Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-221 ja miR-222 sääntely on purettu monissa syövissä, mukaan lukien eturauhassyöpä. Kuitenkin, biologisen roolin ja taustalla olevien mekanismien miR-221 ja miR-222 patogeneesissä androgeenista riippumaton eturauhassyöpä eivät ole vielä selvillä. Lisääntyminen, apoptoosin, solusyklin ero, ja muuttoliike kapasiteetti eturauhasen soluja määritettiin seuraavan transfektoimiseksi miR-221 tai miR-222 estäjä. Biologisia vaikutuksia ja sääntelyn SIRT1 eturauhassyövän solut tutkittiin. MiR-221 ja miR-222 olivat erittäin ilmaistaan ​​PC-3-solujen verrattuna LNCaP-soluissa. Sen jälkeen miR-221 tai miR-222 ilmentyminen estyi, leviämisen ja siirtymänopeuksien PC-3-solujen vähentynyt ja apoptoosin nousi. Lisäksi SIRT1 proteiini säädelty soluissa sen jälkeen, kun ne transfektoitiin miR-221 tai miR-222-estäjän. Solut transfektoidaan siSIRT1 osoitti lisääntynyt maahanmuutto ja laski apoptoosin nopeudella, mutta ei ollut merkittävää vaikutusta soluproliferaatioon kontrolleihin verrattuna. Siellä oli negatiivinen korrelaatio miR-221 tai miR-222 ja SIRT1, mutta ei suoraa tavoitetta suhdetta tunnistettiin. Nämä tiedot osoittavat, että miR-221 ja miR-222 ovat erittäin ilmaistaan ​​PC-3-soluja. Heidän esto johtaa vähentyneeseen solujen lisääntymistä ja muuttoliike ja lisääntynyt apoptoosin eturauhassyövän soluissa. Nämä vaikutukset ovat potentiaalisesti välittävät säätely ylöspäin SIRT1.

Citation: Yang X, Yang Y, Gan R, Zhao L, Li W Zhou H, et al. (2014) Down-asetus mir-221 ja mir-222 Pidättele Eturauhassyöpä Cell Proliferation ja Migration Tämä johtuu osittain Tukena aktivointi SIRT1. PLoS ONE 9 (6): e98833. doi: 10,1371 /journal.pone.0098833

Editor: George Calin, University of Texas, MD Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 helmikuu 2014; Hyväksytty: 7. 2014; Julkaistu: 03 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China ja Zhejiangin maakunnan Natural Science Foundation (81170257 ja Y2110513). Tutkimus myös tukee sitä osittain MD Anderson Cancer Center Startup Fund. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia ja toiseksi yleisin syy syövän kuoleman miesten länsimaissa. Noin 238590 uutta tapausta diagnosoitiin vuonna 2013 [1]. Useimmat kumppanuus- kasvavat hitaasti ja ovat riippuvaisia ​​androgeenireseptorin kasvua; Näin he reagoivat androgeenideprivaatio hoitoon (ADT). ADT on tehokas, mutta useimmilla potilailla tauti tulee lopulta tulenkestävä ja etenemistä androgeeniriippuvaisissa PCa ja androgen riippumaton (kastraatio kestävä) PCa, mikä toi suuria haasteita hoitoon PCa [2]. Siten tunnistetaan uusi ja tehokas terapeuttinen lähestymistapa on tullut keskittyä torjunnassa PCa.

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä (noin 21-23 nukleotidia), ei-proteiini-koodaavat RNA: t, jotka toimivat jälkeisen transkription säätelijöinä kohdegeenien. Nämä molekyylit esiintyy lähinnä eukaryooteissa ja ovat integroitu kokonaan tai osittain, täydentävästi, jossa kohde-mRNA 3’UTR, jolloin hajoamisen tai käännös esto kohde-mRNA. miRNA toimintoja transkription ja transkription jälkeisen geeniekspression säätelyä, vaikuttaminen monissa solun biologisissa prosesseissa [3]. miRNA osallistuvat useisiin solujen erilaistumiseen, proliferaatioon ja apoptoosiin prosesseja, jotka liittyvät läheisesti kasvaimien syntyyn [3]. Viime aikoina jotkut poikkeavasti ilmaisivat miRNA löydettiin PCa ja muiden syöpien, mikä osoittaa, että niillä on ratkaiseva merkitys molekyylitason mekanismi syövän synnyssä ja etenemisessä [2], [4] – [8]. Lisäksi tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-221 ja miR-222 sääntely on purettu monissa syövissä, mukaan lukien Eturauhassyövän [9] – [14], ja kahden miRNA tärkeä rooli kasvainten synnyssä ja etenemistä androgeeniriippuvaisissa PCa ja androgen riippumaton Eturauhassyövän [15] – [17]. Kuitenkin tulokset ovat ristiriitaisia ​​ja jopa kiistanalainen ja mekanismit eivät ole vielä selvillä.

