Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lisämunuaisen kuorikerroksen karsinooma (ACC) on hyvin harvinainen hormonitoimintaa kasvain, vaihtelevalla prognoosi riippuen kasvaimen vaihe ja diagnoosin ajankohdasta. Se on kuitenkin yleensä kohtalokasta, joiden eloonjäämisaste 5 vuotta, alkaen havaitsemista. Sädehoito käyttökelpoisuus ACC hoito on laajalti keskusteltu ja näyttää olevan riippuvainen molekyylien muutoksia, mikä puolestaan ​​johtaa lisääntyneeseen radio-vastus. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että p53 menetys on merkittävä riskitekijä pahanlaatuinen lisämunuaiskuoren kasvain puhkeamista ja on raportoitu, että somaattiset mutaatiot

TP53

geeni esiintyy 27-70% aikuisista satunnaista aluelennonjohtokeskusten. Tässä tutkimuksessa selvitimme roolia somaattisten mutaatioiden

TP53

geeni vastauksena ionisoiva säteily (IR). Olemme tutkineet tilan p53 kaksi lisämunuaisen kuoren solulinjoissa, H295R ja SW-13, kätkeminen ei-toiminnan muotoja tämän proteiinin, puuttuessa eksonien 8 ja 9, ja pistemutaatio eksonissa 6, vastaavasti. Lisäksi nämä solulinjat osoittavat korkeita p-Akt ja

IGF2

, erityisesti H295R. Huomasimme, että palauttaminen p53 aktiivisuuden johti kasvun esto jälkeen ohimenevän solujen transfektiota villin tyypin p53. Arviointi vastauksensa IR kannalta solujen lisääntymisen ja elinkelpoisuus määritettiin avulla solumäärän ja TUNEL määritys.

wtp53 yli-ilmentyminen lisääntyi solukuolema seuraavat sekä säteilyn solulinjoissa. Lisäksi RT-PCR ja Western blotting-analyysi joidenkin p53 kohdegeenien, kuten

BCL2

,

IGF2

ja Akt osoitti, että p53 aktivaation seuraavat IR johti vähenemiseen

IGF2

ilme. Tämä liittyi vähentää aktiivinen muoto Akt. Yhdessä nämä tulokset korostavat roolia p53 vastauksena säteily ACC solulinjojen, mikä viittaa sen merkitys ennakoiva tekijä sädehoidon pahanlaatuinen lisämunuaiskuoren kasvaimet tapauksissa.

Citation: Sampaoli C, Cerquetti L, Gawhary RE , Bucci B, Amendola D, Marchese R, et ai. (2012) p53 vakautus indusoi solukasvuneston ja vaikuttaa

IGF2

Pathway vastauksena Sädehoito vuonna Lisämunuaisen kuorikerroksen syöpäsoluja. PLoS ONE 7 (9): e45129. doi: 10,1371 /journal.pone.0045129

Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ”, Italia

vastaanotettu 23. huhtikuuta 2012 Hyväksytty: 14 elokuu 2012; Julkaistu: 19 syyskuu 2012

Copyright: © Sampaoli et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Italian valtiovarainministeriön yliopisto ja tutkimuskeskus (20085P5S49_005), jota Rooman Sapienza-yliopisto (C26A1097KR), jonka Fondazione Guido Berlucchi per la Ricerca sul Cancro, tutkimusprojekti: ”Tumori del sistema endocrino” Borgonato di Corte Franca – Brescia, Italia . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Lisämunuaisen kuorikerroksen karsinooma (ACC) on hyvin harvinainen hormonitoimintaa kasvain, joiden esiintyvyys arvioidaan noin 1-2 tapausta

kohden

1 miljoona ihmistä vuosittain koko aikuisväestöstä [1], [ ,,,0],2], kun taas lapsen väestö Etelä Brasilian taajuus tämän maligniteetti on suhteellisen korkea, vaihdellen 3,4 4,2

kohden

miljoonaa lasta [3], [4]. Tilastollinen ikäjakauma noudattaa bimodaalisen suuntaus, jossa on ensimmäinen huippu esiintyy varhaislapsuudessa ja toinen neljännessä ja viidennessä vuosikymmenen elämän [2], [5].

aluelennonjohtokeskusten näyttää vaihtelevan prognoosi riippuen kasvaimen vaihe ja diagnoosin aikana, vaikka ne ovat yleensä kohtalokas, joiden eloonjäämisaste 5 vuotta, alkaen havaitseminen [6]. Taajuus etäpesäkkeiden liittyy ACC vaihtelee tutkimuksesta, jotka vaihtelevat 30%: sta 85%: lla potilaista, joilla etäpesäkkeiden aikaan esityksen [7].

