Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) ovat lyhyitä, ei-koodaavat RNA, jotka säätelevät erilaisia ​​solutoiminnoille tukahduttamalla kohdeproteiinin ilmentymisen. Oletimme, että joukko mikroRNA säädellä tuumorivasteita hypoksia estämällä komponenttien hypoksian signalointireitin. Olemme havainneet, että miR-22 ilmentyminen ihmisen paksusuolen syöpä on pienempi kuin normaalin paksusuolen kudoksessa. Olemme myös havainneet, että miR-22 ohjaa hypoksian indusoima tekijä 1α (HIF-1α) ilmentymisen HCT116 koolonisyöpäsolulinja. Yli-ilmentyminen miR-22 inhiboi HIF-1α ilme, tukahduttaa endoteelikasvutekijä (VEGF) tuotantoa aikana hypoksiaa. Kääntäen, knockdown endogeenisen miR-22 parantaa hypoksian indusoima HIF-1α ja VEGF. Esikäsitelty väliaine soluista yli-ilmentävät miR-22 sisältävät vähemmän VEGF-proteiinin kuin kontrolli soluja, ja myös aiheuttaa vähemmän endoteelisolukasvua ja invaasio, mikä viittaa miR-22 vierekkäisissä soluissa vaikuttaa endoteelisolujen toiminto. Yhdessä meidän tiedot viittaavat siihen miR-22 saattaa olla anti-angiogeeninen vaikutus paksusuolen syövän.

Citation: Yamakuchi M, Yagi S, Ito T, Lowenstein CJ (2011) MicroRNA-22 Säätelee Hypoksia Signaling in Colon Cancer Cells. PLoS ONE 6 (5): e20291. doi: 10,1371 /journal.pone.0020291

Editor: Costanza Emanueli, University of Bristol, Iso-Britannia

vastaanotettu: 18 tammikuu 2011; Hyväksytty: 24 huhtikuu 2011; Julkaistu: toukokuu 23, 2011

Copyright: © 2011 Yamakuchi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat American Heart Association avustus (0835446N) (MY) ja NIH avustus (CJL). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat lyhyitä ei-koodaavat RNA: t (18-22 nt), jotka estävät geenin ilmentymistä. Kypsät miRNA tuotetaan RNaasi III entsyymien Drosha ja Dicer, sitten sisällyttää RNA-indusoidun hiljentäminen kompleksi (RISC), ja lopuksi sitoa 3′-transloimaton alue (3′-UTR) niiden kohdegeenin mRNA: iden, estämällä niiden ilmaisu [1], [2]. Uskotaan, että peräkkäisen emäspariutuminen vähintään 7 nukleotidin välissä miRNA sekvenssin (siemenet sekvenssi) ja miRNA tunnistuselementtinä (MRE) on tarpeen tukahduttaa proteiini käännös [3], [4], [5], [6], [7]. Lisäksi jotkut tutkimukset viittaavat siihen, että epätäydellinen sitovia, kuten huojunnoista tai pullistumat siementen sekvenssin estää proteiinin translaation [8], [9].

miRNA on erilaisia ​​fysiologisia ja patologisia toimintoja, kuten valvonta tuumorigeneesiä [ ,,,0],10], [11], [12]. Transkriptiotekijän Yleisimmin mutatoitunut syövän, p53, säätelee joukko miRNA. Aktivointi p53 lisää miR-34a tuotantoa, ja yli-ilmentyminen miR-34a indusoi solusyklin pysähtymiseen, vanhenemista ja apoptoosia. Toinen transkriptiotekijä Syöpää, c-myc, säätelee erilliset miRNA. C-myc-vähentää ilmentymistä useita miRNA lukien miR-22 syöpäsolulinjoissa [13]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että miR-22 tavoitteet useita proteiineja, kuten estrogeenireseptorin a kappale (ERA), c-Myc sitovan proteiinin (MYCBP), Myc liittyvän tekijän X (MAX), ja PTEN, mikä viittaa siihen, että miR-22 voidaan tuumorigeneesiin. Kuitenkin toiminta miR-22 syöpäsoluissa on tuntematon.

