Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tällä hetkellä kemoterapiaa rajoittuu lähinnä genotoksisia lääkkeitä, jotka liittyvät vakavia sivuvaikutuksia johtuvat ei-selektiivisiä kohdentamista normaalia kudosta. Luonnontuotteita on merkittävä rooli kehityksessä eniten kemoterapia-aineiden, jossa 74,8% kaikista käytettävissä kemoterapiaa on johdettu luonnontuotteista.

tavoite

tieteellisesti arvioida ja validoida syövän vastaisen potentiaalin Etanolisuodos otteen hedelmää Pitkäpippuri (PLX), kasvi

pippurikasvit

perhe, jota on käytetty perinteisessä lääketieteessä, erityisesti Ayurveda ja tutkia syövän vastaisen vaikutusmekanismi PLX syöpäsoluja vastaan.

Materiaalit Menetelmät

hoidon jälkeen etanoli pitkä pippuri uute, solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttämällä vesiliukoista tetratsoliumsuolaa; apoptoosin induktio havaittiin seuraavat tumavärjäystä Hoechst, sitovat anneksiini V externalized fosfatidyyliseriinin ja faasikontrastimikroskopiaa. Kuva-sytometrialla havaitsemiseen käytettiin vaikutuksen pitkä pippuri uutteen reaktiivisten hapen lajien ja hajoamista mitokondrion kalvon mahdollisia seuraavien tetrametyylirodamiini tai 5,5,6,6′-tetrakloori-1,1 ’, 3, 3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine kloridi värjäytymistä (JC-1). Arviointi PLX

in-vivo

suoritettiin käyttäen Balb /C-hiiriä (myrkyllisyys) ja CD-1 nu /nu immuunipuutteisilla hiirillä (tehoa). HPLC-analyysi mahdollisti havaitsemiseen joitakin ensisijaisen yhdisteiden läsnä pitkän pippuri uutetta.

Tulokset

Tuloksemme osoittivat, että etanolipitoista pitkä pippuri ote indusoi kaspaasi riippumaton apoptoosin syöpäsoluissa, vaikuttamatta non -cancerous solut, kohdistamalla mitokondrioita, mikä johtaa hajoamista mitokondrion kalvon potentiaalia ja kasvua ROS tuotannossa. Vapauttaminen AIF ja endonukleaasi G yksittäisistä mitokondrioissa vahvistaa mitokondriot mahdollisena kohteena pitkä pippuri. Tehoa PLX in

in-vivo

tutkimukset osoittavat, että suun kautta pystyy pysäyttämään kasvua paksusuolen syöpä kasvaimia immuunipuutteisilla hiirillä, joihin ei liity toksisuutta. Nämä tulokset osoittavat potentiaalisesti turvallista ja myrkytön vaihtoehto, joka on pitkä pippuri ote syövän hoidossa.

Citation: Ovadje P, Ma D, Tremblay P, Roma A, Steckle M, Guerrero J-A, et al. (2014) arviointi Tehoa Biokemiallinen mekanismi solukuoleman indusointi

Piper longum

Ote valikoidusti

In-vitro

ja

In-Vivo

mallit ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 9 (11): e113250. doi: 10,1371 /journal.pone.0113250

Editor: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 29, 2014; Hyväksytty: 21 lokakuu 2014; Julkaistu: 17 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Ovadje et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki tiedot on esitetty muodossa ja taulukoita, joita löytyy käsikirjoituksen.

Rahoitus: Tämä Tutkimuksen rahoittivat Windsor Essex County Syöpä keskuksen säätiölle Seeds4Hope Grant (URL: https://windsorcancerfoundation.org/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: mukana kirjoittamassa Siyaram Pandey on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One Pääkirjoitus politiikan ja kriteerit.

Johdanto

jatkuva kasvu syöpätapausten merkitsee tarvetta lisätutkimusta tehokkaampi ja vähemmän myrkyllinen vaihtoehtoja nykyiset hoidot. Kanadassa yksin, arvioitiin 267700 uutta syöpätapausta syntyy, jossa 76020 kuolemista tapahtuu vuonna 2012 yksin. Maailmanlaajuinen tilastot ovat vieläkin dire, jossa 12,7 miljoonaa syöpätapausta ja 7,6 miljoonaa syöpäkuolemaan johtuvat vuonna 2008 [1], [2]. Tunnusmerkkejä syöpäsolujen paljastaa vaikeuksia kohdistaminen syöpäsoluja valikoivasti. Syöpäsolut ovat tunnettuja ylläpitää proliferatiivisten signalointi, kiertää kasvun hidastuminen, aktivoimalla ja metastaasit ja vastustavat solukuoleman muiden ominaisuuksien lisäksi [3]. Nämä ominaisuudet aiheuttavat erilaisia ​​haasteita kehitettäessä onnistunut syöpähoitoihin. Kyky syöpäsolujen kiertää solukuoleman tapahtumia on ollut huomion keskipisteenä on paljon tutkimusta, jossa keskitytään keskittyy kohdistaminen eri haavoittuvia näkökohtia syöpäsolujen aiheuttavan erilaisia ​​ohjelmoidun solukuoleman (PCD) syöpäsoluissa, ettei niihin liity toksisuudet ei-syöpäsoluja.

