Krooninen sairaus

tiivistelmä

nojalla sen kykyä säädellä koostumuksen selkäydinnesteestä (CSF), suonipunoksen (CP) sopii käynnistämään vastata nopeasti traumaattisen aivovamman (TBI) tuottamalla kasvun säätelyproteiineja. Esimerkiksi ruokatorven syöpään liittyvät Gene-4 (Ecrg4) on kasvaimia estävä geeni, joka koodaa hormonin kaltainen peptidi nimeltään augurin, joka on läsnä suurina pitoisuuksina CP epiteeli (CPE). Koska augurin sen ajatellaan säätelevän vanhenemista, neuroprogenitor solujen kasvua ja erilaistumista keskushermostossa, arvioimme kinetiikka Ecrg4 ilmaisun ja augurin immuunivaste CPE jälkeen CNS loukkaantumisen. Aikuisilla rotilla loukkaantui jolla on läpitunkeva aivokuoren vaurio ja muutoksia augurin immunoreaktiivisuus tutkittiin immunohistokemiallisesti. Ecrg4 geenien ilmentyminen oli ominaista

in situ

hybridisaatio. Solun pinta augurin tunnistettiin histologisesti konfokaalimikroskopiaa ja biokemiallisesti solukomponenttien fraktiointi. Molemmat Ecrg4 geenien ilmentyminen ja augurin proteiinin tasot laskivat 24-72 tuntia vamman jälkeen, mutta palautuu uninjured tasolle päivällä 7 vamman jälkeen. Proteiini värjäytymistä supraoptic ytimen hypotalamuksen, käytettiin kontrollina aivojen alueella, eivät osoittaneet laskua AUGUIN immunoreaktiivisuus. Ecrg4 geenin ilmentymisen lokalisoitu CPE-soluja, ja augurin proteiinin CPE kammion kasvot. Ekstrasellulaarinen solun pinnalla kytkemisen 14 kDa augurin vahvistettiin solun pinnalla fraktioimalla primaaristen ihmisen CPE-soluja in vitro, kun taas 6-8 kDa fragmentti augurin havaittiin elatusaineessa, joka osoittaa vapautumista solun pinnalta proteolyyttinen prosessointi. Rotilla CSF kuitenkin 14 kDa augurin havaittiin. Oletamme ensimmäinen julkaisu ja proteolyyttinen prosessointi augurin osallistuu aktivointi vaiheessa loukkaantumisiin jatkuvia Ecrg4 alassäätöä on dysinhibitory aikana proliferatiivisen vaiheen. Niinpä augurin soittaisi konstitutiivisena estävä toiminto normaalissa CNS taas alas säätely Ecrg4 geeniekspression vammoja, kuten syöpää, dysinhibits lisääntymistä.

Citation: Podvin S, Gonzalez AM, Miller MC, Dang X, Botfield H, Donahue JE, et al. (2011) Ruokatorven syöpään liittyvät Gene-4 on suonipunoksen-Derived Injury Response Gene: Evidence for kaksivaiheisesti Response Early ja Late Brain Injury. PLoS ONE 6 (9): e24609. doi: 10,1371 /journal.pone.0024609

Editor: Colin Combs, University of North Dakota, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 14 elokuu 2011; Julkaistu: 14 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Podvin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Dr. Podvin tukee ohjasivat Young Investigator Award päässä Hydrokefalus Association (www.hydroassoc.org). Dr. Baird, Dr. Eliceiri ja Dr. Coimbran tukena on Yhdysvaltain National Institutes of Health (www.nih.gov) P20 valmisteleva keskus Grant aiheuttaisi Healing Research Yhdysvaltojen National Institute of General Medical Sciences (www.nigms .nih.gov; P20 GM078421) ja tukee myös National Institutes of Health (NIH) EY018479 (Dr. Baird), (NIH) HL073396 (Dr. Eliceiri) ja täydentävät rahoitusta Yhdysvaltain takaisinperintä ja uudelleeninvestointikautta lain (Arra ). Ei ulkoista rahoitusta saatiin näihin tutkimuksiin tohtori Miller, Dr. Dang, Dr. Donahue, Dr. Rossi tai Dr. Stopa. Conrad Johanson tukee NIH AG027910. Kaikissa tutkimuksissa suoritettiin Birminghamin yliopiston tohtori Gonzalez, Dr. Botfield, Dr. Boissaud-Cooke ja tohtori Leadbeater oli rahoitaa School of Clinical and Experimental Medicine, College of Medical ja Dental Sciences, University Birmingham, Iso-Britannia (www.medicine.bham.ac.uk). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

