Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmisen syöpää, ilmaus

let-7

perhe pienenee merkittävästi, ja tähän liittyy lyhyempi elossaoloaika potilailla. Kuitenkin johtavien mekanismien

let-7

downregulation syövän ovat edelleen suurelta osin epäselvä. Koska muutos copy-numero on yksi syy geenin vapauttamisen syövän, tutkimme kopioluku korjauksilla

let-7

perheen 2969 syövän yksilöitä korkearesoluutioinen SNP array aineisto. Huomasimme, että oli väheneminen kopioluku

let-7

geenien syöpää tyyppikohtaisia ​​tavalla. Tärkeää on, polttoväli poistetaan neljä

let-7

perheenjäsenten havaittiin kolmessa syöpätyypeissä: medulloblastoma (

let-7a-2

ja

let-7e

), rintojen syöpä (

let-7a-2

), ja munasarjasyöpä (

let-7a-3 Twitter /

let-7b

). Esimerkiksi genominen locus kätkeminen

let-7a-3 Twitter /

let-7b

poistettiin 44% näytteitä munasarjasyöpä potilaille. Olemme myös löytäneet positiivinen korrelaatio kopioluvun

let-7b

ja kypsä

let-7b

ilmentymistä munasarjasyöpä. Lopuksi osoitimme, että palauttaminen

let-7b

ilmaisu vähentynyt voimakkaasti munasarjojen kasvaimen kasvu

in vitro

ja

in vivo

. Tuloksemme osoittavat, että kopiomäärä poisto on tärkeä mekanismi johtaa downregulation spesifisten

let-7

perheenjäsenten medulloblastoma, rinta-, ja munasarjojen syöpien. Palauttaminen

let-7

ilmentyminen kasvainsoluissa voisi tarjota uusia terapeuttisia strategia syövän hoitamiseksi.

Citation: Wang Y, Hu X, Greshock J, Shen L, Yang X, Shao Z, et al. (2012) Perimän DNA kopioluvun korjauksilla

let-7

Family ihmisen syövissä. PLoS ONE 7 (9): e44399. doi: 10,1371 /journal.pone.0044399

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 helmikuu 2012; Hyväksytty: 06 elokuu 2012; Julkaistu: 06 syyskuu 2012

Copyright: © Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin kokonaan tai osittain, National Institutes of Health Grant R01-CA142776 (LZ), P50-CA83638-7951 Project 3 (LZ), puolustusministeriön Grant W81XWH-10-1-0082 (LZ), ja munasarjojen Cancer Research Fund (LZ). ZS tukivat China Scholarship neuvosto. JT tukivat National Institutes of Health Grant 5K12HD000849. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta.

Kilpailevat edut: LZ on PLoS ONE Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

luonnehdinta heterochronic mutaatioiden

Caenorhabditis elegans

paljasti evolutionistisesti säilytetyn geneettinen polku, joka orchestrates molemmat ajoitus solunjakautumisten ja solujen kohtalot soveltuvalla kehitysvaiheen organismin [1] – [5]. Tässä reitissä microRNA (miRNA)

let-7

ohjaa etenemistä ajoitus tapahtumista ja varmistaa, että solusyklin exit ja terminaali eriyttäminen tapahtuu oikeaan aikaan [6], [7].

let-7

kohdegeenien

lin-28

(RNA sitovan proteiinin) ja

lin-41

(oletetun ubikitiinipromoottori ligaasilla) block

kirjaimien 7

kypsyminen ja vuorovaikutuksessa argonaute proteiineihin. Nämä heterochronic geenit näyttävät muodostaa bistabiili kytkinten kautta double-negatiivinen sääntely palaute silmukoita [2] – [5]. Expression of

LIN28

ja

LIN41

on erittäin rajoitettua erilaistumaton vaiheissa, kuten alkion kantasolujen, varhainen alkioita, ja tietyt somaattisia kantasoluja /progenitorisolujen. Sitä vastoin niiden sääntelyyn miRNA,

let-7

osoittaa vastavuoroisesti ohimolohkon malli, joka on kasvanut dramaattisesti aikana erilaistumisen ja kehityksen, ja se on laajasti ilmaistu aikuisen kudoksissa [2] – [5]. Kolmetoista jäsentä

let-7

perhe on tunnistettu ihmisen genomin [7], [8], joka näyttää sekä erillisiä ja päällekkäisiä toimintoja [8].

rooli

anna-7

syövässä havaittiin ensimmäisen Johnson

et al.

