Krooninen sairaus

tiivistelmä

estämällä DNA vaurioita vastereitissä tuntuu olevan houkutteleva strategia syöpähoitoa varten. Aiemmin raportoitu, että jyrsijän soluja altistuu kuumuudelle stressi, solujen kasvua edisti aktiivisuutta DNA-riippuvaisen proteiinikinaasin (DNA-PK), entsyymiä, joka osallistuu DNA ei-homologisen end liittymällä (NHEJ) vaaditaan double-lohkon tauko korjaus. Puuttuminen toimivan DNA-PK liittyi säätelyä alaspäin lämpöshokkiproteiini 70 (HSP70). Tavoite Tämän tutkimuksen on siten tutkia roolia DNA-PK-inhibition lämmön indusoiman apoptoosin ihmisen solulinjoissa. Inhibiittorit fosforylaation DNA-PK-katalyyttinen alayksikkö (DNA-PKcs) on Ser2056, kuten NU7026 ja NU7441, käytettiin. Lisäksi kaataa DNA-PKcs suoritettiin käyttäen Sirna (siDNA PKcs). Lämmön altistuminen solut pantiin vesihauteeseen 44 ° C: ssa 60 min. Apoptoosi arvioitiin 24 tunnin kuluttua inkubaation virtaus cytometrically. Proteiinit uutettiin 24 tunnin kuluttua ja analysoitiin HSP70 ja Hsp40 ilmaisun Western-blottauksella. Kokonais-RNA uutettiin 6 tuntia hoidon jälkeen ja analysoitiin käyttämällä GeneChip® microarray järjestelmä tunnistaa ja valita up-geenien (≥1.5 kertainen). Tulokset osoittivat parannusta lämmön aiheuttamaa apoptoosia ilman toimivan DNA-PKcs. Mielenkiintoista on, että ekspressiotasot HSP70 ja Hsp40 olivat koholla ilman DNA-PKcs lämpörasituksessa. Tulokset geneettinen verkon analyysi osoitti, että HSP: t ja kesäkuu geenejä säädellään ylöspäin riippumatta DNA- PKcs in altistuu vanhemman ja tyrmätä soluja. Läsnä ollessa toimivan DNA-PKcs, siellä oli havaittu säätely ylöspäin anti-apoptoottiset geenit, kuten NR1D1, kun taas ilman DNA-PKcs pro-apoptoottiset geenit, kuten EGR2, oli edullisesti säädelty. Näitä löydöksiä, olemme tulleet siihen tulokseen, että ihmisen soluissa, inaktivaatio DNA-PKcs voi edistää lämmön aiheuttamaa apoptoosia riippumatta lämpöshokki- proteiineista.

Citation: Okazawa S, Furusawa Y, Kariya A, Hassan MA, Arai M, Hayashi R, et ai. (2013) inaktivointi DNA-riippuvaisen proteiinikinaasin Edistää Heat indusoiman apoptoosin riippumatta Heat-Shock Protein induktio in Human Cancer Cell Lines. PLoS ONE 8 (3): e58325. doi: 10,1371 /journal.pone.0058325

Editor: Michael Sherman, Boston University Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu 6 marraskuuta, 2012 Hyväksytty: 01 helmikuu 2013; Julkaistu: 11 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Okazawa et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Taloudellinen tuki tämän tutkimuksen antamien Grant-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (B) (22390229), Japani Society for Promotion of Science. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pahanlaatuiset kasvaimet ovat suuri ongelma maailmassa, joka lääketieteen tutkimuksen alalla kehitysmaiden tehokkaiden terapeuttisten on aina ollut päällä tutkimuksen etuja vuosikymmeniä. Tämä tavoite on jatkunut yli vuoden aikana huolimatta lukuisista hoitomenetelmien saatavilla (kuten leikkaus, kemoterapia, sädehoito, hypertermia [1], korkean intensiteetin keskityttiin ultraääni (HIFU) [2], immunoterapia [3], jne.), Ja erilaisia strategisen yhdistelmät [1], [4], [5]. Tämä johtuu siitä, että yksikään näistä työkaluista on toiminut täydellisesti tai turvallisesti hävittää syövissä. Kuitenkin asettaa tieteellisiä perusteita löydöt uusia lähestymistapoja, perusteellinen käsitys syövän molekyylibiologian tulee pakolliseksi. Viime aikoina tutkimukset DNA-vaurioita vastaus (DDR) väyliä suoritettu tämän alueen lupaava syövän hoidossa. Yhdistelmä DNA: ta vaurioittavien aineiden kanssa molekyylien kohdistaminen huumeita vastaan ​​toimijoiden DNA korjaukseen väyliä voi aiheuttaa synergististä vaikutusta tappaa syövän soluihin [6]. Tutkimukset DDR paljasti lukuisia molekyylikohteista kuten Ataxia teleangiektasiaa mutatoitunut (ATM), ataksia telangiektasia ja Rad3 liittyvien (ATR), ja DNA-riippuvaisen proteiinikinaasin (DNA-PK). Nämä proteiinit ovat jäseniä phosphoinositol 3-kinaasin kaltainen kinaasi (PIKK) perhe toimivat muuntimet DDR aktivoida useita proteiineja, jotka liittyvät soluvastetta DNA vaurioita [7] – [9].

