Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

MikroRNA ovat nousseet keskeisiksi sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen, ja niiden muuttunutta ilmaisua on liittynyt kasvaimen kehittymisen ja syövän etenemiseen. Siten MikroRNA on potentiaalia sekä syövän biomarkkereita ja /tai mahdollisia uusia terapeuttisia kohteita. Vaikka kertyvät todisteet viittaavat siihen rooliin poikkeavien mikroRNA ilmaisun kohdun limakalvon syövän synnyn, on vielä rajoitetusti tietoa siitä ennustetekijöiden merkityksestä MikroRNA endometriumin syöpä. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena on selvittää ennusteen arvioinnissa valittujen keskeisten MikroRNA endometriumin syöpää analyysi arkistointia formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudokset.

Experimental Suunnittelu

Yhteensä-RNA: t uutetaan 48 pariksi normaali ja kohdun limakalvon kasvain näytteet käyttäen Trizol lähestymistapaa. Ilmaisu Mir-26a, let-7 g, miR-21, miR-181B, miR-200c, miR-192, miR-215, miR-200c, ja miR-205 kvantitoitiin reaaliaikaista qRT-PCR ilmentymisanalyysiä. Tavoitteita differentiaalisesti ilmaisi miRNA kvantitoitiin käyttäen immunohistokemiallista määritystä. Tilastollinen analyysi suoritettiin GraphPad Prism 5.0.

Tulokset

ekspressiotasot miR-200c (P 0,0001) ja miR-205 (P 0,0001) lisättiin merkittävästi kohdun kasvainten verrattuna normaaleille kudoksille. Kaplan-Meier selviytymisen analyysi osoitti, että korkea miR-205 ilmentyminen oli yhteydessä huonoon potilaiden kokonaiselinaikaa (riskisuhde 0,377; logrank testi, P = 0,028). Lisäksi vähentynyt ilmentyminen miR-205 tavoite PTEN havaittiin kohdun limakalvon syöpä kudoksiin verrattuna normaaleihin kudoksiin.

Johtopäätös

miR-205 on ainutlaatuinen potentiaali ennustetyövälineenä biomarkkereiden endometriumin syöpä.

Citation: Karaayvaz M, Zhang C, Liang S, Shroyer KR, Ju J (2012) Prognostic merkitys miR-205 endometriumsyöpään. PLoS ONE 7 (4): e35158. doi: 10,1371 /journal.pone.0035158

Toimittaja: J. Christopher States, University of Louisville, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 marraskuu 2011; Hyväksytty: 13 maaliskuu 2012; Julkaistu: 13 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Karaayvaz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Stony Brook University Translational Research Laboratory Start-up rahasto (Dr. Ju), R01CA155019 (Dr. Ju) ja R33CA147966 (Dr. Ju). Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kohdun limakalvon syöpä on yleisin maligniteetti naisen sukuelinten Yhdysvalloissa [1]. Yleinen viiden vuoden selviytymisen kohdun limakalvon syöpä on noin 80% kaikista vaiheista. Vaikka se on suhteellisen alhainen kuolleisuus verrattuna muihin gynekologisiin syöpiin, tietyt histologisen tyypit ovat erittäin invasiivisia, usein metastaattisen ja huono selviytymismahdollisuuksia. Kaikkein hallitseva alatyyppi, endomet- kohdun limakalvon syöpä (ETY) kattaa noin 80%: ssa tapauksista. Leikkaus on tyypillisesti parantava kanssa suurin osa näistä tapauksista on diagnosoitu varhaisessa vaiheessa. Sitä vastoin potilailla, joilla on edennyt pitkälle tai nonendometrioid kohdun limakalvon syöpiä yleensä näyttää enemmän aggressiivinen ominaisuuksia ja on paljon epäedullisempi ennusteeseen [2]. Vaikka morfologisten muutosten sisältäisivät merkittäviä oivalluksia kohdun limakalvon syöpä, on kiireellinen tarve erittäin herkkä ja spesifinen molekyyli prognostiset biomarkkerit paremmin ennustaa kohdun limakalvon syövän, erityisesti yli 25% endomet- kohdun kasvainten suuri riski kehittää lisää aggressiivinen sairauksia.