kun he huomasivat, että

let-7

perheen säätelee negatiivisesti

let-60 /RAS

in

C. elegans

sitoutumalla useita

let-7

täydentävien alueiden sen 3’alue (3’UTR) [9]. Lisäksi todettuaan, että

let-7

ilmaisu on pienempi keuhkotuumoreita kuin normaalissa keuhkokudoksessa, kun taas

RAS

proteiini on huomattavasti korkeampi keuhkotuumoreita, he ehdotti, että

kirjaimien 7

on tuumorisuppressorigeeniä [9], joka on yhdenmukainen aiempien kliinisten havaintojen keuhkosyövän [10]. Vähentynyt ilmentyminen

let-7

on liittynyt lyhennetty postoperatiivista selviytymisen syöpäpotilailla [7], [11], [12], ja pakotti ilmaus

let-7

perheenjäsenten voi estää syöpäsolujen kasvua sekä

in vitro

ja

in vivo

[13] – [16]. Inhiboiva toiminta

let-7

perhe syövässä on vahvistavat useat ryhmät ja erilaisten kasvainten [7], [11], [12]. On todennäköistä, että

let-7

näistä tehtävistä suuntaamalla eri geenejä. Esimerkiksi

let-7

estää monia hyvin tunnettu onkogeenisiä proteiineja, kuten

KRAS

[9], [17], [18],

HRAS

[9] , [17], [18],

HMGA2

[18] – [21],

c-Myc

[22], ja

NF2

[23]. Lisäksi

let-7

kohdistettu useisiin solusyklin liittyviä geenejä, kuten

CDC25A

[24],

CDK6

[24], ja

CDK4

[25] sekä

sykliini

[25],

D1

[25],

D2

[24], ja

D3

[25 ]. Lopuksi

let-7

tukahduttaa ilmentymistä uudelleenohjelmointi tekijä

LIN28

joka toimii estämään erilaistumista ja ylläpitää syöpä kantasolukkoa [26].

Koska on havaittu että ihmisen syöpien osoittavat vähensi ilmaus

let-7

perhe, ja että tähän liittyy lyhyempi eloonjäämisajasta näillä potilailla [7], [11], [12], luonnehdinta mekanismien johtaen

let-7

downregulation syövässä on tärkeä kliininen merkitys. Yksi syy geneettisen sääntelyn purkamisen syöpä on muutos somaattisen copy-numeron tietyn geenin [27]. On myös raportoitu, että miRNA kopio luvut voivat muuttua muun tuumorigeneesin [28], [29]. Tämä sai meidät tutkimaan, copy-numerot

let-7

perheen muutettiin vuonna syöpään.

Tulokset

Tietyt jäsenet

let-7

perhe on poistot kopiointi- numero Medulloblastoma, rintasyöpä, ja munasarjasyöpä

määrittämiseksi kopioluvun

let-7

perheenjäseniä, analysoimme korkearesoluutioinen SNP array (Affymetrix 250 K Sty array) aineisto, Tumorscape luoma Broad Institute of MIT ja Harvard [27]. Neljätoista tyyppisiä ihmisen syövissä (yhteensä 2969 Tuumorinäytteet) sisällytettiin myös tutkimuksessa (taulukko 1). Segmentoidut raakadataa edellä SNP paneelit haettiin ja analysoitiin seuraavien vakioprotokolla antama Tumorscape tietokannan [27] ja visualisoida genomiikkaa Viewer (IGV) (kuvio 1) [30]. Genomi-alueilla, joilla kopioluku muutoksia esiintyi huomattavasti useammin kuin tausta nopeus tunnistettiin käyttämällä synergisillä algoritmia [31]. Seuraavat ehdot, jotka on määritelty Tumorscape tietokannan [27], käytettiin kuvaamaan tuloksemme. Taajuus ilmaisee osa syövistä, jotka osoittavat vahvistus /poisto sillä genomin lokukseen kätkeminen tietyn

let-7

geeni. Matala Q-arvo (ylempi kynnys = 0,25) viittaavat siihen, että monistuksissa /deleetioita tässä lokuksessa ovat merkittäviä ja rikastaa valikoiva paineet.

