Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viimeisten kahden vuosikymmenen aikana, solun pinnan proteaasien kuuluvat tyypin II transmembraani- seriiniproteaasin (TTSP) perhe ovat nousseet tärkeitä entsyymejä nisäkkään degradome, pelaa kriittinen rooli epiteelin biologia, sääntely metabolisen homeostaasin, ja syöpä. Ihmisen hengitysteissä trypsiinin kaltainen proteaasi 5 (HATL5) on yksi harvoista perheenjäsenten, joka jää tuntemattomia. Tässä me osoitamme, että HATL5 on katalyyttisesti aktiivinen seriiniproteaasi, joka inhiboi kahden Kunitzin tyyppistä seriiniproteaasi-inhibiittorit, hepatosyyttikasvutekijän inhibiittori (HAI) -1 ja 2, sekä serpinA1. Täyspitkä HATL5 on lokalisoitu solun pinnalla viljellyissä nisäkässoluissa kuten on osoitettu konfokaalimikroskopialla. HATL5 näyttää suhteellisen rajoitettu kudosekspressiotutkimuksen profiilin, jossa on sekä transkripti ja proteiinin läsnä kohdunkaula, ruokatorvi, ja suuontelon. Immunohistokemiallinen analyysi paljasti ekspressiokuviota jossa HATL5 on lokalisoitu solun pinnalla eriytetty epiteelisolujen kerrostunut levyepiteelien kaikki kolme näistä kudoksista. Mielenkiintoista, HATL5 merkittävästi vähentynyt kohdunkaulan, ruokatorven, ja pään ja kaulan karsinoomat verrattuna normaaliin kudokseen. Analyysi kohdunkaulan ja ruokatorven syöpä kudosmatriisien osoittivat, että squamous epiteelisolujen menettävät ilmaus HATL5 proteiinin kun pahanlaatuisiksi.

Citation: Miller GS, Zoratti GL, Murray AS, Bergum C, Tanabe LM, List K ( 2014) HATL5: Cell Surface seriiniproteaasigeenin Differentially ilmoitettuna epiteelisyövissä. PLoS ONE 9 (2): e87675. doi: 10,1371 /journal.pone.0087675

Editor: Claudia Daniela Andl, Vanderbilt University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 lokakuu 2013; Hyväksytty: 28 joulukuu 2013; Julkaistu: 03 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Miller et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat käynnistyksen varoja Wayne State School of Medicine ja Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tyypin II transmembraani- seriiniproteaasien jaetaan neljään fylogeneettisesti erillistä subfamilies: ihmisen hengitysteissä trypsiinin kaltaista (HAT) /differentiaalisesti ilmaistut okasolusyöpä geeni (DESC) alaperheessä hepsiinin /transmembraanisen proteaasi seriini (hepsiinin /TMPRSS) alaperheen, matriptase subfamily, ja Corin subfamily. HATL5 kuuluu HAT /laskeva subfamily yhdessä HAT, DESC1, TMPRSS11A ja HAT-kuin 4 [1] -. HATL5 (HATL-5, HAT-like 5) koodaa TMPRSS11b geeni sijaitsee yhden geenin klusterin käsittää kaikki HAT /laskeva geenit sekä hiirillä että ihmisillä [4]. Kaikki jäsenet HAT /laskeva subfamily koostuvat varren alueella, jossa on yksi merisiili sperma proteiini, enteropeptidaasin, agriini (SEA) domeeni ja C-terminaalinen seriiniproteaasidomainissa. On olemassa laaja määrä kirjallisuutta dokumentointia kriittisiä rooleja jäsenten hepsiinin /TMPRSS, matriptase, ja Corin subfamilies fysiologisissa ja patologisissa prosesseissa. Kriittinen roolia näissä TTSPs on kuvattu eri aloilla ja sisältävät epiteelin kehittäminen ja homeostaasiin, raudan aineenvaihduntaa, kuulo, ruoansulatus, verenpaineen säätelyyn, sekä virusinfektio, tulehdus, ja oncogenesis [3] [5], [6]. Verrattain harvat tutkimukset kuvaavat biokemialliset ominaisuudet HAT /laskeva subfamily ja /tai tutkimalla niiden fysiologisia toimintoja on julkaistu. HAT on raportoitu olevan fibrinogenolytic aktiivisuutta, moduloimaan urokinaasireseptorin, ja aktivoimaan par-reseptori (PAR) 2 [7] [8], [9] [10], [11]. Lisäksi HAT voi uncoat reovirus- virionien edistää infektion soluviljelmässä ja lohkaisee pintaglykoproteiinille, hemagglutiniini (HA), influenssaviruksen [12] [13], [14]. Äskettäin tutkimus työllistää geneettinen ablaatio TMPRSS11A ja HAT hiirillä osoitettu, että kaksi proteaasit ovat tarpeeton kehitys, yleinen terveydentila, ja pitkän aikavälin selviytyminen ilman ulkoisia haasteita tai geneettisiä puutteita [15].

