Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

A-tyypin lamins ovat tyyppiä V väli hehkulampun proteiineja geenin koodaama

LMNA

. Mutaatiot

LMNA

aiheuttaa erilaisia ​​rappeuttavia sairauksia, jotka liittyvät ennenaikaista vanhenemista. A-tyypin lamins vaikuttavat myös aktiivisuutta retinoblastoomaproteiini (pRb), ja onkogeenit tällainen β-kateniinin. Näin ollen se on spekuloitu, että ilmentyminen A-tyypin lamins voivat myös vaikuttaa syövän etenemiseen.

Menetelmät /Principal Havainnot

arkistoa peräsuolen syöpä (CRC) ja normaalin paksusuolen kudos seulottiin ekspression A-tyypin lamins. Käytimme Coxin suhteellista riskisuhde (HR) menetelmä tutkia potilaan selviytymistä. Käyttäen CRC solulinjat tutkimme vaikutuksia lamiini A: n eks- muiden geenien RT-PCR: llä; solujen kasvuun FACS-analyysillä; ja invasiivisuus, jonka solujen vaeltamiseen määrityksissä ja siRNA knockdown kohdennettujen geenien. Huomasimme, että Lamin A ilmaistu paksusuolen kantasoluja ja että potilaat, joilla A-tyypin lamiinivektori ilmentävien kasvainten ovat merkittävästi huonompi ennuste kuin potilailla, joilla on A-tyypin lamiinivektori syöpäkasvain (HR = 1,85,

p

= 0,005) . Tämän ymmärtämiseksi havainto, perustimme malli järjestelmä perustuu GFP-Lamin A CRC soluissa. Huomasimme, että GFP-Lamin A näissä soluissa ei vaikuttanut solujen lisääntymistä, mutta ei edistää huomattavasti lisääntynyt solun liikkuvuus ja invasiivisuus. Syynä tähän lisääntynyt invasiivisuus oli ilmaus lamiinivektori Korotetun säätely ylöspäin aktiini niputtaminen proteiini T-plastin, mikä johtaa alas säätely solun adheesiomolekyyli E-kadheriinin.

Johtopäätökset

Expression of A-tyypin lamins riskiä kuolla CRC koska sen läsnäolo aiheuttaa lisääntynyt invasiivisuus ja mahdollisesti enemmän kantasolujen kaltaisia ​​fenotyyppi. Tämä raportti suoraan linkittää A-tyypin lamiinivektori ilme kasvaimen etenemiseen ja nostaa profiilia

LMNA

yhdestä osallisena useita mutta harvinainen geneettinen olosuhteet liittyvän geenin yksi yleisimmistä sairauksista länsimaissa.

Citation: Willis ND, Cox TR, Rahman-Casañs SF, Smits K, Przyborski SA, van den Brandt P, et al. (2008) Lamin A /C on riski biomarkkereiden sisään peräsuolen syövän. PLoS ONE 3 (8): e2988. doi: 10,1371 /journal.pone.0002988

Editor: Kevin G. Hardwick, University of Edinburgh, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 06 toukokuu 2008; Hyväksytty: 17 heinäkuu 2008; Julkaistu: 20 elokuu 2008

Copyright: © 2008 Willis et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: National Health palvelu tutkimus- ja kehitysrahasto, Association for International Cancer Research, Euroopan unionin puiteohjelman 6

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Lamins a ja C ovat tyyppiä V väli hehkulampun proteiinit, jotka muodostavat osan filamenttiarkit kutsutaan tumalevy vuori sisempi tumakalvoa (INM) [1]. A-tyypin lamins on vaihtoehtoisesti liitettyjä tuotteita

