Krooninen sairaus

tiivistelmä

Novel HIV-lektiinin perhe, joka esittää tiukkaa sitoutumisspesifisyys runsaasti mannoosia glykaanien on löytynyt alhaisempi organismeihin. Bakteeri-ortologin on tunnistettu genomin

Pseudomonas fluorescens

Pf0-1 ja geeni koodaa oletetun lektiini kloonattiin, ilmaistu

Escherichia coli

ja puhdistettiin yhdessä vaiheessa geelisuodatuksella. Glykaanin joukko seulonta Rekombinantti lektiinin, kutsutaan PFL, on paljastanut, että PFL tunnistaa edullisesti runsaasti mannoosia glykaaneja kanssa α1-3 Man, joka oli voimakkaasti altistuneiden D2 asemassa. Sen sijaan peittää tämän α1-3 Mies α1-2 Man dramaattisesti heikentynyt lektiini-hiilihydraatti vuorovaikutusta. Vähentäminen terminaali disakkaridi, GlcNAc-GlcNAc korkean mannoosia glykaanien oli myös välttämätöntä PFL-sitova. PFL osoitti voimakas anti-influenssaviruksen toimintaa estämällä viruksen pääsyn soluihin annoksilla alhainen nanomolaari- pitoisuuden. Mikromolaarisina pitoisuus tai korkeampi, PFL oli sytotoksisuutta mukana menetys soluadheesion ihmisen mahasyövän MKN28 soluja. Solun pinnan molekyyli, joka PFL sitoutui, kerasaostuvat biotiinileimatulla PFL ja tunnistettu integriini α2 peptidi massa sormenjälkien käyttäen MALDI-TOF-massaspektrometrialla. Kiehtovan, käsittelemällä eksogeenisen PFL, integriinin α2 solun pinnalla koki nopean sisäistämisen sytoplasmaan ja kertynyt perinuclear alueella yhdessä sitoutuneen PFL. Tuloksena menetys solun sitoutuminen johtaisi signalointireitin, joka indusoi anoikis kaltainen solukuolemaa. Näitä tapahtumia esti esikäsittelemällä PFL kanssa mannnan, osoittaa osallistuminen runsaasti mannoosia glykaanien PFL-solukuolema että laukaisi PFL-integriini α2 vuorovaikutuksia.

Citation: Sato Y, Morimoto K, Kubo T, Yanagihara K, Seyama T (2012) korkea Mannoosia Binding Antiviral Lectin PFL iältään

Pseudomonas fluorescens

Pf0-1 Edistää solukuolema mahasyövän Cell MKN28 kautta Vuorovaikutus α2-integriini. PLoS ONE 7 (9): e45922. doi: 10,1371 /journal.pone.0045922

Editor: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasilia

vastaanotettu: 7. 2012 Hyväksytty: 27 elokuu 2012; Julkaistu: 20 syyskuu 2012

Copyright: © Sato et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain Grant-in-Aid nuorten tutkijoiden (B) Japanin Society for Promotion of Science (JSPS) (Grant numero 24790101). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

korkea mannoosia sitova lektiinejä joka kohdistaa tiettyihin glykaanien viruksen pinnalla ovat lupaavia mahdollisten virusten inaktivoiva aineita, joita voitaisiin käyttää ehkäisyyn ja valvontaan virusinfektioiden [1], [2]. Lukuisat lektiinejä, jotka spesifisesti tunnistavat runsaasti mannoosia glykaaneja löytyy eri taksonomian mukaan lukien bakteerit, levät, kasvit ja eläimet, ja joista osa on osoitettu olevan anti-HIV-aktiivisuus [3]. Olemme hiljattain löytäneet uuden HIV-lektiini perheen jaettu alempaan organismien, kuten bakteerien, syanobakteerien ja merilevä [4]. Niillä yhteisiä ominaisuuksia, kuten sekvenssi moninkertaistuminen hyvin säilyneitä N-terminaalinen domeeni ja yksinomainen runsaasti mannoosia oligosakkaridin tunnustuksia. Jotkut lektiinit tässä perheessä, kuten syanobakteerien OAA alkaen

Oscillatoria agardhii

[4] ja punainen levien ESA-2

Eucheuma serra

[5] ovat osoittaneet estävän HIV: n pääsy isäntäsoluihin EC

50s alhaisen nanomoolialueella suoraan sitoutumalla kirjekuori gp120. Lisäksi punainen levien lektiini KAA-2

