Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

kolorektaalisyövän selvä alaryhmä kasvainten osoittaa CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP). Kuitenkin yksimielisyys miten pisteet CIMP ei saavuteta, ja vaihtelu määritelmä voi vaikuttaa raportoitu CIMP esiintyvyys kasvaimissa. Niinpä vertasi parhaillaan ehdotti määritelmiä ja cut-off metylaation markkereita ja miten ne vaikuttavat CIMP luokituksen paksusuolensyöpä.

Methods

Metylaatiospesifinen multiplex ligaatio riippuva anturi vahvistus (MS -MLPA), minkä jälkeen fragmentti analyysi, käytettiin tutkittaessa metylaation kasvaimen näytteitä. Yhteensä 31 CpG sivustoja, jotka sijaitsevat 8 eri geenit (RUNX3, MLH1, NEUROG1, CDKN2A, IGF2, CRABP1, SOCS1 ja CACNA1G) tutkittiin 64 erillistä paksusuolen syöpien ja 2 koolonsyöpäsolulinjoissa. Ogino geenin paneeli sisältää kaikki 8 geenit, lisäksi WEISENBERGER paneeli, joista vain 5 8-geenien mukana tutkittiin. Kaikkiaan 18 vaihtoehtoisia yhdistelmiä pisteytystä CIMP positiivisuus on probe-, geeni- ja paneeli-tason analysoitiin ja verrattiin.

Tulokset

47 näytettä (71%), Yhdistyneessä CIMP tila oli vakio ja riippumaton kriteerit pisteytys; 34 näytettä olivat jatkuvasti pisteytettiin CIMP negatiivinen, ja 13 (20%) johdonmukaisesti pisteytettiin CIMP positiivinen. Vain neljällä 31 antureista (13%) tutki osoittanut mitään eroa positiivisten näytteiden avulla eri raja-arvot. Sisällä paneelit suuntaus havaittiin, että lisäämällä geeni tason tiukkuuden johti suurempaan ero CIMP positiivista näytettä kuin lisätä koetin tason tiukkuuden. Merkittävä ero positiivisten näytteiden avulla ”tiukimmat” verrattuna ”vähiten tiukat kriteerit (20% vs. 46%, vastaavasti; p 0,005) osoitettiin.

Johtopäätökset

tilastollinen merkittävää vaihtelua taajuuden CIMP riippuen raja-arvot ja geenien mukana paneelissa todettiin, kaksi kertaa enemmän positiivisia näytteitä ainakin verrattuna tiukimpien määritelmää käytetään.

Citation: Berg M, Hagland HR, Søreide K (2014) vertailu CpG Island Methylator Fenotyyppikuvaus (CIMP) Taajuus Colon Cancer käyttäminen Eri Probe- ja Gene-Specific Pisteytys vaihtoehtoja Suositeltava Multi-Gene paneelit. PLoS ONE 9 (1): e86657. doi: 10,1371 /journal.pone.0086657

Editor: Hassan Brim, Howard University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 syyskuu 2013; Hyväksytty: 16 joulukuu 2013; Julkaistu: 21. 2014

Copyright: © 2014 Berg et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus oli osittain rahoittama avustuksia Folke Hermansen Cancer Foundation (avustus # 424508 KS MB post doc fellow) (https://www.folke-fondet.org), Mjaaland Cancer Fund (avustus # 424506 KS ), Stavangerin University Hospital Research Council ja tukirahoituksen Institute of Surgical Sciences, University of Bergen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on geneettinen sairaus kertymi- sen aiheuttamien molekyyli- muutokset ja muunnelmat DNA, joka ajaa kasvaimien syntyyn [1]. Oikea molekyyli luonnehdinta syövän genotyyppiä ja fenotyypit on tärkeää paljastaa merkkiaineita varhaisen havaitsemisen ennustettavuutta tai ennustaminen, sekä lisätä ymmärrystä taudin prosesseja, jotka voivat tuottaa tietoja terapeuttisesta. Paksusuolen syöpä on hyvin tutkittu syövän malli, jota varten kasvaimet ovat nyt jaettu kolmeen fenotyyppiset alaryhmään, riippuen hallitseva tyyppi geneettisten poikkeavuuksien: kromosomi epävakaus (CIN) tarkoittaa muutoksia kromosomin tasolla (esim kopioluku muutoksia); mikrosatelliitti epävakaus (MSI) viittaa muutoksiin emäsparin-toistoja (esim. pohja muutos dinukleotidi toista CA

6), ja; CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP) tarkoittaa poikkeava metylaatio spektri (esim hypo- tai hyper- metyloitu sytosiineista promoottorialueen), verrattuna normaaleihin soluihin [2], [3].