LMNA

-geeni, joka on kartoitettu kromosomiin 1q21.3 [2]. Mutaatiot tässä geenissä ovat syynä kahdellatoista geneettisiä sairauksia, jotka kollektiivisesti kutsutaan laminopathies [3]. Laminopathies ovat kaikki rappeuttavia sairauksia, jotka vaikuttavat pääasiassa kudoksissa mesenkymaaliset [3]. Mahdollisia mekanismeja taustalla laminopathies on tutkittu intensiivisesti viime seitsemän vuotta ja tämä on johtanut siihen päätelmään, että A-tyyppinen lamins edistävät solujen selviytymiseen kahdella eri tavalla. Ensinnäkin, A-tyypin lamins vuorovaikutuksessa tärkeä solun tukirangan linkkeri proteiineja kutsutaan nesprins kautta SUN domain proteiineja, jotka yhdistävät INM ulompaan tumakalvon (ONM) kautta ontelon [4], [5]. Nesprins puolestaan ​​ankkurielementtejä solun tukirangan on ONM [6] – [9], mikä hardwiring solun tukirangan on tumalevy ja tarjoamalla laite transdusoimaan mekaanista jännitystä mittaava solukalvolta tumaan [10], [11 ]. Toiseksi, A-tyyppinen lamins vuorovaikutuksessa tiettyjen sitovien kumppanien tumassa, mikä vuorostaan ​​vuorovaikutuksessa ja vaikuttaa aktiivisuuteen tärkeitä kasvua säätävät. Proteiinien, että A-tyypin lamins vuorovaikutuksessa, parhaiten tunnettu on ns LEM domeenin proteiinit [12], mukaan lukien kiinteä membraaniproteiinien emerin [13], [14] ja Man1 [15], samoin kuin nucleoskeleton proteiini LAP2α [16]. Monimutkainen A-tyypin lamins ja emerin on viime aikoina raportoitu säännellä tumakertymään aktiivisen β-kateniinin ja menetys emerin toiminta johtaa sääntelemätöntä β-kateniinin signalointi ja automaattinen stimuloiva kasvu fibroblasteissa [17]. Vastaavasti monimutkainen Man1 ja A-tyypin lamins on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa reseptorin säännelty Smad (rSMAD) ja antagonisoida TGF-β signaloinnin estämällä rSMAD on INM [18], [19]. Lopuksi, monimutkainen LAP2α ja A-tyypin lamins sitoutuu ja hihnoja fosforyloitumaton muotojen kasvua vaimentimen pRb tumaan [20]. LAP2α ja A-tyypin lamins molemmat osallistuvat Rb riippuvaisia ​​E2F tukahduttaminen [21] ja menetys LAP2α tai A-tyypin lamins fibroblasteissa aiheuttaa nopeutetun S-vaiheen tulon kautta menetys pRb toimintaa [21], [22].

Kun otetaan huomioon A-tyypin lamins ja niiden sitoutumista kumppaneiden sääntelyä kasvun polkuja, se on arveltu, että nämä lamins saattavat liittyä kasvaimen etenemistä [23]. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet ero ekspression A-tyypin lamins kasvainkudoksissa ja ovat sidoksissa puuttuminen A-tyypin lamins lisääntyneeseen leviämisen kasvain. Ne ovat kuitenkin epäonnistuneet yhdistää muutoksiin ilmaisun potilaan ennustetta tai suoraan kasvaimen etenemiseen [24]. Tämän vuoksi päätimme tutkia, miten ilmaus A-tyypin lamins saattaisi vaikuttaa sekä etenemistä ja tuloksia yhteisen kasvain. Siksi meidän seulotaan hyvin suuri arkisto CRC kudoksen liittyy laaja potilaalle tietokantaan [25]. Yllättäen huomasimme, että ekspressio A-tyypin lamins sisällä kasvain oli erittäin merkittävä riski-indikaattorin kasvaimen liittyvää kuolleisuutta. Alavirran tutkimuksissa, huomasimme, että ilmentyminen Lamin A CRC solulinjoissa edistänyt invasiivisuus kautta sääteli ilmentyminen aktiini-niputtaminen proteiini T-plastin, mikä puolestaan ​​aiheuttaa alassäädetty ilmentyminen solun adheesiomolekyyli E-kadheriinin . Olemme päätellä, että ilmentyminen A-tyyppinen lamins CRC edistää kasvainten invasiivisuus uudistamisen kautta aktiinisytoskeletonin.