Kappaphycus alvarezii

, joka myös kuuluu tähän perheeseen estää tartunnan eri viruskantoja EC

50s alhaisen nanomolaari- tasojen kanta-riippumattomalla tavalla, kautta tunnustamista runsaasti mannoosia oligosakkaridin viruksen vaippaglykoproteiinin hemagglutiniini (HA) [6].

lisäksi voimakas antiviraalinen aktiivisuus, ESA-2 esitetään erilaisia ​​biologisia toimintoja, kuten mitogeeniaktiivisuuden hiiren ja ihmisen lymfosyyttien ja

in vitro

kasvun inhibition kasvainsolujen [7], [8]. Vaikka biologisia ominaisuuksia tämän lektiinin perheen käymässä ilmeiseksi, ominaisuuksia bakteerien ortologeja alkaen

Pseudomonas fluorescens

Pf0-1 ja

Herpetosiphon aurantiacus

on vielä selvennettävä.

Tässä tutkimuksessa olemme kloonattu ortologin lektiinin geenin

P. fluorescens

Pf0-1 ja koodatun lektiini proteiini (PFL) ilmennettiin

Escherichia coli

. Toiminnallinen PFL onnistuneesti puhdistettiin johtamalla ammoniakkia tunnettu suhteen sen biologisia vaikutuksia kuten antiviraalisten ja antituumorivaikutus. Kuten ennustaa voimakas rakenteellinen yhtäläisyys PFL muiden jäsenten kanssa tämän lektiinin perheen, PFL näytteillä spesifisyyden ainoastaan ​​korkea mannoosi oligosakkaridin ja voimakas antiviraalinen vaikutus influenssaviruksia. Lisäksi PFL aiheuttama anoikis kaltainen solukuolemaa mahasyövän solun MKN28 kautta vuorovaikutuksessa solun pinnalla integriinin α2.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Stab kulttuurin

P. fluorescens

Pf0-1 oli jalomielinen lahjoitus Dr. Mark W. Silby (University of Massachusetts Dartmouth, USA). Influenssaviruksia ja Madin-Darby koiran munuaissolut (MDCK) soluja jalomielinen lahjoitus tri T. Sakaguchi (Hiroshima University, Japani): Influenssavirukset kasvatettiin korionallantoisnestettä 10 päivän ikäisten kanan munia. MDCK-soluja kasvatettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja penisilliiniä-streptomysiiniä. Vatsa tasyöpäsolulinja, MKN28 luovutti ystävällisesti professori Suzuki (Fukushima Medical University, Fukushima, Japani). Solulinjaa ylläpidettiin RPMI-1640-väliaineessa (GIBCO, Grand Island, NY) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS, GIBCO), 100 IU /ml G-penisilliini ja 100 mg /ml streptomysiinisulfaattia. Toinen mahasyöpä solulinja, GCIY, hankittiin RIKEN CELL BANK (Ibaraki, Japani) ja ylläpidetään samalla tavalla kuin edellä on kuvattu. Ensisijainen normaalia ihmisen hepatosyyttisolulinjasta (ACBRI 3716) ostettiin DS Pharma Biomedical (Osaka, Japani) ja ylläpidetään CS-C väliaineessa kit R (DS Pharma Biomedical).

Hemagglutiniinin Pitoisuus

Hemagglutiniinin määritys suoritettiin käyttäen 2% (v /v) suspensioon trypsiini-käsitelty kanin punasolujen kuten aiemmin on kuvattu [9]. Lyhyesti, kaniinin natiivi punasolujen suspensiota käsiteltiin 0,5% trypsiiniä suolaliuoksessa, ja seosta inkuboitiin 37 ° C: ssa 60 min. Pesun jälkeen suolaliuoksella, 2% trypsiiniä-käsitelty punasolujen suspensio valmistettiin suolaliuoksessa. Hemagglutinaatioaktiivisuus ilmaistiin tiitteri, vastavuoroinen korkeimman 2-kertainen laimennus, joilla positiivinen hemagglutinaation.