Kerrottiin että DNA-PK toimii vuorovaikutuksessa heat shock transkriptiotekijä (HSF1) [10]. Eräässä tutkimuksessa, DNA-PKcs negatiivinen hiiren solulinja scva2 ja sovitetun DNA-PKcs positiivisen solulinjan sc (8) -10 johdettu scva2 ottamalla käyttöön DNA-PKcs rakenteellisen geenin, altistettiin lämpökäsittelyyn ja laajuudesta lämmön aiheuttama apoptoosi arvioitiin. DNA-PKcs negatiiviset solut osoitti hieman myöhässä HSP70 induktio joka saavutti alemman vakiotasolleen. Tämä havainto oli perusteltua HSF1 ja DNA- PKcs vuorovaikutus [11]. Kuitenkin, kuten DDR aktivoituminen kuume ei tunnistettu tuolloin, osallistuminen ATM aktivointi, p53 fosforylaatio [12], ja induktio γH2AX [13] lämmön stressi ei ilmoiteta. Äskettäin, fosforylaatio p53 Ser15 sekä solunsisäisen signaloinnin ei-homologisella lopussa liittymällä (NHEJ) on paljastettu. Lisäksi useat muut skenaarioita DNA-PK osallistuminen lämpöä stressivaste, kuten solujen eloonjäämissignaalin ylössäätöä by Akt fosfory- läpi DNA-PK [14] ja aktivointi NFKB p50 [15], on myös raportoitu. Lisäksi ryhmämme on osoittanut, että estämällä DNA-PK DNA-PK-inhibiittorit ja RNAi tekniikka edistänyt ultraääni-solukuolema riippumatta p53 fenotyypin [16].

Tässä tutkimuksessa, voimme myös tutkia rooli DNA-PK lämmön indusoiman apoptoosin erilaisissa ihmisen syöpäsolulinjoissa. Oletamme, että DNA-PKcs inhibition saattaisi vahvistaa hypertermia-solukuolema. Yksityiskohdat taustalla olevien mekanismien tullaan myös tutkitaan.

Tulokset ja keskustelu

Lämmön aiheuttama Apoptoosi Enhanced DNA-PK-inhibiittorit

Ohjaus ja käsiteltyjä soluja analysoitiin laajuus kromatiinin kondensaatio indikaattorina apoptoosin induktioon käyttäen Nuclear ID ™ vihreä kromatiinin tiivistyminen kit mitataan virtauksen cytometrically. Analyysi suoritettiin 24 tunnin kuluttua lämpöaltistus puuttuessa tai läsnä ollessa DNA-PK-inhibiittorit. Kuten kuviossa 1A B, sekä DNA-PK-inhibiittorit NU7026 ja NU7441 parannettu apoptoosin merkittävästi seuraavien kuumuudesta. Mielenkiintoista on, että NU7026 ei ollut vaikutusta soluihin tavanomaisissa ottaa NU7441 indusoi merkittävän apoptoosin HeLa-soluissa puuttuessa kuumuudesta. Tämä johtui luultavasti korkeampi voimakkuus myöhemmin muita jäseniä PIKK perheen proteiinit, kuten nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) ja phosphatidylinositide-3-kinaasi (PI3K) [17]. Olisi merkitään tässä, että DMSO vahvistettiin, ettei se häiritse saatuja tuloksia (tuloksia ei ole esitetty).

kromatiinin kondensaatio soluissa, kun läsnä on 10 uM (a) NU7026, tai (b) NU7441. (C) estämällä DNA-PKcs fosforylaation Ser2056 10 uM NU7026 tai NU7441 6 tunnin kuluttua altistumisesta kuumuudelle stressiä. (D) aika-riippuvainen Western blot-analyysi HeLa-solujen (0-6 h), jotka osoittavat muutoksia fosforylaation DNA-PKcs on Ser2056 (DNA-PKcs-pS2056) ja HSP: t; HSP70 ja Hsp40, 10 uM NU7026. Kaspaasi-3-pilkkoutumisen ja HSP ilmentymisen Western-blottauksella 24 h käsittelyn jälkeen puuttuessa tai läsnä on 10 uM (e) NU7026 tai (f) NU7441. NU7441 aiheuttama heikko kaspaasi-3 aktivaation ilman lämpöaltistus augmentaatioon kromatiinin tiivistymistä tietoja. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD (*, P 0,05, **, P 0,01, NS, ei-merkitsevä).