Tulokset

Lamin A on aikuisen kantasolujen biomarkkereiden paksusuolen kryptissa

Ennen tutkii, onko A-tyypin lamins vaikutus syövän etenemiseen, me arvioitiin jakelu A-tyypin lamins normaalissa paksusuolen limakalvon värjäämällä kudosleikkeiden monoklonaalisella vasta-aineella, joka on spesifinen näitä proteiineja. Kuten odotettua [26], A-tyypin lamins olivat erittäin ilmaistaan ​​toiminnallisesti eriytetty epiteelikerrosten ja myös vahvasti ilmaistu ympäröivän strooman kudokseen ja alla olevan lihaksen. Toisaalta, A-tyypin lamiinivektori ekspressio oli erittäin heikko tai puuttuu valtaosa solujen paksusuolen crypts. Kuitenkin A-tyypin lamiinivektori ilmentyminen oli korkea noin viisi vaille kymmenen soluja juuressa kryptissa (kuvio 1A, nuolet). Positiivisesti värjäytyneiden solujen sisään kryptissa olivat hyvin samanlaisia ​​numeron ja käytössä vastaavaan asentoon, joka ymmärretään yleisesti olevan paksusuolen epiteelin kantasolujen kapealla [27], [28]. Jotta voitaisiin edelleen tutkia mitkä mainitut A-tyypin lamiinivektori positiivisia soluja, sarja- leikkeet värjättiin vasta-aineilla lamins A C tai leviämisen biomarkkereiden PCNA. Solut kryptissa joka värjäytyi positiivisesti PCNA olivat negatiivisia A-tyypin lamins, kun taas solut, jotka olivat negatiivisia PCNA oli positiivinen A-tyypin lamins (kuvio 1 B) ymmärtää, että pieni määrä A-tyypin lamiinivektori positiivinen pohjapinta krypta soluja voidaan todellakin oletetaan olevan kantasoluja. Huomasimme myös, että vaikka vasta-aineita, jotka spesifisesti lamiinivektori DID värjää ehdotettu kantasolujen kapealla (mutta ei soluja viereisessä kauttakulku vahvistava alue), lamiinivektori C ei havaittu kummassakaan kantasolu kapealla tai kauttakulku monistetaan soluja, mutta ilmentyi erilaistuneissa epiteelisoluissa ja taustalla muscularis (kuva S1). Siten ilmaus Lamin A puuttuessa lamiinivektori C näyttää määritellä joukko soluja pohjapinta alueella paksusuolen crypt, joka vastaa aluetta oletetaan olevan kantasolun kapealla.

(A) Palanäyte formaliinia kiinteä, vaha upotettu näytteitä normaalista paksusuolen värjättiin seuraavasti lämpöä välittämä antigeenin haun monoklonaalisella vasta-aineella JoL2 vastaan ​​lamins A /C. Leikkeitä kevyesti vastavärjättiin Mayers Haemalum. Arrowheads osoittavat eriytetty epiteelin soluja, kun taas nuolet arvioidusta sijainti kantasolujen paikkansa pohjaan kryptassa. Mittaviivat = 150 pm (vasen paneeli) 50 pm (oikea paneeli). (B) Serial osa normaalin paksusuolen värjättiin vasta-aineilla, joko lamins A /C (JoL2) tai PCNA (PC10) ja käsiteltiin edellä kuvatulla tavalla. Nuolet osoittavat hitaasti jakautuvien solujen juuressa kryptissa, joka tahra positiivisesti JoL2 mutta negatiivisesti PC10. Mittaviivat = 150 pm.

Expression of A-tyyppinen lamins on vaara indikaattori CRC

Alankomaat seurantatutkimus ruokavaliota ja Cancer [29] on prospektiivinen kohorttitutkimus. Aluksi kudosnäytteitä 819 potilasta pyydettiin 54 patologian laboratorioiden koko Alankomaat. Incident tapauksissa mukana ne potilaat kolorektaalisyövän kehittymisen välillä 1989 ja 1993. Kasvain aineistoa ei ollut saatavilla 5%: ssa tapauksista ja jäljellä olevien 775 käytettävissä kudosnäytteitä, 737 sisältyi riittävästi kasvain materiaali immunohistokemiallista analyysia varten. Käyttämällä vakioparametrit testattava 5%: n merkitsevyystaso ja 90% teholla, minimikanta koon tarvitaan luotettavasti havaita pieniä riskisuhteita olisi 516, mikä on turvallista olettaa, että otoksen koko oli riittävän suuri tuottaa tilastollista merkittävyyttä .

