Krooninen sairaus

tiivistelmä

kasvu ja ohjausta monien aksonien kehittyvälle hermostolle vaatia Netrin aktivaatio Poistettu kolorektaalisyövässä ( DCC) ja muut vielä tuntematon signalointi vihjeitä. Commissural aksoniohjauksen viat ovat vakavia

DCC

mutanttihiirien kuin

Netrin-1

mutanttihiirien, jossa ehdotetaan DCC aktivoimalla signaalien lisäksi Netrin-1 ovat mukana asianmukainen Axon kasvuun. Kirjoittajat raportoivat, että vuorovaikutus näytöt solunulkoisen proteiinin mikrosiruja, jotka edustavat yli 1000 proteiineja yksilöidä Cerebellin 4 (CBLN4), jäsen C1q-tuumorinekroositekijän (TNF) perheeseen, ja Netrin-1 ekstrasellulaarisen DCC-sitoutumispartnereihin. Immunofluoresenssi ja radio-ligandin sitoutumisen tutkimukset osoittavat, että Netrin-1 kilpailee CBLN4 sitova päällekkäinen sivustolle kalvon-proksimaalisen fibronektiinialueet (FN) 4-6 DCC ja sitoutuu -5 kertaa suurempi affiniteetti. CBLN4 sitoutuu myös DCC homologi, Neogenin-1 (NEO1), mutta jolla on pienempi affiniteetti kuin DCC.

CBLN4

-null hiiret eivät osoittaneet vika commissural axons kehitysmaissa selkäytimen mutta ei näyttää ohimenevä lisääntyminen vaeltava aksonien hartiapunos, sopusoinnussa rooli aksoniohjauksen. Kaiken kaikkiaan tiedot jähmettyy CBLN4 bona fide DCC ligandin ja vahvistaa osallisuutensa aksoniohjauksen.

Citation: Haddick PCG, Tom I, Luis E, Quiñones G, Wranik BJ, Ramani SR, et al. (2014) määrittely Ligandin erityisyys Poistetaan kolorektaalisyövässä (DCC) Receptor. PLoS ONE 9 (1): e84823. doi: 10,1371 /journal.pone.0084823

Editor: Brian Key, School of Biomedical Sciences, University of Queensland, Australia

vastaanotettu: 09 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 20 marraskuu 2013; Julkaistu: 06 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Haddick et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kaikki rahoitus tähän tutkimukseen tarjosi Genentech, jäsen Roche ryhmään. Rahoittaja ei ole rooleja tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista, ja valmistelu käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: Kaikki kirjoittajat ovat tai ovat olleet palveluksessa Genentech /Roche ja voi omistaa yhtiön osakkeita. Kaikki rahoitusta tähän tutkimukseen tarjosi Genentech /Roche. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

laajentaminen aksonien kohti lopullista tavoitetta on tärkeä edellytys asianmukaisen kehittämisen hermosto. Axons kohtaavat ohjaavia merkkejä pitkin niiden kasvun reittejä, joista neljä suurta kanoninen signalointireitteihin: DCC-Unc5-Netrin-1, viiltämällä-Roundabout (Robo), semaforiini-Plexin-Neuropiliini, ja Efriini-Ef [1] – [3]. On kuitenkin olemassa kasvava arvostus että uusia molekyylit osallistuvat tähän prosessiin sekä [4], [5]. Jotta paremmin ymmärtää Axon kasvua ja ohjausta, on tärkeää määrittää ohjelmistoon proteiineja, jotka sitovat ja vuorovaikutuksessa näiden keskeisten signalointi komponentit.

Tässä keskitymme tunnistamaan vuorovaikutuksessa proteiineja DCC. DCC on 175-190 kDa: n jäsen, Ig-superperheen, joka koostuu yhdestä transmembraanidomeeni ja suuri solunulkoisen domeenin (ECD) sisältää neljä C2-, kuten Ig-domeenien ja kuusi FNIII domeenit [6] – [8]. DCC on viime aikoina raportoitu sitoutuvan erittyvän ligandin Draxin välittämisessä aksonaalisessa seuraus inhibition [9]. Kuitenkin, parhaiten tunnettu ligandi DCC on Netrin-1, joka on erittyvä proteiini, joka koostuu globulaaridomeenista VI, verkkotunnuksen V, jossa on kolme EGF toistuu, ja C-terminaalisen domeenin [10]. Vaikka täsmälliset sivuston Netrin-1 sitoutuminen DCC ei tiedetä, viides FNIII toistaa DCC tarvitaan [11], [12].