Nisäkkäillä hiljaista tietoa säädin 1 (SIRT1) on jäsen Sirtuin perhe ja sen on osoitettu olevan erittäin homologisia SIRT2 hiiva [18]. SIRT1 tunnetaan myös NAD-riippuvaisten histonideasetylaasi ja säätelyyn osallistuvan monien fysiologisten prosessien, kuten solujen lisääntymisen, tulehdusvasteen, solusyklin ja solumigraatio [19]. Kuitenkin, ei tiedetä, SIRT1 toimii promoottori geenin tai estävä geeni, koska se on monimutkainen [20] – [23]. Sen tehtävä syöpä ei ole hyvin määritelty. Esimerkiksi SIRT1 osoitti anti-onkogeenin toimintaa ja sen ekspressiotaso liittyi ennusteen paksusuolensyöpä [24], [25]. Kuitenkin, sitä pidetään onkogeenin rintasyövän [26]. PCA kuitenkin rooli SIRT1 on edelleen kiistanalainen [27], [28].

Tässä tutkimuksessa selvitettiin heidän säätelevän roolin miR-221 ja miR-222 ja niiden mahdollisia molekyylitason mekanismeja PCa transfektoimalla miR-221 tai miR-222 estäjä PCA soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja plasmiditransfektiolla

Ihmisen PCa PC-3-solut (androgeeni-riippumattomia ) ja LNCaP (androgeeniriippuvaisissa) ostettiin Institute Biokemian ja solubiologian, Kiinan tiedeakatemia. Soluja ylläpidettiin F12 (Gibco, Carlsbad, CA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco, Carlsbad, CA) 37 ° C: ssa 5% CO 2-ilmakehässä.

pcDNA3.1- tyhjän vektorin (pEX-5), pcDNA3.1-HSA-miR-221-estäjän sienet (miR-221: n estäjä), pcDNA3.1-HSA-miR-222-estäjän sienet (miR-222: n estäjä), pGPU6-tyhjä (pGPU6) ja pGPU6-siSIRT1 (siSIRT1) syntetisoitiin GenePharma (Shanghai, Kiina). Villityypin SIRT1 3’UTR alue rakennettiin osaksi psiCHECK-2 GenePharma (Shanghai, Kiina). PC-3-soluja kasvatettiin 80% -90% konfluenssiin ja transfektoitiin plasmideilla käyttämällä Lipofectamine 2000 (DNA /Lipofectamine 2000 = 1/2), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Neljä tuntia transfektion jälkeen elatusaine korvattiin tuoreella F12, joka sisälsi 10% FBS: ää. Vakaa transfektio ilmentyminen solulinjoissa määritettiin sen jälkeen, kun soluja oli inkuboitu täydellisessä F12 -alustassa G418 (1000 ug /ml) ja 15 päivää. Varmistimme kloonit käyttämällä western blot ja reaaliaikainen PCR, ja yhdistetään onnistuneen kloonit kokeita varten. Tarkastuksessa tulokset western blot on esitetty kuvassa S1. Lisäksi, kaikki kokeet vahvistivat myös lyhytaikaisella transfektiolla.