immunohistokemiallinen värjäys havaita ilmentymisen lamins A /C antigeenieks- haku suoritettiin kaikista käytettävissä olevista näytteistä. Kaikissa osissa strooman ympäröivään kudokseen syöpä oli aina vahvasti positiivinen lamins A /C tarjoaa sisäisen positiivisen kontrollin. Käyttämällä värjäys strooman kudoksen kriteerinä onnistuneen antigeenin haku, 673 (91%) näytteistä oli saatavilla pisteytys. Olemme havainneet, että vaikka siellä oli jonkin verran vaihtelua voimakkuuden yleisen värjäytymisen, tumalevy /C ilme sisällä kasvain voidaan helposti luokitella joko läsnä (kuvio 2E-H) tai poissa (kuva 2A-D) tumasta. Lisäksi todettiin, että muutamissa tapauksissa oli satunnaista sytoplasmista värjäytymistä ja nämä näytteet pisteytettiin negatiivisiksi kun tumavärjäystä oli poissa. Sen jälkeen sokea pisteytys dioja, haku potilaan ja selviytymistä tiedot tietokannasta johti lopullinen ainutkertaisten tapauksissa alennetaan 658 johtuen päällekkäisyyteen potilashallinnon koodit ja edelleen 2 tapausta jätettiin kun luokitellaan sinettisormus kasvaimia.

4 pm formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettujen leikkeiden välillä 656 riippumattomien paksu- adenokarsinoomia otettiin potilailta osallistuvat Alankomaissa seurantatutkimus ruokavaliota ja syövän. Kudosleikkeet tehtiin immunohistokemia käyttäen JoL2 hiiren monoklonaalinen anti-humaani Lamin A /C-vasta ennen kromogeenin visualisointi ja kevyt counterstaining kanssa Mayers Haemalum erottamaan ytimiä. A-D osoittavat positiivisesti värjäystä strooman (S) ympäröivään kudokseen negatiivisesti värjäystä kasvain (T) kudosta. (A) Kohtalaisen hyvin eriytetty vaiheen I adenokarsinooma; (B) Kohtalaisen hyvin eriytetty vaiheen II adenokarsinooma; (C) Kohtalaisen hyvin eriytetty vaiheen III adenokarsinooma; (D) Kohtalaisen hyvin eriytetty vaiheessa IV adenokarsinooma. E-H osoittavat positiivisesti värjäystä strooman (S) ympäröivään kudokseen positiivisesti värjäystä kasvain (T) kudosta. (E) Kohtalaisen hyvin eriytetty vaiheen I adenokarsinooma; (F) Kohtalaisen hyvin eriytetty vaiheen II adenokarsinooma; (G) Kohtalaisen hyvin eriytetty vaiheen III adenokarsinooma; (H) Kohtalaisen hyvin eriytetty vaiheessa IV adenokarsinooma. Mittaviivat = 30 pm.

aikana seuranta-ajan, 246 potilasta kuoli, 163 näistä potilaista kuolee seurauksena CRC. Niistä 656 käytettävissä yksilöitä immunohistokemiallisesti arvioitu, tumalevy A /C ilmentyminen havaittiin olevan positiivinen 463 (70%) potilaalla ja negatiivinen 193 (30%) potilaalla. Sisällä otoksen potilaista, jotka kuolivat CRC liittyvien syiden sisällä tutkimusjakson aikana (kymmenen vuotta), 127 sai positiivisen lamins A /C, kun taas 36 negatiivinen tulos. Käyttämällä Cox Proportional Hazard laskelmat [30], huomasimme, että potilaat ilmentävät lamins A /C sisällä kasvain oli lähes kaksi kertaa niin todennäköisesti kuolee (Riskisuhde [HR] 1,85; 95% luottamusväli [CI] 1,16-2,97) CRC liittyvän syyt verrattuna clinicopathogically identtisiä potilaita, jotka olivat negatiivisia lamins A /C (

p

= 0,005) (kuvio 3). Siten ilmaus Lamin A /C kasvain korreloivat voimakkaasti CRC liittyvä kuolema.

Kaiken kumulatiivinen vaara-analyysin läsnäolon Lamin A /C ilmaisun ja peräsuolen syöpään liittyvää kuolleisuutta Vaiheen I III potilaat Alankomaissa kohortti tutkimus ruokavalion ja syövän. Suhteellinen riskisuhde (HR) = 1,85 (95% CI = 1,16-2,97),

p

= 0,005 (oikaistu sukupuoli ja ikä diagnoosin).