Gene kloonaus ja ekspressio lektiini PFL

Genominen DNA

P. fluorescens

Pf0-1 käytettiin templaattina geenin kloonausta PFL-geenin. Aluksi, joka on oligonukleotidialuketta set, 5′-GGCAGGTCTCCCGAAACTTCAAG-3 ’ja 5′-AGTCGAACGCCTGAACCTGTTGA-3′, joka hybridisoitui ylävirtaan ja alavirtaan PFL koodaavan alueen, vastaavasti, käytettiin, ja PCR suoritettiin käyttäen Prime STAR DNA -polymeraasia (TAKARA). Käyttämällä monistettu PCR-fragmentti templaattina, sen jälkeen PCR suoritettiin eteenpäin aluketta, 5’-CACCATGTCTAAATACGCAGTGGCA-3 ’, joka oli CACC lisäksi sekvenssin ATG-aloituskodonin ja PFL-geenin, ja reverse-aluke, 5’-TTACTCTATCTGCCCACGGAAG -3 ’(TTA, joka vastaa lopetuskodonin RFL-geeni). Monistetut fragmentit ligoitiin pET101 /D-TOPO-ekspressiovektoriin. Yhdistelmä-DNA-plasmidi transformoitiin

Escherichia coli

TOP10-soluihin (Invitrogen). Saatu yhdistelmä-DNA-kloonit varmistettiin olevan oikea konstrukti DNA-sekvensoinnilla. Toiminnallinen klooneja muunnettava

Escherichia coli

BL21 Star (DE3) solut indusoituvaa ilmentymistä PFL geenin. IPTG, joiden lopullinen konsentraatio on 0,8 mM lisättiin transformoitu viljelmä indusoimiseksi PFL ilmaisua. 6 tunnin kuluttua inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, solut kerättiin sentrifugoimalla 8000 rpm 20 minuutin ajan.

puhdistus lektiinin PFL

korjattu bakteeri- solut suspendoitiin uudelleen 20 mM fosfaattipuskuria ( pH 7,0), joka sisälsi 0,15 M NaCl (PBS), ja hajotettiin sonikoimalla. Kun oli sentrifugoitu 8000 rpm: ssä 20 min, alikvootti supernatantista tehtiin Superose 12 -pylväällä (GE Healthcare), joka oli tasapainotettu PBS: llä. Pylväs eluoitiin PBS: llä virtaus- nopeudella 0,8 ml /min isokraattinen tilassa. Eluaattia seurattiin absorption aallonpituudella 280 nm ja tutkittiin hemagglutinaatioaktiivisuus, ja aktiiviset fraktiot yhdistettiin.

Molekyylipaino määritys PFL

molekyylipaino PFL määritettiin MALDI-TOF- MS-analyysi, jossa on AUTOFLEX massaspektrometriä (Bruker, Japani) kalibroinnin jälkeen peptidin kanssa massa standard kit (Bruker, Japani) käyttämällä sinapiinihappoa matriisina.

DNA analyysi

nukleotidisekvenssejä määritettiin dideoksi-ketjun terminaattori menetelmällä käyttäen BigDye Terminator version 3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems). DNA: n sekvensointi suoritettiin käyttäen ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Glycan erilaisia ​​analyysi

PFL leimattiin Alexa Fluor 488 mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen, Eugene, OR). Glykaanin sitova spesifisyys PFL määritettiin painetun glykaanin mikrosiruja (versio 5.0) standardin menettely CoreH konsortion for Functional glykomiikan (CFG) (https://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp ). Keskimääräinen suhteellinen fluoresenssi rinnakkaisnäytteet kuusi laskettiin laskemalla keskiarvo neljästä arvosta poistamisen jälkeen korkein ja alin arvo poistamaan joitakin vääriä osumia erittäin korkea tai matala pistettä. Virhe palkit edustavat standardin keskivirhe (SEM), ja% CV on vaihtelukerroin (SD /keskiarvo) laskettu%.

Anti-Influenssa aktiivisuus PFL

In vitro

anti-influenssa aktiivisuus PFL määritettiin neutraali punainen (ET) väriaineen oton määritystä. Eri pitoisuuksia PFL valmistettiin DMEM, joka sisälsi 10 ug /ml trypsiiniä 96-kuoppalevyn. Kuhunkin kuoppaan, virus lisättiin infektiokertoimella noin 0,001 tarttuvien partikkelien solua kohti. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 48 h, 100 ui NR väriainetta (150 ug /ml DMEM: ssä) lisättiin ja inkuboitiin edelleen 2 h. NR väriaine siirtyy soluihin uutettiin lisäämällä 100 ui 1% etikkahappoa /50% etanolia. Kuopat mitattiin 540 nm: ssä mikrolevylukijalla (1420 -monileimalukijaa, PerkinElmer, MA, USA) kertoimella elossa peräisin viruksen sytopaattisen vaikutuksen.