Tällä hetkellä hoito, joka näyttää tuottavan parhaat tulokset ACC tapauksissa kirurginen resektio lisämunuaisen massasta. Kuitenkin, leikkauksen jälkeinen tautivapaan elinajan 5 vuoden aikana on vain noin 30% ja uusiutuminen ovat jopa 85%. Lääketieteellinen hoito o, p’DDD (orto, para ’, dikloori-, difenyyli-, dikloorietaani tai mitotaani) ja muiden sytotoksisten lääkkeiden rajoittavat tärkeitä sivuvaikutuksia. Näin ollen muut adjuvantti hoitovaihtoehdot jälkeen täydellisen kasvaimen poiston tarvitaan [8], [9].

Sädehoito on usein pidetty tehottomia ACC hoitoon. Itse asiassa jopa 58% potilaista ei näytä merkittävää vastetta. Vaikka kerätyt tiedot hoidetuista potilaista adjuvantti kasvainalueelle säteilytys osoitettu, että sädehoito voivat olla tehokkaita vähentämään korkea paikallisten toistumisen ACC, korkea vaihtelua havaitut vaikutukset viittaavat siihen, että enemmän tutkimuksia tarvitaan, jotta ymmärtää täysin tehokas terapeuttinen rooli sädehoidon [8], [10]. Tällä hetkellä ajatellaan, että sädehoidon potilaalle yksilöllisesti, ottaen huomioon sellaiset tekijät kuin kasvaimen kokoa, resektio tila, Ki-67-indeksi ja kasvaimen leviäminen [11].

Lisäksi vaihtelevuus vasteet havaittiin korostettiin tunnistamisen geneettisten ja molekyylitason muutoksia mukana vastus joidenkin kasvainten sädehoitoon [2], [12]. Tällä hetkellä tieto geneettisiä muutoksia johtaa ACC alttius on melko huono. Kuitenkin monet tutkimukset ovat osoittaneet, että p53 menetys on merkittävä riskitekijä pahanlaatuinen lisämunuaiskuoren kasvain puhkeamista. Potilaat kärsivät Li-Fraumeni oireyhtymä, jotka perivät ituradan mutaatioita

TP53

, ovat todennäköisesti kehittää pahanlaatuisia lisämunuaiskuoren kasvaimia. Lisäksi tietty mutaatio kodonissa 337 (R337H) näyttää olevan vastuussa useimmissa tapauksissa ACC lapsen väestöstä Etelä Brasilia. Lisäksi se on ollut myös raportoitu, että somaattisia mutaatioita

TP53

geeni esiintyy 25-70%: lla aikuisista satunnaista aluelennonjohtokeskusten [2], [9].

Tässä tutkimuksessa tutkimme rooli p53 vastauksena ionisoiva säteily (IR) ACC

in vitro

malleissa. Tarkemmin, olemme analysoineet asema

TP53

geenin kahdesta ihmisen ACC solulinjoissa, H295R ja SW-13, ja olemme havainneet, että tämä geeni on mutatoitunut molemmissa solulinjoissa, jotka ovat osittain resistentti IR annoksena 6 Gy, kuten aikaisemmin on osoitettu, [13]. Yli-ilmentyminen

IGF2

mRNA on toinen tyypillinen piirre ACC löytyy H295R solulinjassa. Täällä, osoitimme, että palauttaminen p53 aktiivisuuden, transfektoimalla villityypin p53 (

wtp53), johti kasvun estoa ja aiheuttama solukuolema seuraava IR annon molemmissa solulinjoissa. Olemme myös huomanneet luotettavan lasku

IGF2

geenien ilmentyminen ja vähentäminen Akt aktivointi seuraavissa IR hoidon soluissa yli-ilmentävät villityypin p53.

Yhteenvetona nämä tulokset korostavat p53 solujen vastauksena IR ACC solulinjoissa. Ne osoittavat myös molekyylitason mekanismi liittyy IGF2, mikä vahvistaa tehokkuus sädehoidon adjuvanttina käsittelyä ACC.

Tulokset

TP53

mRNA analyysi

aiemmassa paperi ryhmämme [13], suuri deleetio

TP53

geeniä, jotka vaikuttavat eksonien 8 ja 9, löydettiin H295R solulinjassa. Me tehdään sekvensointi-analyysi

TP53

koodaavan sekvenssin näiden solujen vaikutuksen arvioimiseksi tämän deleetion mRNA tuotantoon. Huomasimme, että lyhyempi mRNA transkriboidaan, jossa eksoni 7 suoraan sidottu eksonia 10 (kuvio 1, paneeli A, ylhäällä). Joka on yhdenmukainen, RT-PCR-analyysi

TP53

, suoritettiin käyttämällä alukkeita, jotka reunustavat eksonit 8 ja 9 alueella. Tämä paljasti lyhyempi mRNA tuote, josta puuttuu 211 emäsparia (kuvio 1, paneeli B).