hypoksian indusoima tekijä 1 (HIF-1) on heterodimeerinen transkriptiotekijä, joka säätelee geenien transkriptiota, kuten verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) ja perus-fibroblasti kasvutekijä (bFGF) [14], [15], [16]. HIF-1 on heterodimeeri koostuu kahdesta alayksiköstä, HIF-1α ja HIF-1β (ARNT). Hypoksia tai hypoksia jäljittelijät vakauttaa HIF-1α estämällä sen prolyyli hydroksylaatio. HIF-1 osallistuu angiogeneesiin, invaasio, etäpesäke, glukoosin otto ja metabolia syöpäsoluissa [17]. Hypoksia kasvaimissa voi toimia laukaista angiogeneesin toimittaa lisääntynyttä hapen syöpään. HIF-1α ilmentyminen liittyy huonoon ennusteeseen kolorektaalisyövässä ja haimasyövän [17], [18], [19].

Nyt tunnistaa HIF-1α tavoitteeksi Mir-22 on paksusuolensyöpä solulinjassa. Huomaamme, että miR-22 tasoa ihmisen paksusuolen syöpä ovat alhaisemmat kuin normaalissa paksusuolen kudoksessa. Koska paksusuolensyöpä yksilöitä, joilla on alhaisempi miR-22 osoittavat korkeampia VEGF ilmaisun oletamme, että miR-22 säätelee hypoksia signalointi koolonsyöpäsolulinjaa.

Tulokset

Expression of miR-22 paksusuolen syöpä

käytettiin ensimmäisen blottauksella mitata miR-22 ilmentyminen ihmisen kudoksissa, ja totesi, että miR-22 ilmentyy useimmissa kudoksissa, mutta suhteellisen runsaasti sydämessä, sileän lihaksen, virtsarakon, ja rasvakudoksessa (Fig. 1A). Tutkimme seuraavaksi ilmentymisen miR-22 useissa syöpäsolulinjoissa. Havaitsimme miR-22 kolme koolonsyöpäsolulinjoissa, HCT116, HCT116 p53 KO ja HT29, ja myös epiteelin syövän solulinja, HeLa (Fig. 1 B). Tutkia taso miR-22 paksusuolen syövän, mittasimme miR-22 ilmentyminen qPCR 9 ihmisen paksusuolen syövän yksilöitä ja 9 normaalin paksusuolen kudokset potilailta The Johns Hopkins Hospital. Expression of miR-22 on pienempi paksusuolensyöpä yksilöt (P = 0,02) (Fig. 1 C). Koska olemme kiinnostuneita tutkii, miten microRNA säädellä tuumoriangiogeneesissa, myös mitattuna VEGF mRNA: n ilmentymisen samoissa näytteissä ja havaittiin, että VEGF-mRNA: n ekspression paksusuolensyöpä yksilöt on suurempi kuin normaalissa paksusuolen yksilöt (P = 0,03) (1C) . Olemme myös havainneet, että RNA-tasot miR-22: n ja VEGF korreloivat negatiivisesti (P ​​ 0,05) (Fig. 1 D).

(A) MiR-22 ilmentyminen normaaleissa ihmisen kudoksissa. Kaupallinen kalvo, joka sisältää RNA normaaleista ihmisen kudoksissa tutkittiin Mir-22 käyttäen Northern-analyysi. (B) MiR-22 ilmentyminen solulinjoissa. Solulysaatit tutkittiin Mir-22 Northern blottauksella. (C) MiR-22 ja VEGF ilmentymistä normaalissa ihmisen paksusuolen kudosta ja ihmisen paksusuolen syöpä. RNA uutettiin 9 normaalin ihmisen paksusuolen yksilöt (valkoinen) ja 9 ihmisen paksusuolen syöpä yksilöt (musta), ja analysoitiin qPCR Mir-22 ja VEGF lauseke (n = 9 ± S.D.). Paksusuolensyöpä näytteet sisältävät vähemmän miR-22 ja VEGF kuin normaali paksusuoli yksilöitä. (D) yhdistys miR-22 ja VEGF ihmisen paksusuolen syöpä. Luonnollinen log muutos suhteellinen suhde RNA miR-22 ja VEGF käytettiin tilastollista analyysiä (n = 30).