Viime aikoina molekyylitason tutkimuksissa on todettu mikrosatelliittien epävakautta ja mutaatioiden PTEN, K-ras, beeta-kateniinin, p53, HER-2 /neu, p16 ja E-kadheriinin geenien tapauksissa endometriumsyöpätapausta [ ,,,0],3]. Erityisesti, ilmaantuvuus PTEN mutaatioiden on raportoitu olevan korkein muiden geneettisten muutosten, jotka ovat voimassa 34-55% kohdun limakalvon syöpien [4] – [6]. PTEN on tärkeä tuumorisuppressori kohdun limakalvon syöpä, ja tunnistaminen näistä molekyyli uudelleenjärjestelyjä voi tukea paremmin ymmärtämään kohdun limakalvon syövän biologian ja voi myös johtaa löytö uusia molekyylikohteista havaitsemiseksi, ennuste, ja hoito. Vaikka nämä geneettiset muutokset on kuvattu yhtä tärkeitä, ne eivät ole yleisesti läsnä kaikissa tapauksissa viittaa siihen, että epigeneettisten mekanismit (kuten MikroRNA), voidaan myös olla mukana.

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä, ei-koodaavat RNA-molekyylien of 19-25 nukleotidin jotka säätelevät geeniekspressiota transkription jälkeen sitoutumisen kautta 3′-alue (3′-UTR) kohde- mRNA: iden, aiheuttaen mRNA pilkkominen, translaation tukahduttaminen tai mRNA rappeutuminen [3], [7] miRNA ovat todettu säädellä monia kriittisiä solun prosessit, mukaan lukien apoptoosin [8] – [11], erilaistumiseen [12] – [14], ja soluproliferaatiota [8], [13], [15], [16]. Poikkeava ilmentymä miRNA havaitaan useimmissa kasvaintyypeissä, osoittaa rooli syövän synnyssä ja potentiaali prognostisia /diagnostisia biomarkkereita syövässä [17], [18]. Me syystä, että miRNA voidaan hyödyntää paremmin luokan biomarkkereiden koska niiden laaja säätelytoimintoja. Lisäksi ylivoimainen vakaus miRNA formaliiniin parafiiniin upotetut (FFPE) kudoksiin ja kehon eri nesteiden (esim plasma, seerumi) helpottaa lisäksi kliininen hyöty miRNA.

Useat viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoitiin ilmentymisen profiilit miRNA endometriumin syöpä [19] – [26]. Tässä tutkimuksessa pyrittiin tutkimaan ennusteen arvioinnissa on miRNA käyttää arkistointiin FFPE näytteitä kohdun limakalvon syöpäpotilailla. Olemme systemaattisesti määrällisesti ilmaisuja ehdokas miRNA mukana kriittinen solun prosesseissa kuten solusyklikontrollin, chemoresistance, solukuolemaa ja EMT siirtyminen (miR-26a, let-7 g, miR-21, miR-181B, miR-192, miR-215 , miR-200c, ja miR-205) käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qRT-PCR) analyysi. Nämä miRNA valittiin perustuen niiden kriittinen kohde-geenejä, jotka häiriintynyt aikana kohdun limakalvon syövän synnyn (esim. P53, K-ras, PTEN) [27] – [32]. Tuloksemme osoittavat, että ekspressiotasot miR-200c ja miR-205 olivat huomattavasti yli-ilmentynyt kohdun limakalvon syöpä. Kuitenkin vain ilmaus miR-205 oli merkitsevästi yhteydessä potilaan selviytymistä. Aiemmat tutkimukset ovat tunnistaneet PTEN yhdeksi kohdistu suoraa miR-205 [33], [34]. Ottaen huomioon merkityksen PTEN endometriumin syövän biologian, me arveltu, että miR-205 välittämä PTEN eston mekanismi saattaa olla

in vivo

fysiologista merkitystä kohdun limakalvon syöpään. Itse asiassa tuloksemme ovat osoittaneet, että ekspressiotasot miR-205 merkittävästi kääntäen korreloi ekspressiotasoja PTEN. Tämän seurauksena meidän havainnot viittaavat siihen, että miR-205 voi olla ainutlaatuinen potentiaali biomarkkerina ennustetta kohdun limakalvon syöpään.