Apoptosis (PCD tyyppi I) on tutkittu vuosikymmeniä, ymmärrystä, jotka parantavat mahdollisuuksia kehittää tehokkaampia syöpähoitojen. Tämä on solukuoleman muoto, joka tarvitaan säännöllistä solujen kehitystä ja homeostaasiin sekä puolustusmekanismi päästä eroon vahingoittuneiden solujen solut apoptoosin investoida energiaa omaan kuolemaan jottei tulla riesa [2]. Syöpäsolut kiertää apoptoosin jotta antamaan lisä- kasvua etu ja ravintoa, siis nykyinen syöpähoitoihin pyrittävä hyödyntämään eri haavoittuvuuksia syöpäsolujen jotta laukaisemaan apoptoosin kautta joko sisäinen tai ulkoinen väyliä [4], [5]. Haasteet joitakin käytettävissä syövän hoidot ovat kykynsä indusoida apoptoosin syöpäsoluissa indusoimalla genomista DNA-vaurioita. Vaikka tämä on aluksi tehokasta, koska ne kohdistuvat nopeasti jakautuvat solut [6], ne ovat yleensä liittyy vakavia sivuvaikutuksia aiheuttamia ei-selektiivinen kohdentamista normaalien ei-syöpäsoluja, mikä osoittaa tarvetta muille kuin yhteiset tavoitteet apoptoosin ilman liittyvät toksisuudet.

luontaistuotteita (kädellisten) ovat osoittaneet suurta lupausta alalla syöpätutkimuksessa. Viimeisten 70 vuotta ovat ottaneet käyttöön erilaisia ​​luonnontuotteita lähteenä monet lääkkeet syövän hoidossa. Noin 75% hyväksytyistä syöpähoitoihin on johdettu luonnontuotteista, odotettu tilastotieto otetaan huomioon, että yli 80% kehitysmaiden väestöstä on riippuvainen luonnontuotteiden terapiaan [7]. Kasvituotteet varsinkin sisältävät monia bioaktiivisia kemikaaleja, jotka voivat pelata tiettyjä rooleja eri sairauksien hoidossa. Ottaen huomioon monimutkaisten seosten ja farmakologisista ominaisuuksista monia luonnollisia tuotteita, on vaikea ottaa käyttöön erityinen kohde ja toimintamekanismi monien kädellisten. Kanssa kädellisten voimistumassa, erityisesti alalla syövän tutkimusta, on paljon uusia tutkimuksia mekanistinen tehoa ja turvallisuutta kädellisten mahdollisina syöpälääkkeiden [8].

Pitkäpippuri alkaen pippurikasvit perhe, on käytetty vuosisatojen ajan eri sairauksien hoidossa. Useita lajeja pitkään pippuri on tunnistettu, mukaan lukien

Piper longum

(uute, jota käytetään tässä tutkimuksessa),

Piper betle

,

Piper retrofactum

, tiivisteet joista on käytetty vuosien ajan eri sairauksien hoidossa. Pitkä lista hyödyt ja edut liittyvät otteita eri

Piper spp

, raportit osoittavat niiden tehokkuutta niin hyvä ruoansulatuskanavan aineina ja kipua ja tulehduksellinen hillitsevät [9]. Ei ole kuitenkaan juurikaan ole tieteellinen validointi, vain luulojen, että hyödyt käyttöön liittyvien pitkien pippuria otteita. On tieteellisiä tutkimuksia on suoritettu useita yhdisteitä on läsnä otteita pitkä pippuri, kuten piperines, jonka on osoitettu estävän monien entsymaattista huumeiden bio-muuttamassa reaktioita ja soittaa erityinen rooli metabolisen aktivaation karsinogeenien ja mitokondrioiden energiantuotannon [10] – [13], ja erilaisia ​​piperidiini alkaloideja, jossa fungisidinen aktiivisuus [9], [14]. Jotkut näistä yhdisteistä ovat osoittaneet voimakas syövän vastaista aktiivisuutta [15], mikä viittaa siihen, että Pitkäpippuri otteet voisivat edustaa uutta NHP, paremmin selektiivinen teho syöpäsoluja vastaan.