tässä tutkimuksessa suoritimme biokemiallinen luonnehdinta ja ilmaisun analysointi HATL5. Täyspitkän HATL5 cDNA ohjaa ilmentymistä 60 kDa: n N-glykosyloitu proteiini, joka paikantuu solun pinnalle nisäkässoluissa. Puhdistettu aktivoitu HATL5 seriiniproteaasidomainissa hydrolysoi synteettisen peptidin substraatteja, ja inhiboituu jäsenten kahden eri seriiniproteaasi-inhibiittori perheille: Kunitz-tyyppinen; HAI-1, HAI-2 ja aprotiniini ja serpin perheenjäsen; serpinA1. HATL5 proteiini lokalisointi on huomattavan samankaltainen kolmessa eri kudoksissa analysoitiin: kohdunkaula, ruokatorvi, ja suun limakalvoilla. Näin ollen, HATL5 on pääasiassa havaittu pinnalla epiteelisolujen näissä kerrostunut levyepiteelien. Aikana Karsinogeneesin ilmentyminen solun pinnan proteaasi on suurelta osin vähentynyt, ja monissa tapauksissa, huomaamaton levyepiteelin karsinoomasoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

käyttö ihmisen kudoksen parafiini paneelit hyväksyttiin mukaan institutionaalisten ohjeiden mukaan Wayne State University Institutional Review Board Administration (# 2013-43).

kloonaus ja ilmentäminen täyspitkä ihmisen HATL5

ihmisen ruokatorven RNA saatiin BioChain (Newark, CA). Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi suoritettiin Oligo (dT) alukkeita käyttäen RETROscript mukainen pakkaus valmistajan ohjeiden (Ambion, Life Technologies, Grand Island, NY). Alukkeilla oli suunniteltu täyspitkä ihmisen HATL5 käyttäen talletettu sekvenssi

Homo sapiens

transmembraaninen proteaasi, seriini 11B, mRNA, GenBank # BC126195.1. Alukkeita 5′- GCCACCATGTAC-AGGCACGGCATATC-3 ’ja 5′-GAGTCCAGTCTTGGATGTAATCC-3’ käytettiin monistamiseen cDNA käyttäen hifi-Platinum®Taq polymeraasia (Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY), joka sitten insertoitiin pcDNA 3.1 /V5-His TOPO®- TA (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) kehyksen sisällä C-terminaalista HIS-tag ja V-5 epitoopin. Konstrukteja varmistettiin sekvensoimalla (ABI Prism 3730 DNA Analyzer, Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY). Transfektio HEK293 ja COS-7-solut (ATCC, Manassas, VA) suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY). Soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen media (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA). Transfektio suoritettiin 4,0 ug täyspitkän HATL5 sisältävän plasmidi-DNA. Solut hajotettiin käyttäen RIPA-puskuri: 150 mM NaCl, 50 mM Tris /HCl, pH 7,4, 0,1% SDS, 1% NP-40, ja proteaasi-inhibiittoriseosta (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ja kirkastettiin sentrifugoimalla 12000 × g 4 ° C °. Proteiini pitoisuudet määritettiin käyttämällä Piercen BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA). Proteiini Näytteet erotettiin SDS-PAGE käyttäen 4-12% NuPAGE Bis-Tris geeleillä (Life Technologies, Grand Island, NY), pelkistävissä olosuhteissa ja analysoitiin Western blot -menetelmällä käyttämällä ensisijaista V-5 hiiren monoklonaalinen vasta-aine (Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY) ja vuohen anti-hiiri-alkalinen fosfataasi-konjugoitu vasta-aine (Millipore, Billerica, MA).