CpG-saari metylaatio testaus on on ehdotettu välineenä syövän havaitsemiseen, ennuste, ja havaitseminen jäljellä taudin sekä veren tai muiden kehon nesteiden [4], ja osoittaa, että metylaatio tila on kliinistä merkitystä [5] – [9]. Lisäksi metylaatiospesifisen määritykset ovat kaupallisesti saatavilla tänään havaita peräsuolen syöpä, joko testaus metylaation vimentiinista vuonna ulostenäytteitä tai testausta varten metylaatiota

SEPT9

veressä [6], [10].

viime vuosina huomio on keskittynyt biologian ja mahdolliset kliiniset merkityksen CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP) CRC [11], [12]. Vaikka on yleisesti hyväksytty, että etiologisesti ja kliinisesti selvä alaryhmien olemassa [13], [14], täsmällinen määritteleminen CIMP vielä ole tiedossa, sekä menetelmällisesti ja molekyylitasolla [15]. Lisääntyvä käyttö suurikapasiteettisia tekniikoita myös metylaation tutkimukset ovat osoittaneet suurta vaikutusta ja esitti useita paneeleja,

esim

auttamaan syrjintää peräsuolen kasvaimen epiteelisolujen erottaa taudin vaiheissa, prognoosi- ryhmiä, ja alaryhmät liittyy muihin mole- ominaisuuksia [16] – [18]. Ei ole päästy yksimielisyyteen määrittämiseksi CIMP fenotyyppi johtuu osittain siitä, että syy muuttuneen metylaatiokuvion pysyy suureksi osaksi tuntematon [13], [19].

Tämän seurauksena useita geenin paneelit, laboratorio- tekniikoita, ja merkki raja-arvot ovat tällä hetkellä käytössä, jotka kaikki voivat johtaa eroihin raportoitu esiintyvyys CIMP [20]. Koska ei ole olemassa yleismaailmallista standardia tai yhteisymmärrykseen määrällisesti fenotyyppiin perustamisesta sen todellinen esiintyvyys on haaste ja korit vertailu tutkimuksia. Siten Tutkimuksen tarkoituksena oli järjestelmällisesti testata useita määrittelyperusteisiin CIMP kolorektaalisyövässä yksilöitä, ja tutkia ero CIMP taajuuden tehdessä pisteet tasoilla.

Methods

Ihmisen Materiaali ja Study etiikka

syöpä kudos saatiin paksusuolensyöpä leikkauspotilaiden laitoksella ruuansulatuskanavan leikkauksen, Stavanger University Hospital, Norja. Potilaat rekrytoitiin mahdollisille vartijaimusolmukkeessa tutkimuksessa, ja kaikki suostunut tutkimaan osallistumisen ennen osallisuutta ja kudosten haku. Länsi Norja terveydenhuoltopiirin luvan käyttää ihmisen osallistujien jälkeen kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen, hyväksynnän # 197,04. Kaikki tiedot käsiteltiin mukaan Helsingin julistuksen.

Kudos saatiin aiemmin kuvattu [21], ja makean pakastetut koepaloja säilytettiin -80 celsiusastetta. Näyte sarja 64 vaiheen II ja III potilaista ja 2 koolonsyöpäsolulinjaa (Caco2 ja HT29), oli mielivaltaisesti valittu arviointiin nykyisessä tutkimuksessa.

DNA Isolation

tuore syöpä kudosnäytteitä, mistä on sama määrä potilaita otettiin mukaan. Myös referenssinäytettä normaalin paksusuolen epiteelin saatiin varmistaa huomattavan matkan ulkopuolella resektio marginaali paksusuolen kasvain. DNA-näytteet uutettiin käyttäen DNeasy Mini Kit tai AllPrep DNA RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa).

Metylaatiospesifinen Multiplex ligaatio riippuvainen Probe Amplification (MS-MLPA) ja CIMP Status

kaikista 64 DNA-näytteitä, 100 ng DNA: ta denaturoitiin kokonaistilavuudessa 5 ui Tris-EDTA-puskuriin, ja edelleen suoritetaan toimittaja suositteli (MRC-Holland, Amsterdam, Alankomaat).

