittamaan ALDEFLUOR määrityksen jälkeen pesemällä ne PBS: llä ja poistamalla punasolujen käyttäen ACK hajotuspuskuria (Lonza , Walkersville, MD, USA). Ennusteeseen viittaavia kerättiin vastaaville potilaille ja korreloi solujen prosenttiosuus näytteillä ALDH + fenotyyppi niiden askites.

Tilastollinen analyysi

vertailut kahden ryhmän välillä suoritettiin käyttäen Studentin t-testiä ja ANOVA missä tarkoituksenmukaista. Tilastollinen merkittävyys määritettiin

p

0,05. Kaplan-Meier käyrä suoritettiin selviytymisen log-rank varten tilastollista vertailua.

Tulokset

ALDH asema korreloi munasarjasyöpä vastustuskykyä platinavalmisteisiin

isogeenisiin solulinjoja platinaa herkkä (A2780) ja resistenttejä (A2780 /CP70) munasarjasyöpäsoluja arvioitiin niiden eloonjäämisluvut läsnä ja poissa erilaisia ​​annoksia karboplatiinia. Vastaa aiemmin raportoidut tulokset [24], [25], A2780 /CP70 soluja tarvitaan jopa 10 kertaa suurempi annos karboplatiinia saavuttaa IC

50 pitoisuutta kuin sen platina herkkä vastine, A2780 (kuva 1A) . Viime aikoina useissa syövän malleja, ALDH asema on osallistuvat kasvaimen vastustuskyky kemoterapia ylläpitämällä syövän kantasoluja kaltaisten solujen ominaisuuksien kuten aggressiivinen kasvu, elonjäämisetua ja uudelleen eriyttäminen potentiaali [9]. Jotta voidaan testata korrelaatio ALDH aseman ja platinaa resistenssin munasarjasyöpäsoluja, ALDEFLOUR määritykset suoritettiin seuraavilla isogeenisistä soluissa. Mielenkiintoista platina kestävät munasarjasyövän A2780 /CP70 näytteillä vähintään 110-kertainen osuus ALDH + solujen (vaihteluväli 22-40%) verrattuna platina herkkä A2780 soluissa, joka oli vain 0,2% ALDH + soluista (kuvio 1 B) . Samoin western blot-analyysi ALDH1A1 proteiinin tasot näissä soluissa paljasti samanlaisia ​​tuloksia, mikä viittaa yhdistys ALDH aseman platinaa vastus (kuvio 1 C).

isogeenisiin solulinjoissa (A2780- platina herkkä A2780 /CP70- platina kestävä) arvioitiin platinan vaste käyttämällä lääkettä herkkyys määrityksessä, kuten on kuvattu M M osassa (A). Arvioimaan prosenttia ALDH + -solujen, A2780 ja A2780 /CP70-solujen ALDEFLUOR määritys suoritettiin käyttäen BODIPY-aminoasetaldehydi (BAAA) substraattina ALDH entsyymiä, 40 minuutin kuluttua oli inkuboitu 37 ° C: virtaussytometria-analyysi suoritettiin (B) ja western blot tiedot osoittavat edustaa tasoa ALDH1A1 isoentsyymin näissä soluissa (C).

sen arvioimiseksi, onko ALDH + syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja esiintyy myös ensisijainen kasvaimia ja sen yhdessä ilman taudin etenemistä potilaiden olemme koonneet askites 15 munasarjasyöpää sairastavien potilaiden edennyt sairaus ja 2 hyvänlaatuinen vesivatsoja Meigs syndrooma potilaiden ja analysoitiin prosenttia solujen ALDH ilme käyttäen ALDEFLOUR määritystä. Suostumuksella syöpää kantasolujen hypoteesi, ALDH + soluja oli läsnä paljon suurempia prosenttiosuus maligni askites verrattuna niiden hyvänlaatuinen kollegansa. Prosenttiosuus ALDH + -solujen maligni askites vaihteli 1,3-25,4% (potilaat 3-17) verrattuna 2 hyvänlaatuinen askites (potilaat 1 2) (kuvio 2A). Tärkeintä on, prosenttia ALDH + solujen potilaiden Askites korreloi käänteisesti ilman taudin etenemistä. Potilaat että näytteillä ALDH

HIGH ( 15% ALDH) niiden askites oli merkittävästi pienempi ilman taudin etenemistä verrattuna potilaisiin, joiden ALDH

LOW ( 15% ALDH) (3 vs. 9 kuukautta, vastaavasti;

p

= 0,003) (kuvio 2B). Vaikka on vaikeaa tehdä mielekästä johtopäätös johtuen rajallinen määrä askitesta Tässä tutkimuksessa käytetyt, nämä tiedot osoittavat suoraa kliinistä korrelaatio ALDH aseman tuumorivaste platinaan tekijöille ja ilman taudin etenemistä ja munasarjasyöpä potilaille.

