Krooninen sairaus

tiivistelmä

Duktaalinen haiman adenokarsinooman on ranking 4 potilaan kuoleman pahanlaatuinen sairaus länsimaissa, ilman tyydyttävää hoitoa. Me tutki uudelleen täsmällisemmin histonideasetylaaseja (

HDAC

) ja Sirtuin (

SIRT

) geeniekspressiomalleja haimasyövän enemmän haiman kasvaimia ja normaaleissa kudoksissa. Olemme myös examinedthe mahdollinen suhde

HDAC

geeniekspressiotasot ja pitkäaikainen sairaus lopputulokseen. Lisäksi olemme arvioidaan käyttämällä

in vitro

mallijärjestelmän ihmisen haimasyöpäkasvainsolulinjo- linja onko HDAC7 Knockdown voi vaikuttaa solujen käyttäytymiseen. Analysoimme 29 haiman adenokarsinooma (PA), 9 krooninen haimatulehdus (CP), 8 hyvänlaatuinen haiman (BP) ja 11 normaalia haiman kudoksista. Koskevat haiman adenokarsinooma, pystyimme keräämään koepaloja kasvaimen reuna. Arvioida mahdollista osallistumista HDAC7 soluproliferaatioon kapasiteettia, olemme luoneet ihmisen rekombinantti Pancin-1 kasvain, joka on ali-ilmentynyt tai yliekspressoidun HDAC7. Ilmaisu on

HDAC1,2,3,4,7 ja Nur77

kasvanut PA näytteet ovat merkittävästi korkeammat kuin vuonna CP ryhmässä (

p

= 0,0160, 0,0114, 0,0227; 0,0440, 0,0136, 0,0004, vastaavasti). Ilmentyminen HDAC7, oli merkitsevästi suurempi PA verrattuna BP kudosnäytteistä (

p

= 0,05). Mean mRNA transkriptio tasot PA

HDAC7

ja

HDAC2

olivat suuremmat verrattuna niiden vastine koepaloja otettu kasvaimen reuna (

p

= 0,0346, 0,0053, vastaavasti) . Lisäksi saadut tiedot käyttämällä konfokaalimikroskopia ja kvantitatiivisella immunofluoresenssivärjäyksen tukee voimakkaasti HDAC7 yli-ilmentymisen PA kirurgisista näytteistä. Kuolleiden määrä ja uusiutumista lopussa seuranta olivat merkittävästi suurempi potilailla, joiden yli-ilmentyminen

HDAC7

. Mielenkiintoista on, että kasvu oli merkittävästi vähentynyt, kun on kyse kantavan solun shRNA konstrukti kohdistaminen HDAC7 koodaavan geenin verrattuna emo-Panc-1 kasvainsoluja (p = 0,0015) 48 h ja 96 h (p = 0,0021). Tämä tutkimus tukevat voimakkaasti käsitystä, että HDAC7play rooli haiman adenokarsinooman etenemiseen.

Citation: Ouaissi M, Silvy F, Loncle C, Ferraz da Silva D, Martins Abreu C, Martinez E, et al. (2014) edelleen karakterisointi

HDAC

ja

SIRT

geeniekspressiomalleja in Haimasyöpä ja niiden suhde Disease tulos. PLoS ONE 9 (10): e108520. doi: 10,1371 /journal.pone.0108520

Editor: Wei-Guo Zhu, Pekingin yliopiston Health Science Center, Kiina

vastaanotettu 17. maaliskuuta 2014; Hyväksytty: 24 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 02 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Ouaissi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kliiniset tiedot ryhmitellään: SIRIC- Site INTEGRE de Recherche en Cancérologie, ohjelma nimeltä: Vaihtoehtoiset strategiat haiman syövän hoitomuotoja. Pyynnöt voidaan lähettää päällikkö osaston, Dominique Lombardo (puh: +33 (0) 491 324 402).