Metylaatiospesifinen multiplex ligaatio riippuva koetin vahvistusta (MS-MLPA) on menetelmä samanaikaiseen havaitsemiseen metylaation useissa tehtävissä yhdessä reaktiossa [22], [23]. Lyhyesti sanottuna, seos koetin-mix (ME042-B1 CIMP, enemmän tietoa spesifisiä koettimia katso taulukko S1) ja puskuria lisättiin denaturoidun DNA: n, ja koettimia annettiin hybridisoitua DNA: han 60 ° C: ssa 16 tuntia . Kukin näyte jaettiin kahteen putkeen, jossa yksi puoli ligoitiin, ja muut ligoitiin ja pilkottiin käyttämällä mety- restriktioentsyymillä

Hhal

. Molemmat näytteet tämän jälkeen altistettiin PCR-reaktiolle käyttämällä lämpösyklilaitetta (GeneAmp 2700, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), ja fragmentti, joka suoritettiin kapillaari sekvensseri (ABI 3130

xl

, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). DNA normaalista paksusuolen limakalvon käytettiin normaalisti viitteenä. Ulostulo analyysin jälkeen välisiä ja näyte normalisointi, on prosenttiosuus metylaation näytteessä.

Data Analysis of MLPA Data

Raakadataa fragmentti analyysi analysoitiin käyttämällä Coffalyser.NET ™ ohjelmiston, beta-versio, (MRC-Holland, Amsterdam, Alankomaat). Lyhyesti sanottuna metylointi kunkin aseman jokaisessa näytteessä suhteessa vertailutasoon laskettiin Coffalyser.net ™ ohjelmistoa, oletusasetuksilla.

Kaikki laatutoimenpiteitä /parametrit olivat sisällä tyydyttäviä alueella. Kaikki näytteet normalisoitiin vastaan ​​useita ajojen Vertailunäytteen (muun näyte normalisointi), ja lisäksi kaikki koettimet säädettiin viittaus antureista kussakin näytteessä (intra näyte normalisointi).

metylaatio pisteytystä kaikista antureista kaikilla näytteet, suhde huipun korkeudesta pilkottu versus pilkkoutumattomiin näyte laskettiin yksitellen Coffalyser, ja prosenttiosuus metylaation käytettiin lisäanalyysiä.

Määritelmät ja cut-off.

tutkiakseen erot CIMP taajuudella, joka riippui siitä, missä määrin metylaation, eri pisteytys parametrejä testattiin.

Kaksi paneeleja geenien tutkittiin. Ogino pisteytys paneeli sisältää 8 geenit (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

,

SOCS1

,

CDKN2A

,

MLH1

ja

CRABP1

), kun taas WEISENBERGER paneeli sisältää 5 edellä mainitut geenit (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

ja

SOCS1

). Sillä WEISENBERGER paneeli (kutsutaan WEISENBERGER jäljempänä) positiivisen pistemäärän kolme tai useampia viidestä geenien katsotaan CIMP positiivinen, ottaa huomioon, että Ogino paneelin kaksi eri määritelmää testattiin; CIMP positiivisuus jos 5 8 geenejä olivat positiiviset (kutsutaan Ogino 5/8), ja CIMP positiivisuutta jos 6 8 geenejä olivat positiiviset (Ogino 6/8).

Lisäksi erilaiset raja-arvot taposta positiivinen metylaation kunkin koettimen, sekä erilaisia ​​määritelmiä koko metylaatiostatus tietyn geenin tutkittiin: Kaikki asemat /koettimet pisteytetty kaksi eri metylaatio (≥20% tai ≥30%), joka määrittää tietyn aseman /koettimesta metyloitu. Kolme eri raja-arvot testattiin määriteltäessä metylaation kutakin geeniä; joko vähintään 33% (1/3) koettimien oli metyloitu; vähintään 66% (2/3) oli metyloitu, tai; jossa on ainakin yksi tai useampi metyloidut koettimia geenin sisällä.

