Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Krooninen tulehdus liittyy haavainen paksusuolen tulehdus voi altistaa yksilön lisääntynyt paksusuolen syövän riskiä. Näillä tutkimuksissa oli tunnistaa MikroRNA jotka poikkeavasti säädellään tulehduksen aikana ja ne voivat osallistua transformaatio paksusuolen epiteelisolujen tulehdus- ympäristössä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Meillä on käytettävä kvantitatiivinen PCR taulukot verrata microRNA (miRNA) ilmentyminen kasvaimissa ja hallita paksusuolen epiteelisolut eristettiin distaalisesta colons kroonisesti tulehtunut hiiret ja APC

Min /+ hiirillä. Arvojärjestyksen tilastoja käytettiin tunnistamaan eri tavoin säänneltyjä miRNA kasvaimissa, jotka ovat syntyneet johtuu krooninen tulehdus ja /tai ituradan APC-mutaatio. Kahdeksan etusijalle miRNA tunnistettiin: miR-215, miR-137, miR-708, miR-31, ja miR-135b oli differentiaalisesti ilmaistut APC kasvaimia ja miR-215, miR-133a, miR-467d, miR-218, miR-708, miR-31, ja miR-135b koliitti liittyviä kasvaimia. Neljä näistä (miR-215, miR-708, miR-31, ja miR-135b) oli yhteinen molemmille kasvaimia tyyppejä, ja häiriöstä näiden miRNA vahvistettiin riippumattomalla vedostulostus. Target ennustaminen ja polku analyysi viittaa siihen, että nämä MikroRNA, kokonaisuutena, säädellä signaalinvälitysreittien liittyvät MAPK, PI3K, WNT, ja TGF-β, jotka kaikki tiedetään olla mukana muutoksessa.

Johtopäätökset /Merkitys

Olemme päätellä, että nämä neljä miRNA ovat väärin säädellystä jossain hyvin varhaisessa vaiheessa transformaatio paksusuolen epiteelisolujen. Tämä vastaus ei riipu mekanismi aloittamisesta muunnos (tulehdus vs. ituradan mutaatio), mikä viittaa siihen, että miRNA että olemme tunnistaneet todennäköisesti säädellä kriittinen signalointireittien jotka ovat keskeisiä aikaisin tapahtumien transformaation paksusuolen epiteelisolujen.

Citation: Necela BM, Carr JM, Asmann YW, Thompson EA (2011) Differential ilmentäminen MikroRNA kasvaimissa kroonisesti Tulehtuneita tai Genetic (APC

Min /+) mallit Colon Cancer. PLoS ONE 6 (4): e18501. doi: 10,1371 /journal.pone.0018501

Editor: Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay, Instituto Nacional de syöpä, Brasilia

vastaanotettu: 31 tammikuu 2011; Hyväksytty: 01 maaliskuu 2011; Julkaistu: 12 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Necela et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoitettiin osittain jonka CCFA Urakehitys -palkinto BMN. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat luokan pienen ei-koodaavan RNA: t 19-22 nukleotidin osallisena useita tärkeitä solun prosesseja, kuten kehitys, erilaistuminen, proliferaatio, solusyklin etenemisen, apoptoosin, tulehdusta, ja stressistä [ ,,,0],1] – [8]. MikroRNA uskotaan yleisesti toimivan siten, että sitoo 3′-UTR kohde- mRNA: iden ja joko estämällä translaation tai joissakin tapauksissa indusoimaan mRNA: n hajoamisen [3], [9]. Bioinformatiikan tutkimukset viittaavat siihen, että miRNA voi säädellä yksi kolmasosa transcriptome [10], [11]. Koska niiden taipumus säännellä lukuisia prosesseja ja kohde- geenejä, ei ole yllätys, että poikkeava ilmentyminen miRNA on yhdistetty lukuisiin patologisiin tiloihin, kuten astma, diabetes, munuaisten, hermoston, ja sydän. Erityisesti ero miRNA ilmentyminen on yhdistetty moniin syöpiin kuten rinta-, kilpirauhas-, keuhko-, haima-, ja paksusuolen syöpä.

Tähän mennessä yli tusina tutkimuksissa on raportoitu yhdistyksen poikkeavan miRNA ilmentymisen paksusuolensyöpä [ ,,,0],12] – [31]. Expression of miRNA paksusuolen kasvaimet voidaan vaikuttaa lukuisat ennusteeseen viittaavia muuttujia kuten kasvaimen ja sijainti, mutaatio tila (p53, APC, MSI) [32] – [36], ja solujen pitoisuus (