traumaattisen aivovamman (TBI) liittyy usein huono kliinisiä tuloksia, koska yli elämäniloinen tulehdusreaktio voi aiheuttaa tahattomia vahinkoja sekä loukkaantunut ja ei-loukkaantunut keskushermoston (CNS) kudos [1]. Lisäksi on biofyysisiin muutoksia keskushermostossa jotka rajoittavat toiminnallinen takaisinperinnästä. Esimerkiksi, muodostumista glial arpi loukkaantumisen jälkeen suojaa hermosoluja eksitotoksinen tekijät [1], [2], mutta estää synaptisen uudelleen kasvua ja neuroprogenitor solujen infiltraatiota päässä subventrikulaarinen vyöhyke (SVZ) [3]. Lisäksi turvotus voi häiritä veri-aivoesteen (BBB) ​​ja veri-aivo-selkäydinnesteessä (BCSFB) esteet, pakkaa aivoparenkyymissä [4] ja kompromissi endoteelisolujen, suonipunoksen epiteelin (CPE), kammion ependymal (Ve) ja subarachnoid (SA) solut, jotka normaalisti suodattaa myrkkyjä soluvälinesteestä, säilyttää ioninen tasapainon CSF, ja erittävät hormoneja ja kasvutekijöitä säilyttää CNS homeostaasin [5].

CPE erityisesti kärsii ainutlaatuinen aineenvaihdunnan ja rakenteellisia jännityksiä akuutissa vaiheessa CNS vammoja, jotka rajoittavat toimintoja, jotka muutoin palauttaa homeostaasiin korjauksen aikana. Esimerkiksi, vasogenic turvotus loukkaantumisen jälkeen lisää äänenvoimakkuutta solunulkoisen nesteen osastoon ja aiheuttaa ventriculomegaly. Tuloksena mekaanista rasitusta [6] ja neutrofiilien hyökkäys [7] lisätä vuotamisen BCSFB tiiviiden liitosten ja sloughing on apikaalisella värekarvojen peräisin CPE ja Ve soluja. Lisäksi häiritsi tiukka liittymissä heikentää proteiini ultrasuodatuksella ja johtaa lisääntyneeseen irtotavarana ja osmoottinen valumaan CSF [8], [9], [10].

joukossa peptidit tuotetaan, ja sitä valvoo, CPE [11], [12], augurin on vastikään kuvattu hormonin kaltainen proteiini, joka on tuotettu jälkeen proteolyyttinen prosessointi

ruokatorven syöpään liittyvä geeni-4

(Ecrg4) holoproteiinia [13] ja sen ajatellaan pelata rooli CNS homeostaasiin [14], [15]. Aiemmissa raporteissa [15] ovat osoittaneet, että Ecrg4 geenin ilmentymisen tasot CNS ovat suurimmat CPE ja ependyma aikana sekä kehitys- (www.genepaint.org [16]) ja aikuisen CNS (www.brain-map.org [17] ) ja ovat ehdottaneet mahdollista roolia sen tuotteen augurin keskushermoston homeostaasin. Tätä hypoteesia tukee havaintomme, että knockdovvn Ecrg4 geeniekspression aikana zebrafish kehityksen aiheuttama solujen yli leviämisen estäminen kehittyvissä CNS ja synnytti ventriculomegaly fenotyyppi. Sen sijaan, Ecrg4 yli-ilmentyminen aikuisen rotan aivoissa pieneni soluproliferaation SVZ allas aikuisten neuroprogenitor solujen jälkeen aivokuoren vak malli CNS vahinko [14].

Tässä osoitamme, että on nopea menetys sekä augurin ja Ecrg4 geenien ilmentymiseen CPE jälkeen CNS loukkaantumisen. Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että augurin pelaa konstitutiivista estävä toiminto normaalissa CNS ja että sen nopea julkaisu ja myöhemmin katoamista CPE loukkaantumisen jälkeen saattaa auttaa liipaisin ja ylläpitämään CNS vastauksena vahinkoa mahdollistamalla solujen lisääntymisen.

tulokset

augurin on solukalvon proteiini

immunohistokemiallinen analyysit augurin on periventrikulaarisessa aivojen alueissa (kuvio 1A, punainen) osoitti, että monissa tapauksissa, suurin intensiteetti augurin immunoleimaus on polarisoitunut (nuoli) merkittäviä värjäys paikallistamisen sen kammion puolelle CPE-soluja (punainen värjäys verrattuna DAPI tumaväriä sinisellä). Lisäksi kuvio immunoreaktiivisuuden sytoplasmassa CPE oli rakeista, jotka voivat olla osoitus augurin läsnäolo eritysrakkuloiden (upotus). Sitä vastoin augurin immunoreaktiivisuus ei havaittu CP endoteelin tai kudoksenpuoleisella kasvot CPE. Tämä viittasi siihen, että sen jälkeen, kun solun ulkopuolella, augurin voi olla solukalvon liittyvä proteiini kosketuksessa ja mahdollisuus erittymistä CSF. Sen määrittämiseksi, onko augurin päästetään CSF in vivo, me käsitellään rotan CSF immunoblottauksella ja havaitsi 14 kDa: n vyöhykkeen (kuvio 1 B), joka vastasi ennustettu molekyylipaino augurin, käsitellyn 118 aminohapon hormoni kaltainen peptidi, jota koodaa ECRG4 ( 31-148) [18]. Toinen suurempi KA tuntemattomien identiteetin havaittiin myös joka voi heijastaa peptidin voittopuolisesti yhteenlasku- (julkaisematon havainto).

