Krooninen sairaus

tiivistelmä

NQO1 on syntymässä ja lupaava terapeuttinen kohde syövän hoidossa . Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli määrittää, onko anti-kasvain vaikutus tanshinone IIA (TSA) on NQO1 riippuvainen ja valottaa taustalla apoptoottisen solukuoleman polkuja. NQO1

+ A549-soluja ja isogenically täsmäsi NQO1 transfektoitu ja negatiivinen H596-soluja käytettiin testaamaan ominaisuudet ja mekanismit TSA solukuolema. In vivo antituumoriteholla ja kudosjakauma ominaisuuksia TSA testattiin kasvaimen ksenosiirrettyjä nude-hiirissä. Havaitsimme, että TSA indusoi liiallista sukupolven ROS, DNA-vaurioita, ja dramaattinen apoptoottisen solukuoleman NQO1

+ A549-soluja ja H596-NQO1 soluja, mutta ei NQO1

– H596-soluissa. Estoa tai hiljaisuus NQO1 sekä antioksidanttina NAC selvästi päinvastainen TSA aiheuttama apoptoottisia vaikutuksia. TSA hoito hidasti merkittävästi kasvaimen kasvua A549 ksenograftien, joka merkittävästi antagonisoi dikumarolityyppisten co-hoidon kasvusta huolimatta ja pitkäaikainen TSA kertymistä kasvainkudoksissa. TSA aktivoituu ROS laukeaa, p53 riippumaton ja kaspaasi riippuvainen mitokondrioita apoptoottisen solukuoleman polku, joka on tunnettu siitä, lisääntynyt suhde Bax ja Bcl-xl, mitokondrion kalvon mahdollinen häiriö, sytokromi c: n vapautumisen, ja sen jälkeen kaspaasi aktivointi ja PARP-1 pilkkominen. Tulokset näistä havainnot viittaavat siihen, että TSA on erittäin spesifinen NQO1 kohde ainetta ja on lupaava kehittää tehokas lääke terapiassa NQO1 positiivisia NSCLC.

Citation: Liu F, Yu G, Wang G, Liu H, Wu X, Wang Q, et ai. (2012) Lentotoiminnan NQO1 käynnistämä ja p53-riippumattoman Apoptotic Pathway Määrittää antituumorivaikutus of tanshinone IIA vastaan ​​ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 7 (7): e42138. doi: 10,1371 /journal.pone.0042138

Editor: Siyaram Pandey, University of Windsor, Kanada

vastaanotettu: 16 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 02 heinäkuu 2012; Julkaistu: 27 heinäkuu 2012

Copyright: © Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus sai taloudellista tukea pohjaa tekijän National Erinomainen Väitöskirja of China (200979), Natural Science Foundation of Jiangsun maakunnassa (BK2011065), Science Foundation for Youth Scholars opetusministeriön of China (200803161012), Program for New Century erinomainen Talents in University (NCET-09-0770), ja National Natural Science Foundation Kiinan (nro. 91029746, 30801422). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kattaa noin 80~85% kaikista keuhkosyöpää, ja on yleisin kuolinsyy miehillä ja toiseksi naisten rintasyövän [1]. Yhdistelmä kemoterapia, yleensä platina-pohjainen, on tällä hetkellä ensivaiheen hoidon valinta NSCLCs. Kuitenkin ennuste potilaille, joilla on edennyt NSCLC edelleen heikko mediaani elinaika 8 to11 kuukautta ja 1 vuoden eloonjäämisaste 30% [2], [3]. Pitkän aikavälin selviytyminen (5 vuoden) oli jopa huono noin 15% [4]. Viimeaikainen kehitys eri molekyylitasolla huumausaineiden ja niiden yhdistäminen kemoterapiaa huumeita parantaa tulos NSCLC hoito; jää kuitenkin pettymys terapiassa kehittyneiden NSCLC. On selvää, että on kiireellinen tarve tunnistaa uusia terapeuttisia tavoitteita ja kehittää kasvaimen selektiivisen kemoterapeuttisten spesifisiä NSCLCs.