Western blotting, kuvio 1 C esittää, että sekä inhibiittorit voisivat onnistuneesti tukahduttaa fosforylaation DNA- PKcs at Ser2056 6 tunnin kuluttua altistumisesta kuumuudelle stressiä. Aikariippuvainen analyysi solut osoittivat, että fosforylaatio DNA- PKcs at Ser2056 vähitellen lisätä aikaa jopa 6 tuntia lämpökäsittelyn jälkeen. Samaan aikaan tietenkin oli samanaikainen kasvu ilmentymisen HSP70 ja Hsp40. Silmiinpistävän, kun DNA-PK esto, DNA- PKcs-pS2056 laski taas HSP70 ja Hsp40 ilmaisun säilytti aikariippuvainen lisäys (kuvio 1 D). Säilyttämistä HSP: iden kasvu kuvion ilman DNA-PK on vastakohtana liittyy lasku raportoitu hiiren soluissa, ja voi siten heijastaa, että herkistymistä ihmisen solujen apoptoosia DNA-PK-inhibition voi toimia itsenäisesti HSP: iden. Todistaa tämän erityisen eroa, olemme vahvistaneet, että 10 uM NU7441 käsittely laski ilmaus HSP70 kiinalaisen hamsterin munasarjan soluja, CHO-K1 (kuvio S1).

Cell kautta kuolema apoptoosin vahvistettiin edelleen caspase- 3 pilkkominen. Kuviossa 1E F, kaspaasi-3 lohkaisu havaittiin 24 tunnin kuluttua lämmitys. Kaspaasi-3 lohkaisu oli merkittävästi parannettu läsnäollessa estäjien erityisesti NU7441. NU7441 indusoi heikon nauhan ei-lämmitetty solujen augmentaatioon kromatiinin tiivistymistä tietoja. Lisäksi tiedot paljastavat, että lisäys HSP70 ja Hsp40 säilyi jopa 24 tunnin kuluttua hoidon DNA-PK-estäjä.

Lämmön aiheuttama Apoptoosi Enhanced DNA-PKcs Knockdown käyttäminen Pienet Interference RNA

jotta voitaisiin vahvistaa roolia DNA-PK lämmön aiheuttamaa apoptoosia, suoritimme vaihtoehtoisia kokeiluja soluja, joista puuttuu toiminnallinen DNA-PK kautta hiljentäminen proteiinin DNA-PKcs kohdistettuja siRNA (siDNA PKcs). Transfektio menettelyjä ensin vahvistettiin Western-blottauksella 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen. Kuvio 2A esittää ilman endogeenistä DNA-PKcs bändejä kaikilla pitoisuuksilla siDNA-PKcs. Lisäksi kokeet siten suoritettiin käyttäen, jotka on transfektoitu 20 nM. Transfektoitujen solujen lusiferaasin siRNA (siLuc, 20 nM) samanlaisissa olosuhteissa otettiin negatiivisina kontrolleina. Altistettaessa lämmölle, soluja, joista puuttuu toiminnallinen DNA-PK näkyy merkittäviä kromatiinin kondensaatio verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu siLuc (kuvio 2B). Tueksi, pilkotun kaspaasi-3 nauhat 24 tuntia hoidon jälkeen lisääntynyt merkittävästi siDNA PKcs-transfektoiduissa soluissa. Nämä tulokset tukevat edelleen rooli DNA- PKcs lämmön aiheuttamaa apoptoosia. Jälleen, ei ollut ilmeistä, välisestä suhteesta HSP: t ja DNA-PK-hiljentäminen altistumisen jälkeen lämmittää stressi (kuvio 2C). Tämä havainto on vastakohtana raportteja jyrsijän soluja puuttuu toiminnallinen DNA-PK osoittaa, että ilmaisu taso HSP70 lämpörasituksen oli alassäädetty [11] (kuva S2). Vahvista yleistys muihin ihmisen soluihin, suoritimme samanlaisia ​​kokeita kaksi versiota pahanlaatuisten glioomasoluihin, nimittäin; M059K solut toimivat DNA-PK ja DNA-PKcs viallinen M059J variantti. Kuten kuviossa S3, ilmaus HSP70 ja Hsp40 oli samankaltainen molemmissa soluissa riippumatta DNA-PK tila. Sellaisena se voidaan päätellä, että ihmisen soluissa, inhibitio DNA-PK parantaa lämmön indusoimaa apoptoosia riippumatta HSP.