Askites 15 peräkkäisen primaarisessa pitkälle III /IV munasarjasyöpä ja 2 hyvänlaatuisesta (Miegs oireyhtymä) saatiin ja analysoitiin prosenttiosuus ALDH + solujen kautta ALDEFLUOR määrityksessä. Histogrammi on upotettavat osoittaa prosenttia ALDH + solujen hyvän- että pahanlaatuisia askites (A). Ennusteeseen viittaavia tietoja munasarjasyöpä potilasta korreloi prosenttia ALDH + solujen niiden vatsaonteloon sekä arvioida ilman taudin etenemistä kanssa ALDH

HIGH ( 15% ALDH) ja ALDH

LOW ( 15% ALDH) potilaalla (3 vs. 9 kuukautta, vastaavasti;

p

0,01) (B).

ALDH + munasarjasyöpäsoluja näyttelyesineitä kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia

Nämä tulokset johtivat meidät edelleen luonnehtia ALDH mahdollisena kantasolujen markkerina munasarjasyöpä. Syövän etenemistä voidaan yhdistää läsnäolo osajoukko soluja, jotka ilmentävät kantasolujen markkereita ja näytteille aggressiivista käyttäytymistä ominaisuuksia kuten invasiivisia ja lisääntynyt pesäkemuodostusta potentiaalia. Tutkia niiden invasiivisia ominaisuuksia, lajitellut solut (ALDH + vs. ALDH-) arvioitiin käyttäen Matrigel invaasiomääritys. Kuten on esitetty kuvioissa 3A 3B, ALDH + solut osoittivat yli 1,7-kertainen lisäys (

p

0,01) hyökkäyksen kautta Matrigel verrattuna ALDH- soluihin.

A2780 /CP70 solut lajiteltiin ALDH- ja ALDH + fenotyyppien ja arvioitiin niiden kykyjä varten hyökkäystä käyttäen matrigeelin invaasio kammiota (A), kvantitatiivinen data edustama (B) ja pesäkkeiden muodostumista mahdollisten läsnä ja poissa ollessa karboplatiinin (20 uM) arvioitiin käyttäen pehmytagar pesäkkeiden muodostumisen määritykset (C). Jotta voidaan määrittää mahdollinen mekanismi syövän kantasolujen ominaisuuksia ALDH + -solujen, arvioimme useita markkereita ”stemness”. A2780 /CP70 solut lajiteltiin ALDH- ja ALDH + fenotyyppiä, kokonais-RNA eristettiin cDNA valmistettiin ja reaaliaikaisella kvantitatiivisella RT-PCR suoritettiin (D). ** Ilmaisee tilastollista merkittävyyttä (

p

0,01).

Toinen korvike toimenpide luonnehtia syövän kantasoluja kaltaisia ​​soluja on kyky muodostaa pesäkkeitä, erityisesti kun läsnä on kemoterapeuttisten [26]. Sopusoinnussa niiden invasiivisen potentiaalia, ALDH + solut osoittivat tehostetut pesäkkeiden muodostumisen kyky verrattuna ALDH- fenotyypit (2-kertainen,

p

0,01). Tärkeää on, ALDH + fenotyypit tehostunut pesäkkeiden muodostumisen mahdollisuuden, kun läsnä on karboplatiini (5,4-kertainen lisäys,

p

0,01) (kuvio 3C). Jotta saadaan käsitys mahdollinen varsi kaltaiset mekanismit näiden solujen, arvioimme potentiaalisia kantasolujen reittejä kohteisiin näissä soluissa. RT-PCR-tiedot osoittivat lähes 3-kertainen tason ilmentymistä Kruppel-Like Factor 4 (Klf4) in ALDH + soluissa verrattuna niiden ALDH- kollegansa. Klf4 kuuluu sinkkisormipolypeptidiin perheen transkriptiotekijöiden, jonka on raportoitu olevan kriittisiä ylläpitämiseen rintasyövän kantasolujen ja niiden aggressiivinen käyttäytyminen kuten muuttoliike ja invaasio mainos vastustuskykyä Sisplatiinin [27] [28]. Kuitenkin muut kantasolun välittäjäaineiden kuten BMI1, c-myc, Oct3 /4 ja S100A1 eivät osoittaneet mitään havaittavia muutoksia niiden ilmentyminen verrattuna ALDH- fenotyypit (

p

0,01) (kuvio 3D).

