Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä edelleen yleisin syy syöpään liittyvää kuolleisuutta. Käytimme erittäin multipleksoidun proteomic teknologia (SOMAscan) vertailla proteiinin ilmentymisen allekirjoituksia ei pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kudoksiin terveitä viereisten ja etäinen kudokset kirurgisen resektion. Tässä ensimmäisessä raportissa SOMAscan soveltaa kudoksiin, korostamme 36 proteiineja, jotka esittelevät suurimmat ilmaisun erot Hyväksytty kasvain ja ei-tuumorikudoksia. Pitoisuudet kaksikymmentä proteiinien lisääntynyt ja kuusitoista laski kasvainkudoksessa, kolmetoista jotka ovat uusia ja NSCLC. NSCLC kudos biomarkkerit tunnistettu tässä päällekkäisiä ydinjoukko tunnistettu suuressa seerumipohjaista NSCLC tutkimuksessa SOMAscan. Osoitamme, että laajamittainen vertaileva analyysi proteiinin ilmentymisen, voidaan käyttää kehittämään uusia histokemiallisilla koettimia. Kuten odotettua, suhteelliset erot proteiiniekspressiossa ovat suurempia kudoksissa kuin seerumissa. Yhdistetty tulokset kudoksesta ja seerumin esittää laajin näkymä päivämäärä monimutkaisia ​​muutoksia NSCLC proteiinin ilmentymisen ja tarjoavat merkittäviä vaikutuksia diagnosointiin ja hoitoon.

Citation: Mehan MR, Ayers D, Thirstrup D, Xiong W , Ostroff RM, Brody EN, et ai. (2012) Protein allekirjoitus keuhkosyöpään kudosten. PLoS ONE 7 (4): e35157. doi: 10,1371 /journal.pone.0035157

Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Italia

vastaanotettu: 28 marraskuu 2011; Hyväksytty 9 maaliskuuta 2012 Julkaistu: 11 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Mehan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: SomaLogic rahastoiva Proteomiikan biomarkkereiden tutkimusta. SomaLogic oli rooli tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista, ja valmistelu käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: M Mehan, D Ayers , D Zichi, R Ostroff, E Brody, J Walker, L Gold, T Jarvis, N Janjic, ja S Wilcox ovat koko ajan työntekijöitä SomaLogic. D Thirstrup ja G Baird ovat saaneet tutkimusrahoitusta SomaLogic. Nämä edut eivät muuta tekijöiden noudattamista PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

etenemistä terve tila taudeille liittyy muutoksia proteiinien ilmentyminen vaikuttaa kudoksissa. Vertaileva kuulustelun ihmisen proteomista terveillä ja sairaiden kudosten voi tarjota oivalluksia biologian taudin ja johtaa löytämään uusia biomarkkereita diagnostiikan, uudet tavoitteet terapeuttiseen interventioon, ja tunnistaminen potilaiden todennäköisimmin hyötyvät täsmähoitoa. Erityisesti uusien diagnostiikan varhaisia ​​keuhkosyövän tarvitaan kiireesti. Varten hoidon ja ennusteen, keuhkosyöpä luokitellaan patologisesti joko pienisoluinen (15%) tai ei-pienisoluista (85%). Keuhkosyöpä on johtava syy syöpäkuolemista, pitkälti siksi 84% tapauksista diagnosoidaan jo edenneet pitkälle, on viiden vuoden pysyvyys on alle 15% [1] – [3]. Maailmanlaajuisesti vuonna 2008, 1,5 miljoonaa ihmistä oli diagnosoitu ja 1,3 miljoonaa kuoli – eloonjäämisprosentti muuttumattomana vuodesta 1960 [4]. Kuitenkin potilaat diagnosoitu NSCLC varhaisessa vaiheessa ja hoitaa kirurgisesti poistamaan kasvaimia kokea 86% viiden vuoden eloonjääminen [1], [2].

Olemme hiljattain kehittäneet uuden affiniteettiin perustuvaa proteomic tekniikkaa biomarkkereiden löytö, että tällä hetkellä mittaa yli 1000 proteiinit pieni näyte määriä plasmassa tai seerumissa (esim ~ 10 ui plasmaa) vähäisin Toteamisrajojen (mediaani 300 fM), 7 tukit yleistä dynamiikan (-30 fM – 1 uM käyttäen näytteen laimennus), ja 5% mediaani variaatiokerroin [5]. Tämä tekniikka, jota kutsutaan SOMAscan, on otettu käyttöön SOMAmers (Hidas Off-rate Modified Aptameerit), uuden luokan proteiiniin sitoutumisen reagenssien, jotka sisältävät kemiallisesti muokattuja nukleotideja, joka suuresti laajentaa fysikaalis monimuotoisuutta nukleiinihappokirjastoja. Tällaiset muutokset käyttöön funktionaalisia ryhmiä, jotka ovat usein proteiini-proteiini-vuorovaikutus, vasta-aine-antigeeni-vuorovaikutukset, ja vuorovaikutukset pienimolekyylisiä lääkkeitä niiden proteiinipitoisuus tavoitteet, mutta ovat poissa luonnon nukleiinihapot. Nämä muutokset ovat yhteensopivia SELEX (Systematic Evolution of Ligands by eksponentiaalinen Enrichment) prosessi käyttää luomaan SOMAmers sekä tavanomaisia ​​DNA menetelmiä, kuten PCR ja hybridisaatio. Kaiken käyttää näitä muutoksia laajentaa useita mahdollisia tavoitteita varten SELEX, tulokset parantuneet sitoutumisominaisuudet, ja helpottaa valintaa SOMAmers hidas dissosiaatio hinnat [5].