Paneeli A: immunohistokemiallinen näyttöä tethering solun pinnalla: Immunoreaktiivinen augurin tunnista kyseistä vasta-ainetta CP uutteet tunnistettiin tuote Ecrg4 immunoblottauksella ja osoittaa, että läsnä on 14 kDa: n proteiinin ECRG4 (31-148) prosessoidaan pilkkomalla 30 aminohapon johtosekvenssin kuten määritelty aiemmin [13]. Niistä periventrikulaarinen aivoissa, polarisoitunut pesäkkeitä punctated augurin värjäystä havaittiin solunulkoisen kammion edessä suonipunoksen epiteelisolukerroksen (punainen, nuoli) viitaten ydin- vastavärinä (sininen, DAPI). Rakeinen värjäyskuvion havaitaan sytoplasmassa, jos CPE solun kerroksen, joka on osoitus säänneltyjen vesicular eritystä solun pinnalla. Paneeli B: Detection of immunoreaktiivisia augurin rotan CSF: immunoblottauksella rotan CSF oli 14 kDa: n vyöhykkeen (nuoli), joka vastaa ennustettu molekyylipaino augurin (ECRG4 (31-148)). Paneeli C: Biochemical näyttöä solun pinnalla kytkemisen augurin: Expression of Ecrg4 viljellyissä CPE-solujen havaittiin ole Western blot (vasen paneeli) tai RT-PCR-trandusoidun soluja (ei esitetty). Täten tutkimaan Ecrg4 in vitro oli välttämätöntä käyttää adenovirusvektori, joka sisältää ihmisen Ecrg4 ORF. Proteiini eristettiin CPE soluista 48 tunnin kuluttua ei transduktion tai transduktion AD

GFP tai AD

ECRG4. Molekyylipaino Ecrg4 johdettujen peptidifragmenttien ilmaistuna kokosolulysaateista määritettiin Western blotting vasemmassa paneelissa. Solupinnan proteiinit fraktioitiin saostamalla neutravidiini-biotinyloidun proteiineja solun pinnalla (keskiosan), jota seurasi Western blot -analyysi. Peptidi muoto erittyy soluista havaittiin suoralla Western-blottaus väliainetta (oikea paneeli).

edelleen käsitellä solunsisäisen jakautumisen augurin CPE, me biotinyloitu solun pinnan primäärisistä ihmisen CPE-soluja kulttuurin ja fraktioitiin biotinyloitu proteiineja kautta preciptiation kanssa neutravidiinia helmiä. Sitten immunoblotattiin solun pinnan murto anti-augurin aineella [19]. Viljellyt CPE-solut, kuten monet muut viljelmän solutyyppejä, jotka olemme tutkineet, eivät ilmaise endogeenistä Ecrg4 vaan se voidaan seuraavanlaista geenin toimitusta virus- tai plasmidivektoreilla [14]. Sen jälkeen infektoimalla CPE solut AD

ECRG4, 14 kDa detektoitiin kokosolulysaateista (kuvio 1 C, vasen paneeli, kaista 3). Samoin, 14 kDa: n proteiini havaittiin immunoblottauksella solun pinnan proteiineja, mikä osoittaa, että augurin paikantuu solun pinnalla (kuvio 1 C, keskimmäinen paneeli, kaista 3). Western blot-analyysi elatusaine CPE-soluja kuitenkin, jossa me aikaisemmin osoitti sisälsi augurin (tai immunoreaktiivinen fragmentti augurin, joka kvantitoitiin ELISA [14]), osoittivat immunoreaktiivisen peptidiä, joka oli noin 6-8 kDa (kuvio 1C, oikea paneeli, kaista 3). Tämä viittaa siihen, meidän in vitro -mallissa, peptidi pilkkominen julkaisut (an) augurin fragmentti (t) CPE solun pinnalla. Nämä tiedot vahvistavat, että in vitro augurin säilyy solun pinnalla, ja että solun pinnan proteolyyttistä käsittelyä vapauttaa pienemmän peptidin median verrattuna siihen, mitä havaittiin rotan aivo-selkäydinnesteessä. Tämä toi esiin mahdollisuuden, että kaksi eri jalostettuja muotoja augurin voidaan vuodattaa CPE soluja ja saattaa osoittaa kaksi peptidin productes jokaisessa on distince toimintaa. Ei immunoreaktiivisuus havaittiin kokosolulysaateista, solun pinnan jakeet tai väliaine joko trandusoidun tai AD

GFP transdusoidut solut (kuvio 1 C, kaistat 1 ja 2).