Kunkin geenin useita metylaatiokohtia tutkittiin, vaihtelevat 3-6 sivustoja per geeni. Määrä metylaatiokohtia varten geenien tutkittu oli seuraava: 3 koettimina kukin

RUNX3

,

CACNA1G

ja

IGF2

; 4 koettimia kukin

MLH1

,

CRABP1

,

SOCS1

ja

CDKN1A

, ja; 6 koettimia

NEUROG1

.

CIMP päätöstä, kolme paneelit käytettiin yhdessä kaikkien probe- ja geeni-viisasta cut-off, kuva 1. Tämä johti yhteensä 18 vaihtoehto pisteytys määritelmät CIMP. Erot positiivista näytettä havaittiin, ja tilastollinen merkitsevyys arvioitiin.

”tiukimmatkin kriteerit” pisteytys on CIMP määriteltiin metylaatio vähintään 30% anturi tasolla ainakin 66% positiivista antureista geenin sisällä, ja 6 ulos 8 positiivista geenien Ogino paneelissa. ”Vähiten tiukat kriteerit” määriteltiin 20% metylaation on koetin tasolla, yksi tai useampi positiivinen koettimia geenin sisällä, ja 3 5 geenien pisteytetään positiiviseksi WEISENBERGER paneelissa.

Tilastollinen analyysi.

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin SPSS v21 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).

positiivisten näytteiden määrää johtuvat kunkin eri pisteytyksen perusteita verrattiin käyttäen mcnemarin testi on 2 × 2 taulukossa. Kaikki testit olivat kaksipuolisia, ja tilastollinen merkitsevyys tarkoitettu p-arvojen 0,05.

Tulokset

Probe-viisasta Cut-off

Kunkin koetin, suhteellinen metylaatio näytteen, verrattuna normaaliin viittaus, annettiin prosentteina. Cut-off taposta koettimesta metyloitu testattiin käyttämällä sekä 20% ja 30% metylaation näytteen vs viittaus, Kuvio 2. Molemmat raja-arvot testattiin kaikkien antureista määrityksessä. Kaiken käyttäen 30% cut-off, useita positiivisia näytteitä 31 eri antureista testattu, vaihteli 0 (0%) 63 (95%), kun taas käyttämällä 20% cut-off, vaihtelu oli 0 (0%) ja 64 (97%). Keskimääräinen vaihtelu pisteytyksen positiivisten näytteiden välillä 20% ja 30% raja-arvot olivat 3 (5%), vaihdellen vähintään 0 ja enintään 8 näytettä (0-12%). Neljä 31 antureista (13%), kahdessa eri geeniä, ei osoittanut mitään eroa positiivisten näytteiden käyttäen kahta raja-arvot (03-+037.010.228 in

MLH1

, 16-+011.256.544, 16-011.256.960 ja 16-011257200 in

SOCS1

). Suurin vaihtelu havaittiin koetin 09-021965200 in

CDKN2A

, jossa 8 potilaalla (12%) pisteytettiin eri tavalla käyttäen kahta eri raja-arvot. Kolme antureista (16-011256544, 16-011256960 ja 16-011257200 in

SOCS1

) ei ollut yhtään positiivista jommallakummalla kriteerejä, koska metylointi prosenttiosuus vaihteli 0-5%.

akselin vasemmalla näkyy positiivisten näytteiden määrää, ja akselin oikealla näyttää prosentteina positiivisten näytteiden.

Gene-viisasta Cut-off

numero Antureiden tutkittu kutakin geeniä vaihteli 3 6. Kolme erilaista sisäistä geeni asetukset testattiin; yksi tai useampi positiivinen antureista, yli 33% positiivisia antureista tai yli 66% positiivista antureista. Kaikki kolme asetukset testattiin sekä koetin-viisasta cut-off 20% ja 30%.

Tämä johti kuuden scorings kohti geeni, jolle keskimäärin 44,8% näytteistä pisteytettiin positiivisiksi yli 8 geenit. Keskimääräinen prosenttiosuus positiivisten näytteiden koko geenit, kunkin pisteet kriteerit, vaihteli 34,3%: sta 57,0%, käyttäen tiukimmat (30% koetin cut-off, 66% positiivisia antureista per geeni), ja vähiten tiukat kriteerit (20% koetin cut-off, ≥1 positiivinen koetin per geeni), taulukko 1.