eli

tulehdussolujen ) sekä preanalyyttiset ja analyyttisten muuttujien kuten louhintamenetelmää kiinnittymisestä ja valinta analyyttinen alustan (sekvenssi, qPCR tai mikrosiru). Tämän seurauksena näiden muuttujien ei ole yksimielisyyttä jotka miRNA ilmentyvät differentiaalisesti paksusuolen kasvaimissa. Kuitenkin muutamat MikroRNA ovat johdonmukaisesti nousseet ollessa väärin säädellystä paksusuolen syöpä. Näistä miR-31 on jatkuvasti säädelty [12] – [17], [20], [22], [23], [25] ja microRNA klustereita miR-143 /-145 [18], [21] – [ ,,,0],23], [37] – [40] ja miR-194 /-215 [18], [21] – [23], [37], [38], [41] vaimentua paksusuolen syöpä. MicroRNA -31 on yhdistetty solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen koolonkarsinoomasoluissa [42], [43]. MikroRNA -192 ja -215 estävät solujen proliferaatiota ja aiheuttavat solusyklin pysähtymisen p53-riippuvaisella tavalla [37], [44], [45]. Samoin miR-143 ja miR 145 estävät solujen kasvua, tämä toimi osittain johtuu estämällä kohdegeenien kuten DNMT3A, IRS-1, YES1, STAT1 ja FLI1 [21], [46] – [ ,,,0],50].

Yksi kliininen muuttuja, jota ei ole käsitelty riittävästi on tulehduksellinen tila paksusuolen kasvain. Suora yhteys tulehduksen ja syövän on vakiinnuttanut, jossa NFKB nousemassa keskeiseksi pelaaja [51], [52]. Tulehdus uskotaan paitsi muuttaa ja edistää kasvaimen microenvironment, mutta itse, voi johtaa suoraan kasvaimien syntyyn. Potilaat, joilla on haavainen paksusuolen tulehdus, krooninen, uusiutuva paksusuolen tulehdus, ovat lisääntynyt riski sairastua paksusuolen syöpään. Tuore meta-analyysi paljasti todennäköisyydet paksusuolen syövän haavainen paksusuolen tulehdus 2% 10 vuoden kuluttua, 8% 20 vuoden jälkeen, ja 18% 30 vuotta taudin [53]. Yksi mahdollinen mekanismi, jolla tulehduksellinen reittejä voivat vaikuttaa muutoksen kautta vapauttaminen miRNA. Lisääntyvä todistusaineisto viittaa siihen, että miRNA kykenevät säätelemään tulehduksia ja ovat väärin säädellystä erilaisissa tulehdussairauksissa [54]. Äskettäin häiriöstä MikroRNA on havaittu potilailla, joilla on haavainen paksusuolen tulehdus [55], [56]. Kuitenkin tiedetään vähän toiminnallinen seurausta häiriöstä miRNA aikana kroonisen koliitin epiteelisoluissa, ja vielä vähemmän kasvaimien syntyyn. Vaikka rajoitettu, nämä tutkimukset eivät tarjoavat precident että vapauttaminen osajoukko MikroRNA aikana krooninen koliitti voi liittyä neoplastisia ja metaplastiset metaplastiset muutosta. Tätä varten MikroRNA voi olla hyödyllistä biomarkkerit auttaa ennustamaan maligniteettiriski potilailla, joilla on pitkäaikainen sairaus on aktiivinen.

Tutkimukset kuvattu tehtiin alkaa testata hypoteesia, että osajoukko MikroRNA on väärin säädellystä vuonna suoliepiteeliin aikana koliitti ja edistää syövän syntymistä. Mittasimme miRNA kvantitatiivisella PCR alhaisen tiheyden TaqMan taulukoihin käyttäen RNA: ta paksusuolen epiteelisoluissa hiirten indusoitu akuutti dekstraanisulfaatin koliitti (AC), krooninen koliitti (CC), koliitti liittyvä koolontuumoreissa (CAC), ja paksusuolen kasvaimista APC

Min /+ hiirillä. Havaitsimme ero ilmaus miRNA yhteisiä ja ainutlaatuinen jokaiselle sairaustilan. Erityisesti, me osoitamme, että osajoukko miRNA on säädeltyyn sekä kasvaimissa sekä tulehdus- ja geneettistä alkuperää. Nämä miRNA on mahdollista ohjata sekä anti-onkogeenisiä ja pro-onkogeenisen transkription verkot ja näin vaikuttaa kasvaimia synnyttäviä lopputulokseen.