SOMAscan on erittäin multipleksoitu alustan kvantitatiivisesti mitata proteiinien monimutkaisten matriisien, kuten plasma tai seerumi, jossa allekirjoitus proteiinin pitoisuudet muunnetaan vastaava DNA allekirjoitus, joka kvantitoidaan sitten kaupallisessa DNA-siru alustan [5]. Lyhyesti, tasapainon välistä sitoutumista seosta SOMAmers ja proteiinien saavutetaan liuoksessa, minkä jälkeen poistetaan sitoutumaton lajien peräkkäisten helmi-pohjainen liikkumattomuudesta vaiheet mukana pesun. Korkea spesifisyys, jo luontainen ominaisuus SOMAmers, on lisäksi parannettu sisällyttämällä dekstraanisulfaattia aikana sitovia ja pesuvaiheet. Dekstraanisulfaatti, joka kuten nukleiinihapot on polyanioni, on tehokas, koska sukulais SOMAmer-proteiini kompleksit ovat kineettisesti stabiileja kuin ei-spesifinen komplekseja. Lopussa määrityksen erityisiä SOMAmer-proteiini kompleksit säilyvät josta SOMAmers voidaan eluoida denaturoivissa olosuhteissa, hybridisoidaan kaupallisesti saatavilla mikrosiruja, ja suoraan kvantitoida fluorofori kovalenttisesti kytketty SOMAmer. Pohjimmiltaan määritys hyödyntää kaksijakoinen luonne SOMAmers koska molemmat taitettu sitovia yhteisöihin kamittaisia ​​ja ainutlaatuisia nukleiinihapposekvenssejä tunnistettavissa erityisten hybridisaatiokoetinten. Hyödyllisyyttä Tämän määrityksen on osoitettu aiemmin samanaikaiseen mittaukseen lukuisten proteiinien vaihtelevat alhainen pikomolaariset korkeaan mikromolaarinen pitoisuus plasmassa ja seerumissa sekä kliinisiin biomarkkereiden tutkimukset krooninen munuaistauti ja keuhkosyöpä [5], [6].

tulokset

proteomiikan analyysi NSCLC kirurginen asemointia

tässä raportissa, suoritimme laajamittainen proteiinin ilmentymisen analyysi homogenisoitua keuhkojen kudosnäytteitä kirurginen asemointia saatu kahdeksan ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilailla. Kaikki NSCLC potilaat olivat tupakoitsijoita, joiden iät 47-75 vuotta vanhoja ja diagnosoitu patologian-vahvistettu NSCLC vaiheiden IA kautta IIIB (taulukko 1). Saimme kolme näytettä kustakin resektiota: kasvaimen kudosnäytteestä, viereisen ei-kasvainkudoksessa (1 cm: n kasvain) ja kaukana uninvolved keuhkokudoksessa (kauimpana reuna resektio kasvain). Pidettiin huolta yhtenäisyyden säilyttämiseksi kudoksen, jossa on kaikki näytteet jäädytetään 5-10 minuutin leikkaaminen. Kokonaisproteiinipitoisuus säädettiin ja normalisoitu kunkin homogenaattia varten Proteomiikan profilointia seuraa analyysi meidän biomarkkereiden löytö array pitoisuuksien mittaamisessa 820 ihmisen proteiinien äskettäin kuvattu [5].

Nämä Proteiinipitoisuusmääritysten, ilmaistaan ​​suhteellisena fluoresenssin (RFU), mahdollistavat suuren mittakaavan vertailuja proteiinin allekirjoitusten joukossa näytteitä (Fig. 1). Ensin verrataan proteiinin ekspressiotasot vierekkäisten ja kaukainen kudosnäytteiden kullekin potilaalle (Fig. 1A). Kaiken tuottamat signaalit useimpien analyyttien olivat samanlaiset vieressä ja kaukana kudoksesta. Tässä vertailussa, vain yhden analyytin (fibrinogeeni) oli enemmän kuin kaksinkertainen ero näiden kahden välillä kontrollinäytteistä. Fibrinogeeni pitoisuus oli suurempi viereisen ei-kasvainkudoksessa kuin kaukainen ei-kasvainkudoksessa. Fibrinogeeni on liukoinen fibriinin esiaste, joka muunnetaan trombiinin koagulaation aikana. Fibriinikerrostumat tapahtuvat viereisen strooman useimpien kasvaimia, lähinnä soluväliaineen (ECM), jossa fibriini ja muut ECM proteiinit edistävät ja tukevat kasvaimen kasvua prosesseja lukien, solujen lisääntymistä, tarttuvuus, invaasio, muuttoliike, ja angiogeneesi [7].