Tulokset

ilmentäminen miRNA ihmisen kohdun limakalvon syövän ja arviointi niiden prognostisia arvot

ennusteeseen viittaavia parametreja 48 kohdun limakalvon syövän potilaille, joita käytettiin tässä tutkimuksessa on esitetty taulukossa 1. Puolet potilaista oli endomet- karsinooma, ja loput potilaat diagnosoitiin nonendometrioid histologia (13 vakavien karsinooma, 5 kirkas cell carcinoma, 5 pahanlaatuinen sekoitettu MUllerin kasvain (MMMT), ja yksi erilaistumaton karsinooma). Näistä potilaista 26 tapauksessa oli vaiheen I (54%), neljä tapausta oli vaiheen II (8%), 6 tapausta oli vaiheen III (13%), ja 12 tapauksessa oli vaiheessa IV (25%) taudin. Tutkia kliinistä merkitystä valitun miRNA näillä kohdun limakalvon syöpä potilailla, me määrällisesti niiden ekspressiotasot 48 pariksi arkistointia kasvain ja normaali FFPE kudosnäytteiden käyttäen reaaliaikaista qRT-PCR-analyysillä. N miRNA testattu, ei ollut merkittävää eroa ekspressiotasot miR-26a, anna-7 g, miR-21, miR-181 b, miR-192, ja miR-215 välillä kasvainkudoksissa ja vastaavassa normaalissa näytteet (P = 0,742 ; P = 0,91; P = 0,641; p = 0,313; p = 0,106; p = 0,336, vastaavasti) (kuvio 1A-F). Sitä vastoin ilmaisu sekä miR-200c (P 0,0001; kuvio 1G) ja miR-205 (P 0,0001; kuvio 1 H) olivat merkittävästi säädellään ylöspäin kohdun limakalvon syöpä yksilöiden verrattuna viereisiin normaaleihin kudoksiin. Analysoida edelleen merkitystä miR-200c ja miR-205 suhteen kliinisen ennusteen, Kaplan-Meier eloonjääminen analyysi suoritettiin käyttäen potilaan eloonjäämiseen (kuvio 2). Tuloksemme osoittivat, että ekspressiotasot miR-205 olivat merkitsevästi yhteydessä potilaan selviytymistä. Potilaat, joilla on alhainen (cut-off 15-kertainen miR-205) yleensä on parempi eloonjäämisen kuin potilailla, joilla on korkea miR-205 (Hazar suhde, 0,377, logrank testi, P = 0,028) (kuvio 2B). Tämä tukee käsitystä, että kohonneita miR-205 kasvainkudoksissa voisi johtaa huonompi eloonjäämisluvut endometriumin syöpäpotilailla. Kuitenkin ekspressiotasot miR-200C eivät liittyneet elossaololuku (P = 0,576; kuvio 2A).

suhteellinen kvantitointi miRNA ilmaistiin normalisoitui sisäinen kontrolli RNU6B geeni. (A) miR-26a lauseke (P = 0,742). (B) anna-7g lauseke (p = 0,91). (C) miR-21 ilmentyminen (P = 0,641). (D) miR-181B lauseke (P = 0,313). (E) miR-192 lauseke (P = 0,106). (F) miR-215 lauseke (P = 0,336). (G) miR-200c ilmentymisen (P 0,0001). (H) miR-205 ilmentymisen (P 0,0001). Tilastollinen merkittävyys laskettiin pariksi Studentin t-testiä.