immunofluoresenssimikroskoopilla

immunofluoresenssi oli suoritetaan visualisoida pääsyn estäminen influenssaviruksen mukaan PFL. Lyhyesti, MDCK-solut kasvatetaan suojalasi infektoitiin A /Udorn /72 infektiokertoimella noin 0,001 tarttuvien hiukkasten solua kohti, kun läsnä on tai ei ole 200 nM PFL DMEM, joka sisälsi 10 ug /ml trypsiiniä. Sen jälkeen kun 24 tuntia infektion, tartunta solut kiinnitettiin 80% asetonilla 5 min. Pesun jälkeen PBS: llä, soluja inkuboitiin hiiren monoklonaalisten anti-HA-vasta-ainetta (HyTest, Turku, Suomi) 37 ° C: ssa 1 h. PBS-pesun jälkeen soluja inkuboitiin fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -konjugoitu vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (Anticorps Secondaires, Compiegne, Ranska) 37 ° C: ssa 1 h. Sen jälkeen kun vielä PBS pesun jälkeen solut kiinnitetään käyttämällä Vectashield 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA), ja niitä havaittiin fluoresenssimikroskoopilla-mikroskoopin (OLYMPUS BX51, Olympus, Japani).

ELISA-määrityksessä

suora vuorovaikutus PFL viruksen vaippaglykoproteiinin HA määritettiin käyttäen entsyymi-immnosorbent määrityksellä (ELISA). PFL (5 ug /ml) karbonaattipuskurissa (pH 9,6) päällystettiin 96-kuoppaisille ELISA-levyille (BD Biosciences, Bedford, MA). Kuopat pestiin kolme kertaa PBS: llä, joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä (PBST) ja blokattiin 3% kuorittua maitoa 37 ° C: ssa 1 h. PBST: llä, erilaisina pitoisuuksina influenssan HA-rokotteen valmistamiseksi (Astellas, Tokio, Japani) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 h. PBST: llä, kuoppiin inkuboitiin hiiren anti-HA-monoklonaalinen vasta-aine (HyTest) 37 ° C: ssa 1 h, mitä seurasi inkubointi piparjuuriperoksidaasiin (HRP) konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (GE Healthcare, UK ) 37 ° C: ssa 1 h. Tämän jälkeen 3,3 ’, 5,5’-tetrametyylibentsidiini (TMB) substraattina (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MI) lisättiin. Reaktio pysäytettiin käyttäen TMB Stop-reagenssia (Sigma-Aldrich), ja absorbanssi 450 nm: ssä mitattiin mikrolevynlukijaa käyttäen (1420 -monileimalukijaa, PerkinElmer).

Kasvain soluproliferaation MTS-määritys

soluproliferaatiota kvantitoitiin tavanomaisella MTS-määritys käyttäen CellTiter 96-solujen lisääntymisen määrityksessä (Promega, Madison, WI). -Solut ympättiin 96-kuoppaisen mikrolevyn inkuboitiin 72 tuntia erilaisilla pitoisuuksilla PFL sopivassa väliaineessa, jossa oli 10% FBS: ää. Soluja inkuboitiin sitten 20 ui MTS-reagenssia 1 tunti 37 ° C: ssa ja mitattiin mikrolevylukijalla (1420 -monileimalukijaa, PerkinElmer) 490 nm: ssä. Vaikutus hiivan mannaania on cytotoxity on PFL määritettiin inkuboimalla soluja 5 uM PFL, kun läsnä on eri pitoisuuksia hiivan mannaania RPMI 1640, jossa oli 10% FBS: ää 72 tuntia, ja solujen elinkyky mitattiin kuten edellä on kuvattu.