SOCS1 oli pienin positiivisten näytteiden määrää, joiden keskimääräinen pistemäärä positiivisista 5,8%, välillä 0 18,2%, kun taas keskimääräinen pistemäärä on positiivinen näytteitä IGF2 oli 96,0%, että 6 vaihtoehtoisten kriteerien, jotka vaihtelevat 92,4-97,0%, taulukko 1 /Kuva 3.

CDKN2A

osoitti suurinta vaihtelua positiivista näytettä käyttäen 6 vaihtoehtoista kriteerit. Positiivisten näytteiden vaihteli 39 näytettä, jotka vaihtelevat 5-44, käyttäen tiukimmat ja vähiten tiukat, vastaavasti. Päinvastoin,

RUNX3

ja

IGF2

osoittivat vähiten vaihtelua; molemmissa tapauksissa vain 3 potilasta pisteytettiin eri yli 6 eri kriteereitä. Sillä

RUNX3

24 potilasta pisteytettiin positiiviseksi tiukimmatkin kriteerit, verrattuna 27 potilasta vähiten tiukat kriteerit. Sillä

IGF2

useita positiivisia näytteitä oli 61 ja 64 käyttäen parhaiten ja vähiten tiukat, vastaavasti.

CIMP Taajuudet

tulos, mitattuna määrä positiiviset näytteet käyttämällä kutakin kolmea paneelit, kuten erilaisia ​​yhdistelmiä koetin-viisas ja geeni-viisasta scorings, esitetään taulukossa 2 /Kuva 4.

tiukimmatkin kriteerit, käyttäen koetin cut-off 30%, ja vaativat, että 2 kolmesta ( 66%) koettimista tietyllä geenin täytyy olla positiivinen, lisäksi käyttäen Ogino 6/8 paneeli, palautetaan 13 (20%) CIMP-positiivista näytettä. Päinvastoin, käyttäen koetin cut-off 20%, joka edellyttää ainakin yhden tai useamman positiivisen koetin geenin sisällä, ja WEISENBERGER paneelin (3 out of 5 positiivinen geenien), palautetaan 30 (45%) CIMP-positiivista näytettä.

Kun käytetään vähiten vaativat kriteerit probe- (20%) ja geeneihin (≥1 positiivinen geenit) tasolla 24 näytettä (36%) pisteytettiin positiivisiksi käyttämällä Ogino 6/8-paneeli, 29 positiivista (44%) käyttäen Ogino 5/8-paneeli ja 30 positiivisia (46%) käyttäen WEISENBERGER paneeli. Nämä probe- ja geeni tasokriteerit tuloksena oli suurin vaihtelu paneelien, jolloin 6 potilasta (9,1%) on sijoitettiin eri tavalla. 47 potilaan näytteitä (71%), Yhdistyneessä CIMP tila oli vakio ja riippumaton kriteerit pisteytys; 34 näytettä olivat jatkuvasti pisteytettiin CIMP negatiivinen, ja 13 sai kuin CIMP positiivinen.

Merkittävä ero positiivisten näytteiden avulla tiukimmat (20%) verrattuna vähiten ankarat (46%) kriteerit osoitettiin, p 0,005. Verrattaessa vähiten vaativat kriteerit sekä koetin-tason (20%) ja geeni-tason (≥1 positiivinen koetin) välillä kolme paneelia, vain Ogino 6/8 verrattuna WEISENBERGER paneeli oli merkitsevä ero (p = 0,031) . Päinvastoin, tiukimpien kriteerit probe- ja geenien tasolla ei palannut merkittäviä eroja paneelit.

Testing eroja kussakin paneelit, osoitti, että lisäämällä tiukkuus geenien tasolla vähiten tiukat (≥1) tiukimpien (66%), pitäen koetin taso vakiona, aiheutti merkittäviä eri positiivisten näytteiden määrää. Toisaalta, pitämällä geeni taso vakiona, kun vaihdat koetin taso, ei johda merkittäviin eri positiivisia näytteitä ≥1 kriteerien sisällä WEISENBERGER paneelissa vain.

Keskustelu

Independent of käytetyt menetelmät, kriteerit pisteytystä CIMP olisi määriteltävä kolmella tasolla; mitkä geenit tulisi testata, kuinka monta metylaatiokohtia tulisi vaikuttaa geeniä olla transkriptionaalisesti inaktivoitu, ja missä määrin metylointi sivusto on metyloitu vaikuttaa transkriptioon asemaan geenin.