Expression of lamiinivektori CRC solulinjoissa edistävää lisääntynyt invasiivisuus

havainto, että ilmentyminen Lamin A /C potilaan kasvaimissa läheisesti korreloi CRC liittyvä kuolleisuus oli odottamaton ja jossain määrin absurdia. Siksi ymmärtää, miksi ilmaisua lamins A /C lisää riskiä kuoleman CRC, saimme useita CRC solulinjoja ja aluksi arvioitiin niitä Lamin A /C tilan immunoblottauksella. Yksi pre-metastaattinen solulinja, SW480, lamiini A oli lähes mahdoton havaita (kuvio S2A, B), kun taas ekspressiotasot lamins B

1, B

2 ja C olivat samankaltaisia ​​muiden CRC solulinjoja (esim HT29 ). SW480 valittiin sen vuoksi tutkittavaksi. Määrittää, kuinka ilmaus lamiinivektori saattavat vaikuttaa SW480, viljelmät transfektoitiin stabiilisti joko GFP tai GFP-Lamin konstruktio. Sen jälkeen vakaa transfektion GFP-Lamin Kohtalainen määriä sekä endogeenisten Lamin A sekä fuusioproteiini havaittiin, kun taas GFP transfektoidaan kulttuureissa, lamiinivektori aina puuttuneet (kuvio S2C, D). Morfologia solujen GFP ja GFP-lamiini Transfektoitu viljelmissä oli myös erilainen. Morfologiaa solujen GFP transfektoiduissa viljelmissä (SW480 /CNTL) oli mahdoton erottaa transfektoimattomista viljelmät (SW480), jossa monet solut, jotka olivat erittäin litistetty tai kasvaa päällekkäin. Sitä vastoin GFP-lamiini Transfektoitu viljelmät (SW480 /lama), solut oli enemmän karan ulkonäkö ja kasvoi yhtenä kerroksena alhaisessa solujen tiheys (kuvio 4A).

(A) morfologia transfektoimattomat SW480, SW480 /CNTL ja SW480 /Lama verrattiin faasikontrastimikroskopiassa. SW480 /CNTL ja transfektoimattomilla soluilla litteä morfologia ja monikerroksinen kasvua. Sitä vastoin, ektooppinen ilmentyminen GFP-lamiini A (SW480 /Lama) näytti indusoivan morfologisia muutoksia, mukaan lukien ulkonäkö kara-muotoon ja kasvua yhtenä kerroksena. Asteikko bar = 10 um. (B) Scratch haavat tehtiin 100% konfluentteja viljelmiä SW480 /CNTL tai SW480 /Lama soluja. Vaihekontrasti kuvat otettiin kahden tunnin välein 12 tunnin ajaksi identtisiä alueita. Asteikko bar = 200 pm. (C) Haava koon suhteessa lähtö- haavan koko mitattiin 12 tunnin kuluttua kolmessa riippumattomassa kokeessa ja ilmaistuna prosentteina pieneneminen haavan koon +/- standardipoikkeama (S.D.). Solumigraation oli ~seven kertaa nopeampi SW480 /Lama verrattuna SW480 /CNTL kulttuureissa, p 0,005. (D) Cell cycle ominaisuudet tutkittiin käyttäen virtaussytometrialla. Solujen osuus kussakin vaiheessa solusyklin annetaan keskiarvona ± S.D. kolme rinnakkaista. Ei merkittäviä eroja Solusykli dynamiikan kahden solulinjojen havaittiin.

muuttavien /metastaattinen käytös syöpäsoluissa liittyy tyypillisesti fenotyyppisiä muutoksia [31]. Sen tutkimiseksi, muuttunut solumorfologiaan korreloi muuttunut muuttavien käyttäytyminen suoritimme soluliikkuvuus määrityksiä viljelmät. Seuraavat tyhjästä haavoittamisen haavan, oli seitsemän kertaa nopeammin viljelmissä, jotka oli transfektoitu GFP-lamiini verrattuna viljelmissä, jotka oli transfektoitu GFP (kuvio 4B 0,005). (B) SW480 /Lama viljelmiä käsiteltiin salattu siRNA tai siRNA spesifisiä T-plastin. 108H käsittelyn jälkeen RNA uutettiin ja monistettiin RT-PCR: llä käyttäen spesifisiä alukkeita T-plastin ja E-kadheriinin. Sata prosenttia knockdovvn T-plastin mukana oli uudelleen ilmentäminen E-kadheriinin selostukset. (C, D) Vaihtoehtoisesti tyhjästä haavoittaen suoritettiin konfluentteja viljelmiä 108H jälkeen siRNA hoidon ja haavan mitattiin kuten on kuvattu kuviossa 4B, C. Cell siirto on 2-kertaiseksi nopeammin käsitellyissä viljelmissä salattu siRNA verrattuna käsitellyt viljelmät SIT-plastin (