Signaalin erot vierekkäisten ja kaukaisten kudosten (paneeli A), kasvain ja viereiseen kudokseen (paneeli B) ja kasvaimen ja kaukaisten kudosten (paneeli C) ilmaistaan ​​log

2 mediaani suhteet. Pisteviiva kahtalainen muutos (log

2 = 1).

Sen sijaan verrattuna kasvaimen kudosten ei-kasvainkudoksessa (vieressä tai kaukana) tunnistettu 11 (1,3%) proteiineja, joilla on enemmän kuin neljä-kertainen erot ja 53 (6,1%), proteiineja, joilla on enemmän kuin kaksinkertainen eroja (kuviot. 1B ja 1C). Loput (93,9%) proteiinit osoittivat suhteellisen pienet erot kasvain ja ei-kasvainkudoksessa. Jotkin proteiinit oleellisesti tukahdutettiin kun taas toiset olivat koholla kasvainkudoksissa verrattuna viereiseen tai kaukana kudoksiin. Differential proteiinien ilmentymiseen vierekkäisten ja kasvainkudoksen välillä tai distaalisen ja kasvainkudoksen, oli samanlainen yleinen. Muutokset välillä kasvain ja distaalisen kudos olivat yleensä jonkin verran suurempi kuin kasvain ja viereiseen kudokseen (Fig. 1), mikä osoittaa, että suurin osa havaituista proteiini muutokset ovat ominaisia ​​paikalliseen kasvain ympäristössä. Kuviossa 2 on esitetty lämpöä kartan esitys tuloksista. Oli suuntaus proteiinin muutoksista heijastaa pathologic vaiheessa, mikä saattaa tarkoittaa, että proteiinin ilmentyminen korreloi taudeista. Koska pieni otoskoko, korrelaatiot histologisia luokittelua ei voitaisi irrotettu vaiheessa.

Näytteet näkyvät sarakkeet ja erotetaan kaukainen ei ollut kasvainta, vieressä ei ollut kasvainta, ja kasvainkudoksen. Kunkin kudoksen tyyppi, näytteet erotetaan adenokarsinoomat (AC) tai okasolusyöpää (SCC). Numerot päällekkäin sarake vastaa potilaan koodeja. Proteiinit näkyvät riveillä ja määrättiin käyttäen hierarkkinen klusterointi.

biomarkkereiden tunnistamiseen

tunnistamaan mahdolliset NSCLC kudosten biomarkkereita, etsimme analyyttien kanssa suurin muutos proteiiniekspressiossa tasojen kasvain, vieressä, ja kaukainen kudosnäytteet. Tässä me esiin kolmekymmentäkuusi proteiineja, joilla on suurin keskimääräinen fold-muutos proteiinin ilmentymisen välillä kasvaimen ja ei-kasvain kudosnäytteitä (Fig. 3, taulukko 2). Testasimme Näiden muutosten merkitystä kanssa Mann Whitneyn testi ja vaati p-arvo 0,05 korjaamisen jälkeen useita testejä (väärä löytö korko sulku q 0,05). Vaikka määrä näytteitä käytettiin tässä tutkimuksessa oli suhteellisen pieni, tutkimus koostui pariksi kasvaimen ja ei-kasvain kudosnäytteitä kunkin yksittäisen. Tämä tarjoaa enemmän valtaa tunnistaa muutoksia yksilön ja poistaa väestön varianssi liittyy poikkileikkauksen tutkimuksen malleja. Saatavuus valittava asianmukaisesti vertailunäytteiden tunnustetaan yhä ratkaisevan tärkeä osa biomarkkereiden keksintötutkimus [8] – [10]. Lopuksi arvioidaan toistettavuutta tämän uuden menetelmän analysoimalla triplikaattinäytteet kasvaimen ja ei-kasvainkudoksessa asemointia varten kaksi aihetta tässä tutkimuksessa ja löysi 4,5% mediaani CV välillä kolmena mittaukset 820 proteiinit mitattiin (Fig. 4) ja Spearmanin korrelaatio kertoimet 0,99 (osittain täytettynä suuret RFU alue mitattiin). Kolmena kappaleena mittaukset 36 proteiinien suurin keskiarvo-kertainen eroja kasvaimen ja ei-kasvainkudoksessa on piirretty kuvassa. 5.