(a) HeLa-solut transfektoitiin eri annoksilla, pieniä häiritseviä RNA vastaan ​​DNA-PKcs (siDNA-PK) ja lusiferaasin (siLuc); (B) DNA-PKcs- Knockdown solujen kuumassa stressiä osoitti suurempaa prosenttiosuutta kromatiinin tiivistyminen; (C) knockdovvn DNA- PKcs parannettu kaspaasi-3 aktivaation seuraavat lämpörasitusta riippumatta HSP70 ja Hsp40 ilmaisun 24 tunnin hoidon jälkeen; (D) HSF1 aktiiviseen muotoon bändi parannettiin puuttuessa DNA- PKcs 1 h kuluttua altistumisen kuumuudelle stressiä. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD (**, P 0,01, NS, ei-merkitsevä).

ilmentyminen HSF1 aktiivista muotoa analysoitiin HeLa-soluissa 1 h post lämpöaltistus ( 44 ° C: ssa 60 min). HSF1 aktiivinen muoto on säädelty vahvistavasti puuttuessa DNA- PKcs (kuvio 2D). Tämä havainto heijastaa sitä HSF1 aktivointi ei vaadi DNA- PKcs.

geeniekspressioanalyysissä

Kuvio 3A osoittaa, että lämpörasitus voi säätää ylös 403 koetin sarjoista ≥1.5 kertaiseksi sekä siLuc- ja siDNA-PKcs-transfektoiduissa soluissa (ryhmä 1). Toinen 160 koetinsarjojen oli säädelty lämpörasituksen mukaan ≥1.5 kertaisesti siLuc-transfektoiduissa soluissa vain (ryhmä 2), kun taas 179 koetinsarjojen olivat up-säännellään ≥1.5 kertaisesti siDNA PKcs-transfektoiduissa soluissa (ryhmä 3). Geneettisen verkko, joka käsittää ryhmän 1 geenejä, osoitti, että HSP: itä, kuten HSP70 (HSPA6) ja Hsp40 (DNAJB1), olivat erittäin ilmaistuna (kuvio 3B). Proapoptootti- geenejä kesäkuu esikasvaintekijän (kesäkuu) ja FBJ hiiren osteosarkooma viruksen onkogeenin homologi B (FosB) todettiin myös ylös geenien. Ylös-säätely ryhmän 1 geenien molemmilla solussa variantit viittaa siihen, että nämä geenit vastata lämpötilastressi- riippumatta DNA-PK tila, asia, joka edelleen tukee Western blot tiedot. Samanlaisia ​​HeLa-solut, meidän aiemmat tutkimukset osoittivat, että ilmentyminen perus-alueen leusiinivetoketjun (bZIP) transkriptiotekijöiden kesäkuu, ATF3 ja FOS tehostettiin myös ihmisen lymfooma U937-soluissa osoittaa apoptoosin altistumisen jälkeen lämpötilastressi- 44 ° C: ssa 15 min [18].

(a) antava Venn-kaavio jopa geenien in siLuc- ja siDNA PKcs-transfektoitujen solujen altistuksen jälkeen lämpötilastressi-; (B) Yleinen up-geenien sekä siLuc- ja siDNA-PKcs-transfektoidut solut altistetaan lämmölle stressiä (ryhmä 1); geneettinen verkko näytetään graafisesti ja solmujen (geenit) ja reunojen (biologiset suhteet geenien). Solmu väri osoittaa ilmentymisen tason vastaavan geenin. Solmut ja reunat näkyvät eri muotoja, ja merkkejä, jotka edustavat toiminnallisiin luokkiin geenien ja luonteen suhteen solmujen kesken, vastaavasti. Tämä verkko osoittaa, että HSP geenit eivät liittyneet DNA-PK tila ja että kesäkuu liittyviä geenejä säädellään ylöspäin vasteena lämmön aiheuttamalle soluvaurioita.

Ilmaisu profiilia joidenkin valittujen geenien nimittäin; HSPA6, DNAJB1, DNAJA4 ja JUN määritettiin käyttäen reaaliaikaista qPCR (kuvio 4A-D). Tulokset osoittivat, että mRNA-tasot näiden geenien kasvatti merkittävästi kuumuudesta.

HeLa-soluja käsiteltiin 44 ° C: ssa 60 minuutin ajan ja sitten inkuboitiin 37 ° C: ssa 6 h. MRNA ekspressiotasot (a) DNAJB1 (Hsp40), (b) HSPA6 (HSP70), (c) DNAJA4, (d) JUN (e) NR1D1, (f) AHR, (g) BIRC3, (h) JUND , (i) EGR2 ja (j) Klf4 normalisoitu GAPDH ekspressiotason. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD (*, P 0,05, **, P 0,01, NS, ei-merkitsevä).