(A) edustus

TP53

mutaatioita tunnistettiin H295R ja SW-13 solulinjoja, osoittaa suuri poisto vaikuttaa 211 emäsparin H295R soluissa (ylhäällä) ja homotsygoottisia pistemutaatio eksonissa 6 (

r.577c u

) SW-13-solulinja (alhaalla). SW-13-soluissa esiintyy myös polymorfiselle sijaitsee eksonissa 4 (

r.215c g

). (B) Käänteinen kuva suhteessa RT-PCR-analyysi eksonien 7-10 on

TP53

geenin. Elektroforeesi 2% agaroosigeelissä osoitti suuren kaistan ~575 bp, joka vastaa SW-13-transkriptin, ja pienempi vyöhyke ~364 bp, joka vastaa H295R transkriptin (DNA tikkaat, 1 Kb plus). (C) ennustettu aminohapposekvenssi p53 H295R ja SW-13-solulinjoja. Poistetaan eksonien 8 ja 9 H295R määrittää lukukehyksen alkaen kodonissa 261, luoda myöhemmin stop-kodonilla asemassa 274 (ylhäällä). SW-13-soluja, homotsygoottinen pistemutaatio kodonissa 193 määrittää aminohappo substituution (histidiini tyrosiiniin) on DBD proteiinin (alla). (D) Western blotting-analyysi p53 H295R ja SW-13-soluja, jotka osoittavat, että läsnä on lyhyempi proteiinin H295R solulinjassa, joka molekyylipaino on ~44 kDa.

poistaminen eksonien 8 ja 9 määrittää aminohapposekvenssin muutos alkaa kodonista 261, joka myös esittelee ennenaikainen lopetuskodoni aminohappoasemassa 274 (kuvio 1, paneeli C, ylhäällä). Mukaan meidän aiemmin ilmoittanut tämän mRNA osoitettiin käännetään lyhyempi proteiiniin, jonka molekyylipaino on noin 44 kDa (kuvio 1, paneeli D).

Sekvensointianalyyysi on

TP53

koodaus sekvenssi SW-13-soluja vahvisti, että läsnä on homotsygoottinen pistemutaatio eksonissa 6 (

r.577c u

), joka on kuvattu ensimmäisen kerran Reincke

et al.

[ ,,,0],14] (Kuva 1, paneeli A, alhaalla). Tämä johtaa aminohapon muutos kodonissa 193 (histidiinin tyrosiini) (kuvio 1, paneeli C, alhaalla). Lisäksi olemme tunnistaneet polymorfismi kodonissa 72 (CCC CGC) (kuvio 1, paneeli A, alhaalla) tässä solulinjassa, mikä johtaa aminohapposubstituutio tässä asennossa (arginiini sijasta proliini) (kuvio 1, paneeli C, alhaalla). Tuloksena p53-proteiini näissä soluissa on vakio molekyylipaino (kuvio 1, paneeli D), ja ilmentyy voimakkaasti verrattuna LNCaP-solulinja, joka satamat villityypin muoto p53, kuten osoitettiin Western blotting -analyysi (kuvio S1).

vaikutus villityypin

TP53

soluproliferaatioon ja vastaus ionisoivan säteilyn

merkityksen arvioimiseksi

TP53

mutaatiot soluproliferaatioon, me transfektoitiin lyhytaikaisesti H295R ja SW-13-soluja tyhjällä vektorilla (vale) tai vektorina, joka ekspressoi villin tyypin muotoa

TP53

(WT) ja arvioidaan vaikutus solujen kasvuun 24, 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen. Olemme myös arvioitiin vaikutus

TP53

palauttaminen vastauksena säteilytys annoksena 6 Gy.

Sama analyysi suoritettiin säteilyresistenttejä munasarjojen adenokarsinooma SK-OV-3-solut, jotka eivät ilmaista joko p53-proteiinin tai mRNA: n [15].

H295R soluissa (kuvio 2, paneeli A, vasemmalla), mitään merkittävää kasvun estämistä ei havaittu soluissa, jotka ilmentävät villityyppistä p53 verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla ( -11% 48 tunnin jälkeen ja -9% 72 h). Tämä osoittaa, että p53 ei yksin pysty indusoimaan vakaan kasvun pysähtymistä näissä soluissa. IR ei muuttanut merkitsevästi solujen lisääntymistä soluissa transfektoitu tyhjällä vektorilla (-4% 72 tunnin jälkeen), kun taas säteilyn vaikutusta solujen kasvuun näkyi soluissa, jotka ilmentävät

wtp53. Tämä vaikutus oli ilmeistä 48 h transfektion jälkeen (-18% verrattuna pilkata säteilytettyjä soluja; p 0,05) ja vahvistettiin 72 tuntia transfektion jälkeen (48 h säteilytyksen jälkeen), kun kasvun estäminen saavutti -25% (p 0,01).