Proteiinit lisääntynyt (paneeli A) tai pienentää (paneeli B) tasojen kasvainkudoksessa verrattuna viereiseen tai distaalisen kudoksen (paneeli A) kahdeksasta NSCLC näytteistä käytettiin tässä tutkimuksessa. Jokainen yksilö on merkitty eri symboli. Vaakajuovat kunkin laatikon vastaavat ensimmäistä, toista ja kolmatta neljännestä (25% /50% /75%) ja viikset vastaavat suurin ja pienin arvo.

kasvain, vierekkäiset ei-kasvain, ja kaukainen ei-kasvainkudoksessa asemointia otettiin näytteet, uutettiin ja analysoitiin SOMAscan proteomic määritys kolminkertaisesti kaksi henkilöä tutkimuksessa. Mediaani CV Kaikkien 6 triplikaatit oli 4,5% (musta viiva).

kasvain, vieressä ei ollut kasvainta, ja kaukainen ei-kasvainkudoksessa asemointia otettiin näytteet, uutettiin ja analysoitiin SOMAscan proteomiikka määritys kolminkertaisesti kaksi henkilöä (potilasta 56 ja 61) tutkimuksessa. Näytteet ovat värillisiä yksittäiset ja kasvaimen näytteet korostettu kolmioita. Y-akseli on loki mittakaavassa.

Korkea pitoisuus proteomiikka analyysi biologisten näytteiden mahdollistama multipleksoidun määritys mahdollistaa puolueeton löytö Sairauksiin liittyvien proteiineja. Tähän mennessä olemme tehneet useita veripohjaisten kliinisten biomarkkereiden tutkimuksiin ihmisen sairauksien, kuten keuhkosyöpä [6] ja krooninen munuaissairaus [5]. Nämä tutkimukset ovat tunnistaneet uusia potentiaalisia tautia biomarkkerit sekä biomarkkereita, jotka on raportoitu aikaisemmin. Nykyinen tutkimus seuraa tätä suuntausta. Noin kolmannes (13/36) mahdollisten NSCLC kudos biomarkkerit tunnistettu tässä ovat uusia, parhaan tietomme. Loput kaksi kolmasosaa (23/36) on raportoitu aikaisemmin ilmennetty eri proteiineja tai geenejä NSCLC kasvainkudoksessa (taulukko 2). Uutuus määritettiin suorittamalla kirjallisuutta haut PubMed ja internetissä käyttäen potentiaali biomarkkerit ”geeni nimet ja proteiinia aliaksia tunnistaa UniProt.

Mahdollista biomarkkerit voidaan luokitella karkeasti neljään biologisiin prosesseihin liittyviä tärkeitä tunnusmerkkejä tuumoribiologiassa [11], kuten on esitetty taulukossa 3: 1) angiogeneesi, 2) kasvua ja aineenvaihduntaa, 3) tulehdus, ja apoptoosin, ja 4) ja metastaasit. Tosin nämä ovat käteviä, mutta epätarkka luokitusjaksoa lähentää erittäin monimutkainen ja dynaaminen järjestelmä, jossa nämä molekyylit ovat usein moninaisia ​​ja vivahteikas rooleja. Näin ollen tiettyyn tilaan tietyn järjestelmän lopulta vaikuttaa ilmentymistä ja toimintaa tahansa molekyyliä. Käsityksemme biologisen perustan näiden järjestelmien on kaukana täydellisestä. Kun SOMAscan alustan, me alkaneet tutkia määrällinen ilmaisu suuria määriä proteiineja eri kudoksissa ja sairauksien prosesseissa. Nämä tiedot antavat uudet koordinaatit auttaa kartoittamaan dynamiikkaa näiden järjestelmien, mikä puolestaan ​​antaa enemmän tietoa biologiasta tämän taudin. Tulokset nykyisestä tutkimuksen tarjoavat uuden näkökulman NSCLC tuumoribiologiassa, sekä tuttuja ja uusia elementtejä.