Drosophila

, mutantit, DCC homologi

frazzled

johtaa ankarampaa axon keskiviivan ohjausta vikoja kuin

netrinAB

mutantteja ja tämä on osittain pelastettiin

Commissureless

riippumaton netrin ja viittaavat lisäksi frazzled ligandia [13 ]. Samoin knock-out joko

DCC

tai

Netrin-1

hiirissä johtaa epäonnistumiseen commissural aksonien ylittämään selkäydin keskiviivan mutta vakavuus commissural Axon vikoja kehittyvässä selkäydin ovat suuremmat

DCC

knock-out hiirissä verrattuna

Netrin-1

mutanttihiirien [14], [15]. Vaikka ei ole nisäkäshomologi

Commissureless

nämä havainnot tukevat ehdotusta, että on olemassa muita ligandeja säännellä DCC aktiivisuutta selkärankaisissa.

Kirjoittajat raportoivat, käyttäen puolueeton laajamittainen proteiini- microarray-näyttö, joka lisäksi Netrin-1, CBLN4 on erittäin spesifinen ligandi DCC. Neljä jäsentä CBLN perheen, CBLN1-4, erittyy, glykosyloituja proteiineja, jotka sisältävät C-terminaali pallomainen C1q avaruusominaisuudet on C1 q-TNF-superperheen [16], ja ne ilmaistaan ​​kehittää ja aikuisen aivoissa [17] . CBLN1 ja CBLN2 ovat parhaiten ymmärretty CBLN perheenjäseniä ja on havaittu vakauttaa synapsien toimimalla trans-synaptic linkin sitova Beta-Neurexins rae neuronien ja delta 2 glutamaattireseptorien of Purkinjen solujen pikkuaivot [18] – [21]. Kuitenkin vähän tiedetään toiminnallisen roolin CBLN4 eikä obvert käyttäytymisen fenotyypin

CBLN4

knock-out hiiri [22]. Äskettäin riippumaton tutkimus havaitsi DCC kuin CBLN4 sitovan proteiinin avulla suppeampi ehdokas-pohjainen näyttö [22]. Olemme lisäksi tunnettu DCC-CBLN4 vuorovaikutusta ja tunnistaa ohimenevää vaeltava-Axon fenotyyppi hartiapunos että hiiren

CBLN4

knock-out.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

Genentech Institutional animal Care ja käyttö komitea hyväksyi kaikki eläinkokeet.

kloonaus ja Protein Expression

Ekspressiorakenteet luotiin standardi PCR-menetelmillä käyttämällä in-house kloonin kokoelma tai cDNA hankittiin Origene templaattina ja subkloonattiin pRK5-vektorista, joka sisältää sopivan N-terminaalin tai C-terminaalin epitooppimerkkiin. Mutants DCC mappauksella tutkimukset tehtiin käyttämällä Quick-Change II XL mutageneesillä (Stratagene). Kaikki rakenteet olivat sekvenssi varmistettiin ennen käyttöä. N-terminaalista flag-merkitty (MGGTAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKDYKDDDDKLE), täyspitkä ja deleetiorakenteita ihmisen DCC ovat seuraavat: Flag-DCC täyspitkän (H26-I1442); Flag-DCC Ig1-4 (H26-S425-BamH1-L1098-I1442); Flag-DCC FN1-6 (S426-I1442), lippu-DCC FN4-6 (E722-I1442). Proteiinin ilmentyminen konstrukteja tuotettu liukoinen (C-terminaalinen domeeni poistettu) [7] ihmisen Netrin-1 (G25-K453), jossa on N-terminaalinen gD-tag (MGGTAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLLE), ihmisen CBLN4 (M1-L201), jossa on C-terminaalinen fc tag ja solunulkoisen domeenin ihmisen DCC (M1-N1097), jossa on C-terminaalinen fc tag. Täydellinen aminohapposekvenssit on esitetty taulukossa S1.