Tulokset

vertailu analyyttisiä malleja käyttäen akuutti koliitti (AC) näytteet

kvantifiointi miRNA ilmaisun kudosnäytteistä mutkistaa se, että yksi ei ole mitään selvää suoraa keinoja tunnistaa sopivat endogeenisen tarkastuksia, joita voidaan käyttää normalisoimaan ekspressiotietojen ja korjata erot RNA-määrä analysoidaan tai tehokkuutta miRNA uuttamalla tai cDNA muuntamisen näytteissä eri kudoksissa. Tämä mahdollinen ongelma on erityisen akuutti tutkimustulokset, kuten ne, jotka kuvataan alla, jossa me sitoutuvat vertailla miRNA runsaasti kudoksissa hiiristä peräisin eri-ikäisiä, ruokavaliot, tulehduksellinen tila, ja kasvaintaakkaa. Siksi suorittaa on kokeilu verrata eri analyysimenetelmiä ja tilastollisten mallien tunnistamiseen differentiaalisesti säänneltyä miRNA paksusuolen epiteelisoluissa. Tätä varten olemme uutettiin miRNA välillä epiteelisolujen valmisteet distaalisesta kaksoispisteet ohjaus C57BL /6J-hiiret ja hiiret, jotka oli altistettu 3,5% DSS juomavedessä neljä päivää. Histologisesti, kaksoispisteiden kontrollista ja DSS-hoidettujen hiirten olivat erottamattomat, ei ollut näyttöä este erittely, krypta menetys tai invaasiota immuunisolujen. Vaikka nämä kudokset muodollisesti edustavat ennalta tulehtunut tila, näytteet on nimetty AC (akuutti koliitti), sitä seuraavissa keskustelussa, kun taas säätimien tunnistettava Con.

Käytimme AB TaqMan taulukot mitata runsaus 384 miRNA AC ja Con näytteitä ilmaistuna kriittisten kynnysten (Ct) kunkin miRNA ilmaisinta. Kolme analyyttisiä lähestymistapoja verrattiin. Yksinkertaisin näistä oli paremmuusjärjestyksien tilastoja. Jokainen miRNA tietyssä näyte voima paremmuusjärjestykseen analoginen lukemiselle miRNA runsauden (Ct-arvo). Ilmaisimet, jotka pisteytettiin ”huomaamaton” jaettiin Ct-arvot 40, ja kaikki miRNA kanssa Ct = 40 määrättiin sama sijoitus näytteessä. T-testi (olettaen että varianssi on erisuuruinen) suoritettiin sitten vertaamaan paremmuusjärjestyksessä toimeksiannot miRNA kaksi erilaista näytettä ryhmään, jotta voitaisiin selvittää miRNA joiden keskimääräinen arvojärjestyksen ilmaisun muuttunut huomattavasti seurauksena hoidon. Toinen analyyttinen lähestymistapa mukana yksinkertainen mediaani normalisointi näytteistä, jota seuraa t-testi (olettaen että varianssi on erisuuruinen) vertailla Ct-arvojen välillä Con ja AC näytteitä. Ero ilmentyminen ilmaistaan ​​ACt (lyhennettynä DCT), joka edustaa (meanCtMed_Norm_AC) – (meanCtMed_Norm_Con). Kolmas menetelmä palveluksessa Integromics Statminer paketti, joka käyttää Limma perustuva empiirinen Bayes toteuttamiseen laskea hyperparamter, joka on vuorostaan ​​käytetään moduloimaan varianssi ja lisätä vapausasteita koko näytteitä. Statminer paketti laskee myös varianssi joukossa käyttäjän määrittämiä endogeenista valvontaa ja tunnistaa ne, joilla on vähiten varianssi kaikissa näytteissä. Statminer paketti mahdollistaa useiden endogeeninen valvonta voidaan käyttää normalisoimaan aineisto. Tässä tapauksessa vähiten variantti endogeenisen kontrollit olivat sno135 ja miR-25, ja näitä käytettiin normalisoinnista. Ero ilmentyminen ilmaistaan ​​ΔΔCt (lyhennettynä DDCt), joka edustaa (meanΔCtLimma_SM_Tumor) – (meanΔCtLimma_SM_Con) Näin meillä verrattuna suhteellisen yksinkertainen malli, jossa ei ole yritetty normalisoinnista (arvojärjestyksen tilastoja, lyhennettynä Rnk_Diff), yksinkertainen mediaani normalisointi malli (Med_Norm), ja monimutkaisempi empiirinen Bayes että käytetään useita endogeenisen valvontaa normalisoida datan (Limma_SM).

vertailu muutosten paremmuusjärjestyksessä yksittäisten miRNA (Rank ero AC-Con) ja log2 kertainen muutos mediaani normalisoitu data [mediaani normalisoitu DCT (AC-Con)] on esitetty kuviossa 1A, kun taas samanlainen vertailu log2 kertamuutos jälkeen Limma normalisoinnin sno135 ja miR-25 [DDCt (AC-Con)] on kuviossa 1B on esitetty. Jakaumat ovat ilmeisesti lähes identtiset, kuten on osoitettu Spearmanin korrelaatiokertoimet 0,8324 ja 0,8328 varten kuviot 1A ja B, vastaavasti. Tämä samankaltaisuus seuraa lähellä identiteettiä ekspressiotietojen lasketaan mediaani normalisoitu ja Limma-normalisoitu data (kuvio 1 C, Spearmanin korrelaatiokerroin = 0,9996). Havainto, että kaksi hyvin erilaista normalisointi protokollia tuotti olennaisesti identtiset tulokset todennäköisesti osoittaa, että on olemassa hyvin vähän varianssi joko analyyttinen tai biologisia, keskuudessa näytteitä.