Segmentoitu raakadataa SNP paneelit (rintasyöpä, n = 293; munasarjasyöpä , n = 110; myeloproliferatiivista häiriö, n = 215) oli noudettu Tumorscape tietokannasta, analysoidaan sitten visualisoida genomiikkaa Viewer. Vasen paneeli: koko genomin kattavan kuvan kopiomäärä profiilit myeloproliferatiivista häiriö, rintasyöpä, ja munasarjasyöpä (genomiset paikat ovat vasemmalla; kasvain yksilöt ovat yläosassa). Punainen edustaa vahvistusta ja sininen edustaa poisto. Oikea paneeli: Copy-numero profiilit kromosomin 22 alueella

let-7a-3 Twitter /

let-7b

klusteri.

kuten kuvassa 2,

let-7

perhe on läsnä kolmetoista jäsentä sijaitsee kahdeksan loci ihmisen genomissa [7], [11], [12]. Kaikki kahdeksan genomista loci analysoitiin tutkimuksessamme. Suurin osa perheenjäsenten, kuten

let-7a-1

,

let-7f-1,

ja

let-7d

, klusteri yhdessä. (

let-7

geenit nimetty sisällyttämällä kirjeen tarkoittamaan selvä kypsän sekvenssin, ja useat osoittamaan, että samaa kypsää sekvenssi on läsnä selvä genomista loci.) Lyhyesti, olemme huomanneet, että neljä

let-7

loci kätkeminen viisi

let-7

jäsentä osoitti merkittäviä deleetioita kopioluku syöpää tyyppikohtaisia ​​tavalla (kuva 2). Focal poistot näistä

let-7

perheenjäsenten havaittiin kolmessa syöpätyypeissä: medulloblastoma (

let-7a-2,

taajuus 25%;

let-7e,

taajuus 9%), rintasyöpä (

let-7a-2,

taajuus 47%), ja munasarjasyöpä (

let-7a-3 Twitter /

let-7b,

taajuus 44%). Tämä viittaa siihen, että genomista polttoväli kopiomäärä poistamista

let-7

voi olla tärkeä rooli aikana tuumorigeneesiä edellä syövän tyyppejä. Lisäksi kaksi ei-keskeisenä deleetiot (

let-7a-3 Twitter /

let-7b,

taajuus 40%;

let-7

g, taajuus 36%) havaittiin myös rintasyövän, ja yhden ei-polttovälin deleetiot havaittiin melanooman (

let-7a-2,

taajuus 43%) ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (

let-7e,

taajuus 31%). Lopulta vain yksi

let-7

perheenjäsen,

let-7i

, havaittiin olevan monistaa (ei-pienisoluinen keuhkosyöpä). Tämä oli kuitenkin esiintyi kromosomin varsi-tasolla, ei polttovälin vahvistus, mikä osoittaa, että se voisi olla ”matkustaja” geneettinen muutos. Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että vähentäminen kopiomäärä erityisiä

let-7

perheenjäsenen geenit olivat yleisiä medulloblastoma, rinta-, ja munasarjojen syöpien.

Yhteenveto DNA kopioluvun korjauksilla

let-7

perheen 14 tyyppisiä ihmisen syövissä (n = 2969).

let-7

perhe koostuu kolmestatoista jäsenestä sijaitsee kahdeksan loci ihmisen genomin. Monet heistä, kuten

let-7a-1

,

let-7 f-1

ja

let-7d

, klusteri yhdessä (A). Matala Q-arvo (ylempi kynnys = 0,25) viittaavat siihen, että monistuksissa /deleetioita tässä lokuksessa ovat merkittäviä ja rikastaa valikoiva paineet. Tummanvihreä edustaa polttoväli poisto

let-7

perhe.

Kopioi numero muuttaminen

let-7b

korreloi positiivisesti Aikuinen

kirjaimien 7b

Expression munasarjasyövässä

Voit selvittää kopiomäärä korjauksilla

let-7b

vaikuttaa kypsä

let-7

ilmentyminen syövässä, tutkimme munasarjasyöpäsolu aineisto The Cancer Genome Atlas (TCGA) [32], koska tämä itsenäinen genomista aineisto sisältää sovitetun tiedot sekä genominlaajuisten kopioluvun (SNP array) ja kypsä miRNA ilmaisun (miRNA array) suuresta kokoelma ihmisen munasarjakasvain yksilöitä. Taso 3 data (segmentoidut SNP array data ja normalisoitu miRNA array data) on haettu TCGA [32]. Kaikkiaan 537 kasvainten tiedoilla sekä SNP ja miRNA taulukot tunnistettiin. Yhdenmukainen tiedot meidän Tumorscape analyysi oli häviämä kopiomäärä on

let-7a-3 Twitter /

let-7b

lokukseen näytteitä munasarjasyöpä potilaiden (kuvio 3A ). Koska kypsä

let-7

sekvenssin koodaa kolme

let-7

geenit, jotka sijaitsevat kolmessa eri kromosomi loci, emme voineet tutkia korrelaatio kopiomäärä ja ilme for