solun kasvu arvioitiin H295R, SW-13 ja SK-OV-3-solulinjojen transfektoitu tyhjällä vektorilla (vale) tai p53-vektorin (WT), joko säteilytetty tai ei. (A) In H295R solulinjat (vasemmalla), ionisoiva säteily (IR) käsittely indusoi merkittävää solujen kasvun esto soluissa, jotka ilmentävät villityyppistä p53: alkaen 48 h transfektion jälkeen (-18% verrattuna pilkattaa säteilytettyjä soluja; p 0,05 ) ja saavuttaa -25% 72 tunnin jälkeen (p 0,01). Säteilytys ei aiheuta vakaa vaikutus SW-13-soluja (oikealla), jotka oli transfektoitu tyhjällä vektorilla, kun taas solut, jotka ilmentävät villityyppistä p53: n vaikutuksesta inhiboitui merkittävästi 48 h transfektion jälkeen (-28%, p 0,05), kunnes kokeen loppuun ( -31%; p 0,01). SK-OV-3-solut (alhaalla), p53 palauttaminen indusoi voimakas vaikutus solujen kasvuun, mikä näkyy koska 48 transfektiosta (-20% kasvun eston WT + IR näyte verrattuna mock + IR; p 0,01) ja kestää jopa 72 tuntia (-28%, p 0,01). Tiedot ovat keskiarvo ± S.D. vähintään kolmen itsenäisen kokeen suorittamista kaksoiskappaleet. (B) Western-blottaus-analyysi sykliini E ja sykliini D1 ilmentymisen H295R soluissa 72 tuntia transfektion jälkeen paljasti down-regulation näiden proteiinien soluissa, jotka ilmentävät

wtp53 käsiteltiin IR-annoksella 6 Gy. (C) analyysi sykliini E ja sykliini D1 ilmentyminen SW-13-solulinjasta Western blottauksella osoittaa lasku proteiinin tasot näytteissä transfektoitu p53-vektorin jälkeen säteilytyksen. Yhtyeiden voimakkuudet olivat määrällisesti ImageJ ohjelmiston avulla vinkuliini varten normalisointi. (*, P 0,05).

Toisin kuin edellisessä raportissa [13], tässä työssä me parantunut transfektion tehokkuutta käyttämällä pBabe-neo-p53 vektori, joka sisältää MMLV Long Terminal Repeat. Morgenstern ja Land [16] tue mahdollisuutta tämän vektorin parantaa huomattavasti geeniekspressiota monissa solulinjoissa.

Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin SW-13-solulinja (kuvio 2, paneeli A, oikealla). Solut transfektoitu tyhjällä vektorilla tai p53-vektori osoitti hyvin samankaltainen leviämisen suuntausta. Lisäksi säteilytys ei merkittävästi vaikuttanut solujen lisääntymistä soluissa, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla. Päinvastoin, on vahva vaikutus IR hoidon soluissa, jotka ilmentävät

wtp53 oli ilmeistä 24 h säteilytyksen jälkeen (48 h transfektion jälkeen), jossa on 28% solujen kasvun esto (p 0,05) verrattuna säteilytettyjä soluja, jotka on transfektoitu tyhjä vektori. Vaikutus oli vielä suurempi 72 tuntia transfektion jälkeen, kun havaitsimme 31% kasvun eston WT säteilytetään soluissa verrattuna ohjaus (p 0,01).

SK-OV-3-solut (kuvio 2, paneeli A, alhaalla), palauttaminen

wtp53 indusoi vähäistä estämistä solujen kasvun, joka ei kuitenkaan saa ylittää 17% 72 tunnin jälkeen. Havaitsimme myös, että IR-hoito annoksella 6 Gy indusoi kasvun inhibition -27% (p 0,05) 24 tunnin kuluttua soluissa, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla, joka oli -35% (p 0,01) 48 tunnin jälkeen. Kuitenkin, kun läsnä on

wtp53 vahvisti vaikutus IR hoidon. Itse asiassa havaitsimme solun kasvun inhibition -20% (p 0,01) 24 h säteilytyksen jälkeen soluissa, jotka ilmentävät p53 verrattuna transfektoitu tyhjällä vektorilla. Tämä vaikutus lisääntyi 48 tunnin jälkeen (-28%, p 0,01).

merkitys p53 SK-OV-3-solut vaste säteilytys varmistettiin edelleen se havainto, että solut transfektoitu tyhjällä vektorilla alkoi toipua 72 tuntia sen jälkeen, kun IR-hoidon, kun taas ne, jotka ilmentävät

wtp53 edelleen voidaan estää (tuloksia ei ole esitetty).

H295R ja SW-13-solulinjoja, vaikutus p53 vakauttamisen sykliini E ja sykliini D1 arvioitiin, koska näiden proteiinien edistävät solujen lisääntymistä nopeuttamalla G1 vaiheen solusyklin [17], [18]. 72 h transfektion jälkeen tyhjällä vektorilla (vale) tai p53-vektoriin (WT), havaitsimme lasku sykliini E ja sykliini D1 ilmentymisen tasot näytteissä ekspressoivat

wtp53 säteilytetään annoksella 6 Gy, sekä H295R (kuvio 2, paneeli B) ja SW-13 (kuvio 2, paneeli C) solut. Tämä tulos siis osoittaa, että IR hoito pystyy hidastamaan leviämisen nopeus meidän solulinjojen p53-riippuvainen tavalla.