Muutokset paremmuusjärjestyksessä, määritellään keskimääräinen sijoitus AC näytteitä miinus tarkoittaa sijoitus Con näytteitä, piirretään DCT-arvot (keskiarvo Ct_AC miinus tarkoittaa Ct_Con) paneelissa A tai DDCt (keskimääräinen DCt_AC miinus tarkoittaa DCt_Con) paneelissa B. Limma normalisoidut DDCt arvot yksittäisille miRNA piirretään mediaani normalisoidut DCT-arvoja Panel C . Differentially ilmaisi miRNA suodatettiin P 0,01 ja paremmuusjärjestyksessä muutos ≥10 tai log2 kertaluokkamuutos ≥1.0. Päällekkäisyyttä ilmentyvät eri miRNA tunnistaa paremmuusjärjestyksessä tilastojen (Rnk_Diff), t-testi käyttäen mediaani normalisoitu data (Med_Norm), tai Statminer täytäntöönpanoa Limma (Limma_SM) on esitetty ruudussa D.

käyttäminen nämä kolme lähestymistapaa havaitsimme 193 miRNA että pisteytettiin merkitsevästi erilainen (P≤0.01) yhden tai useamman analyysien (lueteltu taulukossa S1). Me määrätty Lisäsuodattimien listalla ero ≥ (± 10) ja P≤0.01 tunnistaa 73 ilmentyvät eri miRNA mukaan paremmuusjärjestykseen tilastoja. Kun suodatetaan log2 kertainen change≥ (± 1,0), ja P≤0.01 havaitsimme 130 miRNA, jotka ilmentyvät differentiaalisesti mediaani normalisoitu analyysi ja 134 miRNA, jotka ilmentyvät differentiaalisesti mukaan Limma analyysi. Venn-kaavio päällekkäisyys näiden miRNA on esitetty kuviossa 1D. Hieman yllätykseksemme oli vain 51 miRNA että täytti kaikki edellytykset kaikissa malleissa. Kolmiulotteinen korrelaatio vertaamalla listalla ero, DCT (mediaani normalisointi), ja DDCt (Limma normalisointi) paljasti 3-ulotteinen korrelaatiokerroin 1,00 nämä 51 näytettä (tuloksia ei ole esitetty). Nämä miRNA edustaa suuri todennäköisyys tavoitteet, jotka ovat todennäköisesti jotain roolia aivan alkuvaiheista tulehduksen. (Nämä miRNA tunnistetaan lihavoitu taulukossa S1.) Sekä mediaani normalisoinnin ja Limma tuottivat merkittäviä määriä poikkeavuuksien taas paremmuusjärjestyksessä tilastollinen analyysi osoitti lähes täydellinen päällekkäisyyttä ainakin yksi muista malleista (Fig. 1 D).

Meidän johtopäätös tästä alkuperäisestä vertailusta kolmella eri normalisointi menetelmiä on, että ne kaikki antavat hyvin samanlaisia ​​tuloksia, suhteellisena miRNA runsaus, joka aineisto vähän analyyttinen tai biologinen vaihtelu valvonnassa ja koeryhmään. Eri tilastollisia malleja antaa merkittävästi erilaisia ​​p-arvoja, mikä johtuu todennäköisesti suurelta osin pieni määrä näytteitä, jotka oli sisällytetty tähän analyysiin sekä käyttöä valvotaan varianssi (Limma) vs. valvomaton varianssi (t-testi). Kaiken arvojärjestyksen tilastoihin toimii vähintään yhtä hyvin kuin jompikumpi normalisoitu mallien taipumus olla konservatiivinen kannalta useissa eri tavoin säänneltyjen miRNA, ja on lisäetuja, että se ei vaadi tietoa asianmukaisten endogeenisen valvonnan ja anna mitään oletuksia yhtä suuret määrät RNA: ta tai yhtä suuri tehokkuus miRNA uuttamalla tai cDNA muuntaminen näytteestä toiseen. Siksi valittiin tyt analyysien avulla paremmuusjärjestyksessä tilastoja tunnistamiseksi ilmentyvät eri miRNA. Kuitenkin muutokset paremmuusjärjestyksessä eivät ole informatiivisia absoluuttisina (tai tarkemmin analoginen) miRNA runsaus, joten vedonnut Limma laskea normalisoitu runsautta ilmaistuna DDCt, mikä vastaa -log2 kertaluokkamuutos normalisoida sno135b /miR-25 .

tunnistaminen ilmentyvät eri miRNA kokeellisissa malleissa paksusuolentulehduksen liittyvien paksusuolensyöpä ja familiaalinen adenomatoottisen polypoosin coli

Käytimme AB TaqMan miRNA paneelit mitata runsaasti 384 miRNA kasvaimissa eristetty distaalisesta kaksoispisteet APC