Tässä tutkimuksessa tarkastellaan tehoa etanoli- uutetta Long pippuria hedelmiä (PLX) vastaan ​​eri syöpäsoluja, sekä yrittää valaista toimintamekanismin, hoidon jälkeen. Tämän tutkimuksen tulokset osoittavat, että PLX vähensi elinkelpoisuutta eri syöpäsolutyyppien annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla, jossa apoptoosin induktio havaittiin, seuraavat mitokondrioiden kohdentamista ja vapauttaa pro-apoptoottisten tekijöistä. Alhaisen annokset PLX vaaditaan apoptoosin syöpäsolun, oli helppo löytää terapeuttinen ikkuna tätä uutetta. Apoptoosin induktio havaittiin olevan kaspaasin riippumaton, vaikka oli aktivointi sekä ulkoisten ja sisäisten reittejä ja tuotanto ROS ei välttämätön mekanismi solukuoleman induktion PLX. Monimutkainen Polychemical uute hedelmää pitkä pippuri kasvi, luonnollinen terveys tuote ennennäkemättömän syövän vastaista aktiivisuutta, tarjoaa tavan kohdistaa useiden haavoittuvuuksien syöpäsoluja. Vaikka läsnä tiettyjen estäjien, PLX oli tehokas apoptoosin viittaa mahdollisen soveltamisen kehittää PLX turvallisena ja tehokkaana syövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Eläinkokeet suoritettiin mukaisesti että eläinten hoito komitea protokolla hyväksymä University of Windsor animal Care komitea; Tämä protokolla ja projekti hyväksyi eläinten hoito komitea – pöytäkirja numero: AUPP 10-17) mukaisesti Kanadan neuvoston Animal Care (CCAC) ohjeita.

Cell Culture

pahanlaatuisen melanooman solulinja G-361, ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinjat HT-29 ja HCT116 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA Cat. nro CRL-1687, CCL-218 CCL-247, vastaavasti) viljeltiin jossa McCoyn Medium 5a (Gibco BRL, VWR, Mississauga, oN, Kanada) täydennettynä 10% (v /v) FBS (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ja 40 mg /ml gentamysiini (Gibco, BRL, VWR). Munasarjojen adenokarsinooma OVCAR-3 (American Type Culture Collection, Cat. No. HTB-161) viljeltiin RPMI-1640-media (Sigma-Aldrich Canada, Mississauga, ON, Kanada) täydennettynä 0,01 mg /ml naudan insuliinia, 20% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS) standardi (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ja 10 mg /ml gentamysiini. Haiman adenokarsinoomasolulinja BxPC-3 (American Type Culture Collection, Cat. No. CRL-1424) viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS) standardin ja 40 mg /ml gentamysiini. Normaali-johdettu paksusuolen limakalvon NCM460 solulinja (INCELL Corporation, LLC., San Antonio, TX, USA) kasvatettiin INCELL n M3Base väliaineessa (INCELL Corporation, LLC., Cat. No. M300A500), jota oli täydennetty 10% (v /v) FBS: ää ja 10 mg /ml gentamysiini.

Kaikki solut kasvatettiin optimaaliset kasvuolosuhteet 37 ° C: ssa ja 5% CO2: ta. Lisäksi kaikki solut jatkettiin varten ≤6 kuukautta.

Long Pepper Extraction

kypsä ja kuivataan Intian pitkä pippuri hedelmät saatiin Quality Natural Foods rajallinen, Toronto Ontario. Kasvimateriaali on alusta asti ja uutettiin vedettömässä etanolissa (100%) suhteessa 01:10 (1 g kasviainesta 10 ml: aan etanolia). Uutto suoritettiin yli yön ravistelijassa huoneenlämpötilassa. Uute läpi P8 karkeasta suodattimesta, jota seurasi 0,45 um: n suodattimen. Liuotin haihdutettiin käyttämällä RotorVap 40 ° C: ssa ja liuotetaan dimetyylisulfoksidiin (Me

2SO) lopulliseen varastossa pitoisuus 450 mg /ml.