Nämä tiedot osoittavat, että palauttaminen

wtp53 ilmaisun H295R ja SW-13 solulinjoissa ei ole riittävä kohdistamaan vaikutus solujen proliferaatioon. Läsnä villityypin muoto p53 näyttää olevan perustavanlaatuinen kasvun inhibition näiden solujen vasteena säteilytys, kuten solut, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla tuskin vaikuttaa tämän hoidon. Kuitenkin

wtp53 ilmentävien solujen merkittävästi estyy.

SK-OV-3-solut, vaikutus IR on vahvempi kuin H295R ja SW-13-soluja, vaikka näytteissä, jotka oli transfektoitu tyhjällä vektorilla, viittaa siihen, että tämä solulinja on herkempi säteilytys kuin ACC solulinjat. Kuitenkin suurin kasvun estäminen saavutetaan, kun villityypin muoto p53 ilmaistaan, mikä osoittaa, että tämä proteiini osallistuu vastauksena IR SK-OV-3-solut samoin.

stabilointi p53 vastauksena ionisoivalle säteilylle

Villityypin p53 yli-ilmentyminen arvioitiin RT-PCR: llä ja Western blottauksella. p53 tasoa merkittävästi lisääntynyt H295R ja SW-13 solulinjoissa 24 tunnin kuluttua transfektion pBabe-neo-p53 vektori ja olivat maksimissaan 48 tuntia. 72 h transfektion havaitsimme lasku p53 tasoa, joka tuntui johtuvan vähentää

TP53

mRNA, luultavasti siksi, että menetys on transfektoitu vektoreilla (kuva S2).

kuitenkin, soluissa, jotka on transfektoitu villin tyypin p53 altistetaan IR hoidon vaikutusta soluproliferaatioon oli voimakkainta, kun 72 tuntia transfektion jälkeen (48 h säteilytyksen jälkeen). Siksi ekspressiotasot p53 arvioitiin RT-PCR: llä ja Western blotting in H295R, SW-13 ja SK-OV-3-solut samanaikaisesti pisteen.

Real Time RT-PCR-analyysi vahvisti, että

TP53

geenin yli-ilmentyy kaikissa näytteissä, jotka on transfektoitu pBabe-neo-p53-vektoriin (kuvio 3, paneeli A, C, E), säteilytetyn tai ei. Verrattuna mock,

TP53

mRNA oli 5- ja 3-kertaisesti enemmän ilmaistu H295R ja SW-13-soluissa, vastaavasti. Mukaan Yaginuma ja Westphal [15], SK-OV-3-solut, ei

TP53

mRNA oli havaittavissa mock näytteitä, toisin kuin solut transfektoitu p53-vektori.

Expression tasot

TP53

ja p53-proteiinin arvioitiin Real Time RT-PCR ja Western blotting in H295R, SW-13 ja SK-OV-3-solut 72 tuntia transfektion jälkeen tyhjällä vektorilla (vale) tai p53-vektorin (WT) . Näytteet käsiteltiin IR-annoksella 6 Gy toisin mainita. (A) RT-PCR (ylhäällä) ja Real Time RT-PCR (alhaalla) analyysi

TP53

ilmentymistä H295R soluissa. Näytteitä transfektoitu pBabe-neo-p53 vektori esittävät 5-kertainen

TP53

mRNA verrattuna mock. (B) Western-blottaus-analyysi p53 H295R solut (ylhäällä) paljasti merkittävän kaistan ~53 kDa (

wtp53) ja pienempi vyöhyke ~44 kDa, joka vastaa typistetty muoto p53 (p53

Δ8 -9). Densitometria osoittaa, että

wtp53 stabiloidaan IR hoito (alhaalla). (C) RT-PCR-analyysi

TP53

mRNA: SW-13-soluja esitetään yli-ilmentyminen geenin näytteissä transfektoitu pBabe-neo-p53-vektoriin (ylhäällä). Real Time RT-PCR-analyysi paljasti 3-kertainen

TP53

transkriptin näytteistä, jotka oli transfektoitu p53: n vektoriin. Ilmaus

TP53

ei ole moduloitu säteilyttämällä (alhaalla). (D) tasot p53-proteiinin SW-13-solut lisäävät merkittävästi jälkeen IR hoidon transfektoiduissa soluissa pBabe-neo-p53 vektori, kun taas mitään muutosta ei havaita näytteissä transfektoitu tyhjällä vektorilla. (E) In SK-OV-3-soluissa, ei ole