Min /+ hiirillä (APC kasvaimet) ja kasvaimia, jotka muodostivat distaalisessa kaksoispisteet kroonisesti tulehtunut hiiret (CAC kasvaimia). APC

Min /+ hiiret eläkkeellä kasvattajat, 120d ikäisiä, ja ylläpidetään rasvaisen kasvattajan Chow. CAC kasvaimia eristettiin hiiristä, jotka oli alistettu 12 kierrosta alhainen tulehduksen indusoima DSS, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kontrollinäytteinä, me eristetty epiteelisolujen vieressä, sivullisten epiteelissä APC

Min /+ (APC kontrolli) tai kroonisesti tulehtunut (CC kontrolli) hiiriin. Arvojärjestyksen tilastoja käytettiin tunnistamaan ehdokas ilmennetty eri miRNA APC ja CAC kasvaimia. (Raaka-Ct-arvot näiden näytteiden annetaan taulukossa S2.) B

Ct-arvoja kaikkien miRNA yksittäisten kasvainten ja kontrollinäytteiden määritettiin ja voimassa sijoittuu, kuten on kuvattu edellä, ja t-testiä käytettiin tunnistamaan miRNA joiden keskimääräinen sijoitus oli merkittävästi erilainen kontrolleissa ja kasvaimia. Keskimääräinen järjestyskäskyjä yksittäisille miRNA APC ohjaus ja APC kasvaimet näkyvät kuvassa 2A. Siellä oli yleensä hyvä vastaavuus välillä arvojärjestys miRNA runsautta APC ohjaus ja APC kasvainnäytteet (Spearman Rank Order korrelaatiokerroin = 0,973, p = 2.0E

-07), mutta 10 miRNA (esitetty punaisella symboleja ) kuulunut 95% ennusteen välein (esitetty rinnakkaista kuvassa. 2A).

Mean järjestyskäskyjä of miRNA runsauden (perustuen Ct-arvot) määritettiin kasvaimia distaalisesta kaksoispisteitä tai sivullisten viereiseen distaalisen paksusuolen epiteelisolujen (paneeli A). SigmaStat avulla laskettiin 95%: n luottamusväli näitä tietoja (rinnakkaiset yhtenäiset viivat) ja miRNA ilmaisimia, jotka eivät kuuluneet näiden väliajoin täytetään punaisella. Samoin vertasimme paremmuusjärjestyksessä ilmentymisen miRNA kasvaimia, jotka muodostivat distaalisessa kaksoispisteet kroonisesti tulehtunut hiiret (CAC) ja mitäänsanomattoman, kroonisesti tulehtunut distaalisen paksusuolen epiteelisolujen valmisteita (CC valvonta), kuten esitetty ruudussa B. MicroRNA ilmaisimia, jotka putosi ulkopuolella 95%: n luottamusväli täytetään punaisella.

Kuva 2B vertailee järjestyskäskyjä runsaudesta miRNA mitataan CCcontrol ja CACtumors näytteitä. Kuten APC näytteitä, oli yleisesti ottaen korkea vastaavuus välillä paremmuusjärjestykseen runsaasti miRNA näissä näytteissä (Spearman Rank Order korrelaatiokerroin = 0,970, p 2.0E

-07). Kuitenkin 10 miRNA (punainen symbolit) kuulunut 95% ennusteen välein (Fig. 2B), mikä osoittaa, että joukkoon näiden miRNA olivat erilaisia ​​valvonnan ja kasvaimissa, joka takaa korkean todennäköisyyden, että nämä miRNA oli ilmennetty eri. On Kokemuksemme mukaan erittäin suuret muutokset miRNA runsauden (osoituksena tässä tapauksessa suurten paremmuusjärjestyksessä erot) ovat joskus liittyy epätyypillisiin kinetiikkaa monistamisen hyvin vähäistä miRNA. Siksi silmämääräisesti qPCR monistuskäyriä kunkin miRNA jokaisessa näytteessä ja poistaa ne, joiden log-lineaarinen vahvistus kinetiikka (1CT /sykli) eivät saaneet. Tämä Curation vaihe vähensi suurella todennäköisyydellä ilmentyvät eri miRNA APC kasvaimia 5 ja kuinka monta tällaista miRNA vuonna CAC kasvaimissa 7. Kuten taulukosta 1, kaksi miRNA oli tukahdutettu APC kasvaimia (miR-215 ja miR-137 ), verrattuna viereiseen ohjaus epiteelin, kun taas 3 miRNA aiheutettiin (miR-708, miR-31, miR-135b). Vain 1 miRNA oli tukahdutettu CAC kasvaimissa verrattuna ohjata kroonisesti tulehtunut epiteelin (miR-215), kun taas 6 miRNA indusoitiin CAC kasvaimia (miR-133a, miR-467d, miR-218, miR-31, miR-135b). Kolme miRNA indusoitiin sekä APC ja CAC näytteiden (miR-31, miR-135b, ja miR-708) ja 1 miRNA tukahdutettiin sekä APC ja CAC näytteiden (miR-215). Lisäksi 1 miRNA oli ainutlaatuisesti tukahdutettu APC kasvaimia (miR-137), ja 3 miRNA oli ainutlaatuisesti aiheutettiin CAC kasvaimia (miR-133a, miR-467d, ja miR-218). 8 ilmennetty eri miRNA taulukossa 1. siis valittu vahvistettavaksi.