HIF-1α on tavoite miR-22

koska HIF-1α on osa suurta hapen tunnistava koulutusjakson, etsittiin mahdollisten miRNA jotka saattavat ohjata HIF-1α käännös käyttäen laskennallisen analyysin (Human miRNA tavoitteet klo Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Computational Biology kotisivuilta http: //cbio. mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl), ja totesi, että miR-22 siemen sekvenssi vastaa 3 ’UTR HIF-1α (7 nukleotidin ottelut mukaan lukien yksi huojunta ottelu). Tutkimme, miten miR-22 säätelee HIF-1 ja hypoksia signalointi käyttäen HCT116 paksusuolen syövän soluja in vitro mallin siitä, miten kasvaimen solut reagoivat hypoksia. Sen tutkimiseksi jos miR-22 säätelee HIF-1α-proteiinin ilmentymistä, transfektoimme HCT116-solujen ennalta miR-22 yli ilmentyminen miR-22 ja anti-sense-miR-22 knockdovvn miR-22. Transfektio pre-miR-22 osaksi HCT116 kasvoi miR-22 tasoa yli 10-kertaisesti (kuvio. 2A). Knockdovvn miR-22 transfektoimalla anti-sense-miR-22 väheni miR-22 tasoa alas 40% (Fig. 2A). Hypoksia lisääntynyt HIF-1α ilmaisun HCT116 odotetusti (Fig. 2B). Kuitenkin yli-ilmentyminen miR-22 inhiboi hypoksian indusoiman HIF-1α ilmentymisen HCT116 ja HT29 (Fig. 2B-D). Sen sijaan, knockdovvn miR-22 tehostettu HIF-1α ilmentymistä hypoksian (Fig. 2C-D). Yli-ilmentyminen miR-22 ei muuttanut tasoa HIF-1β, dimerointi kumppani HIF-1α (Kuva S1). Nämä tutkimukset osoittavat, että endogeeniset miR-22 inhiboi HIF-1α.

(A) muuttaminen miR-22 ilmentyminen transfektiolla. HCT116-solut transfektoitiin pre-miR-22 tai anti-sense-miR-22 tai kontrollioligonukleotidit, ja tasot miR-22 mitattiin qPCR. (B) yli-ilmentyminen miR-22 inhiboi HIF-1α ilmentymistä. HCT116-solut transfektoitiin kontrollioligonukleotidit tai ennalta miR-22, ja sitten altistettiin normoksia tai hypoksia 16 tuntia. Solulysaatit immunoblotattiin varten HIF-1α. Hypoksia indusoi HIF-1α, mutta miR-22 vaimentaa HIF-1α. (C) Kaksi koolonsyöpäsolulinjoissa, HCT116 (kaksi ylempää paneelit) ja HT29 (kaksi alapaneelit), transfektoitiin pre-miR-22 tai anti-sense-miR-22, altistuvat hypoksia, ja solulysaatit immunoblotattiin varten HIF-1α. (D) kvantifiointi densitometrialla on immunoblottaus varten HIF-1α in HCT116 transfektoiduissa soluissa kuten yllä (n = 3 ± S.D.).

MicroRNA voi säädellä geeniekspressiota tukahduttamalla käännös. Yli-ilmentyminen tai knockdovvn miR-22 ei muuttanut ilmentymistä HIF-1α-mRNA: n, joka viittaa siihen, että miR-22 säätelee HIF-1α käännöstä, mutta ei transkription (Fig. 3A). Ihmisen HIF-1α 3 ’UTR on potentiaalinen sitoutumiskohta miR-22 (Fig. 3B). Tutkia mekanismia, jolla miR-22 säätelee HIF-1α, teimme lusiferaasireportteri- vektori, joka sisältää fragmentin 3 ’UTR HIF-1α (ulottuva jälkeen lopetuskodonin 0-401 bp), joka sisältää miR -22 sitoutumiskohta. Me kotransfektoidaan HCT116-soluissa tämän toimittaja vektori ja ennalta miR-22 tai valvontaa. Yli-ilmentyminen miR-22 laski lusiferaasiaktiivisuutta (Fig. 3C vasemmalla). Kuitenkin miR-22 ei vaikuta lusiferaasin ilmentymistä, jossa on mutatoitunut miR-22 sitovat elementit (Fig. 3C oikealla), mikä viittaa siihen, että miR-22 inhiboi HIF-1α ilmentymisen vuorovaikutuksen kautta, ja 3 ’UTR: HIF-1α.