NAD (P) H: kinoni oksidoreduktaasi (NQO1, EY 1.6.99.2) on sytosolin flavoenzyme joka katalysoi pakollinen kahden elektronin pelkistys erilaisia ​​kinoni substraattien, käyttäen sekä NADH: n ja NADPH: ta elektronidonoreina [5]. Alunperin NQO1 oli laajalti uskotaan olevan vieroitus entsyymi otetaan huomioon sen kahden elektronin pelkistys ominaisuus, ohittaen yhden elektronin pelkistys tuottaa epävakaa ja erittäin reaktiivisia semikinonin [6], [7]. Viime aikoina on havaittu, että jotkut kinonit, kuten mitomysiini C, streptonigriinin, E09, ja RH1 [8], [9], [10], [11], [12] ovat bioactivated mukaan NQO1. Bioaktivaatiosta ominaisuus NQO1 lupaa siitä ihanteellisen tavoite kehittää anti-kasvain huumeet, koska erilaisissa ihmisen kasvaimissa [13] ovat koholla NQO1 toimintaa. Siinä tapauksessa, keuhkokasvaimet, NQO1 aktiivisuus lisääntyy jopa 80-kertaiseksi NSCLC kasvainten suhteessa normaaliin keuhkoissa ja 20~35-kertaisesti suhteessa SCLC-solulinjat [14]. Tällainen eriytetty ilmentymisen tila NQO1 välillä kasvainten ja normaaleissa kudoksissa viittaa siihen, että NQO1 tavoite lääkkeet olisivat erittäin selektiivisiä tappaa kasvainsoluja ja säästää samalla normaaleja kudoksia. RH1 on lääke-ehdokas bioactivated jonka NQO1 tuottamiseksi hydrokinonin aktivointi atsiridiinin renkaat ja sen jälkeen DNA: n alkylointia ja säikeiden- silloittumista. Tässä tapauksessa, NQO1 hyödynnetään kasvaimen selektiivisen entsyymin bioactivate aihiolääke ja siten toteuttaa kasvaimen spesifistä toksisuutta. Sen lisäksi omaisuutta oksidoreduktaasi, NQO1 on myös havaittu suoraan mukana vakauttamiseen elintärkeiden tuumorisuppressorien p53 /p73 /p33 [15], [16]. Lisäksi NQO1 polymorfismi, joka johtaa entsyymin toimettomuuden on havaittu olevan vahva prognostinen ja ennustava tekijä huono tulos rintasyövän [17]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että farmakologinen rooli NQO1 on kaukana sen entsyymiaktiivisuutta vähentämiseen kinonit. Kun yhdessä, se olisi erittäin kiinnostavaa määrittää terapeuttista potentiaalit ja taustalla mekanismeja NQO1 tavoite agentit kasvaimia. p-lapatsoni (Lap), hyvin tutkittu NQO1 alustaan, on todettu lupaavaksi aineena eri syövän hoidossa [18]. Kuitenkin toistuva suun hoito Lap indusoi anemian sekä rotilla että ihmisillä, jotka saattavat suuresti rajoittaa sen soveltamista [19], [20]. Toinen rajoitus Lap on sen NQO1 spesifinen aktiivisuus voivat toteutua vain suhteellisen kapealla pitoisuusalueella ja altistuksen aikaikkunassa [18]; on kyseenalaista, onko tällainen ehto voidaan hyvin hallinnassa in vivo valtioissa.

tanshinone IIA (TSA) oli johdannainen fenantreenin-kinoni eristetty Salvia miltiorrhiza (Danshen, kiinaksi), laajalti käytetty kasviperäisiä lääketiede. Vaikka sen perinteistä käyttöä lähinnä keskittynyt sydän- ja aivoverenkierron sairauksista [21], [22], [23], [24] antituumorivaikutuksen TSA ja muiden rakenteeltaan samanlaisia ​​tanshinones vahvistettiin viime vuosikymmeninä [25], [ ,,,0],26], [27]. Useat tutkimukset osoittivat, että TSA aiheutti sytotoksinen vaikutus erilaisten ihmisten kasvainten solulinjoissa [28]. Huolimatta aiempaa yritystä paljastamatta sen mekanismeja [29], [30], molekyylikohteena TSA tuomaan esiin sen anti-kasvain vaikutus jää hämäräksi. Olemme äskettäin havainneet, että NQO1 katalysoitu kinoni vähennys välittömästi seuraa glukuronidaatio on vallitseva metaboliareitti TSA sekä rotilla [31] ja ihmisissä [32]. NQO1 vähentää TSA muodostaen erittäin epävakaa katekoli väli mikä auto-hapettuu takaisin vanhemman TSA ja muodostaa turha redoksijaksossa tuottaa oksidatiivisen stressin [31]. Nämä havainnot sai meidät oletuksen, että NQO1 voi olla ensisijainen solunsisäinen tavoite TSA syöpäsoluissa.

Esillä oleva tutkimus tarkoituksena on määrittää, onko NQO1 on keskeinen rooli aloittamista kasvaimen vastaisen vaikutuksen TSA sekä in vitro ja in vivo. Isogenically Hyväksytty NQO1

+ ja NQO1

– ihmisen H596 ja NQO1 korkea ilmentyminen ihmisen A549 NSCLC solulinjoja käytettiin määrittämään NQO1 riippuva sytotoksisuus, apoptoottiset vaikutus, ROS tuotanto, DNA-vaurioita, ja soluunottoa TSA. Osoitamme, että TSA on lupaava NQO1 erityinen tavoite ainetta, joka indusoi apoptoottista solukuolemaa NSCLC-solujen kautta, on ainutlaatuinen NQO1 käynnistämä ja ROS-aktivaatioon p53-riippumatonta, mutta kaspaasiriippuvaisen mitokondrioiden apoptoottisen reitin.