Vaikka paremmuusjärjestyksessä tilastojen on hyödyllinen työkalu on nimetä miRNA jotka ilmentyvät eri, enemmän kvantitatiivista lähestymistapaa on määrittää suuruus vastaus missä tahansa vertailun. Tätä varten käytimme Statminer toteuttamista Limma suorittaa normalisoinnin ja yhteenvetoa TaqMan array ekspressiotietojen. Tulokset on esitetty kuviossa 3 log 2 muutosta kertainen muutos kunkin 8 tarkennuksen miRNA, jossa taitto Change = – [keskiarvo (DCtTumor-DCtControl)]. P-arvot laskettiin kullekin vertailun käyttäen Limma empiirinen Bayesian toteuttamiseen t-testi vertaamaan normalisoitu (DCT) arvot kasvainten ja valvontaa. Kuten kuviossa 3 esitetään, kaikki ehdokas miRNA näytteillä suuri, tilastollisesti merkittäviä eroja ilmentyminen APC kasvaimia (Fig. 3A) ja CAC (Fig. 3B), suhteessa kontrollinäytteisiin.

MicroRNA runsaasti neljän eri näyte ikäluokat normalisoitiin käyttäen Statminer ja sno135 /miR-25 endogeenisinä valvontaa. APC valvonta normalisoitiin APC kasvaimia (paneeli A) ja CC tarkastuksia CAC kasvaimia (paneeli B). Runsaasti kunkin 8 ehdokas miRNA on yhtä kuin log2 kertainen muutos (keskiarvo Ct kasvaimen – keskiarvo Ct kontrolli) ja p-arvot laskettiin käyttäen Limma empiirinen Bayesian toteuttamiseen hidastui t-testiä.

Käytimme tavanomainen TaqMan cDNA muuntaminen alukkeita ja qPCR reagenssit vahvistaa ero ilmentymisen neljän miRNA että näytteillä alaisiksi vasteita CAC ja APC kasvain näytteet käytettiin alkuperäisessä multiplex qPCR analyysi. Kuten kuviossa 4, tukahduttaminen miR-215 vahvistettiin molemmissa sertin ja APC kasvain näytteet, kun taas induktio miR-708, miR-31, ja miR-135b on niin ikään vahvistanut kasvaimissa molempien alkuperää. Valmistimme ylimääräinen valvonnan ja kasvainten sekä krooninen koliitti ja APC hiiret ja mitataan runsaasti miR-215, miR-708, miR-31, ja miR-135b. Kuvio 5 osoittaa, että kokeellisen virheen rajoissa tulokset ennustaa paremmuusjärjestyksessä tilastolliset analyysit validoitu itsenäisessä näytteessä kohortin.

RNA-näytteet analysoitiin kuvioissa 2 ja 3 muunnettiin cDNA käyttämällä yksittäisiä Taqman hiusneula RT-alukkeita, toisin kuin yleinen nalliseokseen käytettiin TaqMan taulukot. Niinpä eri cDNA valmisteet valmistettiin ja analysoitiin miRNA runsautta APC näytteistä (paneeli A) ja CAC näytteet (paneeli B). MicroRNA runsaus oli normalisoitu sno135 ja p-arvot lasketaan Statminer Limma protokollaa. Tulokset kustakin miRNA oli kalibroitu ilmentymistä (2e-DCT) asianomaisessa kontrollinäytteestä. Pylväät edustavat keskiarvoa ja keskihajonta kussakin miRNA, n = 4. * osoittaa p-arvo 0,05.

RNA valmistettiin riippumaton sarja APC kasvain (n = 9) ja valvonta ( n = 9) (paneeli A) tai CAC kasvain (n = 4) ja ohjaimet (n = 8), (paneeli B). MicroRNA runsaus mitattiin Taqman microRNA erityisiä varsi PCR ja normalisoitu sno135. Data normalisoitiin käyttäen Statminer ja kalibroitu ilmentyminen yksittäisten miRNA kontrollinäytteissä. Pylväät edustavat keskiarvoa ja keskihajontaa. * Tarkoittaa p-arvo 0,05.