let-7a-3

. Niinpä olemme analysoineet korrelaatio deleetioita

let-7a-3 Twitter /

let-7b

lokus ja ilmaus kypsä

let-7b

tässä tietokokonaisuutta. Kuten kuviossa 3 B ja C, ilmaus kypsän

let-7b

merkittävästi ja korreloi positiivisesti

let-7b

kopioluku munasarjasyövän yksilöt (p 0,0001, R = 0,46, n = 537). Emme löytäneet korrelaatiota muuta

let-7

perheenjäsenten kanssa

let-7b

kopioluvun (kuvio 3D). Tämä osoittaa, että väheneminen kopioluvun

let-7b

johtaa ilmentyminen vähenee kypsän

let-7b

munasarjasyövän.

Level 3 tiedot (segmentoidut SNP array data ja normalisoitu miRNA array data) on haettu TCGA. Kaikkiaan 537 kasvainten sekä SNP ja miRNA taulukot tiedot tunnistettiin. A. Vasen paneeli: koko genomin kattavan kuvan kopiomäärän profiilien munasarjasyöpä (genomiset paikat ovat vasemmalla; kasvain yksilöt ovat yläosassa). Punainen edustaa vahvistusta ja sininen edustaa poisto. Oikea paneeli: Copy-numero profiileja kromosomista 22 alueella

let-7a-3 Twitter /

let-7b

klusteri. B. Heat kartta kypsä

let-7

perheen ekspressiotasot Hyväksytty TCGA yksilöitä. Näytteet on järjestetty samaan järjestykseen kuin SNP tiedot. C. väliset korrelaatiot

let-7b

DNA kopiomäärä ja kypsä

let-7b

ekspressiotasot munasarjasyövän päässä TCGA aineisto. D. väliset korrelaatiot

let-7b

DNA kopiomäärä ja ekspressiotasot kypsä miRNA muiden

let-7

perheenjäsenten munasarjasyövän päässä TCGA aineisto.

palauttaminen

let-7b

Expression vähentää merkittävästi munasarjakasvain kasvu

in vitro

Focal menetys kopioluku

let-7

perhe jäsentä medulloblastoma, rinta-, ja munasarjasyöpäpotilaiden viittaa vahvasti siihen, että

let-7

voi olla tärkeä rooli kasvainten synnyssä. Siksi palauttaa sen ilme voi tukahduttaa kasvaimen kasvua näitä syöpiä. Tämän hypoteesin testaamiseksi

in vitro,

transfektoimme kaksi munasarjasyövän solulinjoissa, A2780 ja 2008 ja

let-7b

matkivat (double-RNA-oligonukleotidi). Viljeltyä ihmisen munasarjojen pinnan epiteelisolujen (letku) solulinjaa käytettiin kontrollina, ja solujen kasvua tarkkailtiin kautta MTT-määrityksellä. 72 tuntia transfektion jälkeen, olemme huomanneet, että

let-7b

jäljittele vähensi merkittävästi solujen kasvua syöpäsoluissa (kuvio 3 A ja B). Ei ollut väheneminen solujen kasvua nähdään ohjaus soluissa (kuvio 4C). Tämä viittaa siihen, että palauttaminen

let-7b

ilmentyminen kasvainsoluissa voi olla suuri terapeuttinen potentiaali munasarjasyövän hoitoon.

let-7b

matkivat ja ohjaus oligo (30 nM) transfektoitiin A2780 (A), 2008 (B) ja letku (C) solujen lipofektamiinia. Solun kasvua tarkkailtiin MTT-määrityksellä.

Palauttaminen

let-7b

Expression vähentää merkittävästi munasarjakasvain kasvu

in vivo

arvioidaan

in vivo

terapeuttista potentiaalia

let-7b

matkivat, ortotrooppinen myöhäisessä vaiheessa munasarjasyöpään hiirimallissa tuotettiin injektoimalla vatsaonteloon 10 x 10