tulokset

TSA indusoima sytotoksisuus on NQO1 riippuvainen ja p53-riippumattoman

roolin määrittämiseksi NQO1, TSA sytotoksisuuden määritykset suoritettiin NQO1 korkean ilmentymisen A549-soluja, NQO1 negatiivinen ja transfektoitiin H596-solut; NQO1 proteiinin tasot ja entsyymin toimintaa NSCLC-solut on esitetty kuviossa. 1A. Proteiinin ilmentymisen ja entsyymin aktiivisuus NQO1 ei voitu havaita H596-soluissa; NQO1 entsyymiaktiivisuus H596-NQO1 soluissa on paljon alhaisempi kuin A549-soluja, jotka on yhdenmukaista aikaisempien havaintojen [18]. TSA aiheuttama pitoisuusriippuvaisella sytotoksisuuden A549-soluja, joiden IC50-arvo 5,32 uM. Sen sijaan NQO1 negatiivinen H596-soluja pitkälti vastustuskykyisiä TSA sytotoksisuuden IC50 40 uM (Fig. 1 B). NQO1 esto Erityiseen NQO1 estäjä dikumarolityyppisten (DIC, 10 uM) voitaisiin pitkälti estää TSA sytotoksisuuden A549-soluja; NQO1 siRNA Knockdown voisi myös kumota sytotoksisen vaikutuksen TSA, joskin vähemmässä määrin, että DIC (Fig. 1 C, D). Transfektio NQO1 ja H596 soluihin palautettu sen alttius TSA aiheuttamaa sytotoksisuutta. IC 50 TSA H596-NQO1 ja H596-vektori solulinjoissa on 23,56 uM ja 80 uM (kuvio. 1 E). Huomattavaa on, että IC 50-arvot A549-solut olivat huomattavasti alhaisemmat kuin H596-NQO1 soluja, jotka on yhteisymmärryksessä ero entsyymin toimintaa näiden kahden solulinjoista. Kaikki nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että TSA aiheuttama sytotoksisuus on NQO1 riippuvainen. Lisäksi näyttää siltä, ​​että TSA näytti paremmin NQO1 kohdespesifisyys kuin Lap; IC 50-arvo eroa A549-soluja ja H596 solujen TSA (5,32 uM VS 40 uM) on huomattavasti korkeampi kuin Lap (1,94 uM VS 3,93 uM). Lisäksi esikäsittely tyypillinen p53-estäjän pifithrin-α (PFT-α) [33] ja p53 hiljaisuus siRNA oli vähäinen vaikutus TSA aiheuttamaa sytotoksisuutta (Fig. 1 F), mikä viittaa siihen, TSA aiheuttama sytotoksisuuden on p53-riippumattomalla tavalla.

A, proteiini tasoja ja entsyymin toimintaa NQO1 in NSCLC soluissa. NQO1 toimintaa 1,0 nmol⋅min

-1⋅μg

-1 oli merkitty ei-havaittavissa (ND). B, sytotoksisuus TSA ja Lap NSCLC soluissa; solut altistettiin kaltevuus pitoisuuksia TSA (0,4-40 uM) tai kierros (0,5-10 uM) 72 tuntia. C, vaikutukset NAC tai DIC esikäsittelyn; A549-soluja esikäsiteltiin 5 mM NAC: 1 h tai 10 uM DIC 30 min. D, vaikutukset NQO1 hiljaisuuden A549-soluja. E, TSA sytotoksisuutta H596 ja NQO1-transfektoitujen H596-soluissa. F, vaikutus P53 eston tai hiljaisuus; A549-soluja esikäsiteltiin 10 uM PFT-α 5 h tai esikäsitelty P53 siRNA. Data näytetään keskimääräisenä ± SE kolmen itsenäisen kokeen.

TSA aiheuttaa NQO1 riippuvainen ja p53-riippumattoman apoptoottisen solukuoleman

TUNEL-kokeet suoritettiin sen varmistamiseksi, että TSA solukuolema on koska induktion NQO1 riippuvaista apoptoosia. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, TSA aiheuttama pitoisuusriippuvaisella apoptoosin ja TUNEL positiivisissa soluissa saavutti yli 80%, kun 40 uM TSA hoidon A549-soluja, kun taas TUNEL positiivisten solujen havaita H596 soluista kun TSA hoito ei ole mitään eroa verrokkihoito. Lisäksi sekä DIC ja NQO1 siRNA voisi merkittävästi kääntää TSA indusoi apoptoosia A549-solut (Fig. 2A, B). Samoin transfektio NQO1 ja H596-soluissa merkittävästi palautettu sen alttius TSA aiheuttaman apoptoosin, tunnettu kanssa 38.02% vs. 7,28% TUNEL positiivisten solujen H596-NQO1 solujen ja H596-vektorin soluihin (Fig. 2C), tässä järjestyksessä. Tulokset TUNEL määritykset ovat täysin yhtäpitäviä MTT perustuu sytotoksisuus tutkimukset, mikä viittaa vahvasti siihen, että TSA indusoi NQO1 riippuvainen apoptoottisen solukuoleman NSCLC. Yhdenmukainen MTT seurauksena TUNEL määritys osoitti myös, että p53-estäjän PFT-α ja P53 siRNA oli merkityksetön vaikutus TSA aiheuttaman apoptoosin, mikä osoittaa p53 itsenäinen indusoiman apoptoosin TSA.