kloonaus ja ilmentäminen ihmisen HATL5 seriiniproteaasin Domain Pro-muoto

ihmisen HATL5 seriiniproteaasi (SP) domain kloonattiin pSecTag2a plasmidiin (Life Technologies, Grand Island, NY) ilmaisun ja analyysi nisäkässoluviljelmässä. HATL5 seriiniproteaasi domeenin sekvenssi ihmisen täyspitkän HATL5-V5-His-plasmidi oli PCR-monistettiin käyttämällä seuraavia alukkeita: 5′-CCAAGGATCCATGTTGTGGGAGACAAGTAGCCAAC-3 ’ja 5′-CCAAGCGGCCGCGAGTCCAGTCTTGGATGTAATCC-3’. Saatu PCR-fragmentti kloonattiin pSecTag2a vektoriin BamHI ja Notl käyttäen standarditekniikoita. Transfektio CHO-soluja (ATCC, Manassas, VA), proteiini uuttamalla, ja Western blot -analyysi suoritettiin kuten edellä on kuvattu. Hiiren monoklonaalinen anti-Myc-vasta (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) käytettiin havaitsemiseen Western blottauksella.

kloonaus ja ilmentäminen HATL5 Active seriiniproteaasidomainissa in

Pichia pastoris

ihmisen HATL5 aktiivinen seriiniproteaasidomainissa tuotettiin hiivassa käyttämällä Pichia Expression Kit (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY). Kloonaamista varten pPIC9 vektoriin, HATL5 seriiniproteaasi sekvenssi pcDNA 3.1 V5 /HIS /TOPO ihmisen HATL5 plasmidi mutatoitu poistamaan Xhol käyttäen Agilent Quick-Change II ™ kohdennettu mutageneesi Kit (Agilent Technologies, Inc. Santa Clara, CA). Alukkeet mutageneesiä varten olivat: 5′-gccaggtgtctatactcgggtgacttcttatcgcaattgg-3 ’ja 5′-ccaattgcgataagaagtcacccgagtatagacacctggc-3’. Mutageneesi saatiin yksi synonyymi pistemutaatio, mikä jäljittelee natiivin aminohapposekvenssin. Mutageneesin jälkeen, ihmisen HATL5 seriiniproteaasidomainissa monistettiin ja kloonattiin pPIC9-vektorin Xhol- ja Notl-kohtiin, käyttäen alukkeita 5′-tctctcgagaaaagaattgtgaatggaaaaagctccc-3 ’ja 5′-attcgcggccgctcagagtccagtcttgg-3’. Kloonaus johti HATL5 aktivoitu seriiniproteaasidomainissa sekvenssi (Ile-Val-Asn), joka on asetettu välittömästi Leu-Glu-Lys-Arg-KEX2 pilkkomiskohdan, jota koodaa vektorin. Leu-Glu-Lys-Arg-Ile-Val-Asn pilkkoutuu Arg ja Ile hiivan proteaasi KEX2 joka on transmembraaninen proteaasi sijaitsevat Golgin tehden erittyvä aktivoitu HATL5 seriiniproteaasidomainissa. Expression of matriptase aktiivisen seriiniproteaasi domain

Pichia pastoris

suoritettiin rinnakkain kuvatulla [19]. Transformaatio suoritettiin TOP-10 -soluihin (Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) ja pPIC9-HATL5 positiivista kloonia eristettiin ja monistettiin käyttäen standarditekniikoita. Transformaatioon

Pichia pastoris

, 40 ug pPIC9-ihmisen-HATL5, pPIC9-matriptase, pPIC9 tyhjä vektori pilkottiin SalI: llä, ja puhdistettiin fenoli-kloroformiuutolla. Elektroporaatio linearisoitu plasmidi osaksi GS115 hiivakanta (Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY) tehtiin 1,5 kV käyttämällä 0,2 cm: n kyvetteihin (BioRad, Hercules, CA), joka BTX-Transporator Plus (Harvard Apparatus Holliston, MA). Rekombinantin proteaasien elatusaine yksittäisistä hiivakloonien analysoitiin SDS-PAGE: lla ja Western blotting käyttämällä kanin anti-TMPRSS11b (Abcam, Cambridge, MA) tai kanin anti-matriptase-vasta-ainetta (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) . HATL5 ja matriptase proteiinit puhdistettiin anioninvaihtokromatografialla käyttäen HiTrap Q HP -pylvään (GE Healthcare, Pittsburgh, PA), kuten on kuvattu [16].