6 munasarjasyöpä ( A2780) solut naisten nude-hiirissä (kuvio 5A). Kahden viikon kuluttua hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään, jotka käsiteltiin joko

let-7

matkivat tai oligonukleotidista, i.p. injektio. Hiiriä käsiteltiin kolmen päivän välein yhteensä neljä käsittelyä (kuvio 5A), ja tuumorin solmut kerättiin kolmen päivän kuluttua viimeisestä hoidosta (kuvio 5B). Olemme havainneet, että tuumorin paino solmujen väheni merkittävästi hoidetuilla hiirillä

let-7b

matkivat verrattuna kontrolleihin (kuvio 5 B ja C). Olemme myös seurata endogeenisen

let-7b

jossa käytetään konstitutiivisesti

let-7b

lusiferaasireportteri joka sisälsi sekvenssit täydentävät

let-7

3’UTR [33 ], [34]. Olemme johdonmukaisesti havaittu, että käsittely

let-7b

jäljittele merkittävästi vähentynyt lusiferaasivaikutusta

in vivo

verrattuna kontrolliryhmään (kuva 5 D ja E). Lopuksi löysimme että hoito

let-7b

jäljittele lisäsi merkittävästi

let-7b

ekspressiotasot hoidossa verrattuna kontrolliryhmään (7,03 ± 5,73 kertaiseksi, p = 0,047) . Samaan aikaan mRNA-ekspressiotasot tunnettu

let-7

kohdegeenien, kuten

CCND1

,

CDC25A

,

HMGA2

,

IL6-

ja

LIN28B

merkittävästi vähentynyt

let-7b

matkivat hoitoa. Yhdessä tämä osoittaa, että

in vivo

toimituksen

let-7b

matkivat voi toiminnallisesti palauttaa

let-7

ilmaisun ja huomattavasti vähentää kasvaimen kasvua ennalta kliininen eläinmallissa munasarjasyöpään.

aikajana elinsiirron kasvainsolujen vatsaonteloon, hoito, kuvantaminen, ja kokoelma kasvaimen näytteiden potilaalle tehdä myöhäisessä vaiheessa munasarjasyöpään hiirimallissa. B. Kasvain solmuja kerätään kustakin hiirestä kolmen päivän kuluttua viimeisestä hoidosta. C. Yhteenveto painot kasvaimen solmujen kustakin hiirestä. D. Endogeeninen

let-7b

aktiivisuus kunkin hiiren seurattuna

let-7b

lusiferaasin anturi. E. Yhteenveto lusiferaasin intensiteetin hoidon aikana.

Keskustelu

let-7

perhe on yksi ensimmäisistä miRNA tuumorisuppressori perheitä osoitettu olevan mukana ihmisen syövän. Expression jäsenten

let-7

perhe on raportoitu merkittävästi vaimentua useisiin syöpätyyppeihin, ja tämä laski

let-7

ilmentyminen on korreloitu huonompi kliinisiä tuloksia. Kaksi molekyylitason mekanismeja on ehdotettu, että voi johtaa globaali downregulation

let-7

ilmentyminen syövässä. Ensinnäkin avain proteiineja miRNA biogeneesissä reitin, kuten Dicer ja Drosha, voidaan merkittävästi vapautettiin syöpä [35]. Tämä voi johtaa epäselektiivinen, maailmanlaajuinen downregulation miRNA, mukaan lukien anna-7 perheen. Lisäksi on osoitettu, että RNA: ta sitovan proteiinin,

LIN28,

joka estää selektiivisesti joitakin miRNA perheitä, mukaan lukien

let-7

perheen [36] – [41], on aktivoitu suuri osa syöpäpotilailla [42] – [51]. Kuitenkin edellä kaksi mekanismia voi selittää havainnon, että useimmissa syöpä tyyppejä, vain joitakin

let-7

perheenjäsenet vaimentua. Esimerkiksi ilmaus

let-7

a,

let-7

c, ja

let-7

g on havaittu selektiivisesti vaimentua rintasyövän [ ,,,0],52], mikä viittaa siihen, että on olemassa muita riippumattomia mekanismeja, jotka vaikuttavat ilmentymisen kunkin yksittäisen

let-7

perheenjäsenen.

Viimeaikaiset edistysaskeleet suurikapasiteettisten genomin karakterisointi tekniikoita ovat osoittaneet, että syöpä genomit ovat erittäin epäjärjestykseen, joilla on laaja muutokset kromosomirakenteen ja geenin kopio numeroita. On myös raportoitu, että kopio määrä miRNA yleisesti muutetaan ihmisen syövässä [28], [29]. Esimerkiksi

mir-16-1 /mir-15a

klusteri kromosomissa 13q14 poistettiin yli 50%: n krooninen lymfaattinen leukemia potilailla [53]. Lisäksi, monistus

