Krooninen sairaus

tiivistelmä

peräsuolen syöpä (CRC) on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat kehittyneissä maissa. Varhainen havaitseminen CRC johtaa vähentyneeseen CRC kuolleisuutta. Veren-pohjainen CRC seulontatestinä on erittäin toivottavaa rajallisuuden vuoksi invasiivisuus ja korkea hyväksymismäärän potilailla verrattuna nykyisin käytössä ulosteen piilevän veren testaus ja kolonoskopia. Tässä kuvaamme löytämisen ja validointi 29-geenin paneeli perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC) havaitsemiseen CRC ja adenomatoottisten polyypit (AP). Verinäytteet takautuvasti kerättiin monikeskustutkimus, tapaus-verrokki kliinisessä tutkimuksessa. Ensin profiloitu 93 näytteitä, joissa 667 ehdokasta ja 3 viitaten geenien suurikapasiteettisten reaaliaikainen PCR (OpenArray järjestelmä). Kun analyysi, 160 geenit olivat säilyneet ja testattiin uudelleen 51 ylimääräisiä näytteitä. Matala ilmaisi ja epävakaa geenit hylättiin jolloin lopulliseksi aineisto 144 näytteiden profiloidaan 140 geenejä. Määrittelemään, mitkä geenit, yksin tai yhdistelminä oli suurin potentiaali syrjiä AP ja /tai CRC kontrolleista, tiedot analysoitiin yhdistelmällä yhden ja usean menetelmiä. Luettelo 29 mahdollisesti diskriminantti geenit koottiin ja arvioitiin sen ennakoivan tarkkuutta rangaistaan ​​logistinen regressio ja bootstrap. Tämä menetelmä syrjitty AP 1 cm ja CRC säätimet herkkyys 59% ja 75%, tässä järjestyksessä, jossa 91%: n spesifisyys. Käyttäytyminen 29-geenin paneeli validoitiin kanssa LightCycier 480 reaaliaikainen PCR-alustan, yhteisesti hyväksymien kliinisissä laboratorioissa. Tässä työssä tunnistettiin 29-geenin paneeli ilmaistuna PBMC, joka voidaan kehittää uusia vähän invasiivisia testi tarkka havaitseminen AP: n ja CRC käyttämällä standardia reaaliaikainen PCR-alustalla.

Citation: Ciarloni L, Hosseinian S, Monnier-Benoit S, Imaizumi N, Dorta G, Ruegg C, et ai. (2015) Discovery of a 29-Gene paneeli perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa havaitsemiseksi peräsuolen syövän ja adenoomia käyttäminen korkea suoritusteho Real-Time PCR. PLoS ONE 10 (4): e0123904. doi: 10,1371 /journal.pone.0123904

Academic Editor: Antonio Moschetta, IRCCS Istituto Oncologico Giovanni Paolo II, ITALIA

vastaanotettu: 08 joulukuu 2014; Hyväksytty: 27 helmikuu 2015; Julkaistu: 13 huhtikuu 2015

Copyright: © 2015 Ciarloni et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Diagnoplex SA. Rahoittaja antoi tukea muodossa palkkojen tekijöille LC, NI, SMB, SH, mutta ei ollut mitään ylimääräistä roolia tietojen keruun ja analysoinnin, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Erityinen roolit nämä kirjoittajat ovat muotoutuneet tekijän maksujen osiossa.

Kilpailevat edut: LC SH SMB NI olivat työntekijöitä Diagnoplex SA aikaan tutkimuksen. Lisäksi he omistavat optioita Diagnoplex SA. CR on co-founder, neuvottelukunnan jäsen sekä omistaa osakkeita ja osuuksia Diagnoplex SA. GD on toiminut puhuja, konsulttina ja neuvottelukunnan jäsenenä Diagnoplex SA, ja on saanut tutkimusrahoitusta Diagnoplex SA. Tämä ei muuta meidän noudattamista PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemansyy miehet ja naiset Euroopassa [1]. Tärkeää on, CRC on usein parannettavissa, kun diagnosoitu varhaisessa vaiheessa. Lisäksi tunnistamiseen ja poistamiseen adenomatoottisten polyypit (AP) estää CRC muodostumista ja vähentää kuolleisuutta johtuen CRC. Useat maat ovat jo ottaneet seulonta yksityiskohdista CRC ja hoitosuosituksia suositeltavaa keskimääräinen riski yksilöt alkavat säännöllistä 50-vuotiaita [2, 3]