Cell hoito

Solut ja kasvatettiin 60-70% konfluenssiin, ennen kuin hoidetaan Long Pepper uutteet (PLX), N-asetyyli-L-kysteiini (NAC) (Sigma-Aldrich Canada, Cat. No. A7250), ja laaja-alaista kaspaasiestäjä, Z-VAD-FMK (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ, USA) on oltava oikean annokset ja kesto. NAC liuotettiin steriiliin veteen. Z-VAD-FMK liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (Me

2SO). PLX uutettiin kuten aikaisemmin on kuvattu, liuotetaan uudelleen Me

2SO. Ennen hoitoa, laimealla työskentelee pitoisuuteen 10 mg /ml PBS: ssä, valmistettiin. Soluja käsiteltiin 10 mg /ml saadaan lopulliset pitoisuudet ilmoitetaan tulososiossa.

arviointi tehon Long Pepper Pura (PLX) syöpäsoluissa

WST-1-määritys solujen elinkelpoisuus.

vaikutuksen arvioimiseksi PLX syöpäsolujen, vesiliukoista tetratsoliumsuolaa (WST-1) kolorimetrinen koe suoritettiin valmistajan protokollan mukaisesti (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA ), määrittää solujen elinkelpoisuus funktiona solun aineenvaihduntaan. Sama määrä soluja, ympättiin 96-kuoppaiselle kirkas pohja kudosviljelylevyillä käsiteltiin sitten asianomaiset hoidot ilmoitettuina pitoisuuksina ja kestot. Käsittelyn jälkeen soluja inkuboitiin WST-1-reagenssia 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa 5% CO2. WST-1-reagenssia lohkaistaan ​​formatsaaniksi Solun entsyymit aktiivisesti metabolizing soluissa. Formatsaanipitoisuus kvantifioitiin ottamalla absorbanssilukemia 450 nm Wallac Victor

3 1420 -monileimalukijaa (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Kanada). Cellular elinkelpoisuus mittana metabolinen aktiivisuus ilmaistiin prosentteina liuottimen kontrolliryhmiin.

tumavärjäystä.

jälkeen hoidon tumiin solut värjättiin 10pM Hoechst 33342 väriaine ( Molecular Probes, Eugene, OR, USA) tai 1 mg /ml propidiumjodidia (PI) (Sigma Aldrich, Mississauga, oN. Kanada) seuraamaan ydin- morfologia apoptoosin nimetyissä ajankohtina ja yleistä solukuolemaa. Soluja inkuboitiin 10 gM Hoechst dye ja 1 mg /ml PI 10 minuuttia ja skooppivalokuvat otettu Leica DM IRB käänteinen fluoresenssi mikroskooppi (Wetzlar, Saksa) 400 x suurennus. Kuva-sytometrialla käytettiin määrän kvantitoimiseksi solukuoleman esiintyvien PI-värjäyksellä.

anneksiini V-sitoutumismääritys.

Vahvista apoptoosin induktion, sitoutumisen anneksiini V ulkoistettu fosfatidyyliseriinin ulommalle solun pinnalla, arvioitiin. Hoidon jälkeen PLX, solut pestiin kahdesti fosfaattipuskurissa suolaliuokseen (PBS). Sen jälkeen solut suspendoitiin ja inkuboitiin anneksiini V: n sitoutumisen puskuria (10 mM HEPES, 10 mM NaOH, 140 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 7,6), jossa anneksiini V AlexaFluor-488 (01:50) (Invitrogen, Kanada, Cat nro . A13201) 15 minuutin ajan. Lopullinen 10 minuutin inkuboinnin, 10 uM Hoechst ja 1 mg /ml propidiumjodidia lisättiin mikrosentrifugiputkeen ja inkuboitiin lopullisessa 10 minuutin ajan pimeässä. Micrographs otettiin 400 x suurennus Leica DM IRB käänteismikroskooppi (Wetzlar, Saksa) ja kuvapohjaisia ​​cytometry käytettiin määrällisesti prosenttiosuutta ohjelmoidun solukuoleman (anneksiini V-positiivisia soluja) jälkeinen hoito.

TUNEL Värjäys havaita DNA-vaurio ja määrällisesti Apoptosis.

jälkeen PLX hoitoa, HT-29-solut leimattiin Terminal deoksinukleotidyylitransferaasilla dUTP nick end merkinnät (TUNEL) määritys. Määritys suoritettiin valmistajan protokollan (Molecular Probes, Eugene, OR), jotta voidaan havaita DNA-vaurioita. Soluja käsiteltiin PLX tai VP-16 (positiivisena kontrollina) merkityillä pitoisuuksien ja ajankohtina ja analysoitiin pirstoutumista DNA. Käsittelyn jälkeen solut kiinnitettiin suspendoimalla ne 70% (v /v) etanolia, ja säilytettiin -20 ° C: ssa yön yli. Sitten näyte inkuboitiin DNA-merkintöjä liuosta (10 ui reaktiopuskuria, 0,75 ui TdT entsyymi, 8 ui BrdUTP, 31,25 ui dH2O) 1 tunnin ajan 25 ° C: ssa. Jokainen näyte altistetaan vasta-liuokseen (5 ui Alexa Fluor 488 leimattua anti-BrdU-vasta ja 95 ui huuhteluliuos). Soluja inkuboitiin vasta-aineen kanssa liuoksen 20 minuuttia ja TUNEL-positiiviset solut kvantifioitiin kuva-pohjainen sytometriaa.

kaikkiaan Cell ROS Generation.

hoidon jälkeen PLX, soluja inkuboitiin 2 ’, 7’-Dichlorofluorescin diasetaatti H

2DCFDA (luettelo nro D6883, Sigma Aldrich, Mississauga oN. Canada) 45 minuuttia. Solut kerättiin, pestiin kahdesti PBS: llä ja havaittiin vihreän fluoresenssin käyttäen TALIn kuva-sytometrillä (Invitrogen, Kanada). NAC käytettiin arvioimaan riippuvuutta PLX on ROS sukupolvi ja elinkelpoisuus.