Rahoitus: Tätä työtä tukivat institutionaalisten rahoitusta INSERM (Pariisi, Ranska) ja Aix -Marseille Université (Marseille, Ranska) ja avustus Inca-DGSO-INSERM 6038 alkaen Sites de Recherche Intégrée sur le Cancer (SIRIC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Duktaalinen haiman adenokarsinooman on ranking 4 potilaan kuoleman pahanlaatuinen sairaus länsimaissa [1]. Aggressiivisuus tämä syöpä osoitetaan on taudin aiheuttama kuolleisuus mahdollisimman tarkasti esiintyvyys [2]. Syöpä diffuusio ja etäpesäkkeiden muodostavat noin 90% kaikista syöpään liittyvät kuolemat [2]. Etäpesäke seuraa monivaiheinen monimutkaisia ​​prosesseja, joissa lähialueiden tervettä kudosta tunkeutuu primaarikasvaimen solut, joihin pääsy verenkiertoon ja lopuksi lisääntyvät kaukaisiin kohtiin makroskooppinen sekundaarikasvaimia kautta verisuonia ja /tai perilymfaattinen kudoksen [3]. Siinä tapauksessa, haimasyövän, suurin osa potilaista on jo etäpesäkkeitä aikaan diagnoosin. Useat tutkimukset ovat keskittyneet mahdollisten markkereita, jotka voivat mahdollistaa varhaisen diagnoosin haimasyövän. Erityiset tapahtumat, jotka edistävät kasvaimen kehittymisen ja syövän etenemisen ovat sidoksissa monimutkaisia ​​mole- muutoksia, kuten DNA: n metylaatio, histoni asetylaatio, fosforylaatio, ubiquitylation ja ADP-ribosylaatio-osassa. Tällä hetkellä tulokset perustutkimuksesta korostavat asetylointi ja deasetylaatiolla tasolla paitsi histoni lysiinijäännöksissä mutta myös muita solun tekijöitä, jotka on tarkoitus häiritä geenin ilmentymisen säätelyyn. Itse asiassa, steady sate asetylointi ydinhistonien ohjataan vastakkaiset toimet histoni actetyltransferases (HAT) ja histonideasetylaaseja (HDAC: t), joiden toiminta korreloivat geeniaktivaatiossa ja geeni tukahduttamisen tai hiljentäminen [4]. Kasvava tietämys HDAC osoittaa, että ne ovat säätelijöitä kasvua, erilaistumista ja solukuolemaa (apoptoosia). Toimintahäiriöstä transkription repression välittämän HDAC voi johtaa syövän synnyn. Itse asiassa, modulaatio ekspressiotasoja koodaavien geenien HDAC: t (yli- ja /tai alle lauseke) on raportoitu eri syöpätyyppien [5], [6], [7], [8]. Luonnehdinta keskeisten geenien rooli haiman kasvainten kehittymiseen voi paitsi sallia löytääkseen uusia biomarkkereita, joka tulee keskittyä intensiivisen tutkimuksen etua, mutta myös valottaa mahdollisia geenituotteita voidaan hyödyntää suunnittelua varten valikoiva häiritä syövän etenemiseen. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat [9], [10], että HDAC2 yliekspressoitui haiman adenokarsinooman kudosnäytteistä. Voidakseen tarjota käsityksen biologista käyttäytymistä haimasyövän ja tunnistaa uusia potentiaalisia biomarkkereita, olemme viime vuosina käynnistänyt tutkimuksen, jonka tarkoituksena on tutkia tasot

HDAC

ja

SIRT

geenit ilmaisun joukko kirurgisesti resektoitiin haiman kudoksista mukaan lukien 11 haiman adenokarsinooma näytteitä ja normaalin haiman kudosta. Huolimatta suhteellisen pieni määrä näytteitä tutkittiin, löysimme voimistunutta ilmentymistä HDAC7, luokka IIa deasetylaasin, 9: ssä 11 näytettä [11], [12]. Vaikka olemme käyttäneet yhtä normaalia haiman kuin kalibraattori geenien ilmentymisen mittaukseen ja muita näytteitä lähellä tai kaukana kasvain verrokkeina, ajattelimme, että lisätutkimukset käyttäen suurempaa määrää normaalin haiman kudoksista ja kasvaimen näytteitä tarvitaan tutkia uudelleen täsmällisemmin

HDAC

ja

Sirts

geeniekspressiomalleja haimasyövän. Lisäksi pyrittiin tutkimaan mahdollisia suhdetta HDAC-geenin ilmentyminen ja sairauden lopputulos. Olemme myös arvioida käyttämällä

in vitro

mallijärjestelmän ihmisen haimasyöpäkasvainsolulinjo- linja onko HDAC7 Knockdown voi vaikuttaa solujen käyttäytymiseen.