Chromogenic proteinaasi määritykset

määritykset suoritettiin 96-kuoppaisilla levyillä reaktion kokonaistilavuus 100 ui käyttämällä 50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCI, 0,01% Tween-20, 0,01% BSA laimentamiseen kaikista näytteistä. 5 nM puhdistettu aktiivinen yhdistelmä-HATL5 tai matriptase seriiniproteaasidomainissa inkuboitiin 37 ° C: ssa 60 min 100 pm synteettisen peptidin L-1720 Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA (Bachem, Bubendorf, Sveitsi) on puuttuessa tai läsnä ollessa (estäjä ja substraatti lisättiin samanaikaisesti) ja HAI-1 (60 nM) (R viisi jotka sijaitsevat seriiniproteaasidomainissa (Fig. 1A ja B). Katalyyttinen domeeni hiiren HATL5 sisältää olennaiset seriiniproteaasin katalyyttinen kolmikko jäämiä, H

225, D

270, S

366, ja alustan sitova taskutähteet, D

360, S

386 ja G

388. SWG motiivi katalyyttinen domeeni on konservoitunut kaikkien jäsenten HAT /laskeva subfamily ja ennustetaan sijaita yläreunassa alustan sitova tasku, paikannus leikkaussidosta siteen alustan oikeassa suunnassa (S

386WG in HATL5). Proteolytic aktivointi HATL5 ennustetaan edeltäneiden motiivi (K

184IVNG) risteyksessä pro- ja katalyyttisiä domeeneja. Nämä havainnot viittaavat siihen, että

TMPRSS11b

geeni todennäköisesti koodaa funktionaalista seriiniproteaasi.

(A) aminohapposekvenssi ihmisen HATL5 (UniProtKB /Swiss-Prot: Q86T26.3). Aminohappotähdettä koodaavat transmembraanidomeeni on alleviivattu. Alueella, jolla on homologiaa merisiiliä sperma proteiini, enteropeptidaasin, agriini (SEA) verkkotunnuksia on osoitettu kiinteällä viivalla ja trypsiinin kaltainen seriiniproteaasi domain on merkitty katkoviivalla laatikko. Katalyyttinen tähteet Hänen

225 (H), Asp

270 (D), ja Pa

366 (S) on merkitty neliöt. Mahdolliset N-glykosylaatiokohtia on merkitty piireissä. Aktivointi pilkkomiskohta on merkitty nuolella, ja kahden kysteiinitähteen ennustetaan muodostavan disulfidisillan, joka yhdistää varren alueen seriiniproteaasidomainissa aktivoinnin jälkeen lohkaisu on merkitty kolmioilla. (B) Kaaviokuva ennustetun verkkotunnuksen arkkitehtuuria HATL5. TM = transmembraanidomeeni, SEA = Merisiilin sperma proteiini, enteropeptidaasin, agriini domain, N ilmaisee ennustettu N-glykosylaatiokohtia, aktivointi katkaisukohta on merkitty nuolella, ja SS edustaa disulfidisilta yhdistää SEA ja seriiniproteaasin verkkotunnuksia [31 ].

HATL5 on 60 kDa: n glykosyloitu

karakterisoimiseksi HATL5 koodaama proteiini

TMRSS11b

geeni, täysipituinen ihmisen cDNA tuotettiin hifi-PCR käyttämällä ihmisen ruokatorvi cDNA-kirjastosta. CDNA sekvensoitiin, varmistettiin olevan identtinen ennustettu cDNA-sekvenssin, ja insertoitiin nisäkkään ilmentämisplasmidilla kalustettu ekspressoidun proteiinin kanssa V5-His-epitooppimerkin on C- terminuksessa (Fig. 2A, ylhäällä). Lisäksi, nisäkkään ilmentämisvektoriin, joka sisältää pro-muoto seriiniproteaasidomainissa, mukaan lukien 15 aminohappoa ylävirtaan aktivointi päällä, ja C-terminaalinen Myc-leima oli tuotettu (kuvio 2A, keskellä) samoin kuin