Augurin jakelu suonipunoksen muutoksia sen jälkeen, kun CNS vamma

Käytimme aivokuoren vaurion malli CNS loukkaantumisen [20] arvioida, vamman suorituksesta Ecrg4 geenien ilmentyminen ja augurin immunoreaktiivisuus sivusuunnassa kammion CP. Ohjaus ja loukkaantuneiden rotat tapettiin 1, 3, ja 7 päivän kuluttua suorittamisen 3 mm syvä vaurio oikeaan aivokuori, lateraalisesti kammiot. Kuten kuviossa 2 on esitetty, havaitsimme konfokaalimikroskopialla, että oli merkittävä diffuusia värjäytymistä normaalissa, ehjä sivukammioon CP, joka ilmestyi monia CPE solujen polarisoitu kohti apikaalisella, kammion osoittavan pinnan epiteelisolujen ja välimerkein alueita immuunifluoresenssivasta etiketti (kuvio 2A). Kun arvioitiin 24 tuntia vamman jälkeen (kuvio 2B) Immunovärjäyksen signaali oli melkein poissa, vaikka siellä oli joitakin immunoreaktiivisuus löydetty eristyksissä pesäkkeitä. Sielläkin kuitenkin yleistä värjäytymisen voimakkuus näytti vähentynyt. 3 päivän kuluttua vamma (kuvio 2C), Immunovärjäyksen vielä laski verrattuna hallita uninjured eläimiä, mutta se näytti enemmän tasaisesti koko CP verrattuna värjäystä 1 päivä sen vaurion. 7 päivän, värjäytymisen intensiteetti oli nyt mahdotonta erottaa ohjaus aivot ja oli yhdistetty malli polarisoitunut apikaalisella ja polttoväli pistemäinen värjäys hajanaisempi mallia augurin immunoreaktiivisuus. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että augurin otettiin käyttöön heti CNS loukkaantumisen ja oletettavasti vapautuu CSF.

aivokuoren pistohaava laski augurin proteiinin tasot kontralateraaliseen CP määritettynä immunohistokemiallisella värjäyksellä ja konfokaalimikroskopialla. Oftalminen veitsi tunkeutui rotan selkä- aivokuori transektiotoimenpiteissä aivokurkiaisen 3 mm syvä ja sivusuunnassa oikealle sivusuunnassa kammion. Immunoreaktiiviset augurin proteiinin tasot kontralateraaliseen CP pienenivät 24 h (paneeli B) ja 3 päivää (paneeli C) vamman jälkeen verrattuna ennallaan verrokkieläimiin (paneeli A). By 7 päivää vamman jälkeen augurin proteiini oli palannut suunnilleen samalla tasolla kuin ehjyyskontrollien. Kuvia edustaja n = 3 rotat.

Ecrg4 on vamma vastaus geeni

Pitkän aikavälin menetys immunoreaktiivisia augurin in CPE soluissa aivokuoren vaurion syynä voi olla joko (1) jatkuva ja nopeutetun eritystä ja vapautumisen augurin heikentävien solunsisäisten varastojen tai (2) menetti augurin kautta vähentynyt geenin ilmentyminen. Näin ollen, käytimme in situ -hybridisaatio arvioida geeniekspression suonipunoksen vamman jälkeen (kuvio 3). Antisense koetin rotan Ecrg4 mRNA osoitti vahvan signaalin uninjured ohjaus rotan aivot muistuttivat joka havaittiin immunohistokemiallisella värjäyksellä (kuvio 3A). Signaali ilmestyi rajoittuu CPE-soluja ja proteiinin kanssa, signaali katosi 24 tuntia vamman jälkeen (kuvio 3B), ja pysyi sellaisena läpi 3 päivää (kuvio 3C), jonka jälkeen se uudelleen ilmestyi by 7 päivää (kuvio 3D) samalle tasolle kuin kontrollieläimissä. Signaali havaittu kontrollieläimiltä ja 7 päivää vamman jälkeen katsottiin myös erityisiä, koska mitään hybridisaatiota ei havaittu CP osastoja näennäistä tai 7 päivää postitse vaurio eläimistä, jotka käsiteltiin synteettisellä kontrollikoettimen (kuvio 3E ja F). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että Ecrg4 on varhainen vahinkoa vasteen geenin ja että menetys augurin on kaksivaiheinen: ensin, koska suurin vapautumista solun pinnalta ja solunsisäisiä varastoinnin vesikkelit ja toinen, koska menetys Ecrg4 geenin ilmentymisen koko proliferatiivinen vaihe vammoja.