Seuraavaksi kuvataan mahdollinen geneettinen verkko, joka käsittää up-geenien in siLuc-transfektoiduissa soluissa (ryhmä 2) (kuvio 5A). Tunnistettujen geenien sisältyvät pro-apoptoottisia geenejä, jotka toimivat läpi TNFa liittyviä reittejä kuten TLR4 [19], RIPK2 [20], ja TNFRSF10B, joka tunnetaan myös nimellä DR5, jotka voidaan aktivoida tuumorinekroositekijä-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi [21 ]. Tuumorinekroositekijän reseptori-liittyvä tekijät, kuten TRAF2: n ja TRAF6, havaittiin myös. TRAF2 välittävät signaloinnin TNF-R-superperheen varten JNK: n aktivaatiota (c-Jun N-terminaalinen kinaasi-) tai NFKB: n [22]. TRAF6 osallistuu myös signalointireitin alkaen TLR superperheen ja indusoi apoptoosia kautta kaspaasiriippuvaisen reitin ja lisää NFKB aktivaation [23]. TRAF3IPs vuorovaikutuksessa TRAF proteiinit ja joko I-KB kinaasia tai MAP-kinaasin [24]. IRF1 geenin indusoi solukuolemaa, kun läsnä on INFγ ja TNFa: n [25]. Toisaalta, jotkut solun eloonjäämistä geenejä tunnistettiin myös. Ylös-säätely selviytymisen geenien vahvistetaan taas qPCR määrityksessä. Kuvio 4E esittää, että mRNA taso NR1D1 oli säädellään ylöspäin siLuc-transfektoiduissa soluissa samalla säädellä vähentävästi DNA- PKcs pudotus soluissa. NR1D1 on kuvattu verkon geenin jotka saattavat vaikuttaa TLR4. NR1D1 on raportoitu olevan LXR kohdegeenin ihmisen makrofagien ja tukahduttaa LXR-indusoidun-TLR-4: n ekspression [26]. Mielenkiintoista on, että NR1D1 on yksi intranukleaarinen reseptoreita ja pidetään osaltaan vuorokausirytmin järjestelmä, kuitenkin, biologinen tila sen toiminta on tuntematon. Tuoreessa raportissa ehdotetaan NR1D1 voi toimia rasva-aineenvaihdunnan entsyymin aktiivisuus ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptori 2 (erbB2) -positiivinen rintasyöpä, ja toimia solujen eloonjäämistä [27], [28]. Näin ollen voi olla, että NR1D1 indusoidaan lämpörasituksen DNA-PK edistää solujen aineenvaihduntaa hengissä. Vastaavasti kuvio 4F G esittävät ero ilmaus AHR ja BIRC3 molemmissa solussa variantteja. AHR on lukuisia tehtäviä ATM signalointi, luun erilaistumista, Th17 lymfosyyttien erilaistuminen, P450 ilme, ja sääntelyn NFKB-reitin [29], [30]. Lisäksi AHR parantaa solun suojaamiseen liittyvät geenin SERPINE1 [31], joka oli myös tunnistettu ylös säädelty geeni edellisessä tutkimuksessa [32], [33]. BIRC3 (solun apoptoosi-inhibiittori-proteiinin 2; cIAP2) on yksi estäjien apoptoosin proteiinit. BIRC3 indusoi TNFa: n kautta NFKB reitin, ja voivat indusoida muita reittejä, mukaan lukien PI3K [34]. Tässä vaiheessa oli tärkeää vahvistaa rooli näiden selviytymisen geenien pelastamiseen soluissa jälkeen lämpörasituksen altistuksen. Tätä varten suoritimme knockdown kokeita vastaan ​​NR1D1 ja BIRC3 HeLa-soluissa jälkeen lämpökäsittely. Tehokkuus kaataa varmennettiin qPCR analyysi 24 h transfektion jälkeen (kuvio S4). Transfektoidut solut altistettiin lämmölle stressin 24 h transfektion jälkeen. Western blot-analyysi osoitti, että halkaistut kaspaasi-3 tasoa kasvoi hieman siNR1D1- ja siBIRC3-transfektoiduissa soluissa 24 tuntia hoidon jälkeen (kuva S5). Soluja, joista puuttuu NR1D1 näkyy merkittävä kasvu kromatiinin kondensaatio verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu siLuc, kun taas knockdovvn BIRC3 hieman, mutta ei merkittävästi lisääntynyt solujen prosenttiosuus on tiivistetty kromatiinin lämpökäsittelyn jälkeen (kuvio S6).

( a) Up-geenien in lämpöä alttiina siLuc-transfektoiduissa soluissa (ryhmä 2 kuviossa. 3A). Tähän ryhmään kuuluvat antiapoptooppinen geenejä, kuten NFKB koulutusjakson liittyviä geenejä, AHR ja NR1D1; (B) Up-geenien in lämpöä alttiina siDNA PKcs-transfektoiduissa soluissa (ryhmä 3 kuvassa. 3A). Tähän ryhmään kuuluvat proapoptoottisten geenejä, jotka tavallisesti estävät DNA-PK aktiivisuus kuten EGR2, Klf4 ja ATF4.