(A) MiR-22 ei vaikuta HIF-1α mRNA. HCT116-solut transfektoitiin Pre-miR-22 tai anti-sense-miR-22 tai valvontaa. Kokonais-RNA kerättiin ja analysoitiin HIF-1α mRNA qPCR (n = 3 ± S.D.). (B) Ihmisen HIF-1α 3’UTR sisältää sitoutumiskohdan miR-22. (C) MiR-22 tukahduttaa transaktivaation HIF-1α 3’UTR. HCT116-solut transfektoitiin lusiferaasireport- vektorin (MiRreport), joka sisältää 3 ’UTR: HIF-1α (vasen paneeli) tai mutatoidun 3’UTR HIF-1α (oikea paneeli) ja ennalta miR-22 tai pre-miR -ohjaus. Solut kerättiin ja lusiferaasin aktiivisuus mitattiin (n = 3 ± SD).

MiR-22 ohjaa VEGF ilmentymisen HCT116

roolin tutkimiseksi miR-22 VEGF ilmaisun meidän transfektoitu HCT116 ennalta miR-22 tai anti-sense-miR-22 tai valvontaa, ja sitten mitataan VEGF mRNA ilmentyminen qPCR. Hypoksia ja hypoksia jäljittelevää desferioxamine (DFX) lisääntyi VEGF: n ilmentymistä mRNA: n (Fig. 4A, valkoiset pylväät). Yli-ilmentyminen miR-22 väheni hypoksian tai DFX aiheuttama VEGF lauseke (Fig. 4A, mustat palkit). Kääntäen, knockdovvn miR-22 lisäsi DFX aiheuttama VEGF lauseke (Fig. 4B). Seuraavaksi mittasimme VEGF: n pitoisuus mediassa. DFX lisäsi eritystä VEGF peräisin HCT116 soluista. Yli-ilmentyminen miR-22 tukahdutti eritystä VEGF. Sen sijaan, knockdovvn miR-22 tehostettu VEGF vapautumisen (Fig. 4C-D). Lisäksi tutkimme vaikutus miR-22 ilmennettäessä angiopoietiiniterapia 2 (ANGPT2) ja kantasolujen (SCF), koska ANGPT2 ja SCF ovat angiogeenisten kasvutekijöitä, jotka säätelevät HIF-1 [20]. Hypoksia indusoi ANGPT2 ja SCF, ja yli-ilmentyminen miR-22 inhiboi hypoksian indusoima ANGPT2 ja SCF (kuvio S2).

HCT116 transfektoitiin pre-miR-22 tai anti-sense-miR-22 tai ohjaus, ja altistetaan sitten normoksia tai hypoksia 16 tuntia. Media analysoitiin VEGF ELISA: lla ja RNA: n solulysaateista analysoitiin VEGF-mRNA: n qPCR (n = 3 ± S.D. * P 0,05) (A) Pre-miR-22 vähentää VEGF-mRNA: ta. (B) Anti-sense-miR-22 kasvaa VEGF mRNA. (C) Pre-miR-22 vähentää VEGF-proteiinia. (D) anti-sense-miR-22 lisää VEGF-proteiinin.

MiR-22 HCT116 säätelee endoteelisolun kasvua

Koska angiogeneesi liittyy endoteelisolujen proliferaatiota, testasimme vaikutus miR-22 upon HUVEC lisääntymistä. Transfektoimme HCT116-solujen ennalta miR-22 tai valvontaa, altistuvat solut normoksia tai hypoksia, ja korjattu media. Lisäsimme tämä väliaine ihmisen ensisijaisen endoteelisolujen (HUVEC), viljeltiin vielä 3 päivää, ja sitten mitataan leviämisen HVUEC mukaan BrdU. Ei ollut merkitsevää eroa median normoksia transfektoitu ennalta miR-22 ja mediaa normoksia transfektoitu ohjaus (Kuva. 5A). Kuten odotettua, mediaa hypoksisia transfektoitujen solujen ohjaus lisääntynyt HUVEC lisääntymistä. Kuitenkin mediaa hypoksisia transfektoitu ennalta miR-22 estetty kasvusta leviämisen (Fig. 5A).