C13orf25 /mir-17~92

klusteri kromosomissa 13q31-32 on raportoitu lymfoomapotilailla [54], [55]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että kolme

let-7

lokusten, jotka tarjoavat sataman neljä

let-7

jäsentä (

let-7a-2

,

let-7a-3

,

let-7b

, ja

let-7e

), on deleetioita kopioluku syöpää tyyppinen erityisellä tavalla medulloblastoma, rintasyöpä, ja munasarjasyöpä. Mikä tärkeintä, olemme vahvistaneet korrelaatio

let-7

kopioluvun muutoksia ja kypsä

let-7

ilmentymistä munasarjasyöpä. Nämä tulokset osoittavat, että deleetio kopiomäärä on tärkeä mekanismi, joka johtaa downregulation erityisten

let-7

perheen jäseniä vähintään näiden kolmen ihmisen syövissä. Tämä mekanismi on todennäköisesti syöpä-tyyppinen erityinen, koska emme löytäneet merkittäviä kopiomäärä korjauksilla

let-7

perheen muissa syöpätyypeissä, kuten paksusuolen ja eturauhasen syöpiä.

tärkeää on, polttoväli vähennykset kopio numerot

let-7

perheen mukaan poistaminen

let-7

voi olla tärkeä rooli aikana tuumorigeneesiprosessin ja ehdottaa, että palauttaminen ilmentymistä näistä

anna-7

perheenjäsenet voivat olla uusi strategia hoitoon medulloblastoma, rintasyöpä, ja munasarjasyöpä. Nykyinen nopea kehitys oligonukleotidi /nanohiukkasten hoidon luoda realistisen optimismin perustamaan miRNA uutena ja voimakas terapeuttinen kohde ja /tai solunsalpaajaresistentti modulaattori syövän. Tämän hypoteesin testaamiseksi, toimitimme pieni RNA jäljitellä varten

let-7b

, useimmin Poistetaan

let-7

perheenjäsen munasarjasyöpää sairastavilla potilailla, munasarjojen syöpäsolujen

vuonna vitro

ja

in vivo

. Huomasimme, että palauttaminen

let-7b

ilmaisu dramaattisesti esti kasvaimen kasvua. Suostumuksella havaintojemme palauttaminen

let-7

ilmentyminen on myös osoitettu vähentävän kasvaimen kasvua prekliinisissä malleja muiden syöpätyyppien, kuten keuhkosyöpä [13] – [16], jossa

let-7

perhe on maailmanlaajuisesti vähentynyt [9], [10]. Koska

let-7

samanaikaisesti estää useita kasvaimia synnyttävän polkuja, jotka ovat mukana useimmissa vaiheet tumorigeneesin (kuten

RAS, MYC

, ja

HMGA2) B, palauttaminen

let-7

ilmentyminen kasvainsoluissa tarjoaa uuden terapeuttisen strategian syövän hoitoon. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että meidän

let-7b

hoito ei merkittävästi vaikuta normaaliin munasarjojen pinnan epiteelisolujen kasvua, mikä viittaa siihen, että hoito palauttaa

let-7

ilmentyminen voi olla vähemmän myrkyllisiä kuin perinteiset kemoterapia. Tämä havainto voi johtua siitä, että normaalit solut jo ilmentävät korkeampaa endogeenisen

let-7

ja näin ollen toimituksen lisäksi

let-7

ei merkittävästi lisää sen geenien toimintaa normaalit solut. Toinen selitys voisi olla, että loppupään solujen yhteydessä on erilainen kasvainsoluissa vs. normaalit solut. Esimerkiksi jotkut kohdistu suoraa

let-7,

kuten

LIN28, RAS, MYC

ja

HMGA2,

eivät ilmenny tai aktivoitunut normaaleissa soluissa, mutta eivät ”kuljettajan” geenejä edistää solujen kasvua kasvaimia.

on osoitettu riippumattomat laboratoriot että tukahduttaminen niiden kohdegeenin ilmentymisen tasoja miRNA on suhteellisen lieviä [56] – [59], vaikka jokainen miRNA voi erityisesti ja samanaikaisesti kohdistaa satoja mRNA-transkriptien [56], [59]. Sen yhtenäistä tämän yhteisen käyttäytyminen miRNA, osoitimme, että mRNA ekspressiotasot useiden tunnettujen

let-7

kohdegeenien, kuten

CCND1

,

CDC25A

,

HMGA2

,

IL6-

ja

LIN28B

merkittävästi vähentynyt

let-7b

matkivat hoito (kaikki p 0,05). Kuitenkin tukahduttaminen vaikutukset mRNA tasot

let-7b

ovat tyypillisesti vaatimattomia (välillä 58,0% ± 0,03%: sta 78,9% ± 0,08%). Se voisi tuoda merkittäviä terapeuttisia hyötyjä