Arvio mitokondrioiden toimintaa jälkeen PLX Treatment

tetra- metyyliesteri (TMRM) Värjäys.

tarkkailemista mitokondrioiden kalvon potentiaali (MMP), tetrametyylirodamiini metyyliesteri (TMRM) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Kanada) tai 5,5,6,6′-tetrakloori-1,1 ’, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine kloridia ( JC-1) (Invitrogen, Kanada) käytettiin. Soluja kasvatettiin peitinlaseilla, käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla hoitoja ilmoitettuina ajankohtina, ja inkuboitiin 200 nM TMRM 45 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Micrographs saatiin 400 × suurennuksella Leica DM IRB käänteinen fluoresenssi mikroskooppi (Wetzlar, Saksa). Vahvista saadut tulokset fluoresenssimikroskopisesti, kuvapohjaisia ​​cytometry havaitsemiseen käytettiin punaisen fluoresenssin. Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja hoidon jälkeen, soluja inkuboitiin TMRM 45 minuuttia, pestiin kahdesti PBS: ssä ja asetettiin TALIn liukuu. Punainen fluoresenssi saatiin käyttämällä TALI kuvapohjaisia ​​sytometrillä (Invitrogen, Kanada).

Mitokondrioiden eristäminen arvioida Mitokondrioiden kohdistaminen.

Solut kerättiin trypsiinillä, pestiin kerran kylmällä PBS: llä, uudelleensuspendoitiin kylmä hypotoniseen puskuriin (1 mM EDTA, 5 mM Tris-HCI, 210 mM mannitolia, 70 mM sakkaroosia, 10 uM Leu-pep ja Pep-A, 100 uM PMSF) ja manuaalisesti homogenoitiin. Homogenoitu solujen liuosta sentrifugoitiin 3000 rpm: llä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti sentrifugoitiin 12000 rpm 15 minuuttia 4 ° C: ssa ja mitokondrioiden pelletti suspendoitiin uudelleen kylmään reaktiopuskuria (2,5 mM malaatti, 10 mM sukkinaattia, 10 uM Leu-pep ja Pep-A, 100 uM PMSF: a PBS: ssä). Eristetyt mitokondriot käsiteltiin PLX ilmoitettuina pitoisuuksina ja inkuboitiin 2 tuntia kylmässä reaktiopuskuria. Kontrolliryhmä käsiteltiin liuotinta (etanoli). Seuraavat 2 tunnin inkubaation uutetta, mitokondrio Näytteitä vorteksoitiin ja sentrifugoitiin 12000 rpm 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Saatu supernatantti ja mitokondrioiden pelletit (suspendoitiin uudelleen kylmään reaktiopuskurissa) alistettiin Western Blot-analyysi voidaan arvioida, että mitokondrioiden levittämisen /retentio pro-apoptoottisten tekijöiden.

Western Blot analyysit.

Protein näytteet altistettiin SDS-PAGE: lla, siirrettiin nitroselluloosamembraanille, ja blokattiin 5% w /v maidon TBST (Tris-pusku- roitu suolaliuos Tween-20) liuoksella 1 tunnin ajan. Membraaneja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa anti-endonukleaasia G (EndoG) vasta-aine (1:1000) kaniineissa (Abcam, Cat. No. ab9647, Cambridge, MA, USA), anti-sukkinaattidehydrogenaasi alayksikön A ( SDHA) vasta-aine (1:1000) nosti hiirissä (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-59687, Paso Robles, CA, USA), tai anti-apoptoosin indusoiva tekijä (AIF) vasta kaneissa (1:1000) (Abcam, Cat. No. ab1998, Cambridge, MA, USA). Jälkeen primaarinen vasta-aine oli inkuboitu, kalvo pestiin kerran 15 minuuttia ja kaksi kertaa 5 minuutin ajan TBST: ssä. Kalvoja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä, jossa on anti-hiiren tai anti-kani-piparjuuri-peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (1:2000) (Abcam, ab6728, ab6802, Cambridge, MA, USA), jota seurasi kolme 5 minuutin pesua TBST. Kemiluminesenssi-reagenssia (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, Kanada) käytettiin visualisoimaan proteiinivyöhykkeet ja tiheysmittaus analyysi suoritettiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa.