TP53

transkripti oli havaittavissa RT-PCR: llä näytteistä, jotka oli transfektoitu tyhjällä vektorilla, kun taas solut, jotka on transfektoitu pBabe-neo-p53 vektori voimakkaan signaalin, joka vastaa

TP53

mRNA, on havaittavissa (ylhäällä). Real Time RT-PCR-analyysi ei osoita modulaatio

TP53

ilmaisun jälkeen säteilytys (alhaalla). (F) Western blotting-analyysi p53 SK-OV-3-solut paljasti havaittavissa bändi vain näytteissä transfektoitu pBabe-neo-p53 vektorin (ylhäällä). Densitometria osoittaa, että p53 nousevat säteilytyksen jälkeen, osoittaa vakauttaminen proteiinin (alhaalla). Tulokset edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen.

GAPDH

ja vinkuliini käytettiin normalisointia. (*, P 0,05, #, p 0,01).

Vaikka

TP53

mRNA oli korkeampi p53-transfektoiduissa soluissa, ne eivät vaihtelevat WT säteilytetty ja non -irradiated soluja. Päinvastoin, p53-proteiinin tasoa näytti olevan merkittävästi suurempi p53-transfektoiduista soluista altistettiin IR-hoitoon verrattuna ei-säteilytetyn niistä. Itse asiassa, vuonna H295R solujen tasot villityypin p53 kasvoi 3-kertaisesti säteilytettyjen WT-soluissa verrattuna p53-transfektoitujen, ei-säteilytettyjä soluja (kuvio 3, paneeli B). Kuitenkin endogeenisen muoto p53 (p53

Δ8-9) ei moduloitu sädehoitoa. SW-13-solut osoittivat 1,3-kertainen p53 säteilytettyyn WT näytteissä verrattuna WT (kuva 3, paneeli D), kun taas p53 oli 1,5 kertaa suurempi säteilytettyä SK-OV-3-solut verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuvio 3, paneeli F).

hoito H295R ja SW-13-solujen eri säteilyannosten (4, 6 ja 8 Gy) vahvisti, että

TP53

mRNA ekspressiotasoja ei vaikuttanut IR (kuvio S3, paneelit A, C). Antaminen säteilyannoksen 4 Gy ei aiheuttanut merkittävää vaihtelua p53-proteiinin myöskään. Päinvastoin, p53 upregulated annon jälkeen säteilyannokset 6 ja 8 Gy; kuitenkaan ei havaittu merkittäviä muutoksia näiden kahden annoksen (kuvio S3, paneelit B, D), mikä osoittaa, että IR-hoito annoksella 6 Gy on riittävä indusoimaan vakauttaminen p53 ACC solulinjoissa.

lisääntyminen p53-proteiini havaitun säteilytetty näytteissä ei johdu kasvusta

TP53

ilmaisua, koska mRNA ei vaikuttanut säteilyä. Tämä voidaan selittää aktivoitumisen p53 IR, joka kääntää vakiintumisena tämän proteiinin vasta soluissa tehdään tämä hoito. Vakauttaminen p53 voidaan katsotaan ennustavan Aktivoinnin mikä selittää vaikutusta soluproliferaatioon havaittu vain näytteet, jotka saivat säteilytys.

TUNEL analyysi solukuoleman

Koska p53 on hyvin tunnettu indusoija apoptoottisen prosessin vastauksena genotoksinen korostaa [19], [20], teimme TUNEL määritys, jotta voidaan analysoida läsnäolo apoptoosin H295R, SW-13 ja SK-OV-3-solulinjojen transfektoitu tyhjällä vektorilla (mock) tai p53-vektorin (WT), säteilytetyn tai ei.

Kuten oli odotettavissa, ei merkkejä apoptoosin oli havaittavissa näytteissä ei käsitelty IR (tuloksia ei ole esitetty). Apoptoottista solukuolemaa oli myös poissa säteilytettyjen transfektoitu tyhjällä vektorilla, kun taas näytteet, joissa villityypin muotoa p53 ilmaistiin näytti olevan positiivinen TUNEL värjäys kaikissa solulinjoissa (kuvio 4, paneeli A), mikä osoittaa, että läsnäolo toimiva p53 on tarpeen solukuoleman induktioon vasteena sädehoidossa.