p

0,05). Asteikko bar = 200 pm.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa raportoida kaksi uutta ja odottamatonta havainnoista. Ensinnäkin Lamin A, mutta ei lamiinivektori C potentiaalinen biomarkkereiden kantasolujen paikkansa paksusuolen crypt ja toiseksi ilmentyminen Lamin A /C CRC kudoksissa korreloi voimakkaasti CRC liittyvää kuolleisuutta ja siksi Lamin A /C edustaa uutta ja tärkeitä prognostisia biomarkkereiden CRC.

Sijainti kantasolujen kapealla paksusuolessa on päätelty solusta kineettisen ja radioaktiivista tutkimuksiin. Radioaktiivista S-vaiheen imukerässoluista tritioidulla tymidiinillä, keskimääräinen vaellusnopeus solujen suhteessa niiden solujen asema on mitattu. Tätä lähestymistapaa käyttäen alkuperä muuttoliikkeen ja, ekstrapoloimalla, kantasolu kapealla on ennustettu asua juuressa crypt [35]. Määrä kantasoluja miehittää tämän kapealla on likimäärin välillä viisi vaille kymmenen soluihin [36]. Viime aikoina, ilmaus Wnt-vaste-elementin Lgr5 on osoitettu määritellä paksusuolen kantasoluja ja sitä on käytetty vahvistamaan, että kantasolut miehittää kapealla juuressa kryptissa [27]. Solut vastaava määrä ja miehittää juuri siinä, että kapealla helposti värjätään vasta havaitsemiseksi lamins A /C tai Lamin A, mutta eivät värjätään spesifisesti havaitsemiseksi lamiinivektori C. Sen sijaan soluissa miehittää kauttakulku vahvistava alue, ilmentäminen molemmat lamiinivektori ja lamiinivektori C puuttuu. Kuten odotettua [26], [37], [38], molemmat lamins todetaan helposti toiminnallinen eriytetty epiteelissä on paksusuolen limakalvolla. Yhdenmukainen sen ajatuksen kanssa, että lamiini A on mahdollinen biomarkkeri paksusuolen kantasoluja, soluille kryptan pohjalta, jotka ovat positiivisia lamiini A, ovat yleensä negatiivisia DNA: n replikaation proteiinin PCNA, kuten olisi odotettavissa soluissa, jotka ovat enimmäkseen lepotilassa [39]. Tämä Lamin A on potentiaalinen biomarkkereiden aikuisen kantasoluja on tärkeää yleistä vaikutusta taudin. Lamins A /C mutatoitunut monenlaisia ​​rappeuttavia sairauksia, jotka liittyvät ennenaikaiseen vanhenemiseen [3], ja on ehdotettu, että yksi syy rappeutumista näissä sairauksissa on menetys aikuisten kantasolujen toiminto [40]. Tämä Lamin A: n eks- huomautetaan, aikuisten kantasolujen kapealla paksusuolen, lainaa suora tuki tätä hypoteesia. Havainto, että Lamin A voi olla oletetun kantasolujen biomarkkereiden on edelleen vaikutuksia meidän löytö, että ilmentyminen Lamin A /C CRC korreloi suurentunut riski CRC liittyvää kuolleisuutta, koska se voidaan pitää mahdollista, että syöpäsolut ilmentävät Lamin A voi olla enemmän kantasolujen kaltaisia ​​fenotyyppi ja näin ollen luonnostaan ​​vaarallisempia [41].