Tässä tutkimuksessa löytyi merkittävää eroa CIMP taajuus paksusuolensyöpä MS-MLPA menetelmää, kun vertaillaan eri kriteerejä käytetään määriteltäessä metyloituja näytteitä. Vaikka suuri prosenttiosuus näytteitä (71%) oli johdonmukaisesti sijoitettiin (joista 13 CIMP positiivinen) ilman muutosta mukaan käytetyt kriteerit, loput vaikuttivat muutos pisteytyksen perusteet. Erityisesti vain neljä 31 antureista (13%) tutki osoittanut mitään eroa positiivisten näytteiden avulla eri raja-arvot. Suurin muutos havaittiin yhden koettimista

CDKN2A

geenin. Sillä 8 geenit tutkitaan,

RUNX3

ja

IGF2

olivat eniten sopusoinnussa vähän vaihtelua joukossa näytteitä, kun taas huomattavaa vaihtelua oli havaittavissa

CDKN2A

mukaisesti tuloksiin ilmoittamien Ogino et ai. [20]. Käytetyt kriteerit johti merkittävästi eri positiivisten näytteiden määrää, kun käytetään kahta ehdotti paneelit määritellä CIMP aseman kirjallisuudessa, eli Ogino- ja WEISENBERGER paneelit [20], [24].

Havainnot aiheuttaa useita tärkeitä seurauksia. Ensinnäkin se osoittaa vaihtelua taajuuden CIMP riippuen raja-arvot ja geenien tutkittu paneeliin. Tämä pitää ottaa huomioon tutkijat käyttävät CIMP osana luokitusta ehdotettu peräsuolen syövän. Toiseksi, se osoittaa vaihtelua metylaation sisällä ja välillä geenejä. Tämä voi joko liittyä tosi eroja geenien ja tutkittujen koettimet, tai jotka liittyvät tekniikkaa käytetään tunnistamiseen. Jos entinen on totta, syy miksi tietyt sivustot ovat (johdonmukaisesti) metyloituja kun taas toiset eivät olisi tutkittava, koska se voi muodostaa uutta tietoa syövän synnyn ja miten metylaatio saattaa osaltaan syövän kehittymisen. Lisäksi voi olla, että geenit ja anturit (esimerkiksi

RUNX3

ja

IGF2

) tulisi käyttää yhdessä muiden tai vastaavalla johdonmukaisesti metyloidut geenien paneelien muodostamiseksi päätöstä CIMP asema, jotta välttää yli- tai aliarviointiin CIMP positiivisia tai negatiivisia näytteitä.

Esitetty tutkimus tehtiin, jotta voitaisiin arvioida merkitystä käyttää vaihtoehtoisia pisteytys kriteerit CIMP, käyttämällä metylaatiospesifisen multiplex ligaatio riippuva anturi vahvistus (MS -MLPA). Julkaistussa kirjallisuudessa on useita tutkimuksia arvioitaessa geeni paneelit ja CpG kantoja, joita käytetään CIMP pisteytys, mutta taustalla cut-off varten erityinen asema ja geeni huonosti käsitelty [11], [20], [24].

tässä tutkimuksessa ero positiivisten näytteiden määrää käyttäen tiukimmat verrattuna vähiten tiukat kriteerit olivat tilastollisesti merkitseviä, ja osoittaa, että valittu raja-arvot, joita käytetään pisteytystä CIMP tila on tärkeä. Lisäksi tilastolliset analyysit osoittivat myös, että yhdistelmät kaikilla kolmella tasolla pisteytyksen vaihtoehtoja antoi tilastollisesti eri positiivisten näytteiden määrää, mikä tarkoittaa, että kaikilla kolmella tasolla olisi arvioitava huolellisesti. Kuitenkin kaikissa kolmessa paneelit, muuttamalla geeni tasokriteerit oli suurempi vaikutus näytteiden määrä arvioitiin positiiviseksi kuin muuttamalla anturin tason kriteerit. Vaikka useita eri menetelmiä voidaan käyttää havaitsemaan CIMP fenotyyppi, kaikki nämä menetelmät on otettava huomioon pisteytys kriteerit taustalla CIMP määritelmää. Riippumaton käytetyt menetelmät, yksi on harkittava, mitä CpG sivustoja tutkia ja määrittää cut-off metylaatio tietyn CpG sivuston, määrittää, kuinka monta CpG sivustojen geeni täytyy metyloituvan määrittää geenin metyloitu, ja lopuksi, mitkä geenit, ja kuinka moni heistä tulee metyloituvan lopulta pisteet näytteen metyloitu.