H295R, SW-13 ja SK-OV-3-solulinjat transfektoitiin tyhjällä vektorilla (vale) tai p53-vektorin (WT) ja säteilytetään annoksella 6 Gy. (A) TUNEL määritys suoritettiin 48 ja 72 transfektion jälkeen. Kaikissa solulinjoissa, Tunel-positiiviset solut ovat havaittavissa vain säteilytettyä näytettä ilmentävät villin tyypin muotoa

TP53

. Solut värjättiin myös Hoechst 33342 ja sitten näkyviksi fluoresenssimikroskoopilla suurennuksella 40 x. Kuva näkyy edustaa kolmen kokeen suoritettiin kaksinkertaisina. (B) Prosenttia apoptoosin H295R, SW-13 ja SK-OV-3 laskettiin vertaamalla TUNEL-positiivisten solujen kanssa yhteensä soluja, värjättiin Hoechst 33342. Apoptosis kasvaa transfektoiduissa soluissa p53 vektori verrattuna mock-säteilytetty näytteitä, alkaen 48 h jälkeen transfektion ja vaikutus vahvistaa 72 tunnin jälkeen. (*, P 0,05, #, p 0,01). (C)

BCL2

ilmentyminen arvioitiin H295R solulinjassa RT-PCR: llä. p53 palauttaminen indusoi merkittävä väheneminen

BCL2

ilmaisun 48 ja 72 tuntia säteilytyksen jälkeen. (D) kuvat käänteisesti suhteessa semikvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

BCL2

geeniekspressio suoritettiin SW-13-soluissa, osoittaa merkittävä väheneminen

BCL2

signaali transfektoiduissa soluissa p53- vektori seuraavat ionisoivan säteilyn hoitoon. (E) vaikutus p53 palauttaminen on

BCL2

mRNA-tasot vastauksena säteilytys arvioitiin SK-OV-3 solulinjoissa. p53 inhiboi

BCL2

ilmaisun ja vaikutus on voimakkaampi 72 tuntia transfektion jälkeen. Kuvat edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen.

GAPDH

käytettiin normalisointi.

Apoptosis oli havaittavissa 48 tunnin kuluttua transfektion

wtp53 ja kasvoi 72 h transfektion jälkeen (48 h säteilytyksen jälkeen) kaikissa solussa linjat (kuvio 4, paneelit A, B, taulukko S1). Apoptoottisen solukuoleman kasvoi 2,6-kertaiseksi 48 tunnin säteilytettyyn H295R transfektoiduissa soluissa p53-vektori verrattuna transfektoitu tyhjällä vektorilla (10,3%

vs

3,9%) (p 0,05) ja 4,4-kertaiseksi 72 h (15,1%

vs

3,4%) (p 0,01) (kuva 4, paneeli B, taulukko S1). Vähemmän erilaistunut SW-13-soluissa oli myös 2-kertainen nousu apoptoosin 48 h (8,4%

vs

4,3%) (p 0,05) ja 3,7-kertainen 72 h transfektion jälkeen (16,3 %

vs

4,4%) (p 0,01) säteilytettyä WT näytteessä verrattuna säteilytettyjen mock-solut (kuva 4, paneeli B, taulukko S1). Samoin transfektio tyhjiä vektorin eivät suuresti vaikuttaneet solukuoleman SK-OV-3 solulinja myöskään, kun transfek-

wtp53 huomattavasti prosenttiosuutta apoptoottisten solujen vastauksena sädehoitoa 2-kertaiseksi 48 h (8,7%

vs

4,2%) ja 3,5-kertaisesti 72 h (17,1%

vs

4,9%) (p 0,05) (kuva 4, paneeli B, taulukko S1).

Koska monet raportit osoittivat, että p53 voi tukahduttaa

BCL2

ilmentymistä vasteena apoptoottisen ärsykkeen [21] – [23], analysoimme

BCL2

mRNA-tasoja soluissa käsitelty IR joko ekspressoivat villityypin muotoa

TP53

(WT) tai (mock), 48 h ja 72 h transfektion jälkeen. RT-PCR-analyysi paljasti, että

BCL2

ekspressiotasot laskivat säteilytettyjä soluja vain silloin, kun

wtp53 oli läsnä, kun taas ne pysyivät vakaina näytteissä transfektoitu tyhjällä vektorilla. Mukaisesti TUNEL määrityksen tulokset,

BCL2

kääntyivät laskuun alkaen 48 h ja vähimmäistasoja havaittiin 72 h transfektion jälkeen (kuvio 4, paneeli C, D, E).

Nämä tiedot vahvistavat, että villityypin p53 tarvitaan induktioon solukuolema ja alas-säätely

BCL2

vastauksena säteilytys H295R ja SW-13-soluissa. Lisäksi ilman näitä vaikutuksia säteilytettyjä soluja, jotka ilmentävät vain endogeenisen mutantti p53 näyttää osoittavan, että nämä mutantit ovat toimimattomat proteiinit eivät millään tavoin vaikuta IR hoitoon.

Vaikutus

IGF2

ilme

IGF-II edustaa tärkein markkeri ACC [24], [25] ja sen ilmentyminen on tiukasti säännelty p53 [26], [27]. Koska olemme osoittaneet, että

wtp53 pystyy vähentämään soluproliferaatiota ja aiheuttaa apoptoosia ACC solulinjoissa vastauksena IR, tutkimme myös vaikutusta p53 aktivoinnin

IGF2

ilme. RT-PCR-analyysi

IGF2

mRNA ilmentymistä H295R soluissa (kuvio 5, paneeli A) paljasti, että säteilytys ei muuttanut

IGF2

tasot näytteissä transfektoitu tyhjällä vektorilla. Kuitenkin

IGF2

ilmentyminen väheni 48 h transfektion jälkeen (24 h säteilytyksen jälkeen) ja merkittävää laskua 72 h transfektion jälkeen (-42%, p 0,01) soluissa, jotka ilmentävät villityyppistä p53.