Kuvio 5B havainnollistaa mahdollisia geneettisiä verkoston, joka käsittäisi up-geenien in siDNA -PKcs-transfektoiduissa soluissa (ryhmä 3). Kuva 4H-J tarjoavat qPCR tulokset joidenkin valittujen geenien, nimittäin JUND, ERG2 ja Klf4. Niistä up geenien on JUND joka toimii samalla tavalla kesäkuu proteiineja transaktivoimaan AP-1-reagoivan promoottorin yhdessä (kuvio 4H). JUND osoittaa solusta riippuvaista pyrittäessä estämään solukuolemaan UV-korosti hiiren alkion fibroblasteissa [35], kun taas parantaa UV-induced kaspaasi-3: n aktiivisuuden ihmisen myeloblastinen leukemian [36]. SOCS1 ilmentyminen indusoituu TLR stimulaation ja estää JAK /STAT signalointi [37] kuin negatiivista palautetta malli [38]. SOCS1, joka säätelee JUND T-soluissa [39], säätelee kesto NFKB signalointi ekspression vähentämiseen NFKB-riippuvaisen geenejä [40]. PLAUR on urokinaasi plasminogeeniaktivaattorin reseptorin geeni. PLAUR säätelee endoteelisolun selviytymistä, ja on tärkeää, että VEGF: n indusoiman anti-apoptoosin [41]. Yli ilmentyminen JUND johtaa alas-säätely VEGFA mRNA [42].

Geneettinen verkko myös vahvistaa säätely ylöspäin useiden proapoptoottisten geenejä joka menee koordinoidusti havaitun parannusta apoptoosin Koska DNA-PK. EGR2 on keskeinen rooli PTEN aiheuttama apoptoottisen reitin. ERG2 oli differentiaalisesti kasvoi siDNA-PK kaataa soluja (kuvio 4I). Yli ilmentyminen EGR2 indusoi apoptoosia erilaisissa kasvainsolulinjoissa kautta BNIP3L ja BAK [43]. CYCS (sytokromi c geenissä, joka indusoi apoptoosia Bcl-2-reitin, kun sen vapautumista mitokondrioita solulimassa), aktivoiva transkriptiotekijä 4 (ATF4) (tuet ylös-säätely pro-apoptoottista proteiinia C /EBP-homologista proteiinia ilmentyminen [ ,,,0],44]), sekä sinkki sormen transkriptiotekijä Klf4 (raportoitu osallistuvan apoptoosin induktio T-solujen leukemiaa [45]) olivat kaikki tunnistettiin up geenien. Nousu mRNA tasolla Klf4 oli alle merkitsevyystaso (p = 0,078), mutta suuntaus oli havaittavissa kaikissa näytteitä (kuva 4J). Näiden pro-apoptoottiset geenit voidaan estää DNA-PK-aktiivisuutta, ja näin ollen, puuttuessa toiminnallisen DNA-PK, nämä geenit voivat johtaa lisälaite lämmön indusoiman apoptoosin.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit

selektiivinen DNA-PK-inhibiittorin NU7026 (2- (morfolin-4-yyli) bentso [h] chomen-4-oni) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ja NU7441 (8- (4-Dibenzothienyl) -2- (4-morfolinyyli) -4H-1-bentsopyran-4-oni) hankittiin Axon Medchem (Groningen, Alankomaat). Ne liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), jonka lopullinen pitoisuus on 10 mM. Kantaliuokset varastoitiin -20 ° C: ssa käyttöön asti.

Cell Lines and Treatment

ihmisen kohdunkaulansyövän HeLa S3-soluja (Riken, Tsukuba, Japani), ihmisen pahanlaatuisen gliooman M059K ja sen DNA- PKcs viallinen variantti M059J (toimittanut A. Takahashi, Gunma yliopisto, Japani), olivat kaikki kasvatettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä antibiootti seos. Ja kiinanhamsterin munasarjan CHO-K1, ja sen DNA-PKcs viallinen variantti V3-solujen [46] (Riken) kasvatettiin kaikki MEMα täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä antibiootti seos. Lämmitys suoritettiin upottamalla parafilmillä suljetussa soluviljelylevy vesihauteessa 44 ° C: ssa 60 min. Lämpötilaa seurattiin digitaalisella lämpömittarilla (# 7563, Yokogawa, Tokio, Japani). Inhibitioon kokeissa soluja pre-inkuboitiin 10 uM NU7026 tai NU7441 30-60 min, jonka jälkeen lämpöä altistumista. Käsitellyt jälkeen soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa analyysiin asti ilman väliaineen vaihtoa.

Kromatiini tiivistyminen Analysis

Ohjaus ja käsitellyt solut kerättiin 24 tunnin kuluttua hoidon ja värjättiin käyttäen Nuclear ID ™ vihreä chromatin tiivistyminen havaitseminen kit (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) mukaan valmistajan protokollaa. Laajuus kromatiinin kondensoitumista mitattiin laskemalla fluoresenssin intensiteetti Nuclear ID ™ vihreä vertailuryhmään nähden virtaussytometrillä (Eepokset XL, Beckman Coulter, Miami, FL).