, ylempi, A549-soluja ja H596-soluja altistettiin pitoisuus TSA: ssa 48 tuntia; alempi, A549-soluja esikäsiteltiin 10 uM DIC 30 min, 5 mM NAC: 1 h tai 10 uM PFT-α: ssa 5 h, ja sitten altistettiin 40 uM TSA: ssa 48 tuntia. B, vaikutukset NQO1 tai p53 hiljaisuus TSA aiheutti apoptoosia A549-soluja. C, H596-vektori ja H596-NQO1 solut altistettiin TSA: ssa 48 tuntia; TUNEL määritys suoritettiin käyttäen napsauttamalla-IT TUNEL Alexa Fluor 594 Imaging Assay Kit. Kahdeksasta kymmeneen kenttiä tutkittiin kussakin kokeessa, TUNEL signaali näkyy punaisena ja Hoechst 33342 tumaväriä näkyy sinisenä. Oikea ovat edustavat kuvat TUNEL värjäystä. Kaikki tiedot näytetään keskimääräisenä ± SE kolmen erillisen kokeen (# P 0,05, ## P 0,01, ### P 0,001, NAC, DIC esikäsittely verrattuna TSA hoito yksinään, NQO1 siRNA esikäsittely verrattuna ohjaus siRNA esikäsittelyä, H596-NQO1 soluissa verrattuna H596-vektori soluihin; ** P 0,01, *** P 0,001, TSA kohtelu suhteessa kontrollisoluihin).

TSA indusoi NQO1 riippuvainen DNA-vaurioita

Koska DNA-vaurioita on keskeinen aloitteentekijä on indusoimaan apoptoottisen solukuoleman [34], etsimme onko TSA hoito indusoi NQO1 riippuvaa DNA-vaurioita ja taukoja. Kuten odotettua, TSA indusoi dramaattisen ja konsentraatiosta riippuvainen DNA-vaurioita A549 ja H596-NQO1 soluissa, mutta minimaalinen NQO1 negatiivinen H596 ja DIC tai siRNA esikäsitellyt A549-solut (Fig. 3A, B ja C). H

2O

2 (200 uM) käsittely 4 h indusoi lähes identtiset DNA-vaurioita kaikissa solulinjoissa. Aika kurssi tiedot osoittivat, että TSA aiheuttama NQO1-dependnet DNA-vaurioita saavuttanut suurimman jälkeen 24 h hoidon mutta laski hieman 48 tunnin kuluttua, mahdollisesti koska liiallinen solukuoleman (Fig. 3A). Lisäksi todettiin, että TSA 40 uM aiheuttamaa melko samanlainen määrä DNA-vaurioita A549-soluja ja H596-NQO1 solujen huolimatta eri NQO1 entsyymiaktiivisuuden välillä A549-soluja ja H596-NQO1 soluissa. Ehdotimme, että se on mahdollisesti, että TSA 40 uM voi aiheuttama enintään DNA-vaurioita sekä A549 ja H596-NQO1 soluja ja siten mitään eroa ei havaittu. Kuitenkin, A549-solut ovat todellakin olla paljon herkempi kuin H596-NQO1 solujen TSA indusoiman DNA: n vaurioiden pienempinä annoksina haaste (Fig. 3B, C).

DNA vaurioita määritettiin alkalisen komeetta määrityksissä. A TSA aiheuttama DNA-vaurioita A549 ja H596-soluissa, samoin kuin vaikutus NAC tai DIC esikäsittelyn. B, vaikutus NQO1 hiljaisuuden TSA aiheuttama DNA-vaurioita A549-soluja. C, DNA-vaurioita H596-NQO1 ja H596-vektori soluihin. Vasen paneeli, edustaja morfologinen ulkonäkö solujen TSA hoitoa 24 tuntia; oikea paneeli, kvantitatiivisia tuloksia ilmaistaan ​​kertainen muutos (T /C) komeetan hännän pituudet tai ilmaistuna komeetan hännän pituudet (mielivaltainen yksikkö). Data näytetään keskimääräisenä ± SE vähintään kolmen itsenäisen kokeen. (# P 0,05, ## P 0,01 NQO1 hiljaisuus vs. kontrolli siRNA tai H596-NQO1 vs. H596-vektori; * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, TSA tai H

2O

2 hoitoa kuin verrokkiryhmän solut).

ROS tuotetun NQO1 bioaktivaatiosta on tärkeä välittäjä TSA indusoi apoptoottista solukuolemaa

Olemme havainneet, että TSA vähennettiin by NQO1 tuottaa erittäin epävakaa katekoli väli, joka voitaisiin joko konjugoitunut glukuronihapon läsnäollessa UDP-glukuronihappoa transferaasit (UGT) tai automaattinen hapettuu takaisin TSA ilman niitä [31]. Koska puute UGT havaittiin NSCLC soluissa, on kohtuullista olettaa, että TSA voi laukaista turha redoksijaksossa liiallisessa ROS NQO1 positiivisissa soluissa. Tämän tukemiseksi seikka, DCF värjäys ja glutationin pyöräily määritys sovellettiin seurantaan TSA aiheuttamaa ROS muodostumista. Ajankulku DCF värjäys tiedot osoittivat, että TSA (10 uM) indusoi liiallista ROS muodostumista 30 minuutin kuluessa ja saavuttaa huippunsa 60 min A549-soluja, mutta ei H596 ja DIC esikäsiteltiin A549-solut (Fig. 4A). NQO1 hiljaisuus estää suureksi osaksi TSA aiheuttamaa ROS muodostuminen A549-solut (Fig. 4C). Johdonmukaisesti, transfektio NQO1 ja H596 soluihin palautettu valmiutta TSA aiheuttama tuotannon ROS päässä substraattikierto (Fig. 4D). Saadut tulokset glutationi pyöräily määrityksessä (kuvio. 4E, F) tukee lisäksi, että TSA aiheuttamaa ROS tuotanto käytettäessä NQO1 riippuvaisella tavalla. Sen sijaan, H