Angiogeneesi

Angiogeneesi tuo kasvua uusien verisuonten kasvaimen kasvun tukemiselle ja aineenvaihduntaa. Angiogeneesin säätelyyn on monimutkainen biologinen ilmiö ohjaa sekä positiivisia että negatiivisia signaaleja [11]. Niistä mahdollisia NSCLC kudoksen biomarkkereita tunnistettu tässä tutkimuksessa (Fig. 3) olivat tunnettuja positiivisia ja negatiivisia angiogeneesin sääntelyviranomaisten, jotka kaikki on havaittu aiemmin NSCLC kasvainkudoksessa [12] – [16]. Näitä ovat prototyyppinä angiogeneesin indusoija VEGF: n ja inhibiittorit endostatiinin ja trombospondiini-1 (TSP-1). VEGF on voimakas kasvutekijä, joka edistää uusien verisuonten kasvua; VEGF voimakkaasti säädellään ylöspäin NSCLC kasvainkudoksessa, yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen [12], myös meidän tutkimus seeruminäytteiden pienisoluista keuhkosyöpää [6]. On syytä huomata, että VEGF: n löydettiin alun perin kasvainsolun-eritetyn verisuonten läpäisevyyttä tekijä (VPF), joka lisäsi vuotamisen kasvaimeen liittyvien verisuonten suuria molekyylejä, kuten fibrinogeenin, jotka ovat yleensä ainoastaan ​​plasmassa [17]. Tämä toiminta voi olla merkittäviä vaikutuksia kokoonpanosta liittyvien proteiinien kasvainkudoksessa. Endostatiinista on proteolyyttinen fragmentti kollageeni XVIII ja estää voimakkaasti endoteelisolujen proliferaation ja angiogeneesin [13]. TSP-1 ja siihen liittyvä TSP-2 olivat huomattavasti säädellään ylöspäin NSCLC kasvainkudoksessa. TSP-1 ja TSP-2 ovat soluväliaineen proteiinien monimutkaisia, kontekstisidonnaisia ​​vaikutuksia moduloidaan läpi erilaisia ​​vuorovaikutuksia solupinnan reseptorit, kasvutekijät, sytokiinit, matriksin metalloproteinaasien ja muiden molekyylien. Archetypically mallissa järjestelmissä, TSP-1 ja TSP-2 estävät angiogeneesiä estämällä endoteelisolujen proliferaation kautta CD47-reseptorin (ei mitattu tässä tutkimuksessa) ja joka indusoi endoteelisolujen apoptoosin kautta CD36-reseptorin. On myös näyttöä proangiogeeninen vaikutteita TSP-1 ja TSP-2 [18]. Lopuksi raportoitu TSP-1 ja TSP-2 suhteellisen ja absoluuttisen ekspressiotasot NSCLC kudoksessa vaihtelee [16], [19] – [21] todennäköisesti johtuu niiden monimutkaisia ​​toimintoja. Tutkimuksessamme olemme myös havainneet, että CD36 on säädellä vähentävästi NSCLC kasvainkudoksessa, joka voisi osoittaa mukauttamista syöpäsolujen vähentää herkkyyttä TSP-1 ja TSP-2-välitteistä apoptoosia.

Kasvu ja aineenvaihdunta

Kymmenen mahdollisista NSCLC biomarkkerit tunnistimme liittyy kasvua ja aineenvaihduntaa toimintoja. Puolet näistä biomarkkereiden ovat mukana monimutkainen hormonaalinen säätely solujen kasvun ja energia-aineenvaihduntaa. Kolme insuliinin kaltaisen kasvutekijää sitovat proteiinit (IGFBP), joka moduloivat insuliinin kaltaiset kasvutekijät (IGF: t), olivat säädellään ylöspäin NSCLC kasvaimia (IGFBP-2, -5, ja -7). Monet tutkimukset ovat laadullisesti arvioida IGFBP-2, -5, ja -7 in NSCLC (taulukko 2) ja ehdottaa korkeamman ilmaisun NSCLC kudoksessa kuin normaalissa kudoksessa. Insuliini ja IGF: t toimivat hormonit vaikuttavat suuresti solujen kasvua, aineenvaihduntaa, ja selviytymistä. Syöpäsolut ovat usein riippuvaisia ​​näiden molekyylien kasvua ja lisääntymistä [11]. IGFBP-2 on myös liitetty anti-apoptoottinen vaikutus kautta kaspaasi-3 [22]. Nämä hormonit puolestaan ​​hajottavat insulysin [23], jonka pitoisuus oli suurempi NSCLC kasvainkudoksessa. Hormoni adiponectin säätelee rasva-aineenvaihduntaan ja insuliiniherkkyyttä ja löysimme adiponektiini säädellä vähentävästi NSCLC kasvaimia. Loput viisi biomarkkereiden hiilihappoanhydraasilla III NAGK, TrATPase, tryptaasi- β-2, ja MAPK13, ovat entsyymit, joiden tiedetään rooleja solujen aineenvaihduntaan (taulukko 3).

Tulehdus ja apoptoosi

tulehdus ja apoptoosin ovat tunnusmerkkejä syövän biologian, ja löydämme useita mahdollisia biomarkkereita liittyy näihin prosesseihin, jotka on yhdistetty aiemmin NSCLC (taulukko 2). Löysimme kaspaasi-3 pitoisuuksina NSCLC kasvainkudoksessa. Kaspaasi-3 on liitetty etäpesäkkeitä [24]. Toinen merkittävä esimerkki on liukoinen reseptori glykaation lopputuotteiden sRAGE, jonka on raportoitu olevan dramaattisesti alassäädetty NSCLC kudoksessa [21], [25]. Tämä havainto on johdonmukainen mittaus, jossa sRAGE oli Havaituista muutos proteiineja, jotka ovat alhaisemmat kasvain kuin ei-pahanlaatuinen kudos. Yksi hypoteesi on, että RAGE on rooli epiteelin organisaatiossa, ja alentuneet RAGE keuhkoissa kasvaimet voivat edistää menetys epiteelikudokseen rakenteen, mikä saattaa johtaa pahanlaatuisiksi [25]. Useat kemokiinit, kuten BCA-1, CXCL16, IL-8, NAP-2, on muutettu myös tutkimuksessa, sopusoinnussa hypoteesin, että hyökkäys kasvainten solujen synnynnäisen ja adaptiivisen käsivarret immuunijärjestelmän säätää bioaktiivisten molekyylien, että vaikuttaa proliferatiivinen ja angiogeeninen signaalit [11].