aivokuoren pistohaava laski geeniekspressiotasot CP määritettynä

in situ

hybridisaatio. Oftalminen veitsi tunkeutui rotan selkä- aivokuori transektiotoimenpiteissä aivokurkiaisen 3 mm syvä ja sivusuunnassa oikealle sivusuunnassa kammion ja Ecrg4 geenin ilmentymisen arvioitiin sitoutumisen olevan Ecrg4 mRNA antisense koetin kontralateraaliseen CP koskemattomassa rotan aivoista (paneeli A), 24 t (paneeli B) 72 tuntia (paneeli C) ja 7 päivää (paneeli D) vamman jälkeen. Synteettinen, negatiivinen kontrolli-mRNA-koetin syntyvät pSPT18-Neo-plasmidin ohjaus selkäranka ja käytettiin arvioimaan tausta signaalin ohjaus (paneeli E) ja 7 päivää (paneeli F) kohdat. Kuvia edustaja n = 3 rotat.

Augurin jakelun supraoptic nucleus (poika) ei muutu, kun CNS loukkaantumisen

tutkia augurin tasot muuttuvat kuvio samanlainen CPE seuraavat aivokuoren vaurio, etsimme immunoreaktiivisuus toisella alueella aivoissa, joilla on korkea augurin ja Ecrg4 ilme, poika hypotalamuksen [21]. Emme löytäneet laskua ilmaus 1 ja 3 d.p.i. vaurioituneessa rotilla (kuvio 4B ja C) verrattuna kontrolliin kuvio 4A). Tämä alueellinen vertailu osoittaa alentuneesta augurin 1 ja 3 d.p.i. eivät ole globaalia vastausta koko aivot, ja edelleen vertailuja anatomiset alueet onko tämä tietty kuvio on ainutlaatuinen CPE vastauksena CNS vammoja.

spesifisyyden osoittamiseksi vahinkoa vasteen CPE vastakohtana muilla alueilla aivoissa, joka on korkea Ecrg4 geenin ja augurin proteiinin ilmentyminen [21], tutkimme poika hypotalamus loukkaantunut rotille 1 (paneeli B), 3 (paneeli C) ja 7 (paneeli D) dpi ja verrattiin värjäystä ehjä aivojen (paneeli A). Vaikka saattaa olla hieman incrase 3 ja 7 d.p.i., jyrkkä lasku ilmaisun, joka tapahtui CPE vaurion jälkeen ei havaittu poika. Kuvia edustaja n = 3 rotat.

Keskustelu

Tässä esitetyt tiedot osoittamaan, että CP-johdettu Ecrg4 on vamma vastaus geeni. Ensinnäkin, CNS vamma saostaa nopea menetys Ecrg4 geenin ilmentymisen 24 tunnin kuluessa vahingon ja se jatkui vakaana 7 päivää, jolloin vahinko on alkanut ratkaista [22]. Välitön reaktio oli kuitenkin oletettavasti ensimmäinen pääosa vapautuminen augurin päässä CPE solun pinnan seuraa pysyvämmät eritystä ja vapauttamaan solunsisäisen myymälöissä augurin. Funktio Tämän irtotavarana vapautumisen varhaisessa vaiheessa vahinkoa ei tunneta, mutta sitä seurasi ehtyminen immunoreaktiivisuus aikana puolivälissä vaiheessa vahinkoa, joka pahensi alaspäin säätely Ecrg4 geeniekspressiota, joka säilyi koko proliferatiivinen vaihe CNS vammoja läpi resoluutio 7. päivänä

Ecrg4 geeni on ehdokkaana tuumorisuppressorigeeniä joka on saavuttanut merkittävää huomiota, koska käänteistä yhdistyksen geeniekspression kasvun ja etenemisen epiteelisyövissä [23], [ ,,,0],24]. Down asetus välittyy sen epigeneettisellä hiljentäminen kautta DNA metylaatio Ecrg4 promoottori [25], [26], [27]. Äskettäin Ecrg4 geenin ilmentymistä on myös korreloi käänteisesti syövän etenemiseen ja invasiivisuus [27], tulehdusta geenisäätelyn kautta NF-kB [25], soluproliferaation SVZ [15], ja sitä korreloivat lisääntynyt vanhenemiseen keskushermostossa [ ,,,0],15] ja hormonitoimintaa sääntely reuna-hydro-mineraalitasapainon [21], [28]. Sen avoin lukukehys (ORF) koodaa 148 aminohapon proteiinia, joka on erittäin hyvin säilynyt keskuudessa lajien ja on sekundaarirakenne motiiveja, jotka ovat tunnusomaisia ​​neuropeptidejä [13]. Kuitenkin tietokantalouhinta paljastaa, että Ecrg4 ei ole osa suurempaa perheen liittyviä geenejä. Tämä saattaa merkitä tiukka evoluution ohjaus keskuudessa Ecrg4 ortologit ja ainutlaatuinen biologinen funktio.