HCT116-solut transfektoitiin valmiiksi miR-22 tai valvontaa, ja media kerättiin. (A) HUVEC-soluja kasvatettiin 12-kuoppaisilla levyillä, esikäsitelty väliaine lisättiin, ja HUVEC-inkuboitiin 3 päivää. Proliferaatiota seurattiin BrdU (n = 5 ± S.D. * P 0,05). Pre-miR-22 vähentää kykyä hypoksisten käsiteltyjen solujen tuottamaan tekijöitä, jotka stimuloivat endoteelin proliferaatiota. (B) HUVEC-soluja naarmuuntunut elatusaine lisättiin ja valokuvattiin 16 tuntia. (C) mittaus kulkema jokaisen haavan vertailuryhmään nähden altistuvan, normoksia. (* P 0,05)

Koska angiogeneesi liittyy myös endoteelin muuttoliike, testasimme vaikutus miR-22 upon HUVEC siirtolaiskysymyksen naarmu haavan paranemista määrityksessä. Lisäsimme HUVEC solujen vakioitua elatusainetta HCT116 soluista, jotka oli transfektoitu valmiiksi miR-22 tai ohjaus ja oli sitten altistunut normoksia tai hypoksia. 16 tunnin kuluttua mittasimme endoteelin siirtymisen reunasta tyhjästä haava. Mediaa HCT116 soluista alttiiksi hypoksia lisääntynyt endoteelin muuttoliikkeen (Fig. 5B-C). Yli-ilmentyminen miR-22 HCT116 hidastui HUVEC muuttoliike (Fig. 5B-C). Nämä tiedot osoittivat, että miR-22 HCT116 vaikuttaa endoteelin biologia, lisäämällä proliferaatio ja migraatio.

Keskustelu

Suurin löydös on, että miR-22 estää hypoksia signalointi. MiR-22 ilmentyy monissa syöpäsoluissa, mukaan lukien paksusuolen syöpä solulinja HCT116. Lisäksi miR-22 vaimentaa HIF-1α käännös. Lopuksi miR-22 inhiboi VEGF ilmentymistä tukahduttamalla HIF-1α ilme. Koska toiset ovat osoittaneet, että c-myc rajat miR-22 ilmentyminen, kasvaimet yli-ilmentävät c-myc voidaan olettaa olevan alhaisempi miR-22, korkeampi HIF-1α: n ja VEGF. Näin ollen nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-22 voi säädellä tuumorin angiogeneesiä.

kohderyhmä miR-22

Yksittäiset miRNA voi ekspression modu- monta geenejä. Useat raportit tunnistaa mahdolliset kohteet miR-22 käyttämällä ohjelmistoja algoritmeja, kuten TargetScan, Miranda ja PicTar yhdessä solututkimuk-. MiR-22 tavoitteiden estrogeenireseptorin a kappale (ERA) ja tukahduttaa estrogeenia signalointi useissa rintasyövän solulinjoissa [21], [22]. MiR-22 myös tukahduttaa c-Myc-sitova proteiini MYCBP [23], c-Myc sitovan kumppanin MAX [24] ja tuumorisuppressorigeenin PTEN [25], [26], [27]. PPAR-alfa- ja BMP7 ovat myös tavoitteita miR-22 [28]. Huomasimme, että HIF-1α on uusi tavoite miR-22. 3 ’UTR HIF-1α sisältää komplementaarisen sekvenssin miR-22, joka koostuu 7 nukleotidin; Tämä siemen sekvenssi sisältää yhden huojunta sitovia nukleotidi (G-A). Meidän biokemialliset tiedot viittaavat siihen, että miR-22 suoraan säätelee HIF-1α ilmaisu ostaa tukahduttaa käännös HIF-1α.