erot CIMP pisteytyksen väliin geeni paneelit on arvioitu [20], ja sen todettiin olevan varsin pieni ( 3,2%), vaikka välissä paneelien eri geenejä. Myös vertailu cut-off varten Ogino paneelin (5 8 ja 6 8) verrattiin, ja 3% näytteistä osoitti eri pisteytys (18% ja 15%, vastaavasti) [20].

yleensä riippumattomia kriteereitä ja käytetty menetelmä pisteytystä CIMP aste metylaation mitattuna tietylle asema riippuisi homogeenisuus solujen ja infiltraatiota normaalien solujen näytteessä tutkittu.

myös valinta normaalin viite näytteen tutkimusta varten olisi arvioitava huolellisesti, koska metylointi näytteestä on suhteessa valittuun vertailuaineeseen. Tässä tutkimuksessa käytettiin näytteen normaalin epiteelissä koolonsyövän potilaalle. Teoriassa tämä näyte voisi kertyä jonkin epigeneettisiä ominaisuuksia, jotka vaikuttavat tulosten metylaatiokuvion syövän näytteissä. Tämä vaikuttaa kaikkiin näytteet yhtä, ja on siksi on hyvin vähän merkitystä suhteen arvioinnissa pisteytys kriteerit. Tilaisuus, paras vaihtoehto olisi ollut testata normaalin limakalvon kudos potilaasta jossa kasvain testattu lähtöisin rinnalla kasvain itse. Koska harvoilla materiaalin olimme käytettävissä, paras vaihtoehto oli käyttää ennen mainittua valvontaa ja siten esittää tiedot sen mukaisesti.

Useimmat raportit CIMP tila on käytetty bisulfiittimassasta käsittely DNA ennen valitun menetelmän kyselyä varten metylaatiokuvion. Tämä manipulointi DNA muuntaa metyloitumattomat sytosiinit urasiileja, kun metyloituja jätetään kääntymättömät. On olemassa useita protokollia bisulfiitti hoitoa, eroavat bisulfiittimenetelmällä käytetty pitoisuus ja inkubaatio /bittiä, ja lisätä toisen tason monimutkaisuutta vakuuttavia CIMP tila. Tässä tutkimuksessa esitetään tässä, ei DNA: ta hoito on tehty ennen MLPA menetelmää, mikä rajoittaa virhelähde.

Lisäksi se seikka, että metylointi geenin vaihdellessa luonnollisesti jotta säädellä geeniekspressiota, ja että luonne epigenome vastoin genomi, on oltava jatkuvassa muutos, on toinen näkökohta monimutkaistaa selkeää määrittelyä CIMP [25]. Voit kiertää tämän haasteen täytyisi luottaa materiaalia, jotka on kerätty samaan aikaan aikaväli ja vaiheessa potilaiden hoidossa, koska tällaiset vältetään mahdollisimman nopeutus poikkeamia.

Johtopäätökset

Johtopäätöksenä tässä tutkimuksessa valaisee, miten eri pisteytyksen perusteita johtaa tilastollisesti merkitsevä eri määrän CIMP positiivisia näytteitä. Määritelmä CIMP kolorektaalisyövässä ei ole vielä sovittu, eikä laadulliseen tasolla (joka CpG saaret /geenejä, jotka olisi testattava), on määrällinen taso (montako oltava metyloitu), eikä teknisellä tasolla ( mitä menetelmää käytetään). Kuitenkin riippumatta käytetty menetelmä täytyisi päättää raja-arvot positiiviselle pisteytyksen, joka olisi arvioitava huolellisesti, koska tuloksena CIMP taajuus vaikuttaa merkittävästi tämän päätöksen. Lisätutkimuksia tällä tärkeällä alalla tarpeen parantaa kliinistä käännös roolin CIMP syövässä.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Jaksot, kromosomaalinen sijainti, ja fragmentti pituudet tutkittujen kantojen /koettimina MLPA menetelmällä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0086657.s001

(DOCX) B

Kiitokset

Kiitämme Oddmund Nordgaard varten ystävällisesti tarjota DNA paksusuolen syövistä ja normaali koolonkudoksessa.