(A) Inverted kuvia suhteessa semikvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

IGF2

geenin ilmentymisen suoritetaan H295R soluissa, osoittaa valtava menetys

IGF2

signaalin säteilytettyjä soluja 72 h transfektion jälkeen p53-vektorin (WT). (B) RT-PCR-analyysi

IGF2

mRNA suoritetaan SW-13-soluissa. Merkittävä väheneminen

IGF2

ilme on havaittavissa transfektoiduissa soluissa p53-vektorin (WT) seuraava ionisoivaa säteilyä hoitoon. Kuvat edustavat kolmen erillisen kokeen.

GAPDH

ilmaisua käytettiin normalisoinnin ja yhtyeiden intensiteetit kvantitoitiin käyttäen ImageJ. Band densitometrian näkyy oikealla paneelit. (*, P 0,05, #, p 0,01).

Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin SW-13-solulinja (kuvio 5, paneeli B), vaikka nämä solut ilmentävät hyvin alhainen

IGF2

mRNA. Tässäkin tapauksessa, ei ole vaikutusta

IGF2

ilmaisun jälkeen havaittiin IR annon soluissa, jotka ilmentävät endogeenistä mutantti p53, kun taas voimakas lasku

IGF2

mRNA havaittiin transfektoiduissa soluissa

wtp53 vektori. Tämä lasku oli suurimmillaan 72 h transfektion jälkeen (-35%, p 0,05).

Vaikutus Akt aktivointia

Lopuksi tutkimme vaikutus IR Akt aktivaatio H295R ja SW -13 solulinjoissa joko transfektoitu p53 vektorin (WT) tai (mock). Tämä proteiini, itse asiassa, on tärkein alavirtavaikuttajainhibiittorit IGF-II signalointireittiä ja keskeinen negatiivinen säätelijä apoptoottisen prosessin.

Western blotting-analyysi yhteensä Akt ja sen fosforyloidun aktiiviseksi muodokseen H295R (kuvio 6 , paneeli A) ja SW-13 (kuvio 6, paneeli B-solut) paljasti, että Akt oli läsnä kaikissa näytteissä ja sen ei vaikuttanut

wtp53 ilmaisu (tuloksia ei ole esitetty). Päinvastoin, densitometrisen analyysin p-Akt normalisoitu yhteensä Akt osoittivat, että solut, jotka oli transfektoitu p53 vektori näytetään vähentyneen merkittävästi Akt-fosforylaation vasteena IR verrattuna kontrolleihin, mikä tarkoittaa, että p53 aktivaatio voi pystyä tukahduttaa aktiivisuutta anti -apoptotic proteiini Akt.

(A) Western blotting-analyysi koko Akt ja fosforyloidun Akt tasoja, suoritettiin säteilytettyjä H295R transfektoitu tyhjällä vektorilla (vale) ja p53-vektorin (WT) 48 ja 72 h kuluttua transfektiota. Densitometrinen analyysi Akt normalisoitu vinkuliinin ja p-Akt

vs.

Akt osoittaa, että Akt ilmaisu ei vaikuta p53 status, kun taas aktivoitu muoto proteiinin vähentynyt merkittävästi

wtp53-ilmentäviä soluja. (B) kokosoluliuotteista saatu SW-13-solulinjasta tehtiin Western blotting-analyysi käyttäen vasta-aineita kohdistamista Akt ja Akt-pSer473. Fosforylaation tasoja Akt merkittävästi vähentää p53 vakauttaminen vastauksena ionisoivalla säteilyllä. Esitetyt tulokset edustavat vähintään kolmea koetta. Yhtyeiden voimakkuudet kvantitoitiin käyttäen ImageJ ja yhtyeiden tiheysmittaus näkyy oikealla paneelit. (*, P 0,05, #, p 0,01).

mukaisesti meidän koskevat tiedot solujen lisääntymistä ja apoptoosia, vaikutus Akt fosforylaatioon oli ilmeistä 48 h transfektion jälkeen (-16% in H295R ja -17% vuonna SW-13-soluissa, vastaavasti) ja oli maksimissaan 72 tuntia transfektion jälkeen (-53% vuonna H295R ja -51% vuonna SW-13-solut; p 0,01).

keskustelu

ACC on aggressiivinen ja heterogeeninen maligniteetin ja useimmat hoitovaihtoehdot ovat usein epäonnistuneet, mikä osoittaa, että vaihtoehtoisia hoitostrategioita ACC tarvitaan [8], [9].