Proteiinit ilmennettiin kiinalaisen hamsterin munasarjan (CHO) ja puhdistettiin kuten aiemmin on kuvattu [23]. Lyhyesti, proteiinit puhdistettiin ohimenevä transfektointiväliainetta erää adsorboimalla anti-Flag tai anti-gD-agaroosi-hartsia ja pakkaamalla hartsin sarakkeisiin standardi kromatografiaa. Fc-merkitty proteiinit puhdistettiin lastataan proteiini A-Sepharose (Amersham Biosciences) -pylvääseen. Kun oli pesty fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) lähtötasolle, proteiinit eluoitiin 0,1 M etikkahapolla, pH 3, ja neutraloitiin välittömästi 1,5 M Tris, pH 8,6. Toissijainen geelisuodatuskolonni suoritettavaksi viimeistelyvaiheina. Proteiini puhtaus arvioitiin SDS-PAGE värjättiin Coomassie Blue ja olivat 90%.

proteiinin mikrosirut

proteiinin mikrosiruja muodostettiin epoksisilaanill päällystetty objektilaseille (Schott), kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],24]. Kaksi erittyvä proteiini kirjastoja käytettiin. Kirjasto 1 käsitti 1334 puhdistettuja näytteitä, jotka edustavat 686 erittää tai solunulkoisten domeenien yhden transmembraaniproteiineja [25]. Toinen erittyvä proteiini kirjasto, kirjasto 2, koostui 624 näytettä, jotka edustavat 562 geenit (92 geenit olivat läsnä molemmissa kirjastoissa) (taulukko S2). Tiedot seulontamenetelmiä on kuvattu aiemmin [24]. Lyhyesti, moniarvoisia proteiini-A-mikrohelmiä (Miltenyi Biotech) valmistettiin suhteessa 1:01 sekoitus DCC-Fc ja Cy5-leimattua-hlgG ja inkuboitiin microarray dioja käyttämällä automaattista ahyB hybridisaatio station (Miltenyi Biotech). Objektilasit pestiin PBS-T: n (PBS + 0,1% Tween 20: tä), kuivattiin ja sitten skannataan Cy5 fluoresenssi käyttäen GenePix 4000B skannerin (Molecular Devices). Objektilasit analysoitiin GenePix Pro 6.0-ohjelmisto (Molecular Devices). Raportoima signaalin intensiteetit normalisoitiin keskiarvo fluoresoiva signaali kaikkien näytteiden dia.

Sidonta Kokeet

COS-7-soluissa (ATCC) transfektoitiin cDNA: iden, jotka koodaavat DCC tai kontrollina, Nogo-reseptori (ng) käyttäen PolyFect (Qiagen) valmistajan suositusten mukaisesti. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 48 tuntia, solut pestiin kahdesti sitomispuskuriin (1% lämmöllä inaktivoitua normaalia vuohen seerumia (hings), 0,05% natriumatsidia, 2 ug /ml hepariinia PBS: ssä), ja inkuboidaan 20 nM Alkaline Phasphatase (AP), CBLN4-AP, tai Nogo 66-AP elatusaineesta 90 min sitomispuskuriin huoneenlämpötilassa. Sitten solut pestiin kolme kertaa sitoutumispuskurissa, vahvistettu 7 min 4% paraformaldehydillä (PFA) PBS: ssä, pestiin kolme kertaa HEPES-puskuroitu liuos (HBS -20 mM HEPES, pH 7,0, 150 mM NaCl), lämmöllä inaktivoitu varten 30 min 65 ° C: ssa, ja pestiin kolme kertaa alkalisella fosfataasilla puskurissa (AP-puskuria -100 mM Tris, pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl

2). AP-signaali on kehitetty nitro-blue tetratsoliumkloridi (NBT) /5-bromi-4-kloori-3′-indolyphosphate p-toluidiini suola (BCIP) kantaliuosta (Roche) laimennettuna 50-kertaisesti AP-puskurissa pimeässä ssa vähintään 1 tunti, kunnes AP riippuvainen muodostumista sininen NBT /BCIP sakka visualisoitiin.

pintaplasmoniresonanssilla

pintaplasmoniresonanssilla (SPR) kokeet suoritettiin Biacore 3000 (GE Healthcare) on 25 ° C: ssa käyttäen CM5 sensorisiru 0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,005% Surfactant P20 (HBS-P) ajopuskurissa virtausnopeudella 30 ul /min. Täyspitkää N-terminaalisesti HA-merkitty CBLN1 ja CBLN2 ostettiin R 15082 vasteyksikköä) ja negatiivinen kontrolli Robo3-Fc (oikea; 9833 vasteyksikköä) kanssa CBLN1, CBLN2, CBLN3 ja CBLN4 suihkutetaan analyyttien 10 ug /ml. Tukeva sitoutuminen havaittiin kohteeseen CBLN4 (musta jälki), kun taas ole sitovaa signaalia ei havaittu muiden Cerebellin perheenjäsenet (harmaa jälkiä). B) radio-lignad määritystä käytettiin määrittämään affiniteetin CBLN4-Fc (vasemmalla) ja gD-Netrin-1 (oikealla) DCC transfektoitiin väliaikaisesti HEK293T-soluissa.