Role of miR-22 kasvainangiogeneesissä

MiR-22 on ainutlaatuinen rooleja spesifisiin solutyyppeihin. MiR-22 säätelee eriyttäminen monosyyttitasojen linjan [24]. MiR-22 säätelee PPAR-alfa- ja BMP7 signaalireaktioteissä ihmisen kondrosyyttien [28]. Syövän, toiminta miR-22 on kiistanalainen. Hiiren miR-22-geeni on kartoitettu syöpään liittyvän genomin alueella, ja ihmisen miR-22-geeni sijoittuu heterotsygoottisuuden menetys alueen (LOH) useita syöpäsoluja [23], [29], mikä viittaa siihen, että miR-22 on mukana tukahduttamaan kasvaimen kasvua. Ektooppinen ilmentyminen miR-22 inhiboi proliferaatiota ja pesäkkeiden muodostuminen MCF-7-solujen [23]. Tämä kasvain suppressoriaktiivisuutta miR-22 liittyy tukahduttamisesta MYCBP. Kuitenkin muut ovat osoittaneet, että knockdovvn miR-22 kasvattaa apoptoosin kurssi 16HBE-T-solujen [26]. Näennäinen ristiriita näiden kahden tutkimukset voivat johtua eri solulinjoja tai erilaisia ​​menetelmiä muuttaa miR-22 tasoa. Olemme havainneet, että miR-22 inhiboi VEGF-eritystä, mikä viittaa siihen, miR-22 voi toimia anti-angiogeneesiä tekijä koolonsyöpäsolulinjoissa. Meidän ihmisen tiedot tukevat tätä ajatusta: ihmisen yksilöiden paksusuolen syöpä on alhaisempi miR-22 ja suurempi VEGF verrattuna normaaliin ihmisen paksusuolen kudosta. Tuloksemme osoittavat toinen mekanismi, jonka kautta miR-22 saattaa toimia tuumorisuppressorina: tappio miR-22 ilmentyminen ei ainoastaan ​​voidaan pidentää MYCBP mutta myös kasvua HIF-1α.

Hypoksia signalointi ja miRNA

Paikallinen kasvaimen kasvua rajoittaa hypoksia: kun kasvain laajenee, sen keskus tulee hypoksinen, joka indusoi geenejä, kuten VEGF: n, jotka aiheuttavat angiogeneesiä [30], [31], [32]. HIF-1 heterodimeeri on keskeisessä asemassa hypoksinen signalointi kasvaimissa [15], [33]. Me ja muut ovat tunnistettu miRNA jotka ohjaavat hypoksian signalointi. Olemme aikaisemmin havainneet, että miR-107 inhiboi HIF-1β [34]. Muut ovat osoittaneet, että miR-20b rajoittaa HIF-1α ilmentyminen keuhkoadenokarsinooma ja rintasyövän solulinjat [35], [36], [37]. MIR-17-92 klusteri myös moduloi kasvaimen kasvua estämällä HIF-1α ilme. Nykyinen tutkimus lisää miR-22 luetteloon miRNA jotka säätelevät HIF-1-proteiinia.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture, Hypoksia valotuksen ja transfektio

Ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) hankittiin yhtiöltä Lonza (Walkersville, MD). HUVEC (passage 2-5) viljeltiin endoteelin peruselatusaineessa (EBM2), johon oli lisätty kasvutekijöitä (Lonza). HeLa ja HEK293 (ATCC, Manassas, VA) viljeltiin DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS). HCT116 (lahja Bert Vogelstein, Johns Hopkins University School of Medicine) ja HT29 (ATCC) viljeltiin McCoyn 5A-alusta täydennettynä 10% FBS. Desferrioksamiini (DFX) ja muut reagenssit saatiin Sigma (St Louis, MO). Voit tuoda solujen hypoksia, soluja viljeltiin Billups-Rotenburg kammio 94% N2, 1% O2 ja 5% CO2 37 C: ssa 24 tunnin ajan.

Human Specimen

Ihmisen paksusuolen syöpä yksilöt (n = 9) ja pariksi ei-syöpä normaali paksusuoli näytteestä (n = 9) saatiin potilailta The Johns Hopkins Hospital, Baltimore, MD, on dokumentoitu suostumus kussakin tapauksessa. Kerääminen ja analysointi ihmisen paksusuolen syövän näyte hyväksyttiin Johns Hopkins University School of Medicine Institutional Review Board. Potilaat, joille tehdään leikkaus kolorektaalisyövissä tarjotaan kirjallisen suostumuksensa lahjoittaa kudosta analyysia.

Transfektio

esiasteet miRNA ja anti-sense-oligonukleotidien miRNA olivat Applied Biosystems (Foster City, CA). Transfektoimiseksi esiaste miRNA, HCT116-solut transfektoitiin SIPORT NeoFX (Applied Biosystems), jossa esiasteen miRNA 0-20 nM tai anti-sense miRNA 0-40 nM ja kerättiin 48 tuntia myöhemmin.

blottauksella

Yhteensä-RNA: t uutetaan soluista käyttäen Trizol (Invitrogen). Ihmisen kudosten RNA: t saatiin Applied Biosystems. Northern blotting ja miR-22 suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu. Lyhyesti, 10 ug kutakin RNA: ta ladattiin 15% TBU-geelillä (Invitrogen), siirrettiin nitroselluloosamembraanille ja hybridisoitiin

32P-end-leimattujen koettimien spesifisiä miR-22 42 ° C: ssa 16 tunnin ajan. MIR-22 anturi, 5′-TAAAGCTTGCCACTGAAGAACT-3 ’syntetisoitiin Integrated DNA Technologies; kaikki muut reagenssit hankittiin Applied Biosystems.

Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) B

analysoimiseksi miRNA ilme, TaqMan MicroRNA määrityksiä käytettiin määrittämään tasojen kypsä miRNA valmistajan ohjeiden ohjeet. Lyhyesti cDNA syntetisoitiin puhdistettiin pieniä RNA (10 ng) ja suoritettiin Real-Time PCR käyttämällä iCycler iQ (BioRad). Ekspressiotasot normalisoitiin U6. Alukkeet miRNA RT-PCR ja PCR-seosta hankittiin Applied Biosystems. Havaitsemaan mRNA: n ekspression, cDNA-synteesi suoritettiin käyttäen High Capacity cDNA-synteesi Kit (Applied Biosystems). Alukkeet ihmisen VEGF ja ß-aktiini hankittiin Applied Biosystems.

Lusiferaasimäärityksiä

fragmentti 3 ’UTR HIF-1α (alkaen jälkeen TGA lopetuskodonin ja ulottuu 401 bp), joka sisälsi miR-22-vaste-elementti kloonattiin pMIR-REPORT sivektorissa (Applied Biosystems). Mutaatio miR-22 elementin (5’-GTTGACGG-3 ’→ 5’-G

T

C

G

GG -3′) oli tekemät QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene). HCT116-solut maljattiin 5 x 10

4 solua per kuoppa 24-kuoppalevyille. Seuraavana päivänä, pMIR-SELVITYS lusiferaasiksi vektorit, kuten 3 ’UTR HIF-1α ja esiaste miR-22 tai salattu oligonukleotidia transfektoitiin soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, lusiferaasi määritykset suoritettiin käyttäen dual lusiferaasireportterigeenin määritys (Promega).

Western blotting

Solut hajotettiin 0,4 ml: aan lyysipuskuria (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% NP40, 20 mM NaF, 1 mM ortovanadaatti ja proteaasiestäjäseostabletit). Lysaatit erotettiin elektroforeesilla, blotattiin membraanille ja annettiin reagoida spesifisten vasta-aineiden. Vasta-aine hiiren HIF-1α oli peräisin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Kaikki muut ensisijainen vasta-aineita ja sopiva sekundaarinen vasta-aineet olivat peräisin Santa Cruz.

VEGF Pitoisuudet

ELISA käytettiin kvantifioimaan VEGF erittyy HCT116 solujen median. HCT116-soluja inkuboitiin 1 ml: media 1% FBS puuttuessa (kontrollit) tai läsnä DFX tai alle normoksia tai hypoksia 24 h 37 ° C: ssa. Supernatantit analysoitiin VEGF-tuotanto käyttäen ihmisen VEGF: n ELISA-pakkausta mukaan valmistajan protokollan (R 0,05 pidettiin merkittävänä.

tukeminen Information

Kuva S1.

HIF-1β ei tavoite miR-22. Kuvaus: HCT116-solut transfektoitiin ennalta miR-22 tai pre-miR-ohjaus, ja altistettiin normoksia tai hypoksia 16 tuntia. Solulysaatit immunoblotattiin varten HIF-1a ja HIF-1b. Yli-ilmentyminen miR-22 inhiboi HIF-1a ilmentymisen, mutta ei HIF-1 b.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0020291.s001

(TIF)

Kuva S2.

MiR-22 säätelee ilmaisuja angiogeenisten tekijöiden. Kuvaus: HCT116-solut transfektoitiin ennalta miR-22 tai ohjaus, ja altistetaan sitten normoksia tai hypoksia 8 tuntia. RNA: t solulysaateista analysoitiin angiopoietiini 2 (ANGPT-2), kantasolutekijä (SCF), ja COX-2 mRNA: iden qPCR (n = 3 ± SD * P 0,05) yli-ilmentyminen miR-22 vähensi ilmaisuja angiogeenisten tekijöiden.

doi: 10,1371 /journal.pone.0020291.s002

(TIF) B

Kiitokset

Kiitämme tohtori Scott Kern josta saimme ihmisen paksusuolen syöpä yksilöitä.