Kolonoskopia on ”kultainen standardi” AP ja CRC diagnoosi, mutta se ei ole edullinen menetelmä joukkoseulonnan sen hinnan, invasiivisuus, alhainen noudattaminen ja rajoitettu saavutettavuus. Tällä hetkellä suositellaan ei-invasiivisia menetelmiä joukkoseulonnan kuuluvat immunokemiallinen ja guaiac ulosteen piilevän veren testaus (iFOBT, gFOBT). Silti noudattaminen ulosteen testejä on edelleen optimaalinen maissa, joissa on FOBT seulontaohjelman [4, 5, 6]. Siksi on edelleen olemassa suuri tyydyttämätön tarve vaatii ei- tai mahdollisimman vähän invasiivisia, yhteensopiva, kustannustehokas ja tarkka seulonta toteamiseksi AP ja CRC varhaisessa vaiheessa. Veren perustuva seulonta testi on erittäin houkutteleva, koska sen minimaalinen invasiivisuus ja korkea hyväksyntää potilaiden keskuudessa. Erityisesti me ja muut ovat raportoineet allekirjoituksia, jotka ovat peräisin perifeerisen veren mononukleaaristen solujen (PBMC) geenien ilmentyminen liittyy ruoansulatuskanavan [7, 8, 9, 10], rintojen [11], munuaisten [12, 13], keuhkojen [14] ja virtsarakon syöpä [15]. Nämä testit ovat käsitteellisesti eroaa klassisesta kasvaimen biomerkkiainetestejä, koska ne perustuvat havaitsemiseen isännän vaste kasvain- signaalit [16, 17] sijasta markkereita, jotka ovat peräisin itse kasvain.

Kun etsitään erot geeni-ilmentymisen ja tunnistaminen RNA-transkriptien ja sitä voidaan myöhemmin käyttää potentiaalisia biomarkkereita, yleisimmin käytetyistä menetelmistä ovat microarray-pohjainen DNA-hybridisaatiolla alustoja tai RNA-pohjainen sekvensointitekniikoilla [18, 19]. Vaikka voimakas, nämä menetelmät ovat monimutkaisia, aikaa vievää ja kallista, ja tuottaa suuri määrä tietoja, jotka vaativat erikoistuneita bioinformatiikan työkaluja ja osaamista niiden analysointia. Lisäksi tunnistettiin kiinnostavat geenit vaativat vielä validointi tarkempia ja herkkä menetelmiä kuten reaaliaikaisia ​​qPCR, ennen kuin ne voidaan kääntää kliinisesti käyttökelpoinen testeissä [20]. Vaihtoehdossa näihin menetelmiin, suurikapasiteettisten reaaliaikaisia ​​qPCR alustojen osoitettu toimivan hyvin, kun kandidaattigeenifragmenttikloonien valinta johtui vankka tieteellinen näyttö, huolimatta siitä, että ne mahdollistavat analyysin vain murto-osa transcriptome [21]. Tärkeää on, biomarkkereiden löydöt perustuvat qPCR alustoilla on merkittävä etu, että lisävalidointia askel ottaen huomioon niiden kliinisessä käytössä ei tarvita. Lisäksi ne ovat huomattavasti halvempia kuin koko genomin lähestymistavat, jolloin analyysi suurempi näyte asettaa ja lisää siten tilastollinen voima tutkimuksen.

Kirjoittajat raportoivat löytämisen ja karakterisointi 29-geenin paneeli PBMC havaitsemiseksi peräsuolen adenoomien ja karsinoomien käyttäen nanoliter suurikapasiteettisten qPCR alusta (OpenArray) [22]. Tätä varten käytimme näytteissä takautuvasti kerätty monikeskustutkimus, tapaus-control tutkimus, jossa potilaat alistettu kolonoskopia tai suunniteltu leikkaus CRC poistoa. Olemme myös osoittaneet, että geeni paneeli voitaisiin helposti siirtää ja osaksi lääketieteellisen laboratorion sopiva määritys, joka on tärkeä askel kehitettäessä uuden kustannustehokkaan, yksinkertainen veripohjaisten peräsuolen syövän seulonta testi.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat

tapauskontrollitutkimuksessa (DGNP-COL-0310), joista kolme Etelä-Korean ja kuusi Sveitsin keskuksia, jotka otettiin 1665 aiheista yli 50-vuotiaita, jotka on alistettu kolonoskopia by yleis- tai oli suunniteltu leikkaus, tehtiin kesäkuun 2010 huhtikuussa 2013. tutkimus oli nimenomaan suunniteltu ja kehittäminen ja validointi uusi testi CRC seulontaan. Biomarkkerin tietojenkeruuvaiheessa tapahtui ensimmäisellä puoliskolla potilaan rekrytoinnin. Tätä tarkoitusta varten osajoukko 144 aiheita, myönnetty hallita, CRC ja AP ryhmiä (taulukko 1), valittiin satunnaisesti, ja jota käytetään geenin ilmentymisen profilointi korkea suoritusteho qPCR.