2O

2 indusoi lähes identtiset ROS kaikissa tapauksissa, riippumatta NQO1 ilmaisun.

Solunsisäinen ROS: n syntyminen mitattiin DCF värjäys. A, aikaa tietenkin tutkimuksessa soluja käsiteltiin 10 uM TSA kanssa tai ilman esikäsittelyä 10 uM DIC tai 5 mM NAC; B-solut altistettiin osoitettuun annoksia TSA: ssa 1 tunti; C, vaikutus NQO1 hiljaisuuden TSA laukaisi ROS muodostumista; solut altistettiin 4 uM tai 40 uM TSA: ssa 1 tunti; D, H595-NQO1 solujen ja H596-vektori solut altistettiin 10 uM tai 40 uM TSA 1 h. H

2O

2 (400 uM) käytettiin positiivisena kontrollina. E ja F, Glutathione pyöräily määritykset; E, NSCLC solut altistettiin osoitettuun annoksia TSA tai ilman DIC esikäsittelyn 24 tuntia. F, H596-vektori ja H596-NQO1 solut altistettiin TSA: ssa 24 tuntia. Data näytetään suhteessa muutoksia tyhjiä valvontaa ja esitetään keskiarvo ± SE vähintään kolmen itsenäisen kokeen. (# P 0,05, ## P 0,01, ### P 0,001 NQO1 siRNA vs. kontrolli siRNA, H596-NQO1 vs. H596-vektori, A549 kanssa DIC vs. TSA yksin; * P 0,05, ** P 0,001, TSA tai H

2O

2 hoitoa vs. valvontaluetteloihinsa soluja).

Koska että NQO1 laukeaa ROS tuotanto on hyvin varhaisessa ja jatkuva tapahtuma, on tärkeää määrittää, ROS tuotetun TSA kinoni ja katekoli kierrätys on keskeinen toimija TSA indusoi apoptoottisen solukuoleman. Esikäsittely A549-solujen kanssa 5 mM N-asetyylikysteiini (NAC), joka on tyypillinen ROS scavenger, oli riittävä poistamaan TSA indusoiman solunsisäisen ROS (Fig. 4A). NAC esikäsittely voisi merkittävästi estää TSA aiheuttama sytotoksisuuden (Fig. 1 C), apoptoosin (Fig. 2A), ja DNA-vaurioita (Fig. 3A). Lisäksi kaikissa testi näkökohdat peruutusnopeuden vaikutukset NAC esikäsittelyn ovat melkein verrattavissa saavuttaa DIC esikäsittelyn. Kaikki tulokset osoittivat, että ROS tuotetun NQO1 katalysoivat kierrätysprosessi on tärkeä sovittelijana indusoimaan apoptoottisen solukuoleman NSCLC-solujen.

TSA aiheutti NQO1 ja ROS-välitteisen p53 riippumaton aktivaatio mitokondrioiden reitin

Kuten kuviossa. 5, TSA aiheutti annoksesta riippuvan häiriöitä MMP, joka on sopusoinnussa aiemman tutkimuksen Chiu et al [35], jossa TSA havaittiin indusoivan ROS-välitteisen mitokondrion apoptoottisen solukuoleman. Koska huomasimme, tässä, että TSA indusoi apoptoottista solukuolemaa oli NQO1 riippuvainen, me siis pyrittiin määrittämään roolia NQO1 aktivoinnissa mitokondrion apoptoottisen solukuoleman kautta. NQO1 estäjä DIC, NQO1 siRNA sekä NAC esikäsittelyyn voisi merkittävästi kääntää TSA indusoi MMP häiriö, joka osoittaa NQO1 riippuvainen ja ROS-välitteisen mitokondrioiden häiriöitä aiheuttama TSA. P53 siRNA ei ollut vaikutusta TSA indusoi häiriöitä MMP, viittaa p53-riippumaton mekanismi.