Materiaalit ja menetelmät

Aihe väestö

Vuodesta toukokuu 2007 kautta elokuuta 2012, 29 haiman adenokarsinooma (PA), 9 krooninen haimatulehdus (CP), 8 hyvänlaatuiset haimatuumorien lukien vakavien cystadenoma (SC) n = 2, mucinous cystadenoma (n = 2), hyvänlaatuinen IMPN ( n = 2), hyvänlaatuinen kysta (retentional kysta, n = 1), ja haiman endokriinisten kasvainten (n = 1), otettiin maksu osasto kirurgian la Timone Hospital (Marseille, Ranska). Kaikki potilaat saivat varjoainetehosteisiin rinta- ja vatsaontelon tietokonetomografia, vatsan ultraääni, magneettikuvaus ja verikokeet. PA ei ollut ennen leikkausta hoitoa ennen leikkausta. Kaksikymmentäkaksi pancreaticoduodenectomies (PD), ja 7 vasemmalla pancreatectomies tehtiin haiman adenokarsinooma, vastaavasti. Kaksi PD, 4SP ja 3 Frey menettelyjä [13] tehtiin CP. Neljä PD, 2 SP ja 2 mediaalisen pancreatectomies tehtiin hyvänlaatuisen vaurioita. Neljä normaalia haiman (NP) koepaloja saatiin aikana maksansiirron luovuttajan hepatektomiaa, 7others saatiin aikana susmesocolic leikkauksen kun radikaali gastrectomy tarvitaan vasen pancreatectomy: 3 ampulloma (AP1-3), 2 kolangiokarsinooma pääasiallisen sappitiehyen (BD1-2) , 1 gastrinooma pohjukaissuolen (G), 1 viereisistä normaaleista kudosnäytteistä jälkeen mahalaukun resektio mahalaukun adenokarsinoomaa. Lisäksi 11 näytettä kontrollisilkkipaperia otettu kehällä kirurgisista näytteistä eri potilailla, joilla PA: myös tässä tutkimuksessa. Aineisto prospektiivisesti kerättiin ja standardoidun kyselyn valmistui aikaan seurata ja tutkimuksen arvioinnin. Ennen leikkausta kaikki potilaat olivat allekirjoittaneet tietoisen suostumuksen muoto, joka oli hyväksynyt paikallinen eettinen komitea. Suojelun komitean ihmiset Etelä Välimeren II hyväksytty ministeriön päätöksellä päivätty 31 toukokuu 2012, muodostivat alle järjestys pääjohtajan of Health Agency alueen Provence Alpes Côte d’Azur 13 päivänä kesäkuuta 2012, kokoonpanossa: L. BOYER, V. PRADEL, B. DUSSOL, C. Sichel, M. CAILLOL, F. Vincent, G. NAURAYE, JP. VIDAL, O. SCHWEITZER, J. ACCIARO, keskustella täysistunnossa ilmoituksen tiedostojen tallennukseen ja valmistautuminen tieteellisiä ihmiskehon tunnistetaan opetusministeriön korkeakoulu ja tutkimus viitteellä DC-2013-1857 ja jonka tieteellinen johtaja on Dominique LOMBARDO, antoi myönteisen asiantuntijaneuvoja (Files S1, S2).

Surgery

Kaikki kirurgiset toimenpiteet suoritettiin kolme kokenutta haiman kirurgien (BS, YPLT, IS, MO). Kokeneita vanhempi kirurgien suorittaa kaikki haiman pään resektion. PD suoritettiin käyttäen pylorus säilyttämiseksi tai Whipple menettely, ja end-to-end pancreaticojejunostomy (PJA) oli rakennettu yksikerroksinen anastomosis of keskeytynyt 5-0 PDS (Ethicon leikkaus) imeytyviä ompeleita. Valinta kirurginen tekniikka päätettiin per-operatiivisesti sidottu kirurgin päätöksestä. Anterior SMA lähestymistapaa sitten rutiininomaisesti käytettiin vuodesta 2001 yhtenäistää radicality on resektio on paikalla vatsakalvontakainen marginaalin. Standard imusolmukkeiden tehtiin ennen vuotta 2001 ja laajennettu imusolmukkeiden siitä lähtien [14]. Frozen jakso kokeet haiman trans-viivaa, tehtiin kaikissa tapauksissa ja ei tunkeutuneet kaikille PA. Standard imusolmukkeiden toteutettiin pitkin hepatoduodenal nivelside ja yhteisen maksan valtimo [15]. Kaikki asemointia tehtiin kautta laparotomy. Kun kyseessä on vasemman pancreatectomy: tekniikka distaalisen pancreatectomy alkaa jako haiman kaulan ennen valvonta pernan alusten käytettiin [16]. Varhainen kaula jako mahdollistaa turvallisemman verisuonten ohjaus. Sillä distaalinen pancreatectomy, ensisijainen osa kaulan ja pernan alusten ligaatio yhdistettynä jako vasen maha-Pakkaus rauhanen ja lyhyet mahalaukun alukset, edeltää mobilisointi on devascularized näytteen vähenee verenvuotojen ja näyttää parhaiten siitä carcinologic näkökulmasta. Leikkauksen jälkeen potilaat saivat adjuvanttihoitoa funktiona niiden suorituskyky asemasta, ja harkinnan onkologi. Kaksi pehmeää viemäriin (Peters) tai vasemmalle haiman osio vasemman pancreatectomy rutiininomaisesti sijoitettu lähelle pancreaticojejunal anastomose. Operatiivinen aika tallennettiin. Koska fisteli, viemärit poistettiin 7 päivän kuluttua.