todettuaan, että ilmentyminen A-tyyppinen lamins CRC kudosta korreloi kaksi kertainen lisäys CRC liittyvän kuolleisuuden verrattuna ei ole a-tyypin lamins, ensimmäistä kertaa suoraan yhdistää nämä proteiinit etenemisen yleinen sairaus. Aiemmat tutkimukset ovat kuvanneet muuttunut ekspressio A-tyypin lamins alueella syöpiä, mukaan lukien ihon syövät, keuhkosyöpä, imusuonet ja pehmytkudoksen [24], [37], [42] – [44]. Kuitenkaan mikään näistä tutkimuksista oli mahdollisuus yhdistää joko puuttuessa tai läsnä ollessa, A-tyypin lamins kasvaimen etenemiseen, mutta ainakin yhdessä tutkimuksessa [24], viittasi siihen, että menetys ilmentymisen lamins A /C korreloi parannetun leviämisen hinnat kasvaimissa. Toinen ongelma näiden aiempien tutkimusten on, että rajoitettu määrä näytteitä oli saatavilla analyysiä varten ja näin ollen tutkia koot alitettiin luotettavalle tilastollista analyysiä. Sen sijaan nykyinen toteamus perustuu riittävän riittävän suuri kohortti tarjoamaan täydellisiä luottamuksen merkitys tasoilla raportoitu.

havainto on jossain määrin absurdia, että ilmentyminen A-tyyppinen lamins erilaisissa soluissa yleensä hidastaa solujen lisääntymistä [21], kun taas ilman A-tyypin lamins voidaan korreloida jättämisestä niiden kasvu pysähtyy klo yhtymäkohdassa [22]. Näin ollen, nollahypoteesi käytetään alussa oli, että ei ole A-tyypin lamins olisi korreloi lisääntyneen syöpäriskin liittyvä kuolema. Käyttäen mallia CRC solujen linjat Emme havainneet merkittäviä muutoksia nopeudessa soluproliferaation soluissa, jotka ilmentävät lamiinivektori verrattuna soluihin samanlaisen geneettisen taustan että puuttui ilmaus Lamin. Emme kuitenkaan havaita lisääntynyt merkittävästi invasiivisen ominaisuuksia, kun verrataan lamiinivektori ilmentävien solujen soluihin, joissa ekspressio lamiini A ei ole läsnä. Invasiivista ominaisuuksia näiden solujen syntyy, koska läsnäolo lamiinivektori aiheuttaa myötävirtaan säätely ylöspäin T-plastin, mikä puolestaan ​​johtaa alas-säätely E-kadheriinin. Plastins ovat äskettäin kuvattu perheen aktiini-niputtamista proteiinit, jotka on liitetty invaasio /etäpesäkkeiden [34]. Samassa solulinjassa, kuten käytetty tässä tutkimuksessa, ilmentyminen L-plastin on raportoitu johtavan alas-säädellä ilmentymistä E-kadheriinin ja lisääntynyt invasiivisuus ja on korreloi läheisesti etäpesäkkeitä [32]. Nykyinen havainnot ovat täysin yhdenmukainen aiempien tutkimuksessa, mutta viittaavat siihen, että ensinnäkin Lamin A on määräysvalta tämän reitin ja toiseksi, että invasiivisuus voidaan indusoida ilmentymistä T-plastin läpi samalla mekanismilla. Kiinnostavaa kyllä, myös havaittu, että endogeenisten Lamin A havaittiin SW480-soluissa, kun stabiili ilmentyminen GFP-Lamin A, kun taas läsnä ollessa GFP yksin lamiinivektori pysyi poissa. On hyvin tunnettua, että A-tyypin lamins ovat alttiita pilkkominen ei-kierteiset linkkeri 2 alueella [3]. Lamin esiintyy soluissa joko rinnakkaisia ​​himmentimet tai antiparalleelin tetrameerien jossa N-terminaalinen pää domain päällekkäinen linkkeri 2 alueelle [45]. Koska GFP-osa sijaitsee N-terminaalissa, ehkä tämä suuri proteiini suojaa linkkeri 2 päässä proteolyyttisen hajoamisen ja siksi stabiloi sekä GFP-Lamin A ja endogeeninen lamiinivektori A. seuraus tämän hypoteesin, että puuttuminen Lamin A SW480 solulinjoissa johtuu translaation jälkeisen modifikaation proteiinin.