A549-solut altistettiin TSA gradientin pitoisuuksina (4, 10, ja 40 uM) yksin tai esikäsitelty DIC, NAC tai alistetaan NQO1 ja p53 hiljaisuus, ennen hoitoa 40 uM TSA. Solut, joita käsiteltiin kuten 24 h kuormitettiin 3 uM JC-1 15 min ajan 37 ° C: ssa, sitten pehmeästi pestiin PBS: llä kaksi kertaa. Sytosoliin, monomeerinen muoto tämän väriaineen fluoresoi vihreänä ja sisällä mitokondrioiden matriisissa, erittäin keskittynyt JC-1 muotojen aggregaatit fluoresoivat punaista. A, edustaja valokuvat ottanut Leica BMI3000 B mikroskoopilla -konfokaalimikroskoopilla sovellus. B, fluoresenssi luettiin 488 nm: n virityksellä ja 530 nm: n emissio vihreän, ja 540 nm: n virityksellä ja 590 nm: n emissio punaiselle käyttäen Synergy-H1 fluorimetriä (Bio-Tek Instruments) ja muutokset mitokondrion potentiaali laskettiin kuin punainen /vihreä suhde kutakin kunnossa. (## P 0,01, ### P 0,001, DIC, NAC esikäsittely verrattuna TSA hoito yksinään tai NQO1 siRNA esikäsittely verrattuna ohjaus siRNA esikäsitellyt solut; ** P 0,01, *** P 0,001, TSA hoitoa verrattuna jossa kontrolli solut).

TSA indusoi kerrallaan ja pitoisuudesta riippuvaista säätelyä proapoptootti- Bax ja downregulation pro-eloonjäämisen Bcl-xl käytettäessä NQO1 ja ROS riippuvainen mutta p53 riippumattomasti (Fig. S1, Fig. 6A). Tämä johti dramaattiseen kasvanut suhde Bax /Bcl-xl, joka on tunnettu tärkeä tekijä säätelevät apoptoosia kautta häiriöitä mitokondrioiden [36]. Mitokondriot häiriöt sitten johtaa vapautumisen sytokromi c: mitokondrioista, on osoituksena siitä sytosolin lisäys, mutta mitokondrioiden lasku sytokromi c (Fig. 6B).

A549-solut altistettiin TSA gradientin pitoisuuksina (4, 10 , ja 40 uM) yksin tai esikäsitelty DIC, NAC, tai altistetaan NQO1 ja p53 hiljaisuus, ennen hoitoa 40 uM TSA 48 tuntia. A, kokosolulysaateille valmistettiin sen jälkeen, kun osoitetun hoidon ja western blot-analyysi suoritettiin käyttäen anti Bax, -Bcl-xl, -PARP, -cleaved PARP, -NQO1, -p53, ja -GAPDH vasta-aineita. B, Sytosoliset ja mitokondrioiden proteiinit valmistettiin Western blot -analyysillä käyttämällä anti-sytokromi c: vasta-aine; vaihtelut Proteiinilisäyksen näytteiden välillä seurattiin GAPDH tai COX-IV tasot, tässä järjestyksessä. Suhteellinen tiheys arvo kunkin kaistan alla näkyy Western blot. Tiedot edustavat Tyypillisessä kokeessa, joka suoritettiin kolme kertaa (keskiarvot, P 0,05).

n vapautumisen analysoitiin sitten aktiivisuus määritys käyttämällä substraatteja aktiivisten pilkkoa kaspaasin ja western blot analyysi PARP katkaisun (Fig. 6A, ja Fig. 7A, B). TSA annosriippuvaisesti lisäsi toiminnan kaspaasi-3, -9, ja -8. Pitoisuus riippuvainen induktio PARP pilkkominen edelleen tuettava kaspaasi-3 aktivaation. Yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä, z-VAD-fmk pitkälti heikennettyjä TSA indusoi apoptoosin (Fig. 7C). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että TSA indusoi apoptoottista solukuolemaa on kaspaasivälitteinen. Yhdenmukaisia ​​muiden näkökohtien testattu Tutkimuksessamme TSA aiheuttama romahtaminen MMP, sytokromi c release, ja kaspaasin aktivaatio olivat kaikki NQO1 ja ROS riippuvainen mutta p53 riippumaton.

A ja B, kaspaasiaktiivisuus testi; A549-solut altistettiin TSA gradienttipyörrevirtojen pitoisuuksina (4, 10, ja 40 uM) yksin tai esikäsitelty DIC, NAC, tai altistetaan NQO1 ja p53 hiljaisuus, ennen hoitoa 40 uM TSA 48 tuntia. C, TUNEL määritys TSA aiheuttaman apoptoosin tai ilman esikäsittelyä yleiseurooppalaisten kaspaasiestäjä z-VAD-fmk. Data näytetään keskimääräisenä ± SE vähintään kolmen itsenäisen kokeen. (## P 0,01, ### P 0,001, DIC, NAC tai z-VAD-fmk esikäsittely verrattuna TSA hoito yksinään, NQO1 siRNA esikäsittely verrattuna ohjaus siRNA esikäsitellyt solut; * P 0,05, ** P 0,01 , *** P 0,001, TSA hoito verrattuna sokeakoekuoppaa solut).

antituumorivaikutus TSA in vivo on NQO1 riippuva

vahvista roolin NQO1, The antituumorivaikutuksen tehosta TSA edelleen tutkittiin A549 tuumoriksenografteja TSA hoito yksinään tai yhdessä DIC (Fig. 8A). TSA (20 mg /kg), hoito voisi merkittävästi tukahduttaa kasvaimen kasvua; 20 päivän kuluttua hoidon, kasvainten tilavuuden TSA hoidetussa ryhmässä oli 279 ± 46 mm