125I-leimatun ligandin annettiin sitoutua transfektoitujen solujen läsnä ollessa kasvavien määrien leimaamatonta ligandia. Laskettu

K

D

arvot näkyvät kaavioita ja edustavat 3 itsenäistä koetta.

tunnistaminen CBLN4 Sidonta Partners

Voit selvittää jos olisi muut CBLN4 reseptoreita DCC, proteiini-microarray seulonta suoritettiin päinvastaisessa jossa CBLN4-Fc käytettiin syöttinä, kuitenkaan, ei ole selvää osumia havaittu (tuloksia ei ole esitetty). Kummallista, DCC itsessään ei tunnistettu osuma. Ennen tutkimukset osoittavat, että proteiinit toimivat pitkälti microarray alustan [24], vaikka on mahdollista, että DCC on herkkä tämän tyyppisen immobilisaation. Seuraavaksi neljätoista hermosolujen proteiinien tiedetään koordinoida neuroni aksonaalisen polku löytää samanlainen DCC toiminto, seulottiin käyttäen solu-sitoutumismääritys. Sitoutuminen CBLN4-Fc: tä vastaan ​​arvioitiin COS-7-solut transfektoitu klooneja vastaavat koodaamattomasta täyspitkän kandidaattigeenejä. On huomattava, että negatiivinen tulos ei välttämättä sulje pois ehdokas vuorovaikutus koska proteiini ilmaisuja olivat vahvistamaton. Kvantifiointi fluoresoiva intensiteetti CBLN4-Fc-värjäyksen näihin transfektoidut kloonit tunnistettiin DCC ja kaksi muiden mahdollisten ligandien, Netrin-1 ja NEO1 (kuvio 4A). Signaali havaittu Netrin-1 sitova kuitenkin pysynyt vakiona riippumatta muutoksista CBLN4 keskittyminen ja myös johdetun toteamisvasta-ainetta yksinään (tuloksia ei ole esitetty), mikä viittaa väärä positiivinen näytössä. NEO1, mielenkiintoisesti, on DCC paralogi ja toimii myös Netrin -1-reseptori [29]. Sekä DCC ja NEO1 on samanlainen domeenirakenteet ja jakaa 54% identiteetti yli ECD alueella. Jotta laadun arviointia sitova vahvuudet Netrin-1 ja NEO1, DCC-ilmentävien COS-7-solut yksitellen arvioitava, titraussarjasta alenevassa CBLN4-Fc. Vuorovaikutusta CBLN4 ja NEO1 voitiin havaita CBLN4-Fc pitoisuudet 25 ug /ml (280 nM) tai korkeampi. Sen sijaan, CBLN4-Fc-sitoutumisesta DCC-ilmentävien solujen osoitti vahvaa signaaleja alhaisina pitoisuuksina kuin 0,78 ug /ml (8,7 nM) (kuvio 4B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että sitoutumisen NEO1 on CBLN4 edustaa paljon pienempi affiniteetti vuorovaikutuksen verrattuna DCC sitovia CBLN4. Edelleen karakterisoimiseksi CBLN4-NEO1 vuorovaikutus, NEO1 ohimenevä ilmentävät HEK293T-solut analysoitiin sitoutumisen CBLN4-Fc-proteiinia virtaussytometrialla ja radio-ligandin sitoutumisen määritys, jossa käytetään

125I-leimatun CBLN4. Kuitenkin, CBLN4 ei vuorovaikutuksessa NEO1 ilmentäviä soluja joko näistä lähestymistavoista, todennäköisesti koska hyvin alhainen affiniteetti (tuloksia ei ole esitetty).

A) määrällinen CBLN4-Fc: n sitoutumista COS-7-soluissa, jotka on transfektoitu ilmoitettu aksoniohjauksen proteiineja. Tiedot edustavat kolmea riippumatonta maljat, joista jokainen sisältää kolmesta kaivosta ja virhepalkit edustavat keskivirhe keskiarvon. B) Flag-DCC ja Flag-NEO1 ilmennettiin tilapäisesti pinnalla COS-7 solua havaitaan anti-Flag värjäytymistä (yläpaneeli). Alempi paneeli esittää titraussarjasta sarjan CBLN4-Fc sitoutumisen DCC tai NEO1. Kolme rinnakkaista itsenäistä koetta suoritettiin ja virhepalkit edustavat keskivirheen keskiarvon.