kudosnäytteitä

Kaikki kirurgiset näytteet tarkistaa vanhempi patologi. Kliiniset ja patologinen lavastus (taulukko S1) arvioitiin uudelleen mukaan American sekakomitean Cancer TNM pysähdyspaikan haimasyövän koskevan PA. Kasvaimet olivat snap-jäädytetty RNA myöhemmin ja nestemäisen typen aikana 15 sekunnin ajan ja välittömästi varastoitiin -80 ° C: ssa. Kasvaimet ominaisuudet kirjattiin kaikilla potilailla (taulukko S1). Tämä sisältyi sen sijainti, keskikokoa diagnoosin, UICC lavastus, laajentaminen neoplastisen taudin diagnoosi, useita etäpesäkkeiden sivustoihin, kun läsnä ja imusolmukestatuksesta. Kaikki näytteet luokiteltiin luokituksen mukainen sääntöjen 6

painos (2002) American sekakomitean Cancer Staging Manuel (AJCC) [17]. Radicality of resektio luokiteltiin mukaan R-luokittelu International Union syöpää vastaan ​​(R0: no jäljellä kasvain, R1: mikroskooppinen jäljellä kasvain, R2: makroskooppisia jäljellä kasvain

in situ

) [18]. Vatsakalvontakainen marginaali luokiteltiin R1 jos jäljellä mikroskooppisen kasvain tunnistettiin 1 mm laajuisen viivaa [19]. Vuodesta 2002 patologinen tutkimus kirurgisen näyte standardoitu mukaan Luttges

et al.

Protokollaa [20], käyttämällä rutiinia musteella merkintä vatsakalvontakaiset trans-osiossa linjaa. Tapauksissa verisuonten resektio, täydellinen verisuonten segmentti oli upotettu ja molemmat päät tarkasteltiin erikseen ylimääräisenä resektio marginaalit.

Tissue hoito ja immunofluoresenssilla histologinen tutkimus

Tissue yksilöt (21 PA ja 6 NP näytteitä ) on rutiininomaisesti kiinnitettiin 10% formaliinilla, upotettiin parafiiniin ja edelleen leikataan 5 mm alueita välittömästi säilytettiin 4 ° C: ssa tai värjättiin hematoksyliinillä-magdalanpuna-sahrami (HPS).

Reagenssit ja mAb: t

Kun kyseessä on Western blot-analyysi, joka on hiiren monoklonaalinen anti-aktiini-vasta-aine ja POD-leimattua anti-hiiri-vasta-aineen {Sigma (St Louis, MO)}, käytettiin. Kanin polyklonaalinen anti-HDAC7 vasta-aine oli peräisin Euromedex (Souffelweyersheim, Ranska), POD-leimattua anti-kani-vasta-aine oli peräisin Cell Signaling (Beverly, MA). DMEM soluviljelyalustoissa, penisilliini, streptomysiini, trypsiini-EDTA: ta, hygromysiini B ja neomysiini oli Invitrogen (Carlsbad, NM) Tehdään Immunovärjäyksen, hiiren monoklonaalinen vasta-aine (mAb) anti-HDAC7 (20 ug /ml, Sigma-Aldrich, Ranska ), ja kanin anti-Nur77-vasta-aine (Ab) (5 ug /ml, Thermo Scientific, CergyPontoise, Ranska) käytettiin. Biotiini-konjugoitu F (ab ’) 2-fragmentti vuohen vasta-hiiri-IgG: tä (Beckman Coulter, Roissy CDG, Ranska) tai biotiini-konjugoitu vuohen anti-kani-IgG: tä (Sigma-Aldrich) ja HDAC7 ja Nur77 immunovärjäys käytettiin vastaavasti.

Immunofluoresenssi

Formaliinifiksoidusta, parafiiniin upotettujen kudosleikkeiden (5 um), poistettiin parafiini ja käsiteltiin antigeenin haku ratkaisu. Kudosleikkeitä inkuboitiin 2 h huoneenlämpötilassa (RT) ja anti-HDAC7 tai anti-Nur77 ja pestiin PBS: ssä. Sitten leikkeet pestiin PBS: ssä ja inkuboitiin 1 tunnin ajan RT: ssä 1:50 biotiini-konjugoidun F (ab ’) 2-fragmentti vuohen vasta-aineita hiiren IgG tai biotiini-konjugoitu vuohen anti-kani-IgG: n HDAC7 ja Nur77 immunovärjäys vastaavasti. Leikkeet pestiin PBS: ssä, käsiteltiin 1 h ajan RT: ssä 01:50 laimennoksella streptavidiini-fluoreskeiini (Beckman Coulter). Kaikki leikkeet kiinnitettiin vuonna Dako vesipitoisessa Kiinnitysliiman väliaineessa.

Osiot havaittiin avulla Zeiss Axiovert 200 M -käänteismikroskoopissa 20 tavoitteen ja konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi (CLSM) (Leica, TCS SP5) kanssa 60 tavoite. Argon laser, jossa on heräte 488 nm käyttää aktivoimaan vihreän fluoresenssin.