Invasion and Metastasis

suurin ryhmä potentiaalisia biomarkkerit sisältää proteiineja, jotka toimivat solu-solu ja solu-matriisi vuorovaikutusta ja ovat mukana invaasiota ja etäpesäkkeiden . Monet ovat aikaisemmin raportoitu liittyvän NSCLC. Merkittävimpiä ovat kaksi matriksimetalloproteaaseja, MMP-7: n ja MMP-12, jotka edistävät proteolyyttisen hajoamisen soluväliainekomponentteja ja käsittelyn substraattien, kuten kasvutekijöitä. Esimerkiksi suuri substraatti MMP-12 on elastiini. Tällaiset menetelmät ovat hyvin tunnettuja rooli luomisessa kasvain mikroympäristöihin. Havaitsimme MMP-7: n ja MMP-12 säädellään ylöspäin NSCLC kudos, joka on sopusoinnussa samanlainen tutkimus, joka käyttää vasta-aineisiin perustuvia mittauksia [26]. Yli-MMP-7: n ja MMP-12 on liitetty huonoon ennusteeseen NSCLC [26]. MMP-12-tasot on korreloitu paikallisen uusiutumisen ja etäpesäkkeitä [26]. On mielenkiintoista huomata, että kaksi kahdeksasta tutkituista oli normaali MMP-12, kun taas muut kuusi olivat 15-50-kertainen MMP-12 kasvainkudoksessa verrattuna ei-kasvainkudoksessa.

SOMAmers kuten histokemia koettimina NSCLC biomarkkerit

ymmärtäminen erot proteiiniekspressiossa välillä kasvain ja ei-tuumorikudoksia voi tunnistaa uusia histokemia tavoitteita. Tätä lähestymistapaa käytettiin aikaisemmin MMP-12 ja muut [27]. Tällaiset koettimet voivat mahdollistaa tarkemman molekulaarinen kasvainten ja niiden vaikutukset ympäröivään strooman. Olemme aiemmin osoittaneet, että fluorofori-merkitystä SOMAmers antaa nopean ja selektiivisen histokemiallisella pakastettuina kudosleikkeiden [28]. Täällä tutkittavan kudoksen värjäytyminen useita SOMAmers jotka todettiin biologisten merkkiaineiden analyysimme kudoshomogenaateista. Jäädytetyt kudososat leikattiin samasta kasvaimen resektiota käytetään biomarkkereiden löytö. Esimerkiksi TSP-2 värjäys fluoroforileimattuja leimattua SOMAmer kasvainkudoksessa oli silmiinpistävää ja lokalisoitu pääasiassa alueilla kuitu- strooman arpia (Fig. 6A), mutta tällainen värjäys oli selvästi vähemmän normaalia kudosta (Fig. 6B). Tämä on sopusoinnussa raportoitiin rooli TSP-2 matriisi modulaatio [18], [29]. Sen sijaan normaalissa keuhkokudoksessa, makrofagien mannoosireseptorin (MRC1) SOMAmer värjäys lokalisoitu pintaan keuhkorakkuloiden makrofagien (Fig. 6D) odotetusti tämän tavoitteen [30]. Kasvain kudosnäytteitä, joista puuttuu keuhkorakkuloihin, ilmeni vähän MRC1 värjäytymistä (Fig. 6C). Kuva 6E osoittaa MRC1 SOMAmer värjäys suoritetaan samanaikaisesti vasta-aineisiin perustuva immunofluoresenssimenetelmällä muihin tavoitteisiin (sytokeratiineja ja CD31), joka osoittaa toteutettavuus multiplexing SOMAmer ja vasta-reagenssit histologista tutkimuksissa. Kudosvärjäytyminen SOMAmers oli siis yhdenmukainen homogenaatti profiilit, jossa TSP-2 nostettiin ja MRC1 väheni kasvainkudoksessa verrattuna terveeseen kudokseen. Varmistimme SOMAmer värjäytymiskuvioissa TSP-2 ja MRC1 vasta-aineiden kanssa Kuvio 7. yhtenevyys välillä histokemiallisella tuloksia suunnan muutoksen proteiinin ilmentymisen välillä kasvaimen ja terveen kudoksen homogenaateissa antaa lisänäyttöä siitä, että tunnistetut biomarkkerit ovat yhteydessä sairauteen. Laajamittainen proteomic vertailu kudosten kuvattu tässä on myös tehokas tapa tunnistaa uusia histokemiallista antureista.

(A) Trombospondiinin-2 SOMAmer (punainen) värjäämällä fibrocollagenous matriisi ympäröivä kasvain pesä. (B) Vastaava normaali keuhkojen näyte värjättiin Trombospondiinin-2 SOMAmer (punainen). (C) makrofaagianalyysi mannoosireseptorin SOMAmer (punainen) värjäämällä hajallaan makrofagien keuhkojen adenokarsinooma. (D) makrofaagianalyysi mannoosireseptorin SOMAmer (punainen) värjäys lukuisia keuhkorakkuloiden makrofagien osan normaalin keuhkoparenkyymistä. (E) monivärinen kuva korostetaan cytomorphologic jakelu makrofagien mannoosireseptoriin SOMAmer värjäys: Vihreä = sytokeratiinivasta (AE1 /AE3 vasta-aine), punainen = CD31 (EP3095 Antibody), ja oranssi = SOMAmer. Kaikki ytimet tässä kuviossa vasta- värjätään DAPI.