Koehenkilöiden ei ensimmäisen asteen suvussa CRC tai tunnettuun CRC alttius, aiempi polyyppien tai syövän, mukaan lukien CRC, ei sappiteiden, urogenitaalinen, autoimmuuni- ja tulehdussairauksiin kuten tulehdukselliset suolistosairaudet, tartuntataudit ja kuumetta 4 viikkoa ennen kolonoskopia. Krooniset sairaudet yleisiä vuotiaasta väestöstä, kuten diabetes, verenpainetauti, hyperkolesterolemia, sydämen vajaatoiminta, ei pidetty poissulkukriteereitä. Kontrolli aihe määriteltiin yksittäisen ilman menneitä ja nykyisiä historian paksusuolen muutoksia tai sairauksien (esim. Pieni adenoomia, hyperplastinen polyypit, syöpä). AP ryhmässä aiheista diagnosoitu adenooma suurempi kuin 1 cm, joka perustuu endoskooppinen mittaukseen. CRC ryhmä mukana potilaita, joiden syöpä kaikissa neljässä TNM vaihetta. Lopullinen diagnoosi perustui kolonoskopia ja histopatologisissa.

Eettinen hyväksyntä

Tutkimus protokolla (DGNP-COL-0310) hyväksyttiin toimivaltaisen tarkastuslautakunta eettisen komitean tutkimus ihmisen aiheista Canton Bern, Sveitsi (Kantonale Etikkommission Berne, nro KEK 139/10), Canton St. Gallen, Sveitsi (Ethikkommission des Kantons St. Gallen, No. EKSG 10/091 /1B), Canton Vaud, Sveitsi (komission Cantonale d’éthique de la recherche sur l’être ihmisen, No. VD 77/10), Canton Basel, Sveitsi (Ethikkommission beider Basel, No. EKBB 242/10), on Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, Etelä-Korea (No. 4-2010-0128) ja Institutional Bioetiikka Review Board of Seoul National University Hospital, Etelä-Korea (IRB nro H-1004-020-315). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta TET kiinni paikallisten eettisten ohjeiden.

Veren kerääminen ja käsittely

Perifeerisen veren kaikista aiheista tehtiin joko enintään 30 päivää ennen tai enintään 12 viikkoa jälkeen kolonoskopia ja ennen mitään polyyppi tai syöpä resektio tai ennen leikkausta kemoterapiaa. Verinäytteet kerättiin 4×4 ml BD Vacutainer CPT putkiin (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Täytetty CPT putkia pidettiin huoneen lämpötilassa ja PBMC-erottaminen suoritetaan 6 tunnin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. PBMC: t suspendoitiin uudestaan ​​RNA

myöhemmin

Solution (Life Technologies, Carlsbad, CA), ja säilytettiin -80 ° C: ssa.

RNA: n valmistaminen

automaattinen puhdistus kokonais-RNA oli suoritetaan QIAcube mukaan RNeasy Mini kit (Qiagen, Venlo, Alankomaat) ja siihen sisältyi DNaasikäsittely. RNA-pitoisuus mitattiin Nanodrop spektrofotometrillä (Thermo Scientific, Waltham, MA) ja RNA eheys analysoitiin Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Näytteet, joissa on RIN 7 katsottiin heikkolaatuisia ja heitetään pois. Keskimäärin RNA osoitti RIN 9 ± 0,5. Eristetty kokonais-RNA jaettiin eriin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Vastatakseen suuren RNA-pitoisuus vaatimat RT-protokollaa, RNA-näytteet järjestelmällisesti saostunut seuraavan standardin 100% etanolia /3 M natriumasetaattia menetelmällä.

Screening suunnittelu ja aineisto sukupolven

Jotta löytää asiaan veren biomarkkereita CRC, suoritimme geenin ilmentymisen seulontaa 144 potilaista peräisin olevissa näytteissä AP tai CRC ja verrokkien. Seulonta sai alkunsa 2 vaihetta (kuvio 1). Ensin profiloitu 93 näytettä, jossa on suuri geenin paneeli. Paneeli mukana 667 ehdokasta, joista 42 biomarkkereiden aiemmin tunnistetaan laboratoriossamme [8] ja 625 uuden ehdokkaan valittu kirjallisuudesta (S1 taulukko). Kolme viittaus geenit qPCR tietojen normalisointi lisättiin myös. Kirjallisuudesta keskittyy geenien molekyyli- reittejä ja biologisten prosessien katsotaan olevan merkitystä kasvaimen-isännän vasteen, kuten tulehdusta ja immuunivasteen, kasvaimen invaasio ja metastaasi, hematopoieesin, signaalintransduktioreitteihin (erityisesti NF-kB-reitti), kemokiinien ja sytokiinien (erityisesti IL-1, IL-2), soluväliaineen proteiinit, adheesiomolekyylien ja solun pinnan markkereita. Kunkin ehdokas-geeni, TaqMan-määritys, joka on valittu kaupallinen arkistosta (Life Technologies, Carlsbad, CA) (S1 taulukko) ja jaetaan kolmeen 224-määrityksen Open Array levyt, joiden mitat ovat 12 näytettä samanaikaisesti. Näin ollen täysin profiilin 12 näytettä, kolme 224-määritystä levyt, lämpö- syklein samanaikaisesti, käytettiin. Voit tarkistaa väliseen levy vaihtelevuus ja toistettavuus viittaus geeni RPLP0 määritettiin jokaisesta näytteestä kaikki 3 levyille. RPLP0 keskihajonta (SD) analyysi 3 näytteen toistojen osoitti mediaani SD 0,21 Ct, joiden välinen neljännekseen valikoima 0,14-,34, mikä osoittaa, että näyte mittaus oli tarkka ja hyvin toistettavissa poikki 3-levyn sarja. Tässä vaiheessa keskityttiin kiinni laajalta aihe biologinen vaihtelevuus sijasta minimoimalla tekninen, siis systemaattinen otos rinnakkaista ei ole tehty, jotta profilointi enimmäismäärä näytteitä.