ALDH1A1 isotyypin edistää munasarjasyöpä kantasoluja kaltaisia ​​soluja ”ominaisuuksia

yhdenmukainen CSC kirjallisuutta, meidän paljastivat kohonnut ilmentyminen ALDH1A1 isoentsyymin platina kestävät A2780 /CP70 soluja. Arvioida tarkemmin roolin ALDH1A1 kunnossapidon syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja ominaisuudet platinaa resistenttien munasarjasyöpäsoluja olemme vaimentua ALDH1A1 erityisiä isoentsyymin avulla shRNAs (kuva S1). Toisin kuin korkea ilmaisun downregulation ALDH1A1 ei ole osoittanut mitään merkittäviä eroja invasiivisia ominaisuuksia näiden solujen (kuvio 4A 4B). Kuitenkin ALDH1A1 knockdown vaikuttaa niiden kyky muodostaa pesäkkeitä pehmeässä agarissa, mikä osoittaa 2,5-kertaisen laskun pesäkkeet (

p

0,01) (kuvio 4C). Samoin downregulation ALDH1A1 yksin merkittävästi herkistyneet luontaisesti platina kestävät A2780 /CP70 solujen karboplatiinia. Ottaen IC

50 annosta vaaditaan (82,9 uM ja 43,8 uM negatiivisen kontrollin ja shALDH1A1 soluissa) näille soluille, noin 50%: n vähennys karboplatiini annos on ilmeistä ALDH1A1 pudotus soluja (

p

0,001 ) (kuvio 4D). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että ALDH1A1 tila on yksi kriittisistä tekijöistä ylläpitämisessä varsi-tyyppisten solujen ominaisuuksia ja platinaa vastus munasarjasyöpä.

Lentivirusvektorit ilmentävät ALDH1A1 erityisiä shRNAs tai nontargeting shRNAs transfektoitiin A2780 /CP70-soluja ja sen vaikutus kantasolujen kaltaisia ​​solujen ominaisuudet arvioitiin invasiivisia potentiaaliset matrigeelin invaasio kammiota (A), kvantitatiivinen data edustama (B), klonogeeniset potentiaaliset pehmytagar pesäkkeiden muodostumisen (C, ja karboplatiinin riippuvainen kasvun inhibition CellTiter-Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys (D). tilastollinen merkitsevyys arvioitiin käyttäen opiskelijan

t-testiä.

ALDH1A1 ohjaa solusyklin tarkastuspisteitä säätelyn Klf4 ja p21-proteiineja

lisääntynyt ilmentyminen Klf4 vuonna ALDH + soluissa (kuvio 3D) johti meidät arvioimaan mitään toiminnallista suhdetta ALDH1A1 ja Klf4. Vaikka ALDH1A1 knockdown ei vaikuttanut tasoon Klf4 mRNA, merkittävä lasku Klf4 proteiinin tasot näkyi näissä soluissa (kuvio 5A ). Ottaen huomioon, että toiminnallisen tilan solusyklin säädin p21 liittyy läheisesti Klf4 tehtävänä, mRNA ja proteiini tasoja p21 arvioitiin myös. Kuten odotettua, sekä ALDH1A1 transkriptio ja proteiinin tasot p21 dramaattisesti vähentynyt ALDH1A1 puutteellinen A2780 /CP70-soluja (kuvio 5A). Koska ALDH1A1 tila vaikutti ilmaus solusyklin tarkastuspiste proteiinien p21 /CDK4, me edelleen analysoineet solusyklin profiilit näiden solujen. Virtaussytometrianalyysissä Tiedot osoittavat selvästi vähentynyt G1 solupopulaation (50,25%: sta 42,10%) ja kompensoiva nousu kertyminen solujen S- ja G2-vaiheissa (kuvio 5B). Johtuen siitä, että solut aktiivinen replikaation (S ja G2 vaiheet) ovat alttiimpia genotoksisten stressiä verrattuna niiden ei-jakamisesta tai muu levoton vaiheiden (G0 ja G1), uudelleen herkistää ALDH1A1 puutteelliset solut voivat olla osittain johtuu muutoksiin solusyklin jakeluun. Lisäksi olemme myös vahvistaneet, että Klf4 tila vaikuttaa p21 ekspressiotasot A2780 /CP70-soluja (kuvio S2A S2B). Kuitenkin arvioinnin ALDH aktiivisuus ja ALDH1A1 ilmentymistä soluissa ei esiintynyt mitään havaittavia muutoksia, mikä viittaa siihen, Klf4 todennäköisesti toimii alavirtaan ALDH1A1 (kuvio S2C).