. Kaplan-Meier eloonjäämiseen käyrät piirrettiin perustuvat miRNA ilme. (A) luki- 200c lauseke (P = 0,576, logrank testi). (B) miR-205 lauseke (P = 0,028, logrank testi).

Korrelaatio miR-205 ja PTEN ilmaisun endometriumin syöpäpotilailla

On raportoitu että miR-205 on kohdistettu kriittisiin tuumorisuppressorigeenin PTEN [33], [34], joka on usein mutatoitunut tai endometriumin syöpä [4] – [6]. Kuitenkin geneettiset muutokset eivät voi selittää kaikkia PTEN proteiinin menetystä havaittiin kohdun limakalvon karsinoomat, mikä viittaa vahvasti siihen, että mukana on transkription jälkeinen sääntely PTEN ilmaisun [35], [36]. Koska ekspressiotasot miR-205 olivat koholla kasvainkudoksissa, päättelimme, että tehostettu inhibitio PTEN by miR-205 voi olla fysiologisesti merkityksellisiä mekanismi aikana kohdun limakalvon syövän synnyssä. Tutkiakseen

in vivo

suhde miR-205 ja PTEN-proteiinin ilmentyminen, rakensimme kudossiruina (TMA) alkaen arkistointi FFPE kudosnäytteet ja suoritetaan immuunihistokemiallisesti PTEN 6H2.1-ainetta leikattuna TMA. Tuloksemme osoittavat, että PTEN-proteiinin ilmentyminen väheni endometriumsyöpään verrattuna normaaliin kohdun limakalvoon. Kuvio 3A esittää, että mediaani ilmentymistä PTEN oli merkitsevästi pienempi kasvaimen kudoksissa (mediaani pisteet 85) verrattuna normaaleissa kudoksissa (mediaani pisteet 132) (P = 0,0058). Kuva 3 (B-E) on esitetty esimerkkejä PTEN värjäytyminen normaalissa kohdun limakalvon (3B), endomet- karsinooma (3C), vakavien karsinooma (3D), ja selkeä cell carcinoma (3E).

(A) parvikuvio of immunovärjäyty- pistemäärät PTEN normaalissa kohdun limakalvon ja kohdun limakalvon syöpä laskettu määrällisesti värjäytymisintensiteettiä avulla ImageJ ohjelmistoa. Pylväät edustavat mediaani kunkin luokan (normaali mediaani = 85, kasvaimen mediaani = 132). (B-E) PTEN-proteiinin ekspression havaitaan normaalissa kohdun limakalvon (B), endomet- karsinooma (C), vakavien karsinooma (D), ja kirkas cell carcinoma (E), kuten havaitaan immunohistokemiallisesti.

edelleen vahvistaa käänteinen suhde miR-205 ja PTEN-ilmaisun, teimme ei-parametriset spearman korrelaation analyysi käyttämällä tapauksissa, joissa on sekä miR-205 ja PTEN-proteiinin määrän dataa. Tuloksemme osoittavat, että läsnä on käänteinen korrelaatio 69%: ssa tapauksista (Spearmanin korrelaatiokertoimen = -0,502, p = 0,034) (kuvio 4A). Kuva 4B ja kuva 4C esittävät esimerkkejä PTEN värjäyksen mukana miR-205 ekspressiotasot yksittäistapauksissa. Kuvio 4B osoittaa eriyttämätön karsinooma korkea PTEN värjäys ja vain vähäinen ajan sääntelyn miR-205 ilmaisun välillä kasvain ja vieressä normaali kudos (~1.25 kertainen). Kuvio 4C osoittaa selvän karsinooma erittäin alhainen PTEN värjäystä ja ~350 taittaa-sääntelyn miR-205 ilmaisun välillä kasvain ja vieressä normaalia kudosta.