Ensimmäisessä Kartoitusvaiheessa suoritettu on OpenArray järjestelmä, 670 geenit profiloitiin 93 näytettä. Näistä 163 geenit valittiin ja testattiin edelleen vaiheen 2 ylimääräistä 51 näytettä. Lopullinen aineisto mukana 144 näytettä profiloidaan 163 geenejä. 29-geenin paneeli koottiin perustuu Ylintä syrjiä AP /CRC valvonnasta yhden ja usean analyysi. Lopuksi 29-geenin paneeli validoitiin kanssa LightCycler480 alustalla, joita käytetään kliinisissä laboratorioissa.

Out of 670 geenien analysoitu, 133 ei osoittanut ekspressiota tai huono PCR-monistus. Loput 534 kandidaattigeenit ja 3 viitaten geenit yleistä hyvin ilmaistaan ​​mediaani Ct on 22.94 (inter-neljänneksessä alue: 21,28-25,24) ja mediaani SD 0,7 (inter-neljänneksessä alue: 0,59-1,04) (S2 taulukko). Gene profiilit läpi valolla vaiheen, jossa niiden oli täytettävä vähintään yksi seuraavista kriteereistä ainakin yksi syrjinnän analyysi (

i

.

e

. Kontrolli versus CRC tai ohjaus vs. AP): p-arvo on alle 0,1 tai kertamuutosta suurempi kuin 1,5 (lineaarinen asteikko). Lisäksi biomarkkerit aiemmin tunnistettu laboratoriossamme [8] jäivät tässä vaiheessa riippumatta niiden p-arvo tai luovuttaa muutos, jotta voidaan arvioida suurempi näyte asettaa ja käyttää monimuuttujatestausta tilastollista lähestymistapaa. Kaikkiaan 160 geenit valittiin yhdessä kolme viite geenit, toisen vaiheen seulonnan. Tällä kertaa 163 geenit, mitattuna 168 määritykset (5 geenejä on hyvin alhainen ilme oli toinen määritys vahvistaa toimenpiteen saadut), jaettiin yhden levyn (S3 taulukko). Muita 51 näytteet profiloitu kahtena tämän alentunut geenin paneeli lisätä otoksen koosta ja tilastollista myöhemmissä analyyseissä. Myös 40 näytettä valmiiksi profiloitu vaihe 1, analysoitiin uudelleen varmistaa toistettavuus mittausten poikki vaiheen 1 ja vaiheen 2 ja eri levy-muodossa (224-

vs

. 168-määrityksen muodossa). Ilmaisu tasot saatu molemmissa vaiheissa kyseisten 40 näytteet korreloi (R

2 = 0,993) (S1 kuvio), kannustavat myös yhdistää 93 ja 51 näytteitä, profiloidut 163 geenit, yhdeksi lopullinen aineisto ( kuvio 1). Kokoamaan aineisto, keskiarvoja ja 40 näytettä mitataan kaksoiskappaleet käytettiin.

Nanoliter suurikapasiteettisten qPCR

Yhdeksänsataa ng kokonais-RNA käänteiskopioitiin 20 ul: n tilavuudessa käyttäen korkean Kapasiteetin cDNA Reverse Transcription kit (Life Technologies, Carlsbad, CA), jossa satunnaisia ​​alukkeita, mukaan valmistajan ohjeiden.