ALDH1A1 taitavia ja puutteellinen A2780 /CP70-soluja arvioitiin ilmentymisen kantasolujen -kuten solumarkkerigeenien Klf4 ja solusyklin Checkpoint proteiinin p21 RT-PCR ja Western blot-analyysi (A). Solusyklin jakaumat soluja analysoitiin sen jälkeen, kun vahvistamisesta solujen 70% metanolia ja propidiumjodidivärjäys sen jälkeen virtaussytometrialla (B). Apoptoottisia soluja havaittiin värjäyksen jälkeen solut APC-anneksiini V ja 7-AAD mukaan valmistajan ohjeiden ja analysoitiin virtaussytometrillä (C).

edelleen arvioimista vastuussa olevien geenien chemoresistance ja solujen sykli asetus perustuu tilan ALDH1A1, olemme käyttäneet RT

2 Profiler PCR Array ihmisen Cancer Drug Resistance Cell Cycle (Ambion). Vertaileva ilmentyminen profiilit geenien ALDH1A1 pudotus vs. kontrolli solut paljasti huomattavan laskun ilmentyminen solun lukiertosäätelijöistä CDKN1A (p21) (0,27-kertainen) ja CDK4 (0,26-kertainen), mikä vahvistaa sen roolia yhdessä Klf4 ( Taulukko 1).

Huomattavaa on, että palautettu platinaa herkkyydessä ALDH1A1 knockdovvn, ilmaus proapoptoottisten tekijä BAX säädeltiin lähes 3,95-kertaiseksi. ALDH1A1 pudotus osoittaa, lisääntynyt solujen määrä alussa apoptoottisen vaiheessa kontrolliin verrattuna. Altistuksen jälkeen soluja 1,0 uM staurosporiini 6 tuntia, dramaattinen kasvu alussa apoptoottisia soluja havaittiin ALDH1A1 vajaiden solujen verrattuna niiden ALDH1A1 taitavia counter osat (35,3% vs. 20,3%) (kuvio 5C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että ALDH1A1 pudotus solut ovat alttiimpia BAX: n indusoiman apoptoosin, joka on kuvattu hyvin inhibition p21 solusykliä tarkastuspiste [29].

ALDH1A1-välitteisen platinaa vastarintaa korreloi muuttunut DNA: n korjaukseen verkkojen

Ehjä solusyklin tarkastuspisteitä ja DNA-vaurioita vastaus (DDR) viestinvälitystekniikoita ovat tärkeitä solun: n kyky vastata erilaisten genomisten loukkauksia ja hallittu kehitys solusyklin. Kuitenkin yhteinen piirre syöpäsolujen muuttuu sääntely näiden signa- hankkia lisää geneettisiä muutoksia tarvitaan uudelleen erilaistumisen ja eloonjäämisen siten näyttää terapeuttisia vastus. Samoin ALDH1A1 soluilla muuttunut säätely KFL4 /p21 välittämä solusyklin Checkpoint mekanismi, joka ensisijaisesti ohjaa estyminen G1 S ja G2 M etenemistä vastauksena DNA vaurioita jäisi enemmän aikaa solujen korjata. Ottaen huomioon yhdistys PARP-1 korjaus karboplatiinin aiheuttama DNA vaurioita, arvioimme sen osallistuminen ALDH1A1 soluissa. PARP-1 tasot asteittain nostaa enintään 45 minuutin ajan karboplatiinihoitoa (kuvio 6A ja 6B). Kuitenkin downregulation ALDH1A1 aiheutti huomattavaa laskua (1,8-kertainen) yhteensä PAR tasoilla (PARP-aktiivisuutta) (kuvio 6C) verrattuna ALDH1A1 taitavia soluihin (

p

= 0,012).