Pichia pastoris

vektorin erityksen pilkkoa aktiivisen muodon seriiniproteaasidomainissa (kuvio 2A, alhaalla). Transfektion jälkeen täyspitkän HATL5 vektori HEK293, COS-7, tai CHO-soluissa, vastaavasti, solulysaateista analysoitiin SDS-PAGE: lla ja Western blot. Kaikissa kolmessa solulinjoissa, proteiini tuote noin 60 kDa: n havaittiin (Fig. 2B). Tämä näennäinen molekyylipaino on merkittävästi korkeampi kuin ennustettu molekyylimassa 46 kDa, mikä viittaa siihen, että HATL5 edellyttää translaation jälkeisiä modifikaatioita. Tutkia, onko ilmaistu HATL5 voi olla translaation jälkeen modifioitu glykosylaatio, proteiinien uutteet transfektoiduista HEK293, COS-7, tai CHO-solut alistettiin entsymaattiseen deglykosylaatio ennen western blot -analyysillä. Deglykosylaatiota täyspitkän HATL5 johti syntymistä ~48 kDa laji, joka oli läsnä otteita kaikissa kolmessa solulinjoista (kuvio. 2B). Kun otetaan huomioon, että V5-His-tag lisätään noin 5 kDa rekombinanttiproteiinin, deglykosyloituneet muoto täyspitkän HATL5 on näennäinen molekyylipaino hyvin lähellä ennustettu molekyylimassa. Viisi kahdeksan mahdollista N-glykosylaatiokohtaa sijaitsevat seriiniproteaasidomainissa. Sen määrittämiseksi, onko seriiniproteaasidomeenin HATL5 on glykosyloitu, seriiniproteaasia pro-muoto erittyy transfektoitujen CHO-solujen käsiteltiin deglykosylaatio entsyymien ja analysoitiin western-blottauksella. Ennen deglykosylaatio tässä muodossa näennäinen molekyylimassa oli 45 kDa (kuvio. 2C, vasemmalla). Ennustettu molekyylimassa tämän erittyvän muodon HATL5 on 30 kDa, mukaan lukien myc-tag. Kun deglykosylaatio, vähentää näennäinen molekyylimassa, että 30 kDa: n muotoon, ei havaittu. Samanlainen havainto tehtiin heti deglykosylaatiotek- on korvamerkittöminä pilkkoa aktiivinen HATL5 seriiniproteaasidomainissa erittämä transfektoitujen

Pichia pastoris

(ennustettu molekyylimassa = 26 kDa), joka johti muodossa, jonka näennäinen molekyylimassa oli noin 28 kDa ( Fig. 2C, oikealla). Yhdessä tämä analyysi osoittaa, että ihmisen HATL5 on 60-kDa: n glykoproteiini ja että yksi tai useampi viisi mahdollista

N

linkatun glykosylaatiokohtia seriiniproteaasidomainissa käytetään.

( A) Kaavamainen esitys kolmesta eri yhdistelmä-DNA-HATL5 proteiinit, jotka syntyvät tämän tutkimuksen. V5-H = V5-His-epitooppimerkin (B) kokosoluproteiinikuviot lysaatit HEK293, COS-7, tai CHO-soluja, jotka ilmentävät täysipituista V5-His-merkitty ihmisen HATL5. (C) elatusaine CHO-soluista jotka ilmentävät myc-merkitty HATL5 seriiniproteaasidomainissa tai ilmastoidun median

Pichia pastoris

ekspressoivat halkaistut, aktiivinen HATL5 seriiniproteaasi analysoitiin. (B ja C) proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja analysoitiin Western blot -menetelmällä käyttämällä anti-V5, anti-myc tai anti-HATL5 vasta-aineita, kuten on ilmoitettu. Kaistat proteiiniuutoksilla käsiteltiin deglykosylaatio entsyymeillä ennen SDS-PAGE on merkitty (+), ja käsittelemättömän uutteet (-). Musta nuolenpäät osoittavat kannan glykosyloidun muotoja HATL5, ja avoin nuolenpäät osoittavat aseman deglykosyloituneet muotoja.