geeniekspressioprofilointi suoritettiin käyttäen OpenArray järjestelmää [22] (Life Technologies, Carlsbad, CA) , joka on nanoliter suurikapasiteettisten reaaliaikaisia ​​PCR alustan, jonka avulla 3072 reaktioita yhden levyn. PCR-reaktiot suoritettiin TaqMan OpenArray reaaliaikaisen levyt protokollaa. Lyhyesti, PCR-reaktioseokset, jotka sisälsivät 2,5 ui GeneAmp Fast PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 1 ui TaqMan OpenArray Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 0,3 ui RNaasi-vapaata vettä, ja 1,2 ui cDNA: ta, olivat loaded automaattisesti yhden tai kahtena reaktio osaksi OpenArray levyt käyttäen OpenArray AccuFill mukainen instrumentti valmistajan protokollia. Lämpötilasyklit protokolla koostui 40 syklistä 95 ° C: ssa 15 sekunnin ajan ja 60 ° C: ssa 1 minuutti. Lopussa jokaisen ajon, kuvat, kerätään ennen ja sen aikana PCR aikavälillä oli silmämääräisesti tarkistaa näytteen misloading tai levyjen lukemisen ongelmia. Ct-arvot laskemat OpenArray analyysin ohjelmistoa käyttäen automaattista kynnystykseen kanssa ct luottamus vähimmäismäärä asetettu signaali 300. Arvot alle pienimmän signaalin asetus osoitti epäonnistunut reaktion tai ei vahvistusta ja puuttuvat arvot ilmestyi vietyjä tietoja. Suurimman osan ajasta epäonnistunut reaktio johtui ilmentymistasoihin kuin detektioraja. Koska suurin Ct havaittu oli huonompi 36, nämä arvot korvataan mielivaltaisia ​​Ct-arvo 36. Puuttuvat arvot arvioidaan johtuvan teknisistä syistä korvattu mediaani Ct-arvot asianomaisten geenin kaikissa näytteissä. Viittaus RNA (Xpress Ref Human Universal kokonais-RNA) (Qiagen, Venlo, Alankomaat) oli läsnä positiivisena kontrollina ainakin kerran joka PCR aikavälillä, jotta varmistetaan prosessin ja reagenssin säilyvyys sekä toistettavuus yli erilaista PCR kulkee. Negatiiviset kontrollit, jotka sisältävät veden sijasta cDNA käytettiin sulkea pois mahdolliset DNA saastuminen.

Reaaliaikainen qPCR on 384-kuoppalevyillä

Kaksisataa ng kokonais-RNA käänteiskopioitiin cDNA käyttäen SuperScript Vilo cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Realtime valmis Custom RT-qPCR määrityksissä (Roche, Basel, Sveitsi), joka perustuu Universal ProbeLibrary (UPL) tekniikka (S4 taulukko), olivat ladattu valmiiksi 384-kuoppalevyillä valmistaja. Reaaliaikainen PCR-analyysi 384-kuoppalevyille suoritettiin Lightcycler 480 instrumentti (Roche, Basel, Sveitsi) 144 näytettä. PCR-reaktiot suoritettiin kahtena kappaleena 384-kuoppalevyille kokonaistilavuudessa 10 ui. Kukin kuoppa ladattiin automatisoidulla pipetin (microlab tähtönen, Hamilton Robotics, Reno, NV) 5 ui RealTimen Ready DNA Probes Master Mix (Roche, Basel, Sveitsi) ja cDNA vastaa 2,5 ng kokonais-RNA. QPCR-ohjelma koostui 2 sekuntia 95 ° C: ssa ja 30 sekuntia 60 ° C: ssa 40 sykliä. Positiiviset ja negatiiviset kontrollit muodostettiin kunkin retrotransskription erän ja ne sisällytettiin joka qPCR aikavälillä kohde määritystä. Negatiivinen kontrolli ei sisältänyt RNA eikä cDNA vahvista mitään saastumista tapahtunut. Positiivinen kontrolli tehtiin standardoidulla määrä Human Universal Reference RNA (Clontech, Mountain View, CA) eriin ja varastoitiin -80 ° C: ssa. Sillä qPCR ajaa validointi, negatiivinen kontrolli ei tuottanut vahvistusta tai Ylityspaikka (Cp) arvo ylös- tai yhtä suuri kuin 35, ja positiivinen kontrolli Cp arvo, kunkin kohdegeenin jotka kuuluivat ennalta määrätyn alue. Cp-arvot lasketaan automaattisesti kanssa LightCycier 480 analyysin ohjelmisto mukaan 2

nd johdannainen suurin menetelmä [23].

Tilastollinen

PCR saatujen tietojen OpenArray ja LC480 alustat normalisoitiin jonka ACt menetelmällä käyttämällä keskimääräistä kolmen taloudenhoito geenien RPLP0, NACA ja TPT1. Nämä geenit valittiin, koska ne olivat stabiileja 3 PBMC liittyvien microarray aineisto saatavissa GEO tietokannasta [24] ja myös qPCR suorittaman analyysin meille (tuloksia ei ole esitetty).

geeniekspressio kertainen muutos, määriteltiin kanssa, jossa on normalisoitu data.