lasku augurin proteiinia (kuvio 2) ja Ecrg4 geenin ilmentymistä (kuvio 3) tapahtuu ajankohtina, jolloin solut lisääntyvät normaalissa CNS vahinkoa vasteen [29]. Ajankul- väheni augurin korreloi akuutin ja subakuutin vasteajat CNS vahinko [1] sekä geenin ja proteiinin ilmentyminen on vähentynyt 1-3 päivää vamman jälkeen, mutta palaa uninjured tasolle päivällä 7. Tämä on johdonmukaista edellisessä esittely [14], että Ecrg4 geenin ilmentyminen on korkea normaali CP ja että Ecrg4 yliekspressio vaarantaa neuroprogenitor solujen kasvua ja erilaistumista. Havainnot Tässä esitetyt viittaavat siihen, että augurin voi olla kuin ”Sentinel” liikkumattomuus tekijä, jonka konstitutiivinen läsnäolo on estävä, mutta joiden puuttuminen tulee dysinhibitory signaali, joka mahdollistaa proliferatiivinen vaste vammoja.

Se, että Ecrg4 geenien ilmentyminen on epigeneettiseltä säätelee DNA: n metylaatio herättää mielenkiintoisen mahdollisuuden, että konstitutiivinen taso augurin CP voidaan ohjata epigeneettiseltä samoin. Jos näin on, DNA metylaatio Ecrg4 ohjaisivat määriä pohjapinta augurin jotka ovat konstitutiivisesti läsnä ja käytettävissä vapauttaa aikana akuutissa vaiheessa vahinkoa. Merkitys tämän hypoteesin ei ole selvä, mutta se saattaa merkitä, että DNA: n metylaatio voi myös mitata paluuta geeniekspression aikana resoluutio vaiheessa vahinkoa. Samanlaisia ​​epigeneettiset muutokset DNA: n metylaatio on nyt kuvattu hyvin jälkeen keskushermoston iskemian ja vamman [30]. Jos kääntyminen Tällaisten muutosten vaikutukset elpyminen augurin ekspressiotasoja, sitten kun otetaan huomioon vaikutukset Ecrg4 geenin kaataa ja yli ilmaisun [30], neuroprogenitor vastata vahinkoa voi vaikuttaa merkittävästi.

On erityisen huomionarvoista, että , kun taas augurin on samanlainen kuin muut peptidihormonit, että se on konstitutiivisesti tuotettu CPE eritettäviksi CSF [22], se on myös erillään peptidihormonit, että solun pinnan tethering (kuvio 1C) muistuttaa paracrine tekijät, kuten orvaskeden ja fibroblastikasvutekijät, lovi, rosoinen ja Efrii- [31], [32], [33], [34]. Me [14] ja muut [15], ovat aiemmin kuvattu vapautumista augurin osaksi kunnostetun alustan transduktion jälkeen Ecrg4 siirtogeenin, ja olemme nyt osoittaneet havaitsemisen 14 kDa: n muotoon rotan CSF, ensimmäiset todisteet erittyvän augurin in vivo. Meidän havainnot kaksi eri augurin tuottaman CPE, 6 kDa (in vitro) ja 14 kDa (in vivo), esiin mahdollisuuden eri mekanismeja luovutusta. Se, että kaksi erilaista immunoreaktiivisia muotojen havaittiin voivat johtua solubiologian muuttaa solun viljely prosessi, ja on mahdollista, että vastauksena vamman 6 kDa vuodatetaan osaksi CSF, kun taas 14 kDa: n muotoon kuviossa 1B on konstitutiivisesti vapautetaan. Isoformivyöhykkeet havaittu voisi olla riippuvainen solutyypistä ja ehdollinen: olemme havainneet molemmat isomuodot että väliaine Transdusoitujen viljeltyjen eturauhasen epiteelisolujen (XD, käsikirjoitus tarkastelu) ja 6 kDa muodossa ex vivo malli tulehduksen (AK, käsikirjoitus valmisteilla). Kuva 1C tukee oletusta, että kytketystä 14 kDa: n muotoon vuodatetaan proteolyysin osaksi median. Lomake CSF kuitenkin (kuvio 1 B) voitaisiin vapauttaa (1) poistaminen kalvon ankkuri, (2) konstitutiivista vapautumista ER /Golgin reitin tai (3) toisen solutyypin alkuperän.