Image Processing

Kuvia käsiteltiin kuten aiemmin on kuvattu [11]. Kunkin primääristä vasta-ainetta, värjäytymistä laskettiin suhde koko fluoresenssin pinta-ala (yhteensä erityisiä fluoresenssi) ja pinta tällä alueella (keskiarvo fluoresenssin MSF). Keskiarvoja kuudella värjättyä alueilla kullekin koepala laskettiin sitten.

Seuranta

Leikkauksen jälkeinen seurantaan sisältyy kliininen, biokemiallisia ja radiologisia arviointi 3 kuukauden välein ensimmäisen postoperatiivisen vuosi sitten, 6 kuukauden välein jopa leikkauksen jälkeisen viiveen 5 vuotta ja sen jälkeen joka vuosi jopa 10 vuotta seurannassa. Ei kukaan potilas oli menettänyt seuranta. Elossa potilaat arvioitiin taudin uusiutumisen ja sivuston toistumisen. Seurantatiedot saatiin potilastiedot ja suora potilaiden kuulemiseen. Seuranta jatkettiin kaikilla potilailla tässä kohortissa kesäkuussa 2013 ilman, mukaan lukien uusia potilaita. Pitkäaikainen seuranta-aika oli saatavilla kaikille potilaille. Keskimääräinen kesto seuranta-aika oli 16 kuukautta (mediaani: 18 kuukautta, vaihteluväli: 2-53). Pituus eloonjääminen laskettiin alkaen operaation saakka kuolinpäivästä tai päivästä, joka tässä tutkimuksessa oli päättynyt.

Solun kasvua ja lisääntymistä

Pancin-1-solut (ATCC, CRL-1469) peräisin ihmisen haimakarsinooma kasvatettiin DMEM, jota oli täydennetty 10% FCS: ää, 1% penisilliini (100 U /ml), 1% streptomysiiniä (100 ug /ml) ja glutamiinia (1 mM). Solut ympättiin 4000-solujen

kohden

kuoppa 96-kuoppaiseen levyyn ja solujen kasvua arvioitiin 24, 48, 72 ja 96 h 3- (4,5-dimethythiazol-2-yyli) -2 , 5-difenyyli (MTT). Tulokset esitetään keskiarvona ± SD (n = 8), ja ne edustavat vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen.

Solut transfektion

hiljentäminen on HDAC7 geenin suoritettiin stabiili transfektio Panc-1-soluja jossa SureSilencing shRNA Plasmidi ihmisille HDAC7 (Qiagen, Courtaboeuf, Ranska), joka antaa hygromysiini vastustuskykyä transfektoitujen solujen. Yli ilmentyminen HDAC7 suoritettiin stabiili transfektio käyttämällä pCDNA3-HDAC7-Flag-plasmidi (plasmidi Addgene 13824, Eric Verdin, The J. David Gladstone Institutes, San Francisco, CA, [21]), joka antaa neomysiini resistenssi transfektoitujen solujen. Panc-1-soluja on 50-80% konfluenssiin transfektoitiin Lipofectamine LTX Reagent kanssa PLUS-reagenssia (Invitrogen) valmistajan ohjeiden mukaisesti ”ohjeita. Sen jälkeen 6 tunnin inkubaation jälkeen 37 ° C: ssa 5% CO2: ta, transfektio elatusaine korvattiin täydellisen DMEM väliaineessa 48 h ja sitten tuoretta alustaa, joka sisälsi 300 ug /ml hygromysiini B (shRNA plasmidi) tai 2 mg /ml neomysiiniä (pCDNA3 -HDAC7-Flag plasmidi). Jälkeen 1-2 viikkoa, selektiivisellä alustalla raja laimennus suoritettiin. Valitut kloonit kutsutaan SH tai pFLAG-solukloonien, vastaavasti. Ohjaus Transfektiot suoritettiin käyttäen shRNA CTL-vektori tai pCDNA3 tyhjän vektorin.

SDS-PAGE ja Western blotting

Solut pestiin kolme kertaa jääkylmällä PBS: llä, kerättiin ja pelletoitiin sentrifugoimalla. Pelletit pestiin kahdesti ja lyysattiin 4 ° C: ssa 0,1 ml: aan lyysipuskuria {50 mM Tris /HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 1 mM EDTA, proteaasi-inhibiittoreita (Complete TM, Roche Diagnostics)} . Homogenaatteja inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja kirkastettiin sentrifugoimalla 10 000 g 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja jäädytettiin -20 ° C: ssa. Alikvootti säästettiin proteiinin määritys käyttäen Bicinchoninic Acid Kit (Sigma, St. Louis). Samanlaiset määrät solulysaateista (100 ug) vähentämisessä SDS-puskurissa erotettiin kaltevuus 8-16% Tris-Glycine polyakryyliamidigeeleillä (Pierce). Elektroforeettisen migraation, proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille ja käsitellään immunoblottauksella käyttämällä sopivia ensisijainen ja toissijainen vasta-aineita. Pesujen jälkeen kalvot paljastui kemiluminesenssin (Roche diagnostiset, Meylan, Ranska).