In-Vivo

arviointi Long Pepper Extract

Myrkyllisyys arvio.

Kuusiviikkoisia Balb /C-hiiriä saatiin Charles River Laboratories ja sijoitettu vakio laboratorio-olosuhteissa 12-tunnin valo /pimeä sykli mukaisesti eläimen protokollat hahmoteltu University of Windsor Research Ethics Board-AUPP 10-17). Seuraavat sopeuttamiseen, hiiret jaettiin kolmeen ryhmään (3 eläintä /ohjaus (käsittelemätön), 3 eläintä /letkuruokinnalla kontrollin (kantaja hoitoa) ja 4 eläintä /hoitoryhmä). Ohjaus käsittelemätön ryhmä sai pelkkää suodatettua vettä, kun taas toinen ja kolmas ryhmä sai 50 mg /kg /päivä vehikkeliä (Me

2SO) tai PLX, vastaavasti 75 päivää. Aikana tutkimuksen, myrkyllisyys mitattiin punnitsemalla hiiriä kahdesti viikossa ja virtsaa kerättiin proteiinin virtsa-analyysi virtsan mittatikku ja Bradford määrityksissä. Sen jälkeen kestoa tutkimuksen hiiret tapettiin ja niiden elimet (maksa, munuaiset ja sydämet) saatiin immunohistokemiallista ja toksikologisten analyysi tohtori Brooke yliopistossa Guelph.

teho PLX vuonna -tuumoriksenografti mallit Immuunipuutteiset hiiret.

Kuusiviikkoisia male CD-1 nu /nu-hiiriä saatiin Charles River Laboratories ja sijoitettu vakio laboratorio-olosuhteissa 12-tunnin valo /pimeä sykli mukaisesti eläimen protokollat ​​hahmoteltu University of Windsor Research Ethics Board-AUPP 10-17). Sen jälkeen sopeuttamiseen, hiiriin ruiskutettiin ihonalaisesti oikeaan ja vasemman takajalan kyljet joiden paksusuolensyöpä solususpensio (fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa), jonka pitoisuus on 2 * 10

6 solua /hiiri (HT-29, p53

– /-, in vasempaan kylkeen ja HCT116, p53

+ /+, oikeaan kylkeen). Kasvainten annettiin kehittyä (noin viikon), jonka jälkeen eläimet jaettiin satunnaisesti hoitoryhmiin 4 hiirtä ryhmää kohti, vertailuryhmä, letkuruokintaneulan kontrolliryhmä annettiin pelkkää suodatettua steriiliä vettä, samoin kuin letkulla hoito ajoneuvon (5 ui Me

2SO PBS) kahdesti viikossa. Lopullinen ryhmä sai suodatettua vettä, johon on lisätty pitkä pippuri uute pitoisuudessa 100 ug /ml, samoin kuin letkulla hoito pitkä pippuri uute (5 ui uutetta PBS: ssä), kahdesti viikossa, joka vastaa 50 mg /kg /vrk . Kasvaimet arvioitiin joka toinen päivä mittaamalla pituus, leveys ja korkeus, käyttämällä tavallista paksuus ja tuumorin tilavuus laskettiin kaavalla π /6 * pituus * leveys. Hiiriä arvioitiin myös laihtuminen joka toinen päivä tutkimuksen keston ajan, joka kesti 75 päivää, jonka jälkeen eläimet tapettiin ja niiden elimet ja kudokset (maksa, munuaiset, sydän ja kasvaimia) saatiin ja varastoitiin 10 % formaldehydiä immunohistokemiallista ja toksikologisessa analyysissa.

hematoksyliinillä Eosiini (H E-protokollaa [16].

Phytochemical analyysi Long Pepper Pura HPLC

HPLC analyysi pitkä pippuri Raakauute suoritettiin Ottawan yliopistosta vuonna Arnason laboratoriossa. Yhteensä viisi tunnettu piperamides analysoitiin ja verrattiin raakaa pitkä pippuri uutetta. Uutteet ja piperamide standardit analysoitiin Luna C18-5u-250 x 4,6 mm: n kolonni 45 ° C: ssa virtausnopeudella 1,0 ml /min liikkuvana faasina muodostuu H

2O ja metanolin kuten on esitetty taulukossa 1 . Kromatogrammi profiilit käytettiin havaitsemaan mitään eroja näytteen standardi tunnetaan piperamides raa’assa pitkä pippuri uutteet.

tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme riippumatonta kertaa . Edustavia fluoresenssi kuvia näytettiin tarvittaessa. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen GraphPad Prism 6.0 288 ohjelmisto. Keskiarvo ja keskivirhe kolmen erillisen kokeen analysoitiin määrän dataa. Opiskelijan T-testi ja kaksisuuntainen Anova käytettiin tilastolliseen analyysiin.