eristäminen PFL sitovan molekyylin (t) MKN28 solun

PFL oli leimattu biotiinilla käyttäen biotiini -leimauskittiä (Dojindo molekyyli-, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Yhteen- kasvaneille MKN28 solujen peitinlaseja, biotinyloitua-PFL (200 ug) lisättiin ja inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Kun oli pesty kylmällä PBS: llä, solut kaavittiin pois ja hajotettiin 800 ul: aan RIPA-puskuria (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P40, 0,5% Natriumdeoksikolaatti, proteaasiestäjäseostabletit, 0,1% SDS: ää ). Sen jälkeen 100 ui biotiini-capture avidiinihelmiin (Adar Biotech, Israel) lisättiin solulysaattiin ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa varovasti sekoittaen. Helmet pestiin kolme kertaa 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Jää proteiinit helmet eluoitiin 50 ui SDS-PAGE-näytepuskuria (62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% glyseroli, 1% merkaptoetanolia, 0,003% bromifenolisinistä) ja 15 min 90 ° C: ssa ja alistettiin SDS-PAGE. Proteiini bändi spesifinen PFL hoitoa jae analysoitiin MALDI-TOF MS jälkeen geelissä trypsiinillä hajotusta. Lyhyesti, CBB värjätään Proteiinivyöhykkeet leikattiin pois ja väri poistettiin 25 mM ammoniumbikarbonaattia sisälsi 50% asetonitriiliä. Pelkistävä alkylointi suoritettiin 50 mM TCEP: tä (Tris [2-karboksietyyli] fosfiinia) 25 mM ammoniumbikarbonaattia, jonka jälkeen inkuboitiin 50 mM iodoacetoamide 1 tunti. Dehydraation jälkeen asetonitriilillä, proteiini geeli pilkottiin 10 ul: TPCK-trypsiiniä (100 ug /ml) 50 mM ammoniumbikarbonaattia. Mädätys puhdistettiin Zip kärki (Millipore, Japani) ja täpläksi MALDI tavoite. Yksi ui matriisiliuosta (α-syano-4-hydroxycinnapic happo matriisi [Bruker, Japan] asetoni-etanoli [1:02]) lisättiin sitten paikan päällä. MALDI-TOF MS-analyysi suoritettiin jota AUTOFLEX massaspektrometriä (Bruker, Japani) kalibroinnin jälkeen peptidin kanssa massa standard kit (Bruker, Japani). Peptidi massa sormenjälkien tietoja haettiin jonka Mascot ohjelmisto (Matrix Science, Japani).

Cellular lokalisointi PFL ja integriini α2

MKN28 soluja viljeltiin peitinlaseil- on 6-kuoppalevyllä . Solut kasvavat peitinlaseil- käsiteltiin 30 ug /ml Alexa488 konjugoitua-PFL RPMI 1640 ja inkuboitiin eri ajanjaksoja. PBS-pesun jälkeen solut kiinnitettiin 80% asetonissa 5 min. Pesun jälkeen PBS: llä, soluja inkuboitiin hiiren monoklonaalisten anti-integriini α2 /CD49b-vasta-ainetta (R Kaista 2, puhdistettiin PFL.

päätelty aminohapposekvenssi PFL kanna kaksi homologista domeenia, joista kumpikin koostuu N- ja C-terminaaliset puolikkaat 62% sekvenssi-identiteetti niiden välillä. PFL näytteillä korkea sekvenssihomologia syanobakteerien lektiinin OAA iältään

Oscillatoria agardhii

, punainen levien lektiini ESA-2

Eucheuma serra

, ja bakteeri lektiini MBHA iältään

Myxococcus xanthuksesta

(kuvio . 2B), jotka muodostavat uusia HIV-lektiini perhe. Molekyylimassa PFL ja OAA olivat samanlaisia, 13883,7 ja 13924,1, vastaavasti, ja molemmat lektiinit koostuivat 132 aminohappoa. Sekä PFL ja OAA on yhteinen ominaisuus sen järjestyksessä päällekkäisyyksiä mutta OAA näyttää korkeamman sisäisen identtisyys 75% kahden toistuvan verkkotunnuksia. Sen sijaan, ESA-2 ja MBHA koostuvat neljästä peräkkäin toistuvia homologisia domeeneja 67 aminohappoa. Astetta samankaltaisuuden OAA, ESA-2 ja MBHA PFL niiden N-terminaalista osaa (kukin 132 tähdettä) ja aminohapposekvenssit olivat 62,1, 61,4 ja 62,1% samoja aminohappoja, vastaavasti.