RNA: n eristys ja käänteinen transkriptio

kudokset (≈30 mg) hajotettiin 600 ul Buffer RLT Plus ( Qiagen) käyttämällä sovitettu kokoinen alus häiriöitä ja homogenointi Tissue Ruptor. Kokonais-RNA eristettiin käyttäen Kaikki Prep DNA /RNA Mini Kit (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA-pitoisuus määritettiin absorption ja RNA eheys tarkistettiin RNA Nano sirut (Agilent, Santa Clara, CA). Käänteistranskriptio (RT) reaktio suoritettiin 1 ug kokonais-RNA: sta käyttäen IMPROM-II Kit (Promega, Madison, WI), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. T hän solut kerättiin ja pelletit RNA puhdistus käsiteltiin välittömästi RLT lyysipuskuria (Qiagen). Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini -kittiä (Qiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA-näytteitä käsiteltiin DNaasi I: llä (DNA-free-sarja, Ambion Inc., Austin, Texas) jälkien poistamiseksi epäpuhtauksien genomista DNA: ta. Käänteistranskriptio (RT) reaktio suoritettiin 1 ug kokonais-RNA: sta käyttämällä sattumanvaraisia ​​heksameerejä ja M-MLV-käänteistranskriptaasia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (Q RT-PCR)

Q RT-PCR-reaktiot suoritettiin kolminkertaisina kahteen toisistaan ​​riippumattomaan RNA valmisteet solu- kloonit käyttäen LightCycler480 SYBR Green I Master sekoitetaan ja LightCycler reaaliaikainen PCR-instrumentti (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Saksa), kuten aikaisemmin on kuvattu [12]. Alukkeet on esitetty taulukossa S2. Alukkeet suunniteltiin monistamaan noin 200 bp: n fragmentti koodaavan sekvenssin 11 kuuluvien geenien HDAC /SIR perheitä. 28S RN geeni valittiin ohjaus. Vertaileva rajanylityspaikan Ct-arvot (keskiarvo

Cp

) ja 4 NP ja 7 normaalin haiman koepaloja varten joukko HDAC ja SIRT sekä Nur77 geenejä osoitti, että ne olivat samanlaiset arvot ilman tilastollisesti merkittävä ero (kuvio 1, taulukko S3). Näin ollen 11 koepaloja näytteiden suunniteltu kontrolliryhmään (CG), ja niiden keskiarvo

Cp

arvot kaikkien geenien määritettiin ja käytettiin kalibraattori. 2

-ΔΔCt menetelmää käytettiin analysoimaan suhteellisen geeniekspression [22]. Keskimääräinen Ct (Cp-arvot) laskettiin sekä kohteen ja 28S-geenin ja ACt (C

t,

tavoitteen

-C

t,

28S

) oli määritetään. CG käytettiin kalibraattori [laskemiseksi ΔΔC

t = (C

t,

tavoitteen

-C

t,

28S

) – (C

t,

tavoitteen CG

-C

t,

28S CG

)] [22]. Sillä CG, ΔΔC

t on nolla ja 2

0 on yksi, niin että kansi muutos geenien ilmentyminen suhteessa CG vastaa yhtä. Arviointi 2

-ΔΔCt osoittaa kertainen muutos geenien ilmentyminen suhteessa CG.

Mean Cp HDAC-entsyymeistä, Sirts ja Nurr77 geenejä ja 28S-transkriptien kudosten näytteiden kontrolliryhmässä. qPCR ajettiin kolmena rinnakkaisena kaksi riippumatonta cDNA valmisteet haiman kudoksista, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Keskimääräinen Cp arvot Ct (keskiarvo Cp) määritettiin seuraavat näytteet: NP-1-4, normaali haima; BD-1 ja 2, normaali haima näytteitä potilaista kuljettaa sapen kanavaan kasvaimia. AP-1-3: normaali viereisiin kudoksiin näytteitä ampulloma; G-A: normaali viereinen kudosnäytteistä jälkeen mahalaukun resektio mahalaukun adenokarsinooman; Gastrinooma: normaali viereisten kudosten näytteitä gastrinooma pohjukaissuolen.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Graph Pad 5 -ohjelmaa. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta tai mediaani kanssa kvartiilivälejä. Erot kahden ryhmän analysoitiin käyttämällä U-testi tai opiskelija testi t. Yksisuuntainen varianssianalyysi tai Kruskalin-Wallisin testi suoritettiin vertaamaan enemmän kuin kaksi ryhmää.