Tulokset

Etanolista Ote Long Pepper (PLX) tehokkaasti ja valikoivasti Vähentää elinkelpoisuus Indusoi apoptoosia syöpäsoluissa Dose Aika riippuvaisesti

Ensimmäinen askel ymmärtämään vaikutus pitkä pippuri uutetta tässä tutkimuksessa oli arvioida vaikutusta PLX elinkelpoisuudesta syöpäsolujen. Käsittelyn jälkeen konsentraation kasvaessa PLX lisäämään ajankohtina solut inkuboitiin vesiliukoinen tetratsoliumsuola, joka saa metaboloituu punainen formatsaaniksi tuotteen eläviä soluja, joilla on aktiivinen metabolia. Tämä tuote voidaan sitten kvantitoida absorbanssi spektrometria. Havaitsimme tehoa raakaa PLX vähentää elinkelpoisuuden syöpäsolujen, kuten paksusuoli- (HCT116), haiman (BxPC-3), munasarjasyöpä (OVCAR-3) ja melanoomasoluja. Tämä vaikutus oli annoksesta ja ajasta riippuva (kuvio 1). Arvioitava edelleen syövän vastaisen aktiivisuuden PLX halusimme arvioida rooliaan solukuoleman ja sen selektiivisyys syöpäsoluja. Tuloksemme osoittavat, että PLX kykenee selektiivisesti indusoida solukuolemaa syöpäsoluissa (paksusuolen, haiman ja leukemia) annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla, kuten tunnettu siitä, että kasvu propidiumjodidin positiivisten solujen syöpäsolujen käsiteltiin PLX (kuvio 2) . Lisäksi tämä vaikutus oli valikoiva, sillä normaalit paksusuolen epiteelisoluihin pysyi vaikuta tämän käsittelyn, samoina pitoisuuksina ja ajankohtina (kuvio 2B). Nämä tulokset kvantifioitiin käyttäen kuva-sytometrialla prosenttiosuuden määrittämiseksi solujen apoptoosin ja yhteensä solukuolemaa. Havaitsimme 30-40%: n nousu anneksiini V-positiivisten solujen, seuraavat PLX hoidon ja 80-100% PI positiivinen kasvu samassa solussa näytteet, vahvistaa apoptoosin jälkeen kuolion viljellyissä syöpäsoluissa (kuvio 3).

Colon (HCT116), Munasarjojen (OVCAR-3), haiman (BxPC-3) syöpä ja melanooma (G-361) soluja käsiteltiin raakaa etanolipitoista uutetta pitkä pippuri (PLX), minkä jälkeen ne inkuboitiin WST-1 solujen elinkelpoisuus väriaine 4 tuntia. Absorbanssi luettiin 450 nm: ssä ja ilmaistaan ​​prosentteina kontrolliin. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta nelinkertaisesti 3 riippumattoman kokeen. ** P 0,0001.

(A) hoidon jälkeen Ihmisen haiman (BxPc-3) syövän ja T-solujen leukemian soluja PLX, ilmoitetuilla ajankohtina solut inkuboitiin propidiumjodidilla ja arvioidaan induktioon solukuoleman kuvapohjaisia ​​cytometry. (B) Samanlaisia ​​kokeita suoritettiin ihmisen paksusuolen syövän soluja (HT-29) ja normaalin paksusuolen epiteelisolut (NCM460). Fluoresenssimikroskopialla käytettiin arvioimaan solukuoleman induktioon, kuten ominaista läsnäolo propidiumjodidia positiivisia soluja. Kuvat otettiin 400 x suurennus fluoresenssimikroskoopilla. Asteikko bar = 15 pm.

Image-Based cytometry käytettiin määrällisesti apoptoottinen induktion (% anneksiini V positiivinen), jota seurasi kuolion (% PI positiivinen) in E6-1 ja HT-29-solujen seuraavat PLX hoitoon. Puute anneksiini V tai PI-värjäys käytettiin osoituksena elävien solujen käsittelyn jälkeen (% anneksiini V /PI-negatiivisia soluja) (* P 0,05, ** P 0,003, *** P 0,0001). (E) edelleen varmistamiseksi apoptoosin induktion.