Miten läsnäolon lamiinivektori vaikuttaa ilmaisuksi aktiini-niputtaminen proteiini on aiheena loppupään tutkimukset. Kuitenkin kaksi erillistä mekanismeja voidaan harkita. Se on äskettäin osoitettu, että A-tyypin lamins vaikuttaa suoraan järjestämiseen solun tukirangan, vetolujuus solujen [46], ja niiden kykyä vastata korostaa [10]. Tämä saavutetaan kautta LINC monimutkainen, joka välittää assosiaatioita tumalevy ja solun tukirangan kautta nesprins [4]. Näin ollen, yksi mahdollisuus on, että läsnäolo tai puuttuminen lamiini A syöpäsolu voi johtaa suoraan solun tukirangan uudelleenjärjestelyn kautta silmukka, joka tunnistaa vetolujuus solun. Vaihtoehtoisesti, lamiini A: lla on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa suoraan erilaisia ​​transkriptiotekijöiden [17], ja sen läsnäolo voi vaikuttaa suoraan ilmentymistä T-plastin. Joko niin, fenotyyppiset tuloksista uudelleenjärjestely on lisääntynyt invasiivisuus ja oletettavasti lisääntynyt metastaattinen potentiaali.

Yhteenvetona ehdotamme, että korkea riski kuolla CRC liittyvistä syistä potilailla, joilla esiintyy A-tyypin lamiinivektori ilmaus niiden kasvain syntyy, koska Lamin a on alkupään säätelijänä polun yhdistää aktiini dynamiikkaa menetykseen solun tarttumisen, mikä aiheuttaa lisää soluliikkuvuus ja siten lisääntynyt invasiivisia potentiaalia kasvain. Tämä fenotyyppi voi puolestaan ​​olla heijastava entistä kantasolun kaltaisia ​​omaisuutta syöpiä. Vaikka mutaatiot lamins A /C ovat sekaantuneet monenlaisia ​​harvinaisten geneettisten sairauksien [3], nykyinen havainnot ensimmäistä kertaa yhteyden ilmentymistä näiden proteiinien kanssa etenemistä yksi yleisimmistä syistä syöpään liittyvät kuolemat Länsi maailma.

Materiaalit ja menetelmät

immunohistokemia

Parafiinisektioista (4 pm) normaalin paksusuolen limakalvon ja peräsuolen adenokarsinooma poistui-paraffinised ja niihin lisätään ksyleeniin ja etanoliin. Sillä antigeeni haku, osat upotettiin 3% H

2O

2 sammuttamiseksi endogeenisen peroksidaasin ennen inkuboidaan 0,01 M sitraattipuskurissa (pH 6,0) 20 minuutin ajan 90 ° C: ssa. Sitten leikkeet blokattiin 5% normaalia vuohen seerumia seurasi inkubointi joko JoL2, anti-lamiini A /C-hiiren mAb [47] [1:10], PC10, anti-PCNA-hiiri-mAb [1:100], RalC, anti -lamin C kanin polyklonaalinen vasta-aine, [24] [1:100] tai 133A2, anti-lamiini hiiri-mAb: [48] [1:100] yli yön 4 ° C: ssa. Leikkeitä inkuboitiin sitten biotinyloidulla vuohen anti-hiiri-IgG, joka oli laimennettu 1:400 45 min huoneen lämpötilassa. Standardi ABC prosessi Sitten suoritettiin ohjeiden mukaisesti Dako (DakoCytomation, Glostrup, Tanska). Diaminobentsidiiniä käytettiin kromogeenina, jota seuraa valon counterstaining kanssa Mayers Haemalum.

Soluviljely

Ihmisen pre-metastaattinen paksusuolen adenokarsinooman solulinjoja HT29 ja SW480 saatiin European Collection of Cell Cultures, UK. HT29 viljeltiin McCoyn 5A-alustassa (Sigma, UK), johon oli lisätty 10% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä ja pidettiin kosteutetussa ympäristössä 37 ° C: ssa, 5% CO

2. SW480-soluja ja transfektoituja johdannaisia ​​kasvatettiin Leibovitz-15 (L-15) väliaineessa (Invitrogen, UK), johon oli lisätty 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä ja pidettiin kosteutetussa ympäristössä 37 ° C: ssa ilman CO

2.

stabiili transfektio GFP-toimittajat osaksi SW480 paksusuolen adenokarsinooma solujen

SW480-solut transfektoitiin DNA-konstruktit, jotka koodaavat fuusioproteiinia EGFP-Lamin täyspitkän (lahja Dr. M. Izumi, Institute of Physical and Chemical Research, Saitama, Japani) ja EGFP.