let-7b

korvaushoito verrattuna siRNA perustuvat strategiat: Ensinnäkin sivuvaikutuksia palauttaminen

let-7b

syöpäpotilailla voivat olla lieviä ja rajoitettu. Toiseksi, useita kasvaimia synnyttävän geenejä /reittejä kuten solukierron säätelyssä, DNA-vaurioita vastaus, syövän kantasolujen erilaistumiseen ja tulehdukseen voitaisiin kohdentaa samanaikaisesti. Vuonna samaa mieltä tämän hypoteesin, tosiaan emme löytäneet, että

let-7b

korvaushoito vaikutti merkittävästi normaali epiteelisolujen kasvun terapeuttinen annos (kuvio 4C). Lisäksi miRNA lukien

let-7

säätelemään negatiivisesti kohdegeenin ilmentymistä kaksi päämekanismia eli mRNA pilkkominen (transkription taso) ja /tai translaation tukahduttamisen (translationaalinen taso), joka sekvenssispesifisellä tavalla [7] [8], [11], [12]. Tämä voi olla toinen selitys, miksi me vain löytänyt vaatimaton tukahduttamisesta kohdegeenin ilmentymisen mRNA havaitsemia reaaliaikaisen RT-PCR. Lopuksi, annostus

let-7b

toimitus esillä olevassa tutkimuksessa määritettiin annos-riippuvainen kokeessa. Käytimme minimaalinen toiminnallisen vasteen annos (30 nM) meidän reaaliaikaisen RT-PCR kokeita. Kun lisäsimme annostusta

let-7b

toimitus, löysimme vaikutukset

let-7b

korvaushoito sen kohde- geenejä huomattavasti lisääntynyt.

Se on on hyvin osoitettu, että kypsä

let-7

ilme on vankka biomerkkiaine ennustaa kliinistä tulosta syöpäpotilailla. Esimerkiksi systemaattinen tarkastelu 43 julkaistut tutkimukset osoittavat, että

let-7

on miRNA useimmin ja merkittävästi liittyvät kliinisiin tuloksiin syöpäpotilailla [60]. Tutkia korrelaatio

let-7b /let-7A3

klusterin kopioluvun muutoksia (poistetaan vs. ei-t) ja kliininen tulos potilaita, yhteensä 491 myöhäisvaiheen (vaihe-III ja -IV ) kasvaimista hyvin selityksin eloonjääminen tiedot tutkittiin Kaplan-Meier selviytymisen analyysi. Emme kuitenkaan ei löytänyt merkittäviä korrelaatio

let-7b /let-7A3

klusterin kopiomäärä muutokset ja eloonjäämiseen tässä näytejoukolla (p = 0,343). Tämä tulos osoitti, että DNA: n kopioluvun muutos ei ole ainoa syy, jonka kypsä

let-7

ilmentyminen vähenee syövän. Vuonna täysin yhtyä tähän näkemykseen, me ja muut riippumattomat ryhmät ovat ilmoittaneet, että miRNA vapauttaminen ihmisen munasarjasyövän johti useiden mekanismien [29], [61], [62]. Ensinnäkin, se on osoitettu, että suurin osa ensisijainen miRNA ovat litteroitiin välillä Pol II-promoottori ja säätelevät transkriptiotekijöitä. Useita esimerkkejä osoittaa miRNA sääntelyn purkamisen munasarjasyövän transkription sääntelyn purkaminen on raportoitu. Toiseksi, viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että epigeneettisellä muutoksiin on kriittinen rooli sääntelyn purkamisessa miRNA ilmentyminen ihmisen munasarja- syöpiä. Kolmanneksi mutaatio voi myös edistää alas-säätely kypsä miRNA. Lopuksi, avain proteiinit miRNA biogeneesissä reitti voi olla vahingollisia tai vapautettiin syövän, ja voi parantaa kasvaimen kehittymisen. Siksi transkription sääntelyn purkaminen, epigeneettiset muutokset, mutaatioita, DNA kopiomäärä poikkeavuudet ja puutteet miRNA biogeneesissä koneet saattavat kukin osaltaan, joko yksin vaan todennäköisemmin yhdessä,

let-7

perheen sääntelyn ihmisen syövässä [29 ], [61], [62]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme kertoi, että

let-7b /let-7A3

klusteri poistetaan yli 40% osuus munasarjojen ja rintasyöpiä. Mielestämme on yksi tärkeitä mekanismeja laskevan

let-7

ilmentymistä näissä sairauksissa, vaikka muita mekanismeja, kuten transkription sääntelyn purkaminen, epigeneettiset muutokset, mutaatioita, ja viat miRNA biogeneesissä koneen tarvitaan edelleen tunnettu munasarjojen ja rintasyöpiä.