menetys augurin immunoreaktiivisuus CPE kudoksen vaurion jälkeen viittaa siihen, että on olemassa kolme altaat augurin: (1) peptidi vapautuu biologisiin nesteisiin, kuten CSF, (2) proteiini säilytetään solun pinnalla ja (3) peptidit, tallennetaan solunsisäisiä vesikkeleitä. Välittömän reagoinnin vahingon oletettavasti käsittely solun pinnalla ja seuraa nopeasti augurin vapautuminen solunsisäisiä varastointi rakkulat. Geeniekspressiotasot vaurion jälkeen (kuvio 3) peilin proteiinin tasot (kuvio 2), mikä viittaa siihen, että augurin vapautuu pian sen jälkeen vahinkoa ei täydennetään. Se havainto, että pienempi, prosessoidun muodon augurin löytyy elatusaineessa (kuvio 1 B, paneeli 3) esittää, että proteolyysin ja käsittely tapahtuu, kun solun pinnan irtoaminen. Biologinen toiminto, jos mikään, nämä fragmentit eivät ole tiedossa, mutta ne voivat olla erillään, että ehjän augurin kytkettyinä solun pinnalla (kuvio 5).

Normaali suonipunoksen epiteelin näihin Ecrg4 ja sisältävät merkittäviä 14 kDa augurin proteiini, joka on estävää konformaatiossa. Käsittelemättömän peptidin sisältyy 3 lokeroa (1) solunsisäisten rakkuloiden (eli pistemäisiä solunsisäinen värjäys kuviossa 1) (2) lähellä kammion solun pinnalla (eli polarisoitunut apikaalisella solujen värjäys kuviossa 1 ja (3) kytketyt solun pinnalla ( eli kuvio 1 B). kun vamma, äkillinen vapautuminen ja käsittely solun pinnalla seuraa vapautumisen solunsisäisten myymälöissä kuin ”paniikki signaali” osoittamaan systeemisiä vammoja. alkuperäistä pro-tulehdusreaktio sitten sammuu Ecrg4 geeniekspressiota ainakin 1-3 päivää vamman jälkeen. Siksi alkuvaiheessa vahinkoa, normaalin, konstitutiivisesti estävä toiminnot ovat poissa ja niin korjaus solut lisääntyvät. Koska geenin ilmentyminen palaa, liikkumattomuus on kunnostettu ja homeostaasin uudelleen käyttöön.

tässä esitetyt tulokset ovat yhteensopivia kaksi käyttötarkoitusta mallia augurin aktiivisuutta (kuvio 5). augurin normaalisti toimii kiinteän pisteen estävä tekijä, joka on konstitutiivisesti läsnä epiteelisolujen pinnalla mutta alkuajoista loukkaantumisen jälkeen, augurin fragmentit solun pinnalla voi olla salliva signaali vammoja aktivointia. Paikallinen lasku augurin keskittymä dysinhibit lisääntymistä ja kulkeutumista neuroprogenitor solujen SVZ. Todellakin, augurin yli-ilmentymisen CP ja ependyma vähenee BrdU otto ja nestiinifenotyypin immunoreaktiivisuus tässä, mikä osoittaa, että CPE-johdettu augurin säätelee leviämisen ja elinikä neuroprogenitors [3], [35], [36]. Sen dysinhibition voitaisiin ohjata kantaisä muutto vahingon sivuston rostraalisen vaeltavien virta [3], [35], [36]. Jos näin on, epigeneettiset sääntelyn Ecrg4 geenin ilmentymisen CP voisi auttaa vista herkkä tasapaino neuroprogenitor solun mobilisaatio SVZ korjaus- ja tukahduttamisesta kasvanut eston. . Edelleen kineettinen analyysit augurin jakelun ja Ecrg4 ilmaisun aikana akuuttien ja kroonisten vaiheiden toipuminen aivokuoren leesioista käsitellään tätä mahdollisuutta.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet

Kaikki tutkimukset käyttäen rotat suoritettiin ennakkohyväksyntää, ja mukaisesti, joko Institutional Animal Care ja käyttö komitea Brownin yliopiston (Providence, RI, hyväksymisnumeroita 0062-07 ja 0073-10) tai Home Office at Birminghamin yliopiston (Edgbaston, UK , hyväksyntänumero 3012720-19b2). Kaikki selviytyminen leikkauksia tehtiin aseptisissa olosuhteissa. Tissue kerättiin aikuisilta Sprague Dawley rottia pidettiin vakio valo /pimeä-olosuhteissa

mielinmäärin

pääsy ruokaan ja veteen. Sillä aivokudoksessa korjuu, rotat tapettiin CO

2 hengitettynä ja välittömästi perfusoitiin 4% paraformaldehydillä (PFA) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). Aivot poistettiin ja edelleen kiinteän yön yli PBS: ssä, joka sisälsi 20% sakkaroosia ja 4% PFA 4 ° C: ssa. The, aivot inkuboitiin PBS: ssä, joka sisälsi 30% sakkaroosia yön yli ja pakastettiin OCT-yhdiste kuivan jään päällä ja niitä säilytettiin -80 ° C: ssa jatkokäsittelyyn saakka.