Solun proliferaation ja solusyklin määritys

solulisäkasvumääritykselle, me kylvetään PC-3-solujen vakaa ilmaisu (pEX- 5, miR-221 estäjä, miR-222 estäjä, pGPU6 tai siSIRT1) 96-kuoppaisille mikrolevyt tiheydellä 2 x 10

3 solua kuoppaa kohti ja inkuboitiin niitä eri aikoja (1 7d). Sen jälkeen 10 ui Cell Counter Kit-8 (CCK-8) reagenssia kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin soluja 37 ° C: ssa 1,5 h. Absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä käyttäen elektroluminesenssi immunosorbenttimääritys (ELISA-lukija).

solusyklin määrityksessä, transfektoidut solut ympättiin 12-kuoppalevylle 48 tunnin ajan. Solut kussakin kuopassa kerättiin ja kiinnitettiin 70%: isella jääkylmällä etanolilla 24 h -20 ° C: ssa. Sen jälkeen, kun pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) kolme kertaa, niitä inkuboitiin RNaasi 1 h jäillä ja värjättiin propidiumjodidilla 15 minuutin ajan jäillä. DNA jakauma mitattiin virtaussytometrialla 4 h.

apoptoosimäärityksessä

Stabiilisti transfektoidut solut ympättiin 12-kuoppalevyille ja niitä viljeltiin 48 tuntia. Sitten solut otettiin talteen ja kerättiin sentrifugoimalla 2000 rpm. Pesun jälkeen PBS: llä kolme kertaa, ne värjättiin anneksiini V-tehostetun vihreän fluoresoivan proteiinin (FITC) ja propidiumjodidilla (PI) 15 minuutin ajan valolta suojattuna. Solu apoptoosi korko määritettiin virtaussytometrialla 1 h.

Haavan paranemista määritys ja siirtokuoppaan migraatiokokeessa

haavan paranemista määritys suoritettiin jäljittelemään solujen vaeltamiseen [26]. Lyhyesti, transfektoidut solut maljattiin kuuden kuoppalevylle tiheydellä 1 x 10

6 solua kuoppaa kohti. Soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin ja useat haavan linjat naarmuuntunut pystysuoraan pohjaan kanssa 200 ul pipetin kärki. Pesun jälkeen PBS: llä kolme kertaa, solut inkuboitiin kasvualustassa, joka sisälsi 1,5% seerumia. Haava leveys määritettiin 24 tunnin välein aikana 72 h x 100 alle Nikon Eclipse TS100 mikroskoopilla (Nikon, Japani). Arvot ilmaistiin prosenttiosuutena haavansulkemiseen, joka laskettiin seuraavasti: prosentteina haavan = 1- (leveys

t Twitter /leveys

0

) x 100 %.

solun transwell migraatiokokeessa solut ilman ravintoa 24 tuntia, suspendoitiin uudelleen seerumittomalla F12 -alustassa, ja ympättiin (5 x 10

4-solut) läpi 24-kuoppaisille transwell kanssa 8- um huokosia kalvoon insert (Corning, USA). F12 -alustassa, johon oli lisätty 10% FBS: ää, pantiin alempaan kammioon kuin kemoattraktantti. Soluja inkuboitiin 72 tuntia. Solut, jotka tunkeutui kalvon kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 min, värjättiin kristallivioletilla 30 minuutin ajan ympäristön lämpötilassa, ja valokuvattiin mikroskoopilla (Nikon, Japani). Tunkeutuneet solut eluoitiin alas etikkahapolla. Absorbanssi mitattiin 590 nm: ssä ELISA-lukijalla.

Käänteinen transkriptio ja reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio

Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, kokonais-RNA uutettiin viljellystä soluista käyttämällä TRIzol (Invitrogen , USA) noudattaen valmistajan protokollia. Sillä miRNA ja SIRT1 käänteistranskription, 500 ng kokonais-RNA: ta käänteistranskriptio cDNA: ksi, jossa miRNA-spesifisiä RT-alukkeita (RiboBio, Kiina) ja satunnainen aluke (TaKaRa, Japani), vastaavasti. Geenien ilmentyminen mitattiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla (PCR) käyttäen Applied Biosystems 7500 Fast Sequence Detection System ja SYBR Green PCR Kit (QIAGEN, Saksa) seuraavissa olosuhteissa: denaturaatio 95 ° C: ssa 5 minuuttia, minkä jälkeen 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 10 sekunnin ajan ja hehkutus ja laajentaminen 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Suhteellinen miRNA ja mRNA: n ilmentymisen tasot normalisoitiin U6 ja β-aktiini, vastaavasti.