Materiaalit ja menetelmät

SNP ja miRNA Microarray tietohaku ja analyysi

Segementaaliset raakadataa SNP mikrosiruja (Affymetrix 250 K Sty array) ladattiin Tumorscape tietokannasta (luoma Broad Institute of MIT ja Harvard) [27] ja analysoidaan seuraavat vakioprotokolla tarjoamat Tumorscape, sitten visualisoidaan Integroidun Genomics Viewer (IGV) (kuvio 1) [30]. Neljätoista tyyppisiä ihmisen syövissä (yhteensä 2969 Tuumorinäytteet) sisällytettiin myös tutkimuksessa (taulukko 1). Tason 3 data (segmentoidut SNP array data ja normalisoitu miRNA array data) oli ladata Cancer Genome Atlas (TCGA) aineisto [32], ja yhteensä 537 kasvainten sekä SNP ja miRNA array tiedot tunnistettiin. Genominen alueilla, joilla kopioluvun muutoksia esiintyi huomattavasti useammin kuin tausta nopeus tunnistettiin käyttämällä Genominen merkityksellisten tavoitteet Ravussa (synergisillä) algoritmi [31]. Tiedot varten kasvain tyypit yksilöitä Tumorscape tietokannasta oli saatavilla portaalin Tumorscape (https://www.broadinstitute.org/tumorscape) [27]. Rinta- ja munasarjasyövän kasvainten kliininen tieto oli saatavilla julkaistusta profiileista (GSE7545 ja GSE19399) [27], [63], [64]. Kaikki TCGA munasarjasyöpä yksilöt ovat korkealaatuisia vakavien munasarjakasvainten, joka kerättiin vastadiagnosoidun Munasarjasyöpäpotilaiden vakavien adenokarsinooma jotka olivat käynnissä kirurginen resektio ja ei ollut saanut ennen hoitoa sairauteensa, kuten kemoterapiaa tai sädehoitoa. Kaikki tapaukset oli olevan serous histologia mutta kerättiin riippumatta kirurgisen vaiheen tai histologinen. Tapauksia lavastettu mukaan vuoden 1988 FIGO lavastus järjestelmä. Yksityiskohtaisesti kliininen tietoa yksilöitä TCGA tietokannasta oli saatavilla TCGA data portaalin (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) [32].

Solulinjat ja Cell Culture

Munasarjasyöpä solulinjoja ostettiin American Type Culture Collection (ATCC) ja Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD) Kasvaimen /Cell Line Repository. Kaikki syöpäsolulinjoja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen). Ihmisen munasarjojen pinnan epiteelisolujen (HOSE) solut jalomielinen lahjoitus tohtori Nelly Auersperg (University of British Columbia) [65]. HOSE soluja viljeltiin 01:01 Media 199: MCDB 105 (Sigma), jota oli täydennetty 15% FBS.

let-7b

Mimic

in vitro

transfektio

let-7b

matkivat ja kontrollioligonukleotidit ostettiin Invitrogen. Solut maljattiin 24 tuntia ennen transfektiota. Transfektion miRNA oligonukleotidien (30 nM)

in vitro

suoritettiin käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).

MTT-määritys

MTT määritykset suoritettiin 96-kuoppaisilla levyillä käyttäen Cell Proliferation Kit (Roche) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Neljästä kuuteen kuopat analysoitiin kullekin näytteelle. Saatu värinen liuos kvantifioitiin käyttäen ELx800 Absorbanssi Microplate Reader (BioTek) 570 nm: ssä viitataan aallonpituudella 630 nm.

Generation Stabiilin solulinjojen

let-7 toimittaja vektori oli transfektoidaan A2780-soluihin käyttäen FuGene6 Transfection Reagent (Roche). Väliaine vaihdettiin 48 tuntia transfektion, ja stabiilien kloonien valittiin neomysiinin 14 päivää. Vakaa ilmentävien kloonien let-7 toimittaja oli edelleen vahvistettu lusiferaasianalyysissä.

Generation of Orthotopic munasarjasyövän ksenograftimallissa

Kuudesta kahdeksaan viikkoa vanhoja naaraspuolisia nude-hiiriin, saatiin The Jackson Laboratory . Subkonfluentit munasarjasyöpäsoluja (A2780) trypsinoitiin ja suspendoitiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS), sitten 10 x 10

6 solua kokonaistilavuudessa 0,1 ml ruiskutettiin hiiren vatsaonteloon.