Vasta-aineet

Immunofluoresenssi.

polyklonaalinen IgY vasta-aine nostettiin kanoilla rekombinantti ihmisen ECRG4 (71-148) ja antigeenin affiniteetin puhdistetaan kaupallista sopimusta Genway Biotech, Inc., (San Diego, CA). Puhdistettu esi-immuuni IgY samasta eläimestä käytettiin negatiivisena kontrollina immuunivärjäykseen rotan aivokudoksen ja vuohen anti-kana-AlexaFluor® 594 (Life Technologies, Carlsbad, CA) käytettiin havaitsemiseen. Western blotting: Affiniteettipuhdistettu kanin anti- ihmisen ECRG4 primaarista vasta-ainetta (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ja vuohen anti-kani-piparjuuri (HRP) konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (JacksonImmuno Labs, West Grove, PA) käytettiin havaitsemaan proteiinin Western blotting -analyysi.

virusvektorit

adenovirus vektori, joka sisältää siirtogeenin ihmisen Ecrg4 ORF (AD

ECRG4) valmistettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu. Adenoviruksen sisältävä siirtogeeni vihreän fluoresoivan proteiinin (AD

GFP, Vector BioLabs, Philadelphia, PA) käytettiin kontrollina.

Cell Culture

primaaristen ihmisen CP epiteelisolulinja hankittiin ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, CA) ja niitä viljeltiin Epithelial Cell Medium mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Adenoviruksen infektion maljan solut laskettiin ja transdusoitiin infektiokertoimella (MOI) 20.

Penetrating CNS Vaurion Malli

Rotat nukutettiin 5% isofluraanilla hapessa (1,7 L /min) ja annetaan 0,3 mg /kg buprenorfiinia ihonalaisesti analgesian ennen CNS-vamma. Anestesia arvioitiin tassu hyppysellinen refleksi. Kallo ensin alttiina kanssa sagittaalista viillolla pitkin keskiviivaa pään ja luomisen jälkeen Burr reikä kovakalvon kanssa hammaslääkärin poraa, vaurio tehtiin 3 mm oikealle bregmaan 7,5 mm kielihaarakkeen korvan-bar kone ja 3 mm syvä käyttäen oftalmisen veitsellä (Unitome veitsi, BD Waltham, MA). Aiheuttama vahinko transected aivokurkiainen ja veitsi haava tuli striatumissa. Olemme käyttäneet tätä vahinkoa mallia laajasti muissa tutkimuksissa [37], [38], [39], [40]. Ehjä rotta aivot un toimivia eläimiä käytettiin verrokkeina.

kokoelma rotan CSF

CSF näytteitä aikuisen Spragu-Dawley kerättiin kuten aiemmin on kuvattu [41]. Lyhyesti, rotat syvästi nukutetaan stereotaksiakehykseen pää nousee yli ruumiin. Tehtiin viilto ylhäältä pään pohjaan kaulan. Lihas vedettiin ympäri kallonpohjaan. Käyttämällä Hamilton ruiskuun, CSF poistettiin cisterna magna ja välittömästi jäädytettiin kuivajäässä. Rotat sitten tappoi terminaalin anestesian.

solupintaproteiini fraktiointi ja Immunoblottausmääritys

Ensisijainen ihmisen CPE-soluja infektoitiin AD

ECRG4 tai AD

GFP MOI 20 yli-ilmentää joko Ecrg4 tai GFP. Solun pinnan proteiinit olivat biotinyloitu ja vedetään alas käyttäen Cell Surface Protein Isolation Kit mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Pierce, Rockford, IL). Saostuneet proteiinit eluoitiin NeutrAvidin helmistä inkuboimalla 2% litium umdodekyylisulfaattinäytepuskuria pelkistävissä olosuhteissa yhden tunnin ajan 25 ° C: ssa. Immunoreaktiivinen proteiini havaittiin Western-blottauksella. Lyhyesti, proteiinit fraktioitiin koon on 4-12% Bis-Tris geeli SDS-PAGE. Proteiinit siirrettiin 0,2 um polyvinylideenifluoridia kalvo, joka blokattiin 5% naudan seerumin albumiinia (BSA) liuosta yhden tunnin ajan 25 ° C: ssa. Kanin anti-humaani augurin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) laimennettiin 1% BSA: ta konsentraatiolla 0,5 ug /ml, ja inkuboitiin kalvon kanssa yön yli 4 ° C: ssa. Pesujen jälkeen PBS: llä, joka sisälsi 0,05% Tween-20, kalvoja inkuboitiin 0,1 ug /ml vuohen anti-kani-HRP-sekundaarisella vasta-aineella laimennettuna 1% BSA: lla yksi tunti 25 ° C: ssa, huuhdeltiin ja inkuboitiin sitten Super Signal West Pico