(EN) lopetuskodoni TAA näkyy tähdellä. Kukin numero edustaa asema nukleotidin. Sekvenssi oli täysin sama kuin on esitetty GenBank tietokantoihin tulonumero. ABA72252. (B) rinnastus aminohapposekvenssien PFL ja muiden homologisten lektiinit HIV-lektiini perheen. Syanobakteerien lektiini; OAA alkaen

Oscillatoria agardhii

(SwissP- tulonumero. P84330), Red levien lektiini; ESA-2

Eucheuma serra

(SwissP- tulonumero. P84331), Bakteerien lektiini; MBHA alkaen

Myxococcus xanthuksesta

(GenBank nro. M13831). Identtiset aminohapot neljälle lektiinit ovat boxed.

hiilihydraatteja sitova spesifisyys PFL

määrittämiseksi hiilihydraattia sitovan spesifisyyden PFL, glykaanitähteen erilaisia ​​analyysi suoritettiin konsortio for Functional glykomiikan käyttäen painettua array versiota 5.0. On 611 erilaista oligosakkaridia testattu, PFL (10 ug /ml) sisälsi spesifisyyden ainoastaan ​​paljon mannoosia sisältäviä glykaaneja, kuten on esitetty kuviossa. 3. Koko lista oligosakkaridin testattava ja tulokset löytyvät osoitteesta (https://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp).

Glycan sitoutumisspesifisyys PFL määritettiin painetun glykaanin mikrosiruja v5.0 standardin menettely CoreH konsortion for Functional glykomiikan. Virhe palkit edustavat keskiarvo ± keskihajonta. RFU arvo edustaa suhteellista fluoresenssin yksiköissä. Glykaanirakenteeseen array Tiedot saatiin 10 ug /ml Alexa488-PFL.

PFL sitoutuu voimakkaasti M6 glykaanin (216) ja M8 glykaanin (212), jotka molemmat on alttiina α1-3 mies D2 käsivartensa samalla tasolla korkean RFU arvoista, 43471 ja 40759, vastaavasti. Sen sijaan, peittämisen tämän α1-3 Mies α1-2 Man dramaattisesti heikentynyt vuorovaikutusta PFL ja glykaanien. Tämä oli ilmeisintä vertaamalla M6 glykaanitähteen (216) ja M7 glykaanitähteen (211), jossa lisäksi α1-2 Man D2 arm laski sitovan teho noin 53%. Samoin sitova teho PFL M9 glykaanitähteen (213) laski (RFU = 8535) verrattuna sen vastine M8 glykaanitähteen (212) puuttuu D2 terminaali α1-2 Man, joka osoittaa vain 21%: n teho. Mielenkiintoista, poistaminen vähentää terminaalin disakkaridi, GlcNAc-GlcNAc korkean mannoosia glykaanien paljon dramaattisesti vähentynyt PFL-sitova. Esimerkiksi PFL sitova teho on lähes kokonaan poistettiin ja glykaanit 316 ja 317, joilla ei ole GlcNAc-GlcNAc-sekvenssin nämä vastine glykaanien 212 ja 213, vastaavasti, esillä paljon suurempi teho. Tärkeys terminaali GlcNAc-GlcNAc varmistettiin lisäksi vertailussa glykaanien 217 ja 315, vaikka laajuus arvonalentumisesta PFL-sitoutuminen oli rajallinen. Tämä lektiini puuttui monosakkaridi sitovan lukien mannoosi. Lisäksi, PFL ei vuorovaikutuksessa Man α1-6 Man (314) ja mannotriose (214), jotka ovat ainesosia haarautuneen osan paljon mannoosia glykaanien. Pentasakkaridiannos ydin N-glykaanin (50) ei tunnista PFL mutta sen fukosyloituja vastine (485) näkyy heikko vuorovaikutus (RFU = 746). Nämä oligosakkaridirakenteisiin sitova profiilit PFL olivat hyvin samankaltaisia ​​kuin lentoliikennealue, ESA-2 ja KAA-2, jotka kuuluvat uutta HIV-lektiini perheen alempi organismien [4] – [6].

Anti influenssa virus aktiivisuus PFL

Anti-influenssaviruksen aktiivisuus PFL arvioitiin kahdella viruskantoja, A /Udorn /72 (H3N2) ja A /Beijing /262/95 (H1N1) mukaan NR väriaine otto määritys. PFL tehokkaasti esti solutuhovaikutus aiheuttamaa molemmat viruskantoja, jossa EY