Western-blottaus-analyysi

Solut liuotettiin lyysipuskurissa (50 mM NaCl, 1% Nonidet P-40 ja 50 mM Tris-HCl, pH 8,0), joka sisälsi natriumortovanadaattia ja proteaasien inhibiittori-cocktail (NACALAI TESQUE, Kioto, Japani). SDS-polyaclylamidegel elektroforeesi ja Western blotting suoritettiin, kuten on kuvattu muualla [47]. Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat seuraavat: hiiren monoklonaalinen anti-HSP70-vasta-aineen (MBL, Nagoya, Japani); hiiren monoklonaalisella anti-Hsp40-vasta-aine (MBL); kaniinin polyklonaalista anti-kaspaasi-3-vasta-aine, joka tunnistaa täyspitkä kaspaasi-3 (35-kDa) sekä fragmentteja (19- ja 17-kDa) aktivoidun entsyymin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA); kaniinin polyklonaalista anti-fosfo DNA- PKcs at Ser2056 vasta-ainetta (Abcam, Cambridge, UK); kanin monoklonaalista anti-DNA-PKcs-vasta-aineen (Epitomics, Burlingame, CA); kaniinin polyklonaalista anti-HSF1 vasta-ainetta (Stressgen Bioreagents, Victoria, Kanada); ja hiiren monoklonaalinen anti-glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) vasta-aine (Organon Teknika, Durham, NC). Immunoreaktiivisia proteiineja visualisoidaan tehostetun kemiluminesenssin (ECL) havaitsemisjärjestelmä on luminoiva kuva-analysaattoria (LAS-4000, Fujifilm, Tokio, Japani).

Band tiheydet kvantitoitiin Image J (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2012.) ja suhteelliset määrät proteiineja, jotka liittyvät kuhunkin tiettyyn vasta-aineen normalisoitiin GADPH bändejä.

transfektio sirna (siRNA) B

Negatiivinen kontrolli lusiferaasi siRNA ja DNA- PKcs kohdistettuja siRNA saatiin Nippon Gene Material (Toyama, Japani), ja Thermo Fisher Scientific, Dharmacon Products (Lafayette, CO), vastaavasti. SiRNA kohdistaminen NR1D1 (Rev-erbα) ja BIRC3 (c-IAP2) ostettiin Santa Cruz bioteknologisen, Santa Cruz, CA. Transfektio suoritettiin HeLa-soluissa käyttäen RNAi Max (Invitrogen, Carlsbad, CA) noudattamalla valmistajan protokollan. Lyhyesti, HeLa-solut otettiin talteen, pestiin ja suspendoitiin täydelliseen kasvualustaan ​​ilman antibiootteja. Solut ympättiin tiheydellä 2,5 x 10

4 solua /kuoppa 12-kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan. Transfektiota, 800 ui Opti-MEM (Invitrogen) lisättiin soluihin ja sen jälkeen 200 ui Opti-MEM, joka sisälsi RNAi-Max /siRNA-kompleksit valmistettiin 20 min ennen kuin lisättiin (Reverse transfektioprotokolla). Kuusi tuntia myöhemmin transfektio väliaine korvattiin tuoreella, täydellistä alustaa ilman antibiootteja. Sitten soluja inkuboitiin vielä 42 h. Kolmekymmentä minuuttia ennen lämpökäsittelyä, väliaine vaihdettiin täydellisessä väliaineessa antibiooteilla.

RNA: n eristäminen

Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen RNeasy mini (Qiagen, Valencia, CA) ja käsiteltiin DNaasi I (RNase-free DNase kit, Qiagen) 15 min ajan huoneen lämpötilassa jäljelle jääneen genomista DNA: ta. RNA laatu analysoitiin käyttämällä Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). RNA-näytteet, jotka oli RNA eheyden numero (RIN) arvot yli 9,5 pidettiin hyväksyttävinä.

Microarray ja laskennallisen Gene Expression Analyysit

Geenien ilmentyminen analysoitiin käyttämällä GeneChip® Human Gene 1.0 ST Array täplikäs noin 28869 koetinsarjojen (Affymetrix, Santa Clara, CA). Näytteet array hybridisaatio valmistettiin kuvatulla tavalla Affymetrix GeneChip® Expression Technical Manual. Skannattu taulukot analysoitiin käyttämällä GeneChip® Analysis Suite Software (Affymetrix). Saadut hybridisaatio intensiteetti analysoitiin käyttämällä GeneSpring® analyysiä ohjelmiston versio 11.5 (Silicon Genetics, Redwood City, CA) purkaa merkittäviä geenejä. Tutkia geeni ontologian, mukaan lukien biologiset prosessit, solukomponenttien, molekyyli- toimintoja, ja geneettiset verkot, saadut tiedot analysoitiin käyttämällä Ingenuity Pathways Analysis työkalut (Ingenuity® Systems, Mountain View, CA, USA), web-toimitettu sovellus, joka mahdollistaa tunnistamisen, visualisointi, ja tutkia molekyylien vuorovaikutus verkkojen geenien ilmentyminen tietoja [48]. Täydellinen luettelo koetinsarjojen kaikista näytteistä löytyvät Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE39063).