Wilcoxonin testi [25] sovellettiin normalisoitu geenien ilmentyminen tietoja, jotta voidaan määrittää geenien merkittävästi ilmennetty eri ryhmien välillä. Lisäksi vaiheessa 2 seulonta, Wilcoxonin testiä sovellettiin 500 satunnaisesti valittua aineistot (bootstrap) ja merkitys asetettiin geenejä esiintyy merkittäviä (p-arvo 0,05) vähintään 250 bootstraps ulos 500.

Monimuuttujakalibrointi analyysiä käytettiin ominaisuuksien hallintaan vaiheen 2 seulonta sisälsi seuraavat menetelmät: K-top pisteytys pair, parametri-vapaa, ominaisuus valinta-algoritmi [26], ja rangaistaan ​​logistinen regressio menetelmä eri algoritmeja [27, 28].

arvioimiseksi ennustavan tarkkuuden 29-geenin paneeli, rangaistaan ​​logistinen regressio malleja asennettu aineisto ja validoitu ei-päällekkäin bootstrap menetelmä [29]. Viisisataa satunnainen aineistoja piirrettiin tilalleen aineisto; Kunkin bootstrap oli samankokoinen kuin opetusjoukolla. Mallia uudelleen asennettu jokaisen bootstrap ja validoitu out-of-laukku näytteitä. Spesifisyys ja herkkyys keskiarvot 500 bootstraps laskettiin ja vastaanotin käyttöominaisuudet (ROC) dikäyrät piirtämällä herkkyys vastaan ​​väärien positiivisten määrä (1-spesifisyys). Käyrän alapuolinen alue (AUC) laskettiin.

Pearsonin korrelaatiokerrointa käytettiin arvioimaan lineaarinen korrelaatio geenien mittausten mukaan kahden välineen.

R tilastojen ympäristö käytettiin tilastollisia analyysejä.

tulokset

määritelmä 29-geenin paneeli peräsuolen syövän ja adenooma havaitsemiseen

aineisto tuotetaan vaiheen 2 seulonta (163 geenit ja 144 näytettä) analysoitiin ja suodatetaan alhaisen ilmaisun ja epävakaa geenien poikki kaksi vaihetta, ja 20 geeniä edelleen hylätään, vähentämällä ehdokas geenien 140. tiedot tutkittiin määrittelemiseksi, mitkä geenit, yksin tai yhdistelminä, oli korkein valta syrjiä CRC , AP ja AP yhdessä alkuvaiheen CRC (AP + CRC I-II) kontrolliryhmän (S3 taulukko). Lisäksi CRC ryhmä verrattiin AP ryhmään, tunnistaa geenejä pystyy erottamaan CRC ja AP. Yleisesti, suurin osa geenien näytti olevan säädellään ylöspäin CRC ja AP ryhmiä verrattuna kontrolliryhmään. Havaittu geeniekspressio kertamuutoksia olivat suhteellisen vaatimattomia, enintään kertoimella 2,3 (log2 = 1,22) (kuvio 2). Kun suodatin perustuu FC 1,3 ja p-arvo 0,05 sovellettiin kaikkiin ryhmään vertailuja (CRC /Con, AP /Con, AP + CRCI-II /Con, CRC /AP), huomasimme 28 geenejä, joka tyydytti molemmat kriteerit (S3 taulukko). Niistä, 14 syrjiä CRC ja 8 AP kontrolliryhmän (kuvio 2), joista kaksi oli yhteinen sekä olosuhteet (CES1 ja IL1B). Seitsemän oli erityinen vain erottaa AP CRC ja 1 erotteleva AP + CRC I-II. Geenien vahvistettiin olevan merkittäviä, kun tilastollinen testaus levitettiin 500 satunnaisesti aineistot (bootstrap, tuloksia ei ole esitetty).

tulivuoren koealojen yhteenveto geeniekspression fold-muutoksia (FC) (

x-akseli

) ja p-arvot (

y-akseli

) varten vertailujen: A, CRC vs. kontrolli tai B, AP vs. kontrolli. P-arvo sulku oli vahvistettu 0,05 (vaakasuora viiva) ja taita-muutos kynnys ± 0,38 (vastaa ± 1,3 lineaarisella asteikolla, pystyviiva). Fc yhtä kuin 1 tarkoittaa, että geeni ilmentyy eturyhmältä keskimäärin kaksi kertaa niin paljon kuin verrokkiryhmässä.