50s 19,4 ± 1,5 nM, ja 4,5 ± 0,4 nM (kuvio. 4A). Sen vahvistamiseksi, että PFL esti ensimmäinen askel influenssaviruksen pääsyn soluihin, jakelu viruksen vasta infektoiduissa soluissa havaittiin läsnä ollessa tai puuttuessa PFL käyttäen immunofluoresenssimikroskopialla. Kuva. 4B on esitetty jakautuminen Virusantigeenin jälkeen 24 tuntia infektion A /Udorn /72 havaitsee tietyn anti-hemagglutiniini-aineella. PFL tehokkaasti esti influenssaviruksen tuloa soluihin taas virukset pystyivät tunkeutumaan ja replikoitua isäntäsoluissa puuttuessa PFL. Galaktoosipitoisen lektiiniä PNA iältään

Arachis hypogaea

eivät estäneet viruksen pääsyä soluihin. Nämä tulokset viittaavat siihen, läsnäollessa runsaasti mannoosia glykaanien viruksen pinnalla siihen kohtaan kriittisiä viruksen pääsyä soluihin. Testata, onko PFL olisi suoraan sitoutua viruksen vaipan glykoproteiini HA, joka on ELISA-määritys suoritettiin kaupallisesti saatavissa rokotetta valmiste, joka sisältää HA A /Kalifornia /7/09 (H1N1), A /Victoria /210/09 (H3N2), ja B /Brisbane /60/08 pääkomponenttina. Kuten osoitettu kuvassa. 4C, annoksesta riippuvainen sitoutuminen HA PFL havaittiin.

(A) Anti-influenssa aktiivisuus PFL MDCK-soluissa tartunnan kaksi viruskantoja. Solujen elinkelpoisuus inkuboinnin jälkeen 48 h influenssavirusten läsnä vaihtelevia pitoisuuksia PFL määritettiin käyttäen NR väriaineen sisäänoton määritys. Inhibitioprosentti infektio on ilmaistu keskiarvo päällekkäisiä määrityksissä. Avoimet ympyrät, A /Beijing /262/95 (H1N1); suljetut ympyrät, A /Udorn /72 (H3N2). (B) esto influenssaviruksen tuloa MDCK-soluihin PFL. MDCK-solut infektoitiin A /Udorn /72 (H3N2), läsnä ollessa tai poissa ollessa 200 nM PFL. Sen jälkeen, kun 24-tunnin infektion jälkeen solut kiinnitettiin 80% asetonissa 5 min. Viruksen vasta infektoiduissa soluissa havaittiin, että spesifinen vasta-aine vastaan ​​viruksen vaipan glykoproteiinin (HA) ja FITC-konjugoitua 2. vasta-aine fluoresenssimikroskoopilla. Ytimien sisällä solut värjättiin DAPI (200-kertainen suurennus). (C) Suoraan sitoutuminen PFL viruksen vaippaglykoproteiinin HA. Vuorovaikutus PFL ja viruksen HA määritettiin ELISA. PFL immobilisoitiin 96-kuoppaiseen levyyn ja inkuboitiin eri konsentraation influenssarokotteen, joka sisälsi HA A /Kalifornia /7/09 (H1N1), A /Victoria /210/09 (H3N2), ja B /Brisbane /60 /08. Kuopat inkuboitiin hiiren anti-HA-monoklonaalinen vasta-aine 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja sen jälkeen HRP-konjugoidulla 2. vasta-ainetta 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. HRP-substraatti, TMB, lisättiin sitten kuoppiin ja absorbanssi 450 nm: ssä mitattiin. Kuviossa on esitetty tulokset yhdestä koe, joka toistettiin vähintään kahdesti samanlaisin tuloksin.

PFL solukuolema ihmisen mahalaukun syöpäsolu MKN28

In vitro

anti-kasvain vaikutus PFL mahalaukun syövän solujen MKN28 arvioitiin tavanomaisella MTS-määrityksellä. Kuten on esitetty kuviossa. 5A (vasen paneeli), PFL osoitti annoksesta riippuva vaikutus proliferaatioon MKN28 solun. 72 tunnin kuluessa PFL-hoito, solujen elinkelpoisuuden pieneni merkitsevästi annoksilla 0,5 uM tai enemmän. Sen sijaan alhaisilla annoksilla 0,1-0,3 uM, proliferaatiota hieman edistettävä. PFL-indusoidun solukuoleman MKN28 solujen mukana menetys soluadheesiota pohjaan kulttuurin levy, kuten on esitetty kuviossa. 5B jossa everted klusterin soluja havaittiin ruskehtava linjat. PFL-solukuolema estettiin tehokkaasti läsnä hiivan mannaanista glykoproteiini laakeri korkea mannoosia oligosakkarideja (Fig. 5A, oikea paneeli). Tämä osoittaa runsaasti mannoosia glykaanien MKN28 solut osalliseksi PFL aiheuttaman solun signalointi, joka lopulta johtaa solun kuolemaan. Sen sijaan normaalin ihmisen hepatosyyttien soluja (ACBRI 3716) olivat suhteellisen resistenttejä PFL hoitoon verrattuna MKN28 soluihin (Fig. 5A, vasen paneeli).