Real -Aika kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qPCR) B

reaaliaikainen qPCR määritys suoritettiin Mx3000P® reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Stratagene Japani, Tokio, Japani) käyttämällä SYBR® Esiseos Ex Taq (Takara Bio, Shiga , Japani) mukaan valmistajan protokollaa. Käänteistranskriptaasireaktio (PrimeScript® reagenssi Kit, Takara Bio) suoritettiin DNaasi-käsiteltyjen kokonais-RNA. Alukkeet suunniteltiin perustuen seuraaviin tietokannan sekvenssit: NM 006145, DnaJ (Hsp40) homologi, subfamily B, jäsen 1 (DNAJB1); NM 002155 lämpösokkipromoottoreita 70 kDa proteiinin 6 (HSP70B ’) (HSPA6); NM 018602, DnaJ (Hsp40) homologi, subfamily A, osa 4 (DNAJA4); NM 002228, kesäkuu esikasvaintekijän (kesäkuu); NM 021724, tumareseptori alaheimoon 1, ryhmä D, jäsen 1 (NR1D1); NM 001621, aryylihiilivetyreseptori (AHR); NM 001165 bakulovirusjärjestelmiä IAP toista, joka sisälsi 3 (BIRC3); NM 005354, kesäkuu D esikasvaintekijän (JUND); NM 000399, varhainen kasvu vastaus 2 (EGR2); NM 004235, Kruppel kaltainen tekijä 4 (Klf4); NM 002046, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH). GAPDH käytettiin kontrollina normalisointia [49].

Tilastollinen analyysi

Data esitetään keskiarvoina ± SD. Tilastollinen merkitys minkä tahansa kahden aineistoja määritettiin käyttäen Welchin t-testiä käyttäen R-ohjelmiston (R säätiö Tilastollinen tietojenkäsittely, versio 2.15.1, ilmainen ohjelmisto saatavilla https://www.R-project.org) kanssa p-arvot 0.05 pitää merkittävänä.

tukeminen Information

Kuva S1.

Western blot-analyysi HSP70 ilmentymisen kiinalaisen hamsterin munasarjan (CHO-K1-solut). DNA-PK-inhibiittoria, 10 uM NU7441 vähentynyt ilmentyminen HSP70 CHO-K1-soluissa 6 h altistuksen jälkeen lämmittää stressiä 44 ° C: ssa 60 min.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0058325.s001

(TIF) B Kuva S2.

Western blot-analyysi HSP70 ilmentymisen jyrsijän soluja. Kaksi vaihtoehtoa kiinanhamsterin munasarjasolut, CHO-K1-soluissa, joissa on funktionaalisia DNA-PK ja V3 solujen viallisen DNA-PKcs altistettiin lämmölle stressiä 44 ° C: ssa 60 minuuttia ja sitten laajuus HSP70 ilmentyminen määritettiin 6 tuntia myöhemmin. HSP70 oli alassäädetty puuttuessa funktionaalisten DNA-PK V3 soluissa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0058325.s002

(TIF) B Kuva S3.

Western blot-analyysi HSP70 ja Hsp40 ilmentymistä ihmisen pahanlaatuisen glioomasolulinjoja. Kaksi versiota pahanlaatuisten glioomasoluissa, M059K solut toimivat DNA-PK ja DNA-PKcs viallinen M059J variantti, ilmaus HSP70 ja Hsp40 oli samankaltainen molemmissa soluissa riippumatta DNA-PK tila.

Doi: 10,1371 /journal .pone.0058325.s003

(TIF) B Kuva S4.

tarkastaminen naistaintumisprosenttia tehoa NR1D1 ja BIRC3 reaaliaikaisen qPCR. HeLa-solut transfektoitiin 50 nM joko siNR1D1 tai siBIRC3. Transfektoituja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Ilmentymisen mRNA (a) NR1D1 ja (b) BIRC3 normalisoitiin GAPDH ekspressiotason. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD (**, P 0,01, N. S., ei-merkitsevä).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0058325.s004

(EPS)

Kuva S5.

Western blot-analyysi kaspaasi-3 siNR1D1 ja siBIRC3 transfektoidut solut seuraavan kuumuudesta. Western blot-analyysi osoitti, että pilkotaan kaspaasi-3 bands 24 h hoidon jälkeen kasvoi siNR1D1- ja siBIRC3-transfektoiduissa soluissa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0058325.s005

(TIF)

Kuva S6 .

Kromatiini tiivistyminen analyysi siNR1D1 ja siBIRC3 transfektoidut solut seuraavan kuumuudesta. Altistettaessa lämmölle stressi, solut kumottu NR1D1 näkyy merkittävä kasvu kromatiinin kondensaatio verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu siLuc, kun taas kumota BIRC3 taipumus lisätä siinä määrin, kromatiinin kondensaatio näyttämättä tilastollista merkittävyyttä. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD (*, P 0,05, NS, ei-merkitsevä).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0058325.s006

(EPS) B

Tiedoksi

kirjoittajat kiitollisena tunnustavat Prof. Akihisa Takahashi, Gunma University lahjasta pahanlaatuisten glioomasolulinjaa M059K ja M059J.