TSP-2 on tunnistettu sarja jääleikkeille yhden keuhkosyöpä näytteestä (A) kotitekoisen kanin polyklonaalista TSP-2 polyklonaalista vasta, (B) pre-immuuni seerumi kanit käytetään tekemään kotitekoisia polyklonaalista vasta-ainetta, (C) kaupallinen (Novus) kaniinin polyklonaalista TSP-2-vasta-aine, ja (D) TSP-2 SOMAmer. TSP-2 SOMAmer käytettiin värjäämään jääleikkeille normaalien ja pahanlaatuisten keuhkokudoksessa, standardin Avidin-Biotin-Peroxidase värin kehitys, osoittaa eri morfologisiin jakaumat: (E) Vahva värjäys fibroottisten strooman ympäröivä kasvain pesiä, minimaalisella sytosolisia värjäys karsinoomasoluja, (F) vahva värjäys fibroottisten strooman ympäröivän kasvaimen pesiä on mucinous adenokarsinooma, joilla ei ole merkittävää värjäytymistä karsinoomasoluja, (G) normaali keuhkokudoksessa, vahvassa sytosolin värjäytymistä keuhkoputkien epiteelin ja hajallaan keuhkorakkuloiden makrofagien, ja (H) voimakas sytosolin värjäys adenokarsinooma, ilman merkittäviä värjäys ei-fibroottisten, pääasiassa tulehduksellinen strooman.

Joitakin yleisiä varovaisuudella liittyvät löytämisen mahdollisten NSCLC biomarkkerit voidaan panna merkille. Ensinnäkin se, että proteiini on liittynyt kasvainkudoksessa ei välttämättä tarkoita, että se on spesifinen kasvainkudoksessa. Esimerkiksi tulehdus, soluväliaineen remodeling, hypoksia, ja kudoksen kuolion mukana kasvaimen etenemiseen, mutta myös monia muita ei-pahanlaatuisten tilojen, kuten vamman, haavan paranemisen tai infektio. Toinen, biomarkkerit tunnistimme saattaa heijastaa eroa suhde solutyyppien, jotka muodostavat kasvaimen näyte verrattuna normaalin keuhkokudoksen. Esimerkiksi, jos kasvain kudos koostuu syöpäsolujen liikakasvua, jotkut biomarkkerit odotetaan olevan spesifinen, että solutyypin (tässä tapauksessa, epiteelisolut), jotka on transformoitu tai ei. Vastaavasti, jos kasvain kudosnäyte on joko enemmän tai vähemmän verisuonittuneita kuin ympäröivä normaali kudos, muutos ilmentyminen endoteelisolujen-spesifisten proteiinien voidaan havaita. Itse asiassa havaitsimme huomattavasti pienempiä pitoisuuksia ESAM, proteiinin spesifinen endoteelisoluja, verrattuna yhteen, ei-tuumorikudoksessa. Olemme vahvisti tämän histokemiallisesti, kuten on esitetty kuviossa 8, jossa mitattiin 35-kertaisesti enemmän ESAM-positiivisia endoteelisolujen kaukana ei-kasvainkudoksessa verrattuna kasvainkudoksen. Lopuksi SOMAmers, kuten kaikki affiniteettireagensseilla sitovat ja tunnistavat epitoopit kohde- proteiinit on konformaatiosta riippuvalla tavalla, ja mitään erityistä mittaus kuvastaa saatavuutta että epitoopin.

ESAM värjäytyminen näkyy keuhkojen kasvain ( A, C) ja normaali keuhko (B, D) kaukana kasvain. Endoteelisolujen ovat selvästi runsaampaa normaalin keuhkojen osassa, sopusoinnussa korkea verisuonikkuudesta normaali keuhko. Raakakuvia esitetään A ja C, joissa ESAM-positiivisten solujen tunnistetaan CellProfiler algoritmilla merkitty ”1” kuvaa B ja D.

vertailu NSCLC kudosten ja seerumin biomarkkerit

Olemme hiljattain valmistunut NSCLC tutkimus [6], jossa kartoitettiin 1326 seeruminäytteistä neljä itsenäistä kliininen tutkimus keskusten käyttäen samaa proteomic alustalle ja proteiinia menu lähes identtinen että käytetään solukon (813/820 proteiineja). Tutkimuksessa oli mukana potilaita diagnosoitu sairauden tai kliinisen vaiheen I-III NSCLC ja ohjaus väestö, joilla on ollut pitkäaikainen tupakointi, mukaan lukien aktiivinen tupakoitsijoita ja ex-tupakoitsijoita, joilla on vähintään 10 Pack-vuotta tupakoinnin. Kun laajat varotoimenpiteet huomioon ennalta analyyttinen muuttujia, tunnistimme 44 ehdokasta biomarkkereita, ja kehitti 12-proteiini-paneeli, joka erottaa NSCLC tarkastuksissa 91% herkkyys ja 84% tarkkuus on training set ja 89% herkkyys ja 83% tarkkuus pidennetyn, riippumattoman tarkastuksen asetettu. Saatavuus Tämän tietokannan avulla voimme verrata muutoksiin proteiinin ilmentymistä kudoksessa ja seerumin NSCLC potilaiden.