Jos haluat vertailla kategorisen muuttujia, chi-neliö testi tai Fisherin tarkkaa käytettiin. Kaplan-Meier-menetelmää käytettiin arvioitaessa yleistä ja uusiutumisen vapaa elinaika. Kaikissa testeissä, p-arvo on alle 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Expression of HDAC, SIRT ja Nurr77 hallita haiman kudoksista

paneeli 11 normaali haima kirurgisista näytteistä tutkittiin. Näiden kudosten näytteet arvioitiin HDAC: t, Sirts ja Nur77 mRNA tilan kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä. Kuten kuviosta 1 ja taulukko S3), kun otetaan huomioon rajanylityspaikka (

Cp

), joka määrittää piste, jossa fluoresenssi nousee huomattavasti yläpuolella takaisin maahan fluoresenssi, todetut arvot kullekin geeniä eivät olleet tilastollisesti merkitsevästi erilainen (p-arvot vaihtelivat 0,13-1) viittaa siihen, että kohde-geenit ilmentyvät samanlainen tasoilla kirurgisista näytteistä tutkittiin. Tämä antoi meille mahdollisuuden määritellä 11 kirurgisista näytteistä kuin kontrolliryhmä (CG), siis käyttäen keskiarvoja niiden

Cps

kuin kalibraattori.

vertailu Q RT-PCR-analyysi HDAC , Sirts ja Nur77 expressionbetween haimasyöpä, krooninen haimatulehdus, hyvänlaatuinen kasvain ja kontrolliryhmän

edellisessä raportissa [12] olemme osoittaneet, että HDAC7 merkittävästi ilmaistaan ​​PA kudosnäytteistä. Koska vain 11 PA kudosnäytteet ja yksi normaali haiman koepala käytettiin, suoritimme qPCR analyysi

HDAC

,

Sirts

ja

Nur77

ilmaisun yhteensä 46 kudosten näytteet käsittävät 29 PA. Lisäksi 11 normaalin haiman kudoksista koepalat käytettiin kalibraattorin määrittelemään tarkemmin havaittavissa mRNA geeniekspressiotasot joukossa kudoksia PA, CP ja B. Mean

op

arvot (Ct) on

HDAC7

,

Nurr77

,

SIRT1

,

SIRT2

, olivat merkittävästi pienemmät PA ryhmässä verrattuna CG (

p

= 0,0010; 0,040; 0,0420; 0,0366, vastaavasti) (kuvio 2). Tämä tulos osoitti, että

HDAC7

,

Nurr77

,

SIRT1

,

SIRT2

ylittyivät huomattavasti ilmaistu PA näytteissä kuin CG niistä.

Näytteet ajettiin kolmena kappaleena kahteen toisistaan ​​riippumattomaan cDNA valmisteiden haiman kudoksista kuvatulla Materiaalit ja menetelmät osassa. (Cp) Ylityspaikka arvoja. Vertailuja tehtiin Wilcoxonin testi ja erot katsottiin merkitsevä p 0,05.

levitetään sitten 2

-ΔΔCt menetelmän analysoida suhteellisen geeniekspression kudosnäytteitä PA, B ja PC [22]. Kuten kuviossa 3A, ilmaus

HDAC1,2,3,4,7 ja Nur77

kasvanut PA näytteet ovat merkittävästi korkeammat kuin jos kyseessä CP ryhmän (

p

= 0,0160, 0,0114, 0,0227, 0,0440, 0,0136, 0,0004, vastaavasti). Lisäksi ilmaus HDAC7, oli merkitsevästi korkeampi PA verrattuna B kudosnäytteet (

p

= 0,05).

(B) SIRT geenien ilmentymisen haiman tuumorikudoksissa. Kudosnäytteitä Haiman adenokarsinooma (PA), Benin kasvain (B) ja krooninen haimatulehdus (CP). Punainen viiva: mediaani suhteellisten RNA-transkriptin tasot.

Q RT-PCR-analyysi osoitti, että ekspressio eri Sirts mRNA kudoksissa PA, CP, ja B (kuvio 3B). Vaikka jotkut merkittävää vaihtelua tasolla

SIRT

s geenin transkription voitaisiin osoittaa, data ei salli tunnistaa

SIRT

geeniekspressiotasot vaihtelu PA, CP ja B näytteitä.

entisestään verrattuna tasot geeniekspression joissakin yksilöitä missä pystyimme keräämään koepaloja kasvaimen reuna. Kuten kuviossa 4A, PA näytteet osoittivat tilastollisesti suurempi keskimääräinen mRNA transkriptio tasot

HDAC7

ja

HDAC2

verrattuna niiden vastine koepaloja otettu kasvaimen reuna (

p

= 0,0346, 0,0053, vastaavasti). Vaikka jonkin verran vaihtelua

Sirts

geeniekspressiotasot voitaisiin osoittaa välillä kudosnäytteitä, mitään sellaista merkittävää eroa kuin havaittiin

HDAC7

ja

HDAC2

näkyi. Nämä tulokset tukevat käsitystä, että joukossa

HDAC

ja

Sirts

geeniä tutkittiin,

HDAC7

ja

HDAC2

ovat kaksi geeniä, jolla on korkein mahdollisuus olla markkereita PA.