(A) Korrelaatio miR-205 ja PTEN ilmentyminen analysoitiin kaksisuuntaisella Spearmanin nonparametric korrelaatio koe (P = 0,034, Spearmanin korrelaatiokerroin = -0,502). PTEN-proteiinin ekspression mukana miR-205 lauseke (kolmena kappaleena) on havainnollistettu yksittäistapauksissa; erilaistumaton karsinooma (B), ja selkeä cell carcinoma (C).

Lopuksi tukemaan hypoteesia, että vähentynyt PTEN-proteiinin ilmentymistä välittyy transkription jälkeinen ohjaus, me määrällisesti PTEN mRNA-tasoja käytetään todellisia -Time qRT-PCR: llä. Tuloksemme osoittavat, että PTEN mRNA: n ekspressiotasot kohdun limakalvon syöpä yksilöiden ei osoittanut eroa verrattuna viereisiin normaaleissa kudoksissa (kuvio 5). Nämä tulokset viittaavat siihen, että korrelaation puuttuminen PTEN mRNA menetys PTEN proteiinin endometriumsyöpään todennäköisesti johtuu transkription jälkeen säännelty mekanismi.

suhteellinen kvantitointi PTEN mRNA ilmaistiin normalisoitui sisäinen kontrolli β-aktiini-geeni (p = 0,31). Tilastollinen merkittävyys laskettiin pariksi Studentin t-testiä.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa tunnistimme merkittävästi yliekspressoitujen miR-200c ja miR-205 endometriumsyöpään verrattuna normaali kohdun kudoksessa (kuvio 1). Tämä havainto on yhdenmukainen monet muut tutkimukset, jotka kohonnut näiden kahden miRNA eri tyyppisiä kohdun limakalvon syöpä [19] – [24], [26]. Siksi ehdotamme, että yli-ilmentyminen allekirjoitus näiden miRNA endometriumin syöpä ei ole spesifinen histologista tyyppiä. Chung

et al.

Raportoitu, että poikkeava ilmentyminen miR-205 korreloi edistynyt endometriumsyöpään [22]. Kuitenkin meidän tulokset osoittivat, että miR-205 ilmentymistä eivät liity edennyt sairaus tai kasvain tyyppi (kuva S1). Huomasimme, että miR-205 ilmentyminen oli merkitsevästi yhteydessä yleiseen elossaololuku siten, että potilailla, joilla on korkeampi miR-205 on yleensä elinajan fenotyypin (kuvio 2). Tuloksemme tukevat käsitystä, että miR-205 voi olla potentiaalia biomarkkerina negatiivista ennustetta kohdun limakalvon syövän ja hoitomenetelmät kohdistaminen kohonneet miR-205 olisi tutkittava uutena lähestymistapa parantaa hoitotuloksia.

MIR-200 perhe ja miR-205 on myös raportoitu olevan väärin säädellystä vuonna muiden syöpien. MIR-200 perhe on raportoitu säädellään ylöspäin munasarjasyövän ja kolangiokarsinooma [37] – [39], mutta alassäädetty maksasolukarsinoomassa, rintasyöpä ja munuaissolukarsinooma [40] – [42]. Sen sijaan miR-205 on raportoitu olevan säädellään ylöspäin munasarja-, virtsarakko-, ja rintasyövät [37], [43], [44], mutta alassäädetty eturauhasessa ja ruokatorven syöpiä [45], [46] . Nämä eri ilmaisun muotoja joidenkin syöpien voi heijastaa läsnäolo kasvain tyypille erityisiä mekanismeja, jotka välittävät sääntelyn miRNA. Kaikkein hyvin tunnettu funktio miR-200 perheen ja miR-205 on niiden kyky säädellä ilmentymistä E-kadheriinin transkriptiorepresso- ZEB1 (tunnetaan myös nimellä δEF1) ja SIP1 (tunnetaan myös nimellä ZEB2), tekijät tärkeää epiteelin mesenkymaaliset siirtyminen (EMT) ja tuumorietäpesäke [32]. Kuitenkin miR-200 perhe ja miR-205 toimivat tuumorisuppressoreilla kautta estämällä EMT. Koska ilmaus näiden miRNA on lisääntynyt kasvain näytteissä, päättelimme, että muut proteiinit kohteina nämä miRNA saattaa olla mukana kohdun limakalvon syöpä. Yksi raportoitu tavoitteet miR-205 on kriittinen kasvainsuppressorigeenin, PTEN [33], [34].