Western blot-analyysi

Seitsemänkymmentäkaksi tuntia transfektion jälkeen solut otettiin talteen ja hajotettiin, kun läsnä on proteaasiestäjäseostabletit ja sentrifugoitiin 12500 rpm 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti kerättiin ja proteiinipitoisuus mitattiin käyttämällä bikinkoniini- hapon proteiinia iinianalyysikitissä (Shenggong Bio-Tech Co., Ltd, Shanghai, Kiina). Alikvootti 80 ug denaturoitua proteiinia kustakin näytteestä pantiin 10% natriumdodekyylisulfaattia polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Membraanit blokattiin kuoritun maidon 5% 2 h ympäristön lämpötilassa, jonka jälkeen inkuboitiin primaarisen vasta-aineen (1:2000 laimennus, Abcam, USA) 4 ° C: ssa yön yli ja piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (1:1000 laimennus, Abcam , USA) 1 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa. Blotteja inkuboitiin sitten tehostettu kemiluminesenssi 2 min. Signaalit havaittiin ja kvantitoitiin densitometrialla käyttämällä Määrä Yksi ohjelmistoa. β-aktiini käytettiin endogeenisen ohjaus normalisoitu ilmentymisen tietoja.

SIRT1 tavoite ennustaminen ja lusiferaasiaktiivisuus määritys

miRNA tavoitteet ennustettiin käyttämällä Miranda tietokantaa (http: //www.microrna. org /). Sillä lusiferaasiaktiivisuus määritys, nukleotidit 2341-2731 (täydellinen ennustettu miR-221 ja miR-222 tavoite sivusto SIRT1-3’UTR) insertoitiin alavirtaan Renilla lusiferaasin geeni Renilla /tulikärpäsen lusiferaasireportteriplasmidin, psiCHECK- 2 (GenePharma, Shanghai, Kiina). PC-3-solut transfektoitiin 0,5 ug reportteri plasmidien kuoppaa kohti plus miR-221 tai miR-222-estäjän plasmidi. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen, Renilla /tulikärpäsen lusiferaasi-aktiivisuus mitattiin dual lusiferaasireportterista määritystä (Promega, USA) automaattisella mikrolevynlukijalla (Thermo, USA).

Tilastollinen

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS ohjelmistoversio 17,0 (Chicago, Illinois, USA). Data ilmaistiin keskiarvona ± SEM. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin varianssin analyysiä tai kaksisuuntaisella Studentin t-testiä. P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa.

Tulokset

Expression of mir-221 ja mir-222 PCA soluissa

miR-221 oli erittäin ilmaistu PC-3 soluja verrattuna LNCap (P 0,05) (kuvio 1A). Samoin miR-222 oli myös merkittävästi lisääntynyt PC-3-solujen verrattuna LNCap (P 0,01) (kuvio 1 B). Transfektion miR-221 estäjä dramaattisesti tukahdutti ilmentymistä miR-221 PC-3-solujen (P 0,05) (kuvio 1 C). Samoin miR-222-ekspressio väheni merkittävästi, kun transfektio miR-222-inhibiittorin (P 0,01) (kuvio 1 D).

(A) miR-221 tasoa PC-3 ja LNCaP. (B) miR-222 tasoa PC-3 ja LNCaP. (C) miR-221 tasoa PC-3-solujen transfektion jälkeen pEX-5 (tyhjä vektori plasmidi) tai miR-221-estäjän. (D) miR-222 tasoa PC-3-solujen transfektion jälkeen pEX–5 tai miR-222 estäjä. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta.

* P 0,05,

** P 0,01.

Effects of mir-221 estäjä ja mir-222 estäjä soluproliferaatioon, solusyklin jakelu, ja apoptoosin PC- 3-solut

Kuten kuviossa 2 on esitetty, verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla (pEX-5), jotka on transfektoitu miR-221-estäjän tai miR-222-estäjän osoitti merkittävästi vähentynyt proliferaatio viidennen, kuudennen, ja seitsemännen päivän (P ,01-0,05).

PC-3-solut transfektoitiin tyhjällä vektorilla plasmidi (pEX-5), miR-221-inhibiittorin, tai miR-222-estäjän. Solujen proliferaatio analysoitiin käyttäen CCK-8-määrityksessä. Leviämisen transfektoitujen solujen miR-221-estäjän tai miR-222-estäjän väheni verrattuna transfektoitu pEX-5. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta.