Focus miRNA ilmentymisen ensisijainen ihmisen paksusuolen syöpiin

Rakenteessa ilmentymisen 8 painopiste miRNA taulukossa 1 tarkoittaa, että joitakin tai kaikkia näiden miRNA voi olla mahdollinen rooli etiologiassa alkuvaiheessa adenoomia, jotka muodostavat APC

Min /+ hiirillä ja /tai hiirillä, jotka ovat läpikäyneet kokeellista krooninen koliitti. Kirjallisuuskatsaus osoittaa, että jotkut näistä keskittyä miRNA on aiemmin raportoitu ilmentyä erilailla primäärisistä ihmisen paksusuolen syövissä, kuten on esitetty taulukossa 2. MikroRNA miR-31 ja miR-135b on raportoitu indusoituvan paksusuolen syöpä, samanlainen vastaus, että olemme havainneet alkuvaiheen kasvaimissa kroonisesti tulehtunut tai APC

Min /+ hiirillä. Samoin havaitsimme downregulation miR-215 kasvaimissa molempia, ja downregulation miR-133a in CAC muttei APC kasvaimia. Molemmat miRNA raportoidaan vaimentua ihmisen paksusuolen syövissä [18], [21] – [23], [37]. Meidän analyysit osoittavat, että nämä miRNA lajien aiheuttama hyvin aikaisin muutos ja luultavasti vaikuttaa signalointireitteihin, jotka ovat keskeisiä prosesseja, jotka ovat riippumattomia mekanismin aloittamista.

Analyysi mahdollisten miRNA tavoitteet ja tehtävät alussa vaiheessa kasvaimia

useita erilaisia ​​algoritmeja on kehitetty ennustaa miRNA tavoitteet, jotka perustuvat eri parametrien arvioimiseksi täydentävästi miRNA siementen sekvenssien sisällä olevat sekvenssit 3 ’transloimattomilta alueilta mRNA: iden [10], [57] – [59 ]. Vaikka nämä analyysit ovat kaukana täydellisestä kannalta ennustavan kyky, ne pysyvät vain työkaluja ennustamiseksi miRNA tavoitteita, ja tuotos Näiden analyysien on hyödyllistä ennustettaessa hypoteettisen yhteyksiä miRNA, kohdennettuja reittejä, ja biologisia toimintoja. Koska erilaisia ​​algoritmeja usein tuottaa erilaisia ​​tuloksia, käytimme PicTar, mikrokosmos, TargetScan, ja DianaT tuottaa luettelon potentiaalisia kunkin differentiaalisesti ilmaisi miRNA. Olemme mukana näissä luetteloissa ainoastaan ​​tavoitteet, jotka konservoituneita hiiren ja ihmisen selostukset, ja yksittäiset ennustukset yhdistettiin muodostamaan pääluettelon otaksuttu tavoitteet kaikille neljälle miRNA. Tämä lista on sitten verrattava microarray tietojen eristetty hiiren distaalisesta paksusuolen epiteelisolut [60], ja tavoitteet, jotka eivät pisteytettiin ”Present” näissä soluissa on eliminoitu. Kuraattori luettelot käytettiin sitten reitin ennustamiseen.

keskittyneet 4 miRNA jotka ilmentyvät eri alkuvaiheen vauriot sekä geneettisten ja tulehduksellinen alkuperä (miR-215, miR-31, miR-708, miR -135b). Käyttäen suodattimet edellä kuvatun tunnistimme 527 potentiaalisia kohde-mRNA: iden, jotka ilmaistiin hiiri distaalisessa paksusuolen epiteelisoluihin. Gene ontologia analyysi (taulukko 3) todettu syöpä kuin alkuun biologinen toiminta liittyy tämän geenin setti, jossa 130 527 tavoitteet liittyvät Cancer kautta GO termejä (p-arvoalueen 5.86E

-05 ja 2.87E

-02). GO liittyvät termit Gene Expression nousi top Molecular and Cellular Toiminto, jossa 131 tavoitteet liittyvät tähän ryhmään (p-arvoalueen 5.78E

-11 2.87E

-02). Top Tox toiminto oli TGF-β Signaling (p = 5.2E

-04, joissa 9/77 signalointi komponenttien tunnistettu mahdollisina kohteina). Loput tilastollisesti merkitsevä Tox ​​toiminnot liittyivät tumareseptoreista jotka on tutkittu paljon puitteissa paksusuolen epiteelisolujen fysiologiasta ja patologian, kuten TR /RXR, VDR /RXR, ja FXR /RXR.

Nämä hypoteettinen GO toiminnot ennustaa vahva kytkös neljän ilmentyvät eri miRNA ja transformaatio paksusuolen epiteelisolujen. Tämä hypoteettinen sidos korostaa se data kuviossa 6, jossa otaksuttu miRNA tavoitteita (näkyy vihreänä) ovat päällekkäin päälle tietoon perustuvan (Ingenuity) Molecular Mechanisms of Cancer kanoninen koulutusjakson (p = 1.14E

-06, 28 ennustettu tavoitteet /372 reitin komponentit). Kriittinen kalvo signalointi liittyvät toiminnot Ras /MAPK, PI3K, ja WNT /β-kateniinin edustavat mahdollisia mekanistinen yhteyksiä näiden miRNA ja transformaatio, kun taas ydinvoima toiminnot liittyvät RB /E2F ohjaus esiin mahdollisina välittäjinä solusyklikontrollin. Lopuksi, kuten on osoitettu GO analyysi Tox toiminto, TGF-β /BMP /Smad signalointi nimitetty erittäin merkittävä välinen mahdollinen yhteys näiden neljän miRNA ja transformaatio paksusuolen epiteelisolujen.