PTEN ilmentymistä on raportoitu vähennetään kohtukarsinooma [4], joten se on kriittinen rooli endometriumsyöpään biology [35], [36], [47], [48]. Kuitenkin mutaatiot /deleetiot PTEN eivät ole ainoa syy alennetun PTEN ilmaisua. Pikemminkin epigeneettiset mekanismit, kuten promoottori metylaatio, lisääntynyt PTEN proteiinien hajoaminen tai asetuksen kautta miRNA ovat myös tärkeitä [49]. Tässä mielessä olemme analysoineet ekspressiotasot PTEN mRNA ja proteiini kohdun limakalvon syöpä potilailla. Olemme osoittaneet, että, vaikka ei ollut mitään muutosta ilmentymisen PTEN mRNA: n ekspressio PTEN-proteiinin väheni kasvainkudoksissa verrattuna viereisiin normaaleihin kudoksiin. Tämä tukee oletusta, että transkription jälkeinen säätely PTEN, mahdollisesti välittämä miRNA, on pätevä. Yhdessä raportit että PTEN on välittömänä kohteena miR-205, tuloksemme tukevat mahdollista roolia miR-205 säätelyssä PTEN endometriumin syöpä.

Yleensä lasku PTEN ilmentyminen liittyy endometriod syöpä ja se voi olla hyödyllinen biomerkkiaine erottaa endomet- karsinooma päässä vakavasta kohdunkaulan [4]. Kuitenkin, muissa tutkimuksissa on raportoitu mitään merkittävää eroa PTEN ilmentymisen, mikä viittaa siihen, että PTEN ei ehkä aina ole tarpeen erottaa nämä kasvaimen alatyyppejä [50], [51]. Siksi kliininen hyöty PTEN biomarkkerina on vielä määrittämättä. Olemme selvää, että miR-205 voi olla ylivoimainen biomarkkereiden kuin PTEN ansiosta suuri vaikutus useita tavoitteita ja reittejä.

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että ilmentyminen miR-205 ja PTEN ne ovat käänteisesti verrannollisia endometriumin syöpäpotilaita, mikä fysiologista merkitystä miR-205 välittämä PTEN esto mekanismi endometriumsyöpään biologiassa. Vielä tärkeämpää on, ekspressio miR-205 on liitetty kohdun limakalvon syöpä potilaan selviytymisen. Niinpä selvää, että miR-205 voi säädellä PTEN ja muun proteiinin ilmentymistä synnyssä kohdun limakalvon syöpä. Tulevaisuuden tutkimuksia tarvitaan selvästi täysin vahvistaa kliininen hyöty miR-205 ennustetekijöiden biologisten merkkiaineiden kanssa monikeskustutkimus suuri endometriumsyöpään potilasaineistoihin.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics

Kliininen näyte kohortti käyttää tähän hyväksyi tutkimuksen Institution Review Board of Stony Brook University Medical Center. Kirjallinen suostumus saatiin kaikki osallistujat mukana tutkimuksessa.

Potilaat ja näytteet

hyväksyntää toimielimen Review Board saatiin sekä kudosten keräämisen ja käytön arkistointia Formaliinifiksoidusta parafiiniin (FFPE) kudospaloista. RNA uuttamalla, kasvain näytteet ja viereisen normaaleissa kudoksissa saatiin 48 endometriumsyöpään potilailla, joille tehtiin kohdunpoisto at Stony Brook University Hospital, Stony Brook, NY. Ominaisuudet näillä potilailla on esitetty taulukossa 1. Immunohistokemiaa kasvaimen kudokset saatiin 47 kohdun limakalvon syöpä potilaiden ja ei-patologinen kohdun limakalvon kudoksissa normaalit kontrollit saatiin viisi ei-kohdun limakalvon syövän potilaille. Parafiiniblokit sisältäviä formaliinikiinnitetyt yksilöiden kudoksissa (FFPE) hankittiin arkistokokoelmien Department of Pathology ja käyttää tämän jälkeen analyysejä. Näytteet on valittu 1995-2010 jopa 15 vuotta kliinistä seurantaa tiedot.