*, # P 0,05 vs pEX–5,

**, ## P 0,01 vs pEX–5.

virtaussytometria-analyysi osoitti, että 70,2 ± 1,8% solut, jotka on transfektoitu pEX-5 olivat G0 /G1 vaiheissa, kun taas 87,1 ± 2,0% ja 81,9 ± 0,9% soluista, jotka oli transfektoitu miR-221-inhibiittorin ja miR-222-estäjän olivat G0 /G1, vastaavasti (P ​​ 0,01) ( Kuviot 3 A ja B). Transfektion miR-221 estäjän tai miR-222 estäjä johti huomattavasti pienempi osuus solujen S-vaiheessa verrattuna transfektoitu pEX–5 (4,9 ± 1,9% tai 9,9 ± 1,1% vs. 21,9 ± 1,7%, P 0,01 ). Ei ollut merkittäviä eroja solut G2 /M vaiheiden ryhmien kesken.

(A) Cell DNA sisällön jakelun jokaiseen vaiheeseen. (B) prosenttiosuus solujen jaetaan kunkin vaiheen solusyklin. **,

## P 0,01 vs pEX–5.

apoptoosin hinnat PC-3-solut transfektoitu miR-221 estäjän tai miR-222 estäjä korotettiin 2,8-kertaiseksi ja 2,6-kertaisesti, vastaavasti, verrattuna transfektoitiin pEX-5 (P 0,05) (kuviot 4A ja B).

(A) apoptoottinen solu jakelu PC-3-solut transfektoitiin pEX-5 miR -221 estäjää tai miR-222-estäjän virtaussytometrialla. (B) Suhteellinen apoptoosin määrä kussakin ryhmässä. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta. (

*, # P 0,05 vs pEX–5.

Effects of mir-221 estäjä ja mir-222 estäjä on PC- 3 solumigraation

Kuten kuvioissa 5A ja B sulkeminen hinnat MIR-221 estäjä ja miR-222 estäjä ryhmät olivat alemmat kuin oli pEX-5 ryhmä. esimerkiksi sulkeminen hinnat olivat 25 ± 1,5% ja 34 ± 2,9% ja miR-221 ja miR-222-inhibiittorit, vastaavasti, verrattuna 57 ± 7% pEX-5 (P 0,01-0,05) 48 h, ja 47 ± 2,7% ja 59 ± 9,9 % vs. 100% (P 0,01), 72 tuntia. Samanlaisia ​​havaintoja inhibition maahanmuuton havaittiin käyttäen transwell määritystä. Kuten kuvioissa 5C ja D, solumigraatio väheni huomattavasti transfektion jälkeen miR-221-estäjän tai miR-222 inhibiittori verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu pEX-5 (P 0,01).

(A) Haavan paranemista määritys osoittaa sulkemisen hinnat transfektoitujen solujen pEX-5 (tyhjä vektori plasmidi), miR-221-inhibiittori, tai miR-222-estäjän. (B) kvantitointi haavan hinnat eri ajankohtina. (C) TranswellTM määritys osoittaa, että solut tunkeutui insertin kalvo. (D) kvantitointi solujen lukumäärä, jotka tunkeutuivat insertin kalvo. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta.

*, # P 0,05 vs pEX–5,

**, ## P 0,01 vs pEX–55).

esto mir-221 ja mir-222 kasvu SIRT1 proteiinin ilmentyminen

Western blot-analyysi osoitti, että SIRT1 proteiinin tasot transfektoitujen solujen miR-221-inhibiittorin ja miR-222-inhibiittoria merkittävästi lisääntynyt verrattuna niiden kanssa transfektoitujen solujen pEX-5 (P 0,05 ja P 0,05 vs pEX–5,

## P 0,01 vs pEX–5.

Effects of SIRT1 proliferaatioon, apoptoosiin, ja maahanmuuttoa PC-3-solujen

SIRT1 ekspressio suppressoi merkittävästi soluissa, jotka on transfektoitu siSIRT1 verrattuna transfektoitu pGPU6 kontrollina (kuvio 7A). Ei ollut merkittäviä eroja solujen lisääntymisen välillä, jotka on transfektoitu siSIRT1 ja pGPU6 (kuvio 7B). Kuitenkin solut, jotka on transfektoitu siSIRT1 johti kaksinkertainen vähentäminen apoptoosin määrä verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu pGPU6 (P 0,01) (kuviot 8A ja B). Mielenkiintoista on, että migraatio transfektoitujen solujen siSIRT1 lisääntyi merkitsevästi verrattuna transfektoitujen solujen pGPU6 (P 0,05) (kuviot 9A ja B).