(A) sytotoksisuus PFL on MKN28 soluissa (vasen paneeli; musta ympyrät) ja vaikutus hiiva mannaania sytotoksisuuteen of PFL (oikea paneeli). Ihmisen MKN28 soluja inkuboitiin vaihtelevilla PFL 72 tuntia. Lopussa inkuboinnin solujen eloonjäämisaste määritettiin MTS menetelmillä. Sytotoksisuus ilmaistaan ​​prosentteina solujen eloonjäämisaste kontrolliin verrattuna. Kuviossa on esitetty tulokset yhdestä koe, joka toistettiin vähintään kahdesti samanlaisin tuloksin. Vaikutus hiivan mannaania on PFL sytotoksisuus määritettiin inkuboinnin jälkeen MKN28 soluja 5 uM PFL, kun läsnä on eri pitoisuuksia hiivan mannaania 72 tuntia. Vertailua vaikutus PFL normaaleilla ihmisen hepatosyyttien soluja (ACBRI 3716) on esitetty (vasen paneeli, valkoiset neliöt) (B) mikroskooppinen kuva ohjaus (vasemmalla) ja PFL-käsitelty (oikea) MKN28 soluja. Soluja inkuboitiin 72 h: n läsnä tai poissa ollessa 5 uM PFL ja havaittiin alle valomikroskoopilla.

eristäminen PFL sitova molekyyli (t) ihmisen mahasyöpä solun MKN28

Vastatakseen molekyylitason mekanismi, jolla PFL indusoi solukuolemaa MKN28 solun, solun pinnan molekyyli (t), johon PFL sitoutuneet tutkittiin. Biotinyloitu PFL inkuboitiin 2 h MKN28 solut ja solut lyysattiin RIPA-puskurilla, joka sisälsi 0,1% SDS: ää. Solun pinnan molekyyli (t), johon biotiini-PFL sitoutuneen oli yhteistyössä saostettiin avidiinilla päällystetyillä helmillä. Proteiinit loukkuun helmet eluoitiin seuraavaksi SDS-PAGE-näytepuskuriin ja analysoitiin SDS-PAGE (kuvio. 6A). Vaikka useat epäspesifisiä vyöhykkeet havaittiin, havaitsimme 150 kDa jossa nimenomaan havaittiin PFL käsitelty jae. Tämä bändi on edelleen suoritettava in-geeliä ruuansulatuksen trypsiinin seuraa MALDI-TOF massaspektrometrianalyysissä. Saatu peptidi massa sormenjälki- (Fig. 6B), etsittiin tietokannasta ja proteiini tunnistettiin integriini α2, ja todennäköisyys, joka perustuu tulokset 57 (p 0,05).

MKN28 soluja käsiteltiin biotiini- PFL (200 ug) ja inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen kun hajotus solun RIPA-puskurilla, joka sisälsi 0,1% SDS: ää, proteiineja, jotka sidottu biotiini-PFL saostettiin avidiinihelmiin. Jää proteiinit helmet eluoitiin SDS-PAGE-näytepuskuriin inkuboimalla 15 minuuttia 90 ° C: ssa ja alistettiin SDS-PAGE (A). 150 kDa proteiini bändi nimenomaan eluoitu PFL jae analysoitiin MALDI-TOF MS jälkeen geelissä trypsiinillä hajotusta. Peptidi massa sormenjälkien data (B) tehtiin haku, jonka Mascot ohjelmisto.

Cellular lokalisoinnin eksogeenisesti lisättyä PFL ja integriini α2

käyttäytymisen PFL itsensä ja integriini α2 käsittelemällä PFL tutkittiin käyttäen konfokaali fluoresenssimikroskooppia. Tässä kokeessa fluoresenssileimattua PFL (Alexa488-PFL) käytettiin seurata PFL lokalisointi. Kuten on esitetty kuviossa.