Oletetut mRNA tavoitteet 4 focus miRNA koottiin käyttäen PicTar, mikrokosmos, TargetScan, ja DianaT tietokantoja. Ennustettu tavoitteet peitettiin harmaalla Nerokkuus molekyylimekanismeihin Cancer kanonisen reitin.

Keskustelu

keskeinen tavoite oli verrata miRNA ilmaisua koolontuumoreissa jotka johtuvat krooninen tulehdus ja ituratamutaatiot mallissa järjestelmissä. Oli selvää jo varhain, että normalisointi tietojen olisi ongelma, koska olimme vertaamalla hyvin erilaisia ​​kudoksen valtioiden (

esim.

, Kroonisesti tulehtunut hiiret vakio laboratorioruokaa versus ikäinen kasvattajat korkean rasvaa sisältävä ruokavalio); ja ei ole vakiintuneita objektiiviset kriteerit sopivien endogeenisen ohjauslaitteet normalisointia miRNA ilmaisun näissä oloissa (katsausta varten tästä ongelmasta [61]). Ensimmäinen tavoite oli siis käyttää erillistä vedostulostus vertailla eri malleja normalisointia. Tätä varten me valmistetaan ja analysoidaan distaalisen paksusuolen epiteelisoluissa kontrollista ja akuutisti tulehtunut kudoksiin, käyttämällä tavanomaista DSS akuutti koliitti malli. Tutkimme aikaisin, pre-tulehtuneet, valtion, ennen havaittavaa menetystä histologista eheyden distaalisen paksusuolen epiteelin, ajattelu minimoida muutoksia miRNA lauseke, joka saattaa liittyä massiivinen immuunisolujen soluttautumista. Käyttäen kolmea eri analyyttisten lähestymistapojen tunnistimme 51 etusijalle miRNA tavoitteita, jotka todennäköisesti merkittävä rooli säätelyssä geeniekspression epiteelisoluissa aivan alkuvaiheista DSS aiheuttama tulehdus. Vaikka nämä havainnot ovat, tietojemme mukaan ensimmäinen yksityiskohtaisen raportin ero miRNA ilmaisun tässä koliitin mallissa, emme ole vielä analysoitu näitä tietoja. Pikemminkin käytimme näitä tietoja vahvistamaan valintaamme paremmuusjärjestyksien tilastojen tunnistamiseksi ilmentyvät eri miRNA. Tämä analyyttinen lähestymistapa ei vaadi tunnistaa asianmukaiset sisäisen valvonnan ja soveltuu erityisesti analysointiin suhteellisen pienissä ryhmissä näytteitä, koska mitään oletuksia tarvita suunnilleen yhtä RNA lastaus tai tehokkuus uuttamalla miRNA tai cDNA muuntaminen hyvin erilaisista kudoksista [62 ]. Yleensä paremmuusjärjestyksessä erot havaitsimme korreloi hyvin analogisilla miRNA runsaus ilmaistuna DCT mediaani normalisoitu data tai DDCt että sno135 /miR-25 normalisoitu (Statminer) analyysit. Kuitenkin p-arvojen määrittämä eri tilastollisia malleja vaihteli huomattavasti, mikä johtuu ainakin osittain pienen otoksen koosta ja käyttöä valvotaan (Limma empiirinen Bayes) versus moderoimaton (t-testi) lähestymistapoja varianssin arviointi. Koska mitään tilastollisen mallin todennäköisesti murtaa pienillä näytejoukoille, me päättänyt käyttää yksinkertaisin ja konservatiivinen lähestymistapa: paremmuusjärjestykseen tilastot. Käytimme Statminer normalisointi (vastaan ​​sno135 ja miR-25) purkaa suhteellinen miRNA runsaus.

Rank jotta tilastoja käytettiin tunnistamaan 8 ilmennetty eri miRNA in kasvaimia, jotka muodostivat distaalisessa kaksoispisteet APC

Min /+ hiirillä ja kroonisesti tulehtunut hiiret. On syytä huomata, että nämä kasvaimet ovat pääasiassa adenoomien ja edustavat siten hyvin varhaisessa vaiheessa muutosta. Meidän olisi myös korostettava, että nämä 8 miRNA edustavat vain näkyvin, ja siksi todennäköisesti kaikkein toistettavissa muutokset miRNA ilmentymistä näistä näytteistä.