Monimuuttuja-analyysi levitettiin aineisto syrjiä CRC, AP , AP + CRC kontrolliryhmään. Se sisälsi KTS-pair [26] ja viisi eri algoritmit perustuvat rangaistaan ​​logistinen regressio menetelmässä [27, 28, 30] vaihtelevan valinnat ja mallin sovitus. Geenit rankattiin mukaan taajuuden valinta käytetyn menetelmän, joka tiivistää monimuuttujatestauksen pisteet. Kolmekymmentäkahdeksan geenien kanssa pisteet vähintään kaksi jäivät koota lopullisen geeni listan (S3 taulukko).

yhden ja usean geenin luettelot olivat silloin yhdistettiin, jolloin lopulliseksi luettelo 29 geenien (taulukko 2). Kiinnostavaa kyllä, suurin osa yhden muuttujan top-pisteytys geenien näytti olevan myös top-pisteytys geenien Monimuuttuja-analyysissä. Neljä geenit (MAP2K3, MAPK6, CD63, ITGB5), suljettu pois suodatin on yhden muuttujan analyysin, koska FC 1,3 mutta tilastollisesti merkitsevä (p-arvo 0,05), olivat ”pelastettiin”, jonka monimuuttujamenetelmin. Muista 10 geenejä ei ole tilastollisesti merkitsevä ja integroitu lopullisten luetteloiden ansiosta monimuuttujatestauksen lähestymistapaa (GATA2, LTF, MMP-9, CXCL10, MSL1, RHOC, FXYD5), kolme ensimmäistä osoittivat FC 1.3.

Funktionaalianalyysi suoritettiin nerokkuus Pathway Analysis paketti (IPA, www.qiagen.com/ingenuity), paljasti, että paneelin rikastui geenien leukosyyttien muuttoliikkeen ja kemotaksista (CCR1, CXCL10, CXCL11, CXCR3, IL1B, IL8, ITGA2, MMP-9, S100A8) (taulukko 3). Nämä solun toiminnot tiiviisti liittyvät immuunijärjestelmän solujen ihmiskaupan ja tulehdusta. Erittäin edustettuina olivat myös geenien solujen lisääntymisen ja erilaistumisen (Bcl3, CD63, EGR1, GATA2, kesäkuu, LTF, MAPK6, MMP11, NME1, PPARg, TNFSF13B), mikä mahdollinen rooli hematopoieesissa.

validointi 29-geenin paneeli

arvioimiseksi kliinistä merkitystä meidän 29-geenin paneeli, erityisesti sen ennustavan tarkkuus, rangaistaan ​​logistinen regressio levitettiin aineisto ja varustettu mallien todensi ei-päällekkäiseen bootstrap menetelmä. Mallit voivat syrjiä CRC tai AP 1 cm säätimet, joiden keskimääräinen herkkyys 75% ja 59%, vastaavasti. Keskimääräinen spesifisyys, joka määritellään tarkastusten lukumäärä luokiteltu oikein yli kokonaismäärä valvonnan, oli 91%. ROC-analyysillä määritettiin, AUC oli 0,88 (+0,83-+0,92, 95% CI) ja 0,85 (,78-+0,91, 95% CI) CRC tai AP havaitseminen, vastaavasti (kuvio 3). Kun samaa lähestymistapaa sovellettiin 15 kärkipään geenien CRC tai AP syrjinnästä yhden muuttujan analyysin vain (taulukko 2), ennakoiva tarkkuus rajusti vähentynyt. Kun spesifisyys asetettiin 91%, CRC havaittiin herkkyydellä 65% ja AP herkkyydellä 37%, ja AUC 0,86 (0,77-0,84, 95% CI) ja 0,77 (0,70-0,82, 95% CI ), vastaavasti. Tätä tulosta tukivat valinta on integroida yhden ja usean lähestymistapa geenin valinta: geenit, jotka muuten olisivat hylättiin, koska ei täytä kiinteää p-arvo ja FC kriteerit, olivat todellakin arvokas CRC ja tukiasemien tunnistus katsomilla mukaan monimuuttujamenetelmät.

. Yhteenveto vääriä ja oikeita positiivisia määriä 29-geenin paneeli luokittelussa CRC tapauksissa. B. Yhteenveto vääriä ja oikeita positiivisia määriä 29-geenin paneeli luokittelussa AP tapauksissa. Analyysit suoritettiin käyttäen 500 bootstrap vahvistukset. Boxplots edustavat jakauma 500 kenkiin. Musta viiva kuvaa keskiarvoja yli 500 bootstraps kliinistä spesifisyys ja herkkyys.

Pitoisuus siirtymistä 384-kuoppaisen levyn qPCR alustan

OpenArray alustan osoitettu olevan arvokkaita high suoritusteho geeniekspressioprofilointi ja biomarkkereiden löytö. Kuitenkin tämä alusta ei sovi rutiininomaisesti kliinisessä laboratoriossa, jossa helppokäyttöisyys, joustavuus ja alhaiset kustannukset ovat edullisia. Kun tavoitteena on kehittää 29-geeni paneelin laajalti käytetty CRC-seulontatesti, arvioimme paneeli käyttäytyminen on qPCR alustalla, joka on yleisesti hyväksynyt kliinisissä laboratorioissa. 144 Näytteet profiloitu kanssa 29-geenin paneeli käyttäen LightCycler 480 (LC480) väline ja joukko kaupallisesti saatavilla koetin perustuvissa määrityksissä (Universal ProbeLibrary, Roche), ladattu valmiiksi 384-kuoppalevyillä.