HATL5 on katalyyttisesti aktiivinen proteaasi

tutkimiseksi entsymaattisen ominaisuudet HATL5, seriiniproteaasidomainissa, mukaan lukien aktivoituminen pilkkomiskohdan ja 15 muuta aminohappoa ylävirtaan pilkkomiskohdan, ilmennettiin CHO-soluissa (kuvio. 2 keskellä). HATL5 proteiini erittyy kasvatusalustaan ​​yksiketjuisena pro-entsyymi. Samanlaista lähestymistapaa aiemmin käytetty matriptase-3 johti erittyvä proteiini, joka kykenee läpikäymään automaattinen aktivointi osoituksena pientä nousua elektroforeettisen liikkuvuuden ja sen hankittu proteolyyttinen aktiivisuus [18]. Erittyvän muodon HATL5 ei kuitenkaan näytä olevan auto-katalyyttisiä ominaisuuksia, koska inkubaatio erilaisissa eri olosuhteissa (puskuri koostumuksen, lämpötilan ja ajan) ei tuottanut havaittavia liikkuvuuden siirtymän tai katalyyttistä aktiivisuutta (dataa ei ole esitetty). Jotta ilmaista HATL5 ja välittävät proteolyyttistä hajoamista klo aktivointikohdan,

Pichia pastoris

ilmaisun järjestelmä käytettiin käyttäen solunsisäistä hiiva proteaasin, KEX2. KEX2-transmembraaninen seriiniproteaasi kuuluu subtilisiinin kaltaisina pro-proteiinin konvertaasi perheen spesifisiä lohkaisu jälkeen parittaisia ​​emäksisiä aminohappoja ja on lokalisoitu myöhäisessä Golgissa osastoon. Kloonaamalla HATL5 seriiniproteaasidomainissa osaksi PIC9 vektorin kanssa HATL5 aktiivisen seriiniproteaasi domeenin sekvenssi (

185IVNG) välittömästi LGKR KEX2 pilkkomiskohdan, jota koodaa vektori, uuden fuusio pilkkoutumiskohta luotiin (Fig. 2, pohjan ). LGKRIVNG sekvenssi pilkotaan Arg (R) ja Ile (I), jonka KEX2, tekee erittyvä aktiivinen HATL5 seriiniproteaasidomainissa. Expression of matriptase aktiivisen seriiniproteaasi domain

Pichia pastoris

suoritettiin rinnakkain kuvatulla [19]. Läsnäolo HATL5 seriiniproteaasin kunnostetussa mediaa

Pichia pastoris

klooneja transfektoitu PIC9-HATL5 vektori vahvistettiin western blottauksella käyttäen anti-HATL5 vasta-aineella (Fig. 3A, vasen). Mitään signaalia ei havaittu vakioitua elatusainetta klooneista transfektoitiin tyhjällä PIC9 vektorin tai PIC9-matriptase vektori. Vastaavasti anti-matriptase-vasta-aineen havaittiin erittyvän matriptase seriiniproteaasidomainissa sisään vakioitua elatusainetta transfektoitujen solujen PIC9-matriptase vektori (Fig. 3A, oikealla) ja ei klooneista, jotka on transfektoitu PIC9-HATL5 ekspressiovektorin tai PIC9 vektori ilman proteaasi insertti. Katalyyttisen aktiivisuuden HATL5 ja matriptase, vastaavasti, vahvistettiin käyttäen seriiniproteaasi kromogeenisen peptidolytic substraatin Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA (Fig. 3B). Esikäsitelty väliaine transfektoiduista soluista tyhjä PIC9 vektori sisällytettiin negatiivisena kontrollina sen varmistamiseksi, että ei ole häiritsevää erittyy hiivan proteaasit.