CBLN4 sitoutuu FN4-6 alueen DCC

DCC on yksittäinen transmembraaninen proteiini, joka sisältää neljä Ig toistoja ja kuusi FNIII toistojen ECD. Arvioimaan, mitkä alueet DCC ovat tarpeen CBLN4 sitovia, deleetiorakenteita DCC: tä syntyy ja transfektoitiin COS-7-soluihin sitoutumisen analyysi. Neljä DCC konstruktit testattiin, jotka muodostavat joko koko ECD (DCC.FL), The Ig1-4 toistaa (DCC.Ig), The FN1-6 toistaa (DCC.FN1-6), tai vain C-pään FN4-6 toistoja (DCC.FN4-6). Ig1-4 toistaa (DCC.Ig) ei osoittanut sitoutumista CBLN4-Fc, mikä viittaa siihen, että ensisijainen sitoutuminen on riippuvainen FN domeeneja (kuviot 5A-B). Tämän mukaisesti tulkinnan, ilmaus vain FN toistetaan (DCC.FN1-6) tai vain kolme viimeistä FN verkkotunnuksia (DCC.FN4-6) säilytti vahvan CBLN4-Fc sitova. Nämä tulokset osoittavat, että DCC-FN4-6 riittää välittävät sitoutumista CBLN4.

A) kaavamainen esitys DCC näytetään Ig verkkotunnuksia musta ja FN verkkotunnuksia vihreänä. Edustavia fluoresoiva kuvat näkyvät CBLN4-Fc sitoutumisen COS-7-solut ilmentävät täyspitkä DCC, DCC Ig1-4, DCC FN1-6, DCC FN4-6, ja negatiivinen kontrolli APP. Detection of CBLN4-Fc sitoutuminen oli kautta anti-ihmisen Alexa Fluor-488 (vihreä). Havaitseminen ilmentyminen solun pinnalla kaikissa flag-koodattu DCC deleetiomutantit vahvistettiin kanssa Alex Fluor-647 leimattua anti-hiiri-IgG (punainen). B) määrällinen CBLN4-Fc: n sitoutumista DCC verkkotunnuksen deleetiokonstruktioista. Kolme rinnakkaista itsenäistä koetta suoritettiin ja virhepalkit edustavat keskivirheen keskiarvon.

Netrin-1 kilpailee CBLN4 Sidonta

Aiemmin julkaistut raportit syyttämään FN4-6 alueen DCC Netrin-1 sitova [11], [12]. Havaintomme, että CBLN4 sitoutuminen kartoitettu samaan alueen DCC johtanut meidät tutkimaan, jos Netrin-1 ja CBLN4 kilpailevat DCC sitovia tai jos kaikki kolme proteiinia voi muodostaa kolmen komponentin kompleksi. Käyttäen samanaikainen immunosaostus tutkimuksissa, se on viime aikoina raportoitu, että CBLN4 sitoutumista DCC voidaan kilpaili Netrin-1 [22]. Näiden tulosten vahvistamiseksi, käytimme herkkä radioligandina lähestymistapaa. Tiedot osoittavat, että

125I-leimattua CBLN4-Fc: tä (300 pM), sitoutui spesifisesti DCC ilmentävät HEK293T-soluissa ja että sitoutuminen estettiin esi-inkuboimalla soluja Netrin-1 (1 uM) verrattuna mitään hoitoa ohjaus ( Kuvio 6A). Epätäydellinen estäminen

125I-leimattua Netrin-1 (52 pM) kanssa CBLN4-Fc (2 uM) havaittiin käänteinen kokeessa ja todennäköisesti voidaan katsoa johtuvan -5-kertainen ero affiniteetti CBLN4 ja Netrin- 1 DCC. Titraus kasvavien pitoisuuksien kanssa Netrin-1 osoitti selvää siirtymä kiinteän pitoisuuden

125I CBLN4-Fc DCC ilmentävät HEK293T-solut (kuvio 6B). Tuloksemme osoittavat, että CBLN4 ja Netrin-1 sitoutumiskohdat kartta samaan FN alueen DCC ja steerisesti päällekkäisyyttä.