3 (P 0,01 verrattuna kontrolliryhmään 552 ± 90 mm

3). DIC hoito yksinään myös hieman esti kasvaimen kasvua ominaista kanssa kasvaimen 439 ± 99 mm

3; päinvastoin, DIC esikäsittely antagonisoi merkittävällä kasvaimen suppression vaikutusta TSA, mikä viittaa siihen, että tuumorin vastaista vaikutusta TSA in vivo oli myös NQO1 riippuvainen. Histologiset tutkimukset osoittivat suuria tuumorinekroosi ja apoptoosin esiintynyt TSA hoidetussa ryhmässä hiirten, ja huomata, ei toksisuutta normaaleissa elinkudokset havaittiin upon TSA hoitoa 20 päivän (Fig. 8B).

, ylempi, kasvaimen tilavuus mittaus (P 0,01, TSA vs. kontrolli; P 0,05, TSA vs. TSA + DIC); alempi, kasvaimen paino (# P 0,05, TSA vs. TSA + DIC, *** P 0,001, TSA vs. kontrolli); Tiedot esitetään keskiarvona ± SE ja kuusi hiirtä. B, histologiset tarkastukset; kasvain ja kudosleikkeiden analysoitiin hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäys histologista piirteitä. C, biologista jakautumista TSA A549 kasvain lastataan nude-hiirissä; Tiedot esitetään keskiarvona ± SE 6-hiirissä.

arvioimiseksi kerääntymiseen kasvaimeen tasot TSA jakautumista kudoksiin Tutkimus suoritettiin hiirillä, joilla on A549 kasvainksenografteja (Fig. 8C). Yhdenmukainen aiempien tutkimus TSA jakaumien rotilla [37], TSA joka valmistettiin kiinteä dispersio, jossa PEG6000 etupäässä jakautuu retikuloendoteliaalisen järjestelmiin. Tästä rajoituksesta huolimatta, TSA voi silti tehokkaasti jakaudu kasvainkudoksessa; TSA osoitti korkeampia keskittymisen tasoja ja pitkäaikainen altistuminen kertaa kasvaimia kuin plasmassa. DIC esikäsittelyn huolimatta antagonisoi tuumorisuppressiogeeneksi vaikutuksen TSA, lisäsi merkitsevästi altistumistasoja TSA mukaan lukien kasvaimen kudokset, mekanismilla estämään TSA aineenvaihdunnan kautta NQO1 /UGT [31]. Parantaminen TSA toimitus, joka voi paeta retikuloendoteliaalijärjestelmä oton voisi odottaa edelleen kasvattaa kasvain keskittymisen tasoja ja siten paremmin antituumoriteholla.

Keskustelu

Kertyvät näyttöä siitä, että NQO1 on lupaava terapeuttinen kohdistaa eri kasvaimia, erityisesti NSCLC, jossa NQO1 on yli-ilmentynyt tavanomaiseen verrattuna keuhkokudoksessa [14]. Siitä huolimatta tällä hetkellä ei ole erityistä NQO1 tavoitetta käytettävät lääkkeet klinikan ja näin ollen sen terapeuttinen arvo edelleen tutkimatta. Vaikka jotkut anti-kasvain lääkkeet, kuten mitomysiini voidaan bioactivated mukaan NQO1, ne kaikki ole riittävästi selektiivisyys ja spesifisyys NQO1 ja niiden anti-kasvain vaikutukset paremmin selittää muilla mekanismeilla [38], [39]. Todisteet kerätään tutkimuksista Lap osoittaa, että NQO1 aktivoitu turha redoksijaksossa voi aiheuttaa ainutlaatuinen solukuolemareittiin, inspiroivia uusia ajatusta kehittää NQO1 kohde anti-kasvain huumeita. Tutkimuksessa rakennetaan tunnistaa tiettyä NQO1 alustan TSA, joka indusoi ainutlaatuinen p53 riippumaton aktivaatio mitokondrioiden apoptoottisen reitin päälle NQO1 bioaktivaatiosta.