ALDH1A1 taitavia (kontrolli) ja puutteellinen (shALDH1A1) A2780 /CP70 soluja arvioitiin kykynsä korjata karboplatiini indusoi yhden säikeen katkoksia katsomalla aikariippuvainen induktion PARP-1-proteiinin tasot western blotit (A), densitometrisesti blotteja Image J ( B) ja yhteensä PARP-aktiivisuus määritettiin mittaamalla PAR tasot (C). Arvioida ALDH1A1 riippuvaisen ekspression DDR ja korjaus proteiineja, kokosolulysaateista normalisoitiin yhteensä proteiinien ja western blot-analyysi suoritettiin käyttäen vasta-aineita, kuten on esitetty (D).

Useat viimeaikaiset tutkimukset rintasyövästä Stern- solut osoittavat muuttunut säätely DNA korjausverkostoja, erityisesti käänteinen suhde ALDH1A1 tila ja BRCA1-geenin ilmentyminen [15], [16]. Lisäksi vastauksena DNA-vaurioita, BRCA1 tiedetään hallitsemaan solusyklin tarkastuspisteitä ja valinta DNA korjaukseen väyliä ajoissa korjata näitä DNA vaurioiden [16]. Yhdenmukainen rintasyöpä kantasolujen data, Western blot-analyysi paljasti käänteinen suhde ALDH1A1 ja BRCA1 ilmaisun A2780 /CP70 soluihin, mikä viittaa ALDH1A1 ilmentävät munasarjasyöpä kantasoluja kaltaisia ​​soluja todennäköisesti menettää tai ilmaista alhainen BRCA1. Tarkempi analyysi paljasti alas säätely ALDH1A1 indusoidun spontaanin DNA-vaurioita vastaus ilmaisemalla γ-H2AX proteiini (merkki kaksinkertainen säikeen katkoksia). Tämä on myös samaan aikaan vähentynyt taso Leikkauskorjauksessa proteiinia (XRCC1), replikointi tarkastuspiste kinaasiproteiini 1 (Chk1) ja muut replikointi stressi liittyvät Fanconin anemia (FA) -BRCA geenituotteiden FANCD2 ja FANCJ [30] – [32]. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että munasarjasyöpä kantasoluja kaltaisia ​​soluja voidaan säilyttää terapeuttinen vastus ilmaisemalla ALDH1A1 ja ehtyminen jotka kumottua G1 ja S-vaiheen tarkastuspisteiden (kuviot 5A ja 6C) johtavat replikaatioin- stressi (kuvio 5B). Vaikka ALDH1A1 köyhdytetty solujen kertynyt S ja G2-vaiheissa, fosforylaatiota tilan lisääntymään Checkpoint proteiinin Chk1 (Ser317) ja ilmentymistä replikaatiohaarukan liittyvän FA reitin proteiinit FANCD2 ja FANCJ vaikutti. Tämä on myös myönnetty induktion γ-H2AX, merkkiaine DSB ja vähentää solujen eloonjäämistä. Koska Chk1 ja FA proteiinit ovat tärkeitä replikointi tarkistuspiste ja vakautta pysähtynyt lisääntymään haarukat, spontaani DNA-vaurioita vastaus näissä soluissa voidaan katsoa johtuvan loikata näissä proteiineissa (kuvio 6D). Tunnistaa molekyyli verkon signaaleja, jotka ilmentyvät differentiaalisesti ALDH1A1 ilmentävien solujen olemme alun perin arvioitiin ilmentymistä Fanconin anemia reitin ja kasvaimen vastustuskyky kemoterapeuttisia aineita. Johdonmukaisesti, tuloksemme osoittivat suoraa korrelaatiota ALDH1A1 aseman ja FANCD2 ilme. Yhdessä meidän tiedot osoittavat yhteyden ALDH1A1 asema stemness ja platinaa vastus munasarjasyövän solujen muuttunut sääntelyä DNA korjaustöitä.

Keskustelu

Useat mahdollisten munasarja- CSCS erityinen pinta markkereita on kuvattu tällaisia kuten CD44 + /CD 117 + [33], CD44 + /MyD88 + [34], CD133 + [35], CD44 + /CD24- [21], [36] ja ALDH /CD133 + [37]. Havaitsemiseksi ALDH1A1 kautta ALDEFLUOR määritys on yksinkertainen ja tehokas lähestymistapa tunnistamiseksi ja eristämiseksi munasarjojen CSCS solulinjoista ja ensisijainen kudoksissa.