(A) SIRT1 proteiinin tasot PC-3-solut transfektoitiin jossa pGPU6 (tyhjä vektori plasmidi) tai siSIRT1 (pGPU6-si-SIRT1) Western blot -analyysillä. (B) Solujen proliferaatio määritettiin kvantitatiivisesti käyttäen CCK-8-määrityksessä. Ei ollut merkittäviä eroja kahden ryhmän välillä (P 0,05). Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta.

(A) Apoptoosi mitattiin virtaussytometrillä INPC-3-solut transfektoitiin pGPU6 tai pGPU6-siSIRT1. (B) Suhteellinen apoptoosin määrä kussakin ryhmässä. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta.

** P 0,01 vs pGPU6.

(A) transwell määritystä käytettiin mittaamaan solujen migraatiota transfektoitu pGPU6 tai pGPU6-siSIRT1. (B) Solujen määrä tunkeutui insertin kalvo. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta.

* P 0,05 vs pGPU6.

SIRT1 ei ole välittömänä kohteena mir-221 ja mir-222

Koska Miranda tiedot osoittavat, miR-221 ja miR -222 sitoutuneena yhteen kohdesekvenssien sijaitsee 3′-UTR SIRT1 mRNA: ta (kuvio 10A). Sen varmistamiseksi suoraa vuorovaikutusta miR-221 tai miR-222 ja SIRT1 mRNA-3’UTR, lusiferaasiaktiivisuus määritys suoritettiin. Kuitenkin Lusiferaasiaktiivisuudet eivät paljastaneet tilastollisesti merkitseviä eroja miR-221 tai miR-222 tason PC-3-solut kotransfektoitiin SIRT1-3’UTR sitovan sekvenssin reportteriplasmidilla kontrolliin verrattuna (kuvio 10B). Toisin sanoen, miR-221 ja miR-222 ei sitoudu SIRT1 sekvenssin suoraan ja ei aiheuttanut suoraa biologista vuorovaikutusta.

(A) toisiaan täydentävä sitoutumiskohtia miR-221 ja miR-222 SIRT1-3’UTR ennusti Miranda tietokantaan. (B) Lusiferaasiaktiivisuus suorittaa tarkistaa sitoutumisen ja vuorovaikutusta miR-221 ja miR-222 SIRT1. Ei ollut eroja lusiferaasiaktiivisuudessa ryhmien kesken (P 0,05). Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta.

Keskustelu

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-221 ja miR-222 ovat säädelty erilaisissa syövissä ja ovat siten harkittu onkogeenejä [9], [13], [29]. Itse asiassa tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA vaikuttavat sarja biologisten prosessien kautta komplementaarisen sitoutumisen yhteen tai useampaan kohdegeenien. Esimerkiksi P27, TRPS1, PTEN, Arhi, TIMP-3, HECTD2 ja RAB1A olivat kohdegeenien miR-221 ja miR-222 [10], [11] ,. Nämä havainnot viittaavat siihen, että nämä miRNA ovat terapeuttisena kohteena. Olemme osoittaneet, että tasot miR-221 ja miR-222 lisättiin merkittävästi PC-3-solujen verrattuna LNCaP-soluissa, joka on yhdenmukainen muiden havaintojen [34]. Down-regulation miR-221 tai miR-222 ilmaisu inhiboi solujen lisääntymistä ja muuttoliike ja lisääntynyt apoptoosin PC-3-solut. Lisäksi tehokas transfektio miR-221-estäjän tai miR-222-estäjän johti korkeampaan olevien solujen prosenttiosuus G0 /G1 vaiheet ja alhaisempi soluja S-vaiheessa. Nämä havainnot osoittavat, että esto miR-221 tai miR-222 ilmaisu saa aikaan tärkeitä biologisia vaikutuksia soluproliferaatioon, apoptoosin, solumigraatio, solusyklin jakelu, ja solujen siirtyminen PC-3-solut. Ilmentyminen SIRT1 lisääntyi PC-3-solujen jälkeen miR-221 ja miR-222 oli alassäädetty. Tämä havainto viittaa siihen, että SIRT1 lähettää tukahduttava rooli kasvainta vastaan ​​edistävä toiminta miR-221 ja miR-222. SIRT1 on raportoitu hillitä LNCap soluproliferaatiota [35]. Wang et ai. osoittivat vähensi SIRT1 ilmentymistä PCA kudoksessa verrattuna hyvänlaatuisen eturauhasen liikakasvun kudoksen [27]. SIRT1 voivat toimia kasvaimen promoottori tai kasvaimia estävä, riippuen onkogeeninen polku ominaisia ​​tietyille kasvaimia [19], [22], [24]. SIRT1 saattaa toimia onkogeenin inhiboimalla kasvaimen synnyssä, kuten p53: n [36], ja se voi toimia anti-onkogeeni, jonka repressoivan useita onkogeenejä tai onkoproteiineja, kuten β-kateniinin ja surviviiniperäisten [37], [38].