hypoteesi NQO1 kuin solunsisäisen tavoite TSA perustui aikaisempia havaintoja, NQO1 on nopeutta ohjataan entsyymi määrittämiseen TSA aineenvaihdunnassa [31], [32]. Voit tarkistaa sen, tutkimme roolia NQO1 määritettäessä syöpälääkkeen vaikutuksia TSA vastaan ​​NSCLC. Kaikilla testatuilla osa, TSA näytteillä käytettäessä NQO1 riippuvainen tavalla aiheuttaen sytotoksisuutta, apoptoosin, ROS tuotanto, ja DNA-vaurioita; kaikki nämä tapahtumat voitiin havaita vain NQO1 positiivinen solulinjat A549 ja H596-NQO1. Johdonmukaisesti, hiljaisuus NQO1 erityisillä estäjä DIC ja siRNA voitaisiin suurelta kumoaisi kaikki nämä tapahtumat A549-soluja. Vielä tärkeämpää on, NQO1 riippuvaisen syövän vastaisen vaikutuksen TSA edelleen vahvistettu A549 tuumoriksenograftien. TSA (20 mg /kg) käsittely merkitsevästi hidasti kasvaimen kasvua, kun taas samanaikainen antaminen DIC voisi pitkälti kumota tämän vaikutuksen. Se oli erittäin mielenkiintoista huomata, että DIC lisää merkittävästi kerääntymiseen kasvaimeen TSA samalla vähentää sen kasvaimen vastaisen tehon (Fig. 8). Tämä selittyy sillä, että TSA oli pääasiassa metaboloituu NQO1 ja UGT. Kuitenkin NQO1 oli vähän vaikutusta ottoa solun sisään TSA, mistä on osoituksena siitä havainnosta, että solujen keskittymistä TSA A549 ja H596 solulinjoissa oli lähes identtinen ja siRNA hiljaisuus NQO1 A549-soluissa oli vähän vaikutusta TSA sisäänoton (kuvio . S2). Tällainen farmakokineettisiä ja farmakodynaamisia paradoksi vahvasti siihen, että NQO1 välittämä bioaktivaatiosta on keskeinen määrittämisestä TSA: n anti-NSCLC tehoa.

suurta ominaisuudet NQO1 katalysoitu bioaktivaatiosta on tuottaa erittäin epävakaa katekoli väli Automaattisesti hapettaa sen vanhempi kinoni muodostaen turha redoksijaksossa joka tekee solut jatkuvaan ROS haasteisiin. Se on hiljattain raportoitu, että ROS valmistettu NQO1 välittämää redoksijaksossa pelataan ratkaiseva rooli Lap aiheuttamaa apoptoosia [40]. Näyttää siltä, ​​että ROS voi myös olla tärkeä rooli TSA solukuolema, koska NAC co-hoito voi pitkälti poistaa TSA aiheuttama DNA-vaurioita, apoptoosia, ja sytotoksisuuden NQO1 positiivisia soluja (kuvio. 1, 2, ja 3).

p53-tuumorisuppressorin on keskeinen säätelevä komponentti, joka tunnistaa eri ulkoisen ja sisäisen jännitykset ja aloittaa apoptoottisen solukuoleman [41]. Lisäksi p53-proteiini hajoamista säätelee negatiivisesti NQO1 kautta inhibition ubikitiinin riippumaton 20S proteosomin välittämän hajoamisen reitti [42]. Siksi on tärkeää määrittää roolin p53 apoptoottisen solukuoleman aiheuttama NQO1 substraatteja. Kaikki todisteet kerätään esillä Tutkimus osoitti, että TSA indusoi apoptoottista solukuolemaa on p53 riippumaton. Ensinnäkin, esikäsittely tyypillinen p53-estäjän ja p53 hiljaisuuden siRNA oli vähäinen vaikutus TSA indusoitua sytotoksisuutta, apoptoosin, ja kaikki testattiin tapahtumia mitokondrioiden apoptoottisten reittien A549-soluissa (kuvio. 1F, Fig. 2A, B, Fig. 5 , Fig. 6, Fig. 7). Toinen, TSA voivat aiheuttaa ilmeistä ja pitoisuudesta riippuva sytotoksisuus ja apoptoosin H596-NQO1 solut (Fig. 1 E, 2C), jossa p53 on tunnettu mutatoitavan [43]. Lopuksi, TSA käsittely A549-soluja aiheuttama pitoisuusriippuvaisella vaikutus vähenee p53-proteiinin sisällöstä, ja edun NQO1 estäjä DIC voi synergisesti TSA vähentämiseen p53 proteiinipitoisuus A549-soluja, mutta kääntää downregulation NQO1 proteiinipitoisuuden (Fig. S3 ). Vaikka yksityiskohtainen mekanismeista TSA vaikutuksesta alas säätelevä p53-proteiinin tasot lisätutkimusten, esillä olevat tulokset osoittavat, että tämä vaikutus voi johtua NQO1 säännelty ubikitiinistä riippumaton p53 heikkenemiseen, koska TSA hoito myös lyijyä ja alas-säätely NQO1 vuonna yhdensuuntainen muutos p53-proteiinin tasoa (Fig. S3). NQO1 voisi vakauttaa p53 estämällä ubikitiinistä riippumaton proteasomaalisten hajoaminen [15], [44]. Johdonmukaisesti, The NQO1 estäjä kuten DIC voisi edistää tätä hajoamisreitit ja siten häiritä p53 aloitetaan apoptoottista reitin [45]. Havaintomme että TSA synergizing kanssa DIC vähentämään p53-proteiinin tasoa säädetään selitystä miksi NQO1 alustoille indusoi apoptoottista solukuolemaa on p53 riippumaton. Se voi ehdottaa, että NQO1 alustoille, kuten tyypillinen NQO1 estäjät, voivat myös edistää ubikitiinistä riippumaton proteasomaalisten hajoaminen; yksityiskohtaiset mekanismit ovat parhaillaan tutkittavana laboratoriossamme.

Koska kaspaasi toimii keskeinen osa apoptoosin koneiden, me vieressä on pyrkinyt määrittämään rooliaan TSA indusoi apoptoottista solukuolemaa.