(A) väliaine näytteet

Pichia pastoris

kloonit transfektoitiin joko ekspressiovektorin ilman proteaasia insertti (vektori), jossa on HATL5 seriiniproteaasidomainissa cDNA (HATL5 # 1 ja # 2) tai matriptase seriiniproteaasidomainissa cDNA analysoitiin western-blottauksella käyttäen anti-HATL5-vasta-ainetta (vasen paneeli) tai anti-matriptase vasta-aine (oikea paneeli). Sijainnit HATL5 (avoin nuoli pää) ja matriptase seriiniproteaasidomainissa (musta nuoli pää) on merkitty. (B) Näytteitä elatusaineesta on kuvattu (A) inkuboitiin 37 ° C: ssa 60 minuutin ajan synteettisen kromogeenisen peptidin Suc-Ala-Ala-Pro-Arg-pNA (100 um) ja absorbanssi 405 nm: ssä kirjattiin (C) 5 nM puhdistettua aktiivista yhdistelmä-DNA-HATL5 (valkoiset pylväät) tai matriptase (mustat pylväät) seriiniproteaasidomainissa inkuboitiin 37 ° C: ssa 60 minuutin ajan synteettisen kromogeenisen peptidin MeOSuc-Glu-Val-Lys-Met-pNA (100 um ) puuttuessa tai läsnä ollessa (estäjä ja substraatti lisättiin samanaikaisesti) ja HAI-1 (60 nM), HAI-2 (40 nM), aprotiniinia (2 pm), leupeptiiniä (20 um), bentsamidiini (2 mM), tai serpinA1 (60 nM). Entsyymin toimintaa kullekin entsyymille on esitetty suhteessa aktiivisuutta ei inhibiittoria lisättiin.

vaikutus eri seriiniproteaasi-inhibiittoreiden vaikutus hydrolyyttistä aktiivisuutta puhdistetun HATL5 seriiniproteaasidomainissa kohti Suc-Ala-Ala- Pro-Arg-pNA analysoitiin myös käyttäen jälleen matriptase kuin hyvin kuvattu viite TTSP (Fig. 3C). HATL5 aktiivisuus väheni yleinen molekyylin seriiniproteaasien, leupeptiiniä ja bentsamidiinin. Täydellinen estyi kanssa pallomainen polypeptidin, Kunitz tyyppi seriiniproteaasiestäjän, aprotiniini (naudan haiman trypsiini-inhibiittori). Makromolekyylisen Kunitz tyyppi seriiniproteaasi-inhibiittorit, hepatosyyttikasvutekijän inhibiittori (HAI) -1 ja 2, on aiemmin osoitettu estävän useita jäseniä TTSP perheen, mukaan lukien matriptase, matriptase-2, HAT, hepsiinin ja TMPRSS13 [20] [21 ], [22] [23] [24] [25] [26] [27]. HAI-1 ja HAI-2 inhiboi HATL5 50% ja 75%, vastaavasti. Lisäksi HATL5 estyi jäsen serpin superperheen, serpinA1 (α

1-1-antitrypsiini).

HATL5 paikantuu solupinnalla soluviljelmää ja Stratifioitu levyepiteeleissä

analyysi HATL5 proteiinisekvenssin paljasti yksittäisen transmembraanidomeenin, joka osoittaa, että HATL5 proteiini, joka on samanlainen aiemmin tunnettu jäsenten TTSP perhe, voi sijaita solun pinnalla. Tutkia solunosasijaintia HATL5, HEK293-solut, jotka ilmentävät V5-merkitty täyspitkä proteaasin analysoitiin fluoresoivalla immunosytokemialla. Läpäisemättömiksi tehdyissä transfektoidut solut värjättiin primaarisella anti-V5-vasta-aineen ja AlexaFluor 568-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen analysoitiin konfokaalisella fluoresenssimikroskopialla. Transfektoidut HEK293-soluissa näkyy voimakkaan punainen fluoresoiva signaali, joka rajoittui plasmamembraanin (Fig. 4A, vasen paneeli). Kun ensisijainen vasta-aineet, joka on substituoitu ei-immuuni-lgG, ei ole havaittavissa olevaa värjäytymistä ei havaittu (kuvio. 4A, oikea paneeli). Vastaava kalvon värjäytyminen havaittiin Rinnakkaisessa kokeessa käyttämällä transfektoituja COS-7-soluissa (tuloksia ei ole esitetty).