Korrelaatio ja lineaarinen regressioanalyysi osoitti, että geeniekspressiotasot mitattuna kahden alustan olivat erittäin vertailukelpoisia (korrelaatiokerroin: 0,933) (kuvio 4A). Yleensä geenien ilmentyminen osoittivat samanlaisia ​​varianssi poikki näytteistä (kuvio 4B). Kuitenkin ryhmä nöyrä ilmaisi geenien näytetyt mittaustulokset pienempiä keskihajonnat on LC480 alustalla kuin sen OpenArray yhteen, mikä viittaa siihen, että määritykset on LC480 väline ovat tarkempia. Kun toistuva ero geeniekspressioanalyysiä välillä valvonnan ja CRC ryhmien kanssa LC480 aineisto, huomasimme, että suhteellinen runsaus ja tilastollista merkitystä 29 geenit olivat samankaltaisia ​​tai kanssa samansuuntaisesti mitä havaittu OpenArray aineisto (kuvio 4C ja 4D) . Kuitenkin viisi geeniä (PTGES, MMP11, IL8, CCR1, S100A8) tilastollista merkittävyyttä katosi, kun mitataan LC480.

sirontakaavioissa analyyseja suoritetaan kullekin geenin tietosarjat on LC480 ja OpenArray alustat . Seuraavia muuttujia on käytetty: A. Mean normalisoitu ilmaisu arvot (ΔCp ja ACt) (R

2: 0,933), B. Mean keskihajonnat (SD) suhteessa kunkin kohdegeenin mitataan, C. Geenien ilmentyminen kertamuutoksia välillä CRC ja kontrolliryhmän (lineaarinen absoluuttisia arvoja), D. p-arvot tilastollinen testaus välistä CRC ja kontrolliryhmän (loki muuttaneet). Linjat edustavat p-arvo 0,05. Gene nimet on päällekkäin kuvaajien.

Keskustelu ja päätelmät

Tässä työssä olemme tunnistaneet 29 geenin paneeli ilmaistuna PBMC, joka pystyy syrjimällä yksilöiden AP 1cm tai CRC terveistä yksilöistä. Rangaistaan ​​regressioanalyysimme luokiteltu oikein 75%, 59% (herkkyys) ja 91% (spesifisyys) CRC, AP ja valvontaa, vastaavasti.

Lähestymistapa käytimme on erilainen kuin nykyiset seulontatestien CRC, kuten se perustuu PBMC geeneihin ekspressioprofiileja. Tämä hyödyntää vakiintunut käsite kasvaimeen isäntä vuorovaikutus ja panos luuytimestä peräisin olevien solujen kasvaimen etenemiseen [16, 17]. On etua, että AP, katsotaan premalignien leesioiden, havaitaan myös, vaikkakin alhaisempi herkkyys, jonka 29-geenin paneeli. Todellakin, tulehdus liittyy neoplastiseen paksusuolen polyyppi muodostumisen [31] ja tulehduksellinen suolistosairaus, erityisesti colitis ulcerosa, ovat riskitekijä CRC [32]. Tärkeää on, ei-steroidiset anti-inflammatoriset lääkkeet suojata CRC kehittämiseen [33], estävät adenooma muodostuminen kokeellisissa malleissa familiaalinen adenomatoottisen polypoosin coli [34] ja reverse-geenin ilmentymisen muutoksia normaalissa paksusuolessa adenooma sekvenssin [35]. Tämä vahvistaa käsitystä, että ehdotettu lähestymistapa voitaisiin kehittää AP ja varhaisen CRC havaitseminen on tehokkaampaa vaihtoehtona ulosteen piilevän veren perustuvia testejä. Allas 670 kandidaattigeenejä käytettiin seulontaan sisältyy monia isäntägeenejä ja reittejä mukana tulehdus, immuunivastetta ja syövän etenemiseen. Mikä tärkeintä, nämä geenit ei valittu perustuu edellisen genomin-laajakuva, vaan perustuu olemassa olevaan tietoon (eli kirjallisuudesta ja omat tiedot) ja hypoteesit (eli tulehduksen roolista syövän etenemistä). Suurin osa näistä 29 geenien Paneelin ovat välittäjiä /säätelijöitä tulehdus, solun liikkuvuus, solujen eloonjäämistä, solujen signalointi ja lisääntymistä (taulukko 2 ja 3). Tämä on johdonmukaista sen havainnon kanssa, että kasvaimen-liikkeelle luuytimestä peräisin verenkierrossa myelomoncytic solut ovat tilassa aktivointi vasteena kasvaimen vapautetaan tekijät.