Vaikka käytetyt menetelmät analysoida proteiiniprofiileja näytteissä näistä kahdesta NSCLC tutkimuksissa on sama, joitakin merkittäviä eroja voidaan panna merkille. Ensinnäkin seerumi ennalta analyyttinen vaihtelua ei havaittu tutkimuksessa keskusten, ehkä peittää jotkut syöpä biomarkkereita [6]. Toiseksi NSCLC kudoksessa tutkimuksessa raportoitiin täällä, jokainen kasvain näyte on oma ohjaus kudosta (vieressä ja etäinen kuin kasvain), kun taas suuremmat NSCLC seerumin tutkimuksen välttämättömyys koostuu asian ja valvonnan näytteitä eri henkilöitä. Kuitenkin, differentiaali proteiinien ilmentymisen seerumeissa NSCLC: lla potilaista verrattuna syöpää vapaa valvonta verrattuna NSCLC kudosnäytteiden tuottaa hyödyllistä tietoa (Fig. 9, taulukko 4). Silmiinpistävin havainto on, että suhteelliset muutokset proteiiniekspressiossa ovat suurempia kudoksissa kuin seerumissa. Tämä tulos oli odotettavissa, koska kasvain kudos on lähde muutokset proteiinin ilmentymisen, joka sitten, vaikka täysin vapautettu liikkeeseen, laimennettiin many-kertaisesti kokonaistilavuus verta. Tämä kehitys on nähtävissä pitkänomainen jakeluun datapisteiden pitkin x-akselia kuvassa 9, jossa akselit on piirretty samassa mittakaavassa valaista asiaa. Yksitoista analyyttien esitetty kuviossa 3, kuten muuttaa kasvainkudoksessa myös ekspressoituu differentiaalisesti seerumeista pienisoluista keuhkosyöpää kontrolleja (täytetty punaiset ympyrät kuvassa. 9). On syytä huomata, että julkaistut NSCLC seerumin tutkimuksessa [6] ei mitata MMP-12, joka tässä tutkimuksessa tunnistettiin alkuun kudosta biomarkkereiden. Seuraavina NSCLC seerumin tutkimuksia, MMP-12 mitattiin ja löysimme se oli myös alkuun seerumi biomarkkeri kanssa KS-etäisyys 0,42 (taulukko 2). Tämä viittaa siihen, että seerumin MMP-12 suoraan kuvastaa NSCLC tuumoribiologiassa. Useimmat muut biomarkkerit yhteisiä kudosten ja seerumin myös muuttaa samaan suuntaan, mutta muutama ei. Paikallinen pitoisuudet proteiinien kudoshomogenaatti selvästikään ei tarvitse korreloi verenkierrossa proteiinien ja käänteinen korrelaatio voi antaa vihjeitä koskien uudelleenjako tiettyjen biomarkkereita sairaissa verrattuna normaaleihin kudoksiin.

kaksi parasta paneelit osoittavat log2 suhde (LR) johdettu seeruminäytteistä riippuvuus log tunnusluvut on saatu viereiseen kudokseen ja kaukainen kudosta, vastaavasti. Pohja neljä paneelit ominaisuus zoomata osia tonttien edellä, väri ilmaisee tontin (vihreä vähentynyt ja punainen lisääntyneen ilmentymisen verrattuna ei-kasvainkudoksen). Analyyttien kuvassa 2 on merkitty ja määritykset mainittu julkaisu seeruminäytteistä näkyvät täytetään punaisella symboleja punainen.

Keskustelu

Löytö uusien biomarkkereiden kanssa todistettavasti diagnostisia tai kliinistä hyötyä on ollut suuri haaste viime vuosina [8]. Syitä tähän ovat: läsnäolo kaikkialla preanalyyttiset ja analyyttinen esineitä, ei ole saatavilla sopivia terveen tilan valvonta, liittyvät kysymykset tutkimaan malleja, ja vaikeus havaita pieniä muutoksia proteiinien tasoja hyvin pieninä pitoisuuksina. Tämä haaste on erityisen korostunut syöpä biomarkkereita jossa tavoitteena on usein löytää biomarkkerit pieni maligniteetti vereen suhteellisen suuri ihmiskehon varhaisessa vaiheessa.

Äskettäin valmistunut National Lung Screening Trial (NLST) raportoitu merkittävä kuolleisuus etu seulonta NSCLC pieniannoksisen TT ja havaita varhaisessa vaiheessa taudin riski on suuri väestö [31].