(A) micrographs fluoresoiva konfokaalisen analyysi, joka osoittaa solun pinnan ilmentyminen edustavia esimerkkejä HEK293-solut transfektoitiin ohimenevästi ihmisen täyspitkän HATL5-V5-ekspressioplasmidin. Läpäisemättömiksi tehdyissä soluja inkuboitiin anti-V5-vasta-aineen (vasen paneeli) tai kontrollina ei-immuuni-vasta-ainetta (oikea paneeli), jonka jälkeen inkuboitiin AlexaFluor 568-leimatut sekundääriset vasta-aineet ja Hoechst-värjäys visualisoida ytimiä (blue; molemmat paneelit). Solut visualisoitiin konfokaalisella fluoresenssimikroskopialla at 543 nm: ssä (AlexaFluor 568) ja 405 nm: n virityksellä aallonpituuksilla (Hoechst). Sulautuneen kuvia saatu kahden viritysaallonpituuksia on esitetty. Koko palkit ovat 100 pm. (B) Expression of HATL5 (ylempi paneeli) tai GAPDH (alempi paneeli) viestin RT-PCR-analyysi mRNA uutetaan koko hiiren elimiä. (C) immunohistokemiallinen analyysi HATL5 ilmentymisen normaaleissa ihmisen kudoksissa. HATL5 proteiini havaittiin kanin anti HATL5-vasta ruokatorven musoca (C1, D1), kohdunkaulan limakalvon (E), suun limakalvojen (kieli) (F) ja kurkunkannessa (osa supraglottiset kurkunpään) (G). Ensisijainen vasta-aineet, joka on substituoitu ei-immuuni-kani IgG: tä leikesarjojen kaikki näytteet ja mitään merkittävää värjäytymistä ei havaittu (nuolenpäät C2, D2 ja ei ole esitetty). Vahva epiteelin värjäytymisen (nuolenpäät) havaitaan apikaalisella, squamous epiteelisolujen normaalin ruokatorven (C1, D1), normaali kohdunkaula (E), ja kielen (F) ilman merkittävää värjäytymistä mesenkymaaliset osastoon (merkitty tähdillä). Suurennos on suuri, HATL5 proteiini selvästi lokalisoitu solun pinnalla apikaalisella epiteelisolujen (nuoli pää D1). In epiglottis (G) värjäytyminen havaitaan squamous suprabasaalisissa epiteelisolut lisäksi apikaalisella soluihin. Epi = normaali epiteelin. Koko baareja kaikki paneelit; 50 um.

ekspression määrittämiseksi HATL5 kudoksissa, RT-PCR-analyysi suoritettiin kokonais-RNA useista aikuisen hiiren kudoksissa (Fig. 4B). Tämä analyysi paljasti, että HATL5 näyttää suhteellisen rajoitettu kudosekspressiotutkimuksen profiilin, jossa mRNA havaittiin 4 ulos 19 kudosten analysoitu: ruokatorvi, kohdunkaula, kielen, ja kivekset. Yhteistä välillä ruokatorvi, kohdunkaula, ja kieli on, että limakalvovuorauksissa näiden kudosten kaikki sisältävät kerrostunut levyepiteelillä. Tämä sai meidät tutkimaan jakeluun ja sijainti solun HATL5 proteiinia näissä kudoksissa immunohistokemiallisesti (IHC). Edustavia osat normaalin ruokatorven, kohdunkaulan, ja pään ja kaulan (kielen ja kurkunkannessa) limakalvo on esitetty kuviossa 4C. Käyttäen leikesarjojen, objektilasit tutkittiin kanin anti-HATL5 proteiinin tai käytettiin negatiivisina kontrolleina, jossa primaarinen vasta-aine oli substituoitu ei-immuuni-kani-IgG (Fig. 4C ja tietoja ei ole esitetty). Kaikissa kolmessa kudostyypeistä vahvan epiteelin värjäytyminen apikaalisella okasolujen, joilla ei ole merkittävää värjäytymistä submukosaalisen tai mesenkymaaliset osastoihin. HATL5 proteiini on pääasiassa lokalisoitu solun pinnoille suuremman okasolujen. Tämä solun pinnan lokalisointi on yhteisymmärryksessä odotettu jakautuminen ennustetun kalvon ankkuroitu topologia HATL5.