Haiman adenokarsinooma kasvaimet (PA), kauko koepaloja kudokset (RB).

Patterns ja ekspressiotasot HDAC7 ja Nur77

Kun käytetään HDAC7 mAb, värjäytyminen oli negatiivinen tai hieman positiivinen kontrolli tapauksissa (NP), kun taas voimakas positiivinen immunoreagoivuuden löydettiin kaikista PA (kuvio 5A). Analysoida tarkemmin tason immunovärjääminen kudosnäytteistä, kuusi värjättyä alueilla kullekin immunofluoresenssimenetelmällä kuvan kvantifioitiin mittaamalla MSF intensiteetti värjättyä alueilla. Kaikki PA näytteillä tilastollisesti suurempi MSF arvoja kuin kontrolli yksilöitä. Keskimääräinen MSF intensiteetin löytyi mAb HDAC7 lisääntyi merkitsevästi PA (keskiarvo = 173,78 ± 4,46) verrattuna kontrolliryhmään näytteet (keskiarvo = 54,31 ± 13,26) (kuvio 5B) (

P

= 0,0004) . Analyysi kuudesta värjättyä alueilla kullekin immunofluoresenssimenetelmällä kuvan mittaamalla MSF intensiteetti osoitti, että keskimääräinen MSF arvojen löytyi mAb Nur77 lisääntyi merkitsevästi PA (keskiarvo = 146,50 ± 8,07) verrattuna kontrolliryhmään näytteet (keskiarvo = 110,00 ± 4,41 ) (Kuva 6) (

P

= 0,0225).

lievä värjäytyminen löytyy NP. PA, voimakas värjäytyminen havaitaan sytoplasmassa ja yhdessä solun solukalvon. Alkuperäinen suurennus 250X. Kvantitatiivinen määritys keskimääräinen fluoresenssi on (MSF) (B). Kuusi alueet kussakin tapauksessa mitattiin. Mediaanit MSF intensiteetin saatu PA ja NP kudoksia edustavat vaakaviivat ja Kvartiiliväli edustaa laatikoita. (*

P

0,0004).

Kohtalaisen värjäytymistä havaitaan sytoplasmassa NP. PA-solut värjäytyivät voimakkaasti sytoplasmassa ja kohtalainen värjäytyminen havaittiin solujen solukalvojen. Alkuperäinen suurennus 250X. Kvantitatiivinen määritys keskimääräinen fluoresenssi on (MSF) (B). Kuusi alueet kussakin tapauksessa mitattiin. Mediaanit MSF intensiteetin saatu PA ja NP kudoksia edustavat vaakaviivat ja Kvartiiliväli edustaa laatikoita. (*

P

0,0225).

vaikutus

HDAC7, HDAC2 ja Nurr77

ilmaisun tuloksesta potilaan kanssa haiman adenokarsinooma

sitten tutkittiin mahdollisen yhteyden geenien transkription tasolla (

HDAC7

,

HDAC2

ja

Nurr77

) ja tulos tauti. Kuten kuvioissa 7, 8, 9 ja 10, ei havaittu tilastollisesti merkitsevää eroa näkyi ryhmien välillä kokonaistaloudellisesti ja taudista vapaan eloonjäämisen harkittaessa yksilöt ilmentävät enemmän alle 4 kertaa perustason geenin transkription tasolla. Kuitenkin, kun olemme analysoineet useita kuolemaan ja uusiutumista lopussa seurata, joukko kuoleman ja uusiutumisen olivat merkittävästi suuremmat potilaalla yliekspressioon

HDAC7

(4 kertaa perustason geenin transkriptio taso) (kuva 8) .

Overall (yhtenäinen viiva) ja taudista vapaan eloonjäämisen (katkoviiva).

N: peruslinjan transkriptio tason CG.

N : perusviivasta transkriptio tason CG.

N: peruslinjan transkriptio tason CG.

kehittäminen stabiileja ihmisen haiman solulinjojen ilmentävien tai yli-ilmentämään HDAC7

arvioimiseksi mahdollista osallistumista HDAC7 soluproliferaatioon kapasiteetti, me tuotettu ihmisen rekombinantti Pancin-1 kasvaimen solukloonien käyttäen neljä kaupallisesti saatavilla shRNA rakentaa ja vastaava ohjaus plasmidiin. Lisäksi pCDNA3-HDAC7-Flag plasmidia käytettiin saavuttaa yli-ilmentyminen HDAC7 proteiinia. Transfektiot suoritettiin myös käyttäen pCDNA3 tyhjän vektorin kontrollina. Transkriptio HDAC koodaavan geenin analysoitiin Q RT-PCR: llä.