tutkimuksessamme kaatamalla SIRT1 PC-3-solujen lisännyt solujen vaeltamiseen ja laski apoptoosin korko, mutta mitään merkittävää eroa ei havaittu solujen lisääntymisen. Nämä havainnot viittaavat siihen, että SIRT1 osallistuu maahanmuutto- tukahduttaminen ja apoptoosin edistämistä PC-3-solut, mutta ei juurikaan sääntelyvaltaa solujen elinkelpoisuuden. Inhiboiva miR-221 ja miR-222 ilmentymisen parannettu SIRT1 ilmentymistä, mikä viittaa siihen, että havaittu lisääntynyt apoptoosi ja laski muuttoliike transfektion jälkeen miR-221 tai miR-222-estäjän säädellään SIRT1 aktivointi. Nämä solut ”leviämisen-tukahduttaminen kapasiteetin jälkeen miR-221 ja miR-222 alassäätöä voidaan mukauttaa muiden molekyylien polkuja, kuten p27 [31] tai Arhi [39]. Vaikka SIRT1-3’UTR olemassa sitoutumiskohtien miR-221 ja miR-222, lusiferaasireport- määritys ei tunnistaa suoran sitoutumisen suhde SIRT1 ja miR-221 tai miR-222. Tämä viittaa siihen, että miR-221 ja miR-222 epäsuorasti hillitä ilmaus SIRT1 muiden molekyylien polkuja. Lisätutkimuksia tarvitaan kuvaamaan mekanismeja ja molekyylitason reitit miR-221, miR-222, ja SIRT1, jotka ovat mukana PCa synnyssä yliekspressiolla kaksi MikroRNA ja ilmentymisen moduloimiseksi SIRT1 eri solulinjoissa. Investigation biologisen toimintojen miR-221/222 ja SIRT1 ja niiden suhdetta in vivo käyttäen eläinmallissa olisi myös harkittava.

Yhteenvetona miR-221 ja miR-222 ovat erittäin ilmaistaan ​​PC-3-solujen . Esto miR-221 tai miR-222 lauseke vähentää solujen lisääntymistä ja muuttoliike ja lisää apoptoosia PCA soluissa. SIRT1 proteiini on säädelty soluissa transfektion jälkeen miR-221 tai miR-222 estäjä. Solut transfektoidaan siSIRT1 osoittavat lisääntynyt maahanmuutto ja laski apoptoosin korko, mutta mitään vaikutusta soluproliferaatioon. Nämä tiedot osoittavat, että biologiset vaikutukset miR-221 ja miR-222 eturauhasen syöpäsolujen liittyy SIRT1. Modulaatio näiden molekyylien ilmentyminen voi vaikuttaa tuumorigeneesiin eturauhassyöpää. Nämä havainnot voivat tarjota potentiaalinen terapeuttinen lähestymistapa eturauhassyöpää.

tukeminen Information

Kuva S1. Authentication transfektoitujen solujen miR-221 tai miR-222-estäjän Western blotilla. 1-8: numeroitu klooneja. Onnistunut kloonit nuolilla yhdistettiin yhteen tarkistaa biologisiin kokeisiin.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0098833.s001

(TIF) B Kuva S2. Expression of SIRT1 mRNA. Reaaliaikainen PCR suoritettiin mittaamiseksi SIRT1 mRNA muutoksia PC-3-solut transfektoitiin pEX-5, miR-221-estäjän tai miR-222-estäjän. Ei ollut tilastollista eroa ryhmien välillä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0098833.s002

(TIF) B