A) määrällinen määrä

125I-radioleimattua CBLN4-Fc tai gD-Netrin- 1 sitoutuneen DCC ilmentävät HEK293T-soluissa, tai transfektoimattomia kontrollisoluja, esi-inkuboitiin leimaamattoman gD-Netrin-1 tai CBLN4-Fc, vastaavasti. Data neljästä itsenäisestä kokeesta on esitetty. Jokainen pylväs edustaa 3 tekninen rinnakkaista ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD. Yksisuuntaista Studentin

t

testiä sovellettiin: *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001. B) tilavuus juoni, edustaja kolmena itsenäisestä kokeesta, on esitetty gD-Netrin-1 kilpailee sitoutumisen

125l-radioleimattua CBLN4-Fc DCC ilmentävien HEK293T soluja.

karakterisointi CBLN4 toiminto alkionkehityksen aikana

aikaisemmin on osoitettu, että DCC ja Netrin-1 ovat tarpeen asianmukaista ohjausta ja kasvua aksonien alkionkehityksen aikana [7], [15]. Jotta voidaan tutkia osuus CBLN4 voi olla DCC-Netrin-1 signalointi, neuronaalinen ennusteet

CBLN4

knock-out-hiiret tutkittiin. Sukupolvi

CBLN4

knock-out hiiri sisältyvät knock in a LacZ ekspressiokasetin, jonka avulla β-galaktosidaasi värjäys

CBLN4

+/-

hiiriä visualisoida lokalisoinnin CBLN4 ilmaisu. Β-galaktosidaasin ekspressiota

CBLN4

+/-

hiirissä on erilainen, mukaan lukien ekspressio selän raajasilmuissa on E11.5 ja moottorin sarakkeessa selkäydin E13.5 (kuvio 7A ). Yksi tärkeimmistä roolit DCC ja Netrin-1 on moitteettoman keskiviivan ylittäminen commissural aksonien kehittyvissä selkäytimessä. Sen tutkimiseksi jos CBLN4 on rooli keskiviivan ohjausta, pre-rajan commissural aksonien visualisoitiin TAG-1 immunovärjääminen poikittaisleikkeet E11.5 hiirten (kuvio 7B

)

. Kun taas commissural axons voidaan nähdä saavuttaa ja rajan lattialaatan villin tyypin hiirissä, hyvin vähän, jos lainkaan, commissural axons saavuttaa ja ylittää lattialaatan sisään

Netrin-1

– /-

hiirillä. TAG-1 immunovärjäystä commissural axons

CBLN4

– /-

hiirillä osoittavat, että ne saavuttavat ja ylittävät axons samanlainen villityypin ja ei ole havaittavaa eroa immuunivärjäykseen välillä

Netrin-1

– /-

;

CBLN4

+ /+

ja

Netrin-1

– /-

;

CBLN4

– /-

hiiriä tai

Netrin-1

+/-

;

CBLN4

+ /+

ja

Netrin-1

+/-

;

CBLN4

– /-

hiirillä.

A) Lac-Z reportterin ilmentymisen CBLN4 vuonna E11.5

CBLN4

+/-

hiiriä (top paneelit) osoittaa erottuva ilme raajoissa mukaan lukien selkä raajan ilme. Lac-Z toimittaja värjäys CBLN4 vuonna E13.5

CBLN4

+/-

hiiriä (alempi paneeli) osoittaa ilmaus selkäytimessä moottorin runko. B) commissural axons E11.5 selkäytimen visualisoitu TAG-1 immunovärjääminen yhdistelmiä

CBLN4

ja

Netrin-1

genotyypit. C) Kuvat ovat ja kvantifiointiin vaeltava aksonien (valkoiset nuolet) on hartiapunos on E11.5

CBLN4

– /-

hiirillä. Tukey kontrastit; **,

P

0,01; ***,

P

0,001; n on vasen ja oikea etujalan sisäkkäisiä hiiri; n = 4

CBLN4

+ /+

; n = 5

CBLN4

+/-

; n = 6

CBLN4

– /-

.

ilmentyminen CBLN4 kehittämisessä raajasilmuihin johti meidät arvioimaan kehityskaari liikehermosolusairaudet aksonien tässä vaiheessa. Nämä axons ilmaista DCC [7] ja navigointiin moottorin runko selkäytimen lopullisiin tavoitteisiin hermoissa lihaksia raajan [30] ja niiden tiedetään olevan herkkiä Netrin-1 [31], [32].