DNA: n fragmentoituminen on keskeinen biokemiallinen ominaisuus apoptoosin. Edelleen vahvistaa tämän apoptoosi TUNEL merkintöjä havaitsemiseksi DNA pirstoutumista käytettiin. Kvantifiointi tulokset kuva-sytometrialla tehon osoittamiseksi PLX apoptoosin, seuraavat DNA-fragmentaation HT-29 paksusuolisyöpäsoluja ajasta riippuvalla tavalla. VP16, tunnettu kemoterapeuttisen aineen kanssa, DNA: ta vaurioittavat ominaisuudet, käytettiin positiivisena kontrollina (kuvio 4).

TUNEL merkintöjä havaitsemiseen käytettiin DNA: n fragmentoituminen. Sen jälkeen PLX ja VP16 (positiivisena kontrollina DNA-vaurioita) käsittely, solut leimattiin DNA värjäys ratkaisu ja kvantifioidaan kuvapohjaisia ​​cytometry. Käsiteltyjä soluja kontrolliin verrattuna käsittelemättömien solujen näytteessä. (**** P 0,0001).

Lisäksi apoptoosin erilaisissa syöpäsoluissa, melanooma (G-361), munasarjojen ja paksusuolen syöpä (HT-29) solua, vahvistettiin anneksiini -V sitoutumismäärityksessä. Tämä apoptoosin induktio vahvistettiin olevan selektiivinen syöpäsoluja, kuten normaalit paksusuolen solut (NCM460) pysyi vaikuta PLX hoitoon. Tämä on esitetty ydin- tiivistyminen, solu- morfologia ja ulkoistamista fosfatidyyliseriinin ulomman seloste solukalvon, kuten Hoechst-värjäys, vaihekontrasti kuvia ja sitovat anneksiini V väriaineen (kuvio 5A ja B). Selektiivisyys PLX syöpäsoluja vahvistettiin edelleen WST-1 solujen elinkelpoisuuden määritys, joka osoitti, että PLX oli erittäin tehokas niin pienillä annoksilla, terapeuttinen ikkuna oli helposti havaittavissa (kuvio 5C). Treatment of HT-29 0,20 mg /ml vähensi tehokkaasti elinkelpoisuuden noin 90%, kun taas NCM460 solut pysyi 100% elinkelpoisuuden samalla annoksella. Tämä osoittaa, että PLX voivat olla tehokkaampia hyvin pienillä annoksilla, mikä vähentää mahdollisuuksia myrkyllisyyden hoitoon liittyvät.

jälkeen hoidon PLX solut (Munasarjojen, OVCAR-3, melanooma, G-361 ja Normal paksusuolen epiteeli-soluja (NCM460) värjättiin Hoechst karakterisoimaan ydin- morfologia ja anneksiini-V tunnistaa apoptoottiset solut (A) ja solun morfologiassa faasikontrastimikroskopiassa (B); kuvat otettiin 400 x suurennus fluoresenssimikroskoopilla. Mittakaava = 15 pm. (C) jälkeen PLX hoitoon, HT-29-peräsuolen syövän solut ja ei-syöpä NCM460 soluja inkuboitiin WST-1 solujen elinkelpoisuus väriaine 4 tuntia, ja absorbanssi luettiin 450 nm: ssä ja ilmaistuna prosenttia ohjaus . Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD 3 itsenäisen kokeen. ** P 0,0001.

PLX indusoi kaspaasi-Independent Apoptosis in Human Cancer Cells

Kaspaasit ovat kysteiini asparagiiniproteaasien, että ratkaisevassa roolissa kuin kuolema proteaaseja [17]. heidän rooleja eri solukuoleman prosesseja edelleen kiistanalainen, koska niiden aktivointi tai esto voisi olla olennaista etenemistä estämällä solukuolemareittejä [18], [19]. Roolin arvioimiseksi kaspaasien tutkimuksessamme, hoidon jälkeen 0,10 mg /ml PLX, milloin ilmoitettuina ajankohtina, BxPc-3-solut kerättiin, pestiin ja niitä inkuboitiin lyysipuskurilla saada solulysaattiin. Solulysaatti inkuboitiin kaspaasi substraattien, kunkin kaspaasi (3, 8 ja 9), ja inkuboitiin tunnin ajan. Fluoresenssilukemat saatiin käyttäen spektrofluorometrillä. Tuloksemme osoittavat, että PLX pystyy aktivoimaan molemmat reitit (ulkoisten ja sisäisten apoptoosin) on aikariippuvainen tavalla. Tämä havaittiin nopea kaspaasien aktivaatio-3, 8 ja 9 havaittiin niinkin aikaisin kuin tunnin käsittelyn jälkeen (kuvio 6A).

hoidon jälkeen 0,10 mg /ml PLX, milloin ilmoitettuina ajankohtina, BxPc -3 solut kerättiin, pestiin ja niitä inkuboitiin lyysipuskurilla saada solulysaattiin.