kudossiruina (TMA) B

kudossiruina valmistettiin FFPE korttelin kohdunpoisto yksilöitä. Hematoksyliinillä ja eosiinilla värjätyt leikkeet kaikista tapauksista tarkasti. Kullekin tapauksessa alueet kohdun limakalvon syövän ja normaali endometrium nimettiin. Käyttämällä Advanced Tissue ryhmittäjällä (Malli: ATA-100, Millipore, Billerica, MA, USA), jossa on 1,5 mm: n neulaa, kolme ydintä poimittiin alueen kasvain ja kolme ydintä poistettiin hyvänlaatuinen endometriumin tapauskohtaisesti. Ytimet upottaa parafiiniin kudokseen microarray lohkon ennalta määrätyissä kohdissa, joissa jopa 60 ydintä kussakin kudoksessa microarray ja kaksi ydintä sijoitettu nimetä suunta lohkon.

immunohistokemia (IHC) analyysi PTEN Expression

TMA leikattiin 5 um, ja leikkeet lämpöä immobilisoitiin objektilaseille 60 ° C: ssa yön yli. Jälkeen deparaffinization, antigeeni haku suoritettiin sitraattipuskurissa [20 mmol /l (pH = 6)] 120 ° C: ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen 3% vetyperoksidia viisi minuuttia. Värjäys levitettiin FFPE kudoksiin käyttämällä avidiini-biotiini (ABC) menetelmä (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Leikkeitä inkuboitiin yksi tunti hiiren monoklonaalisella PTEN-vasta-aine, PTEN 6H2.1 (Cascade Biosciences, Winchester, MA) laimennoksena 1:300. Monoklonaalinen hiiren IgG: tä (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) käytettiin isotyyppiä negatiivisena kontrollina. PTEN värjäys visualisoitiin 3, 3′-diaminobentsidiiniä (Dako, Carpinteria, CA), ja leikkeet vastavärjättiin laimealla hematoksyliinillä, kuivattu, ja peitettiin kirkkaita-kentän mikroskopia. Värjäys IHC kvantifioitiin keskimäärin intensiteetti kolmesta ytimiä kussakin tapauksessa (ImageJ ohjelmistot (https://rsb.info.nih.gov/ij/)).

RNA: n eristäminen

käyttäminen arkistointiin FFPE kudokset, erilliset alueet kasvaimen ja normaalin kohdun limakalvon tunnistettiin käyttäen vastaavaa hematoksyliinillä ja eosiinilla värjätyt leikkeet ja hylsyt mittaamalla halkaisijaltaan 1,5 mm ja 2 mm pitkä (noin 0,005 g) uutettiin. Sen jälkeen näytteet poistettiin parafiini, sammutettua, digestoitiin proteinaasi K:, ja lopulta koko RNA: t eristettiin käyttäen TRIZOL-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad CA, USA).

Reaaliaikainen qRT-PCR analyysi miRNA Expression

MIR-26a, let-7 g, miR-21, miR-181B, miR-192, miR-215, miR-200c, ja miR-205 spesifisiä alukkeita ja sisäisen valvonnan RNU6B geeni hankittiin Ambion ( Applied Biosystems, CA, USA). cDNA-synteesi suoritetaan High Capacity cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems, CA, USA) miRNA alukkeita. Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) suoritettiin Applied Biosystems 7500 reaaliaikainen järjestelmä (ABI 7500HT instrument) kanssa miRNA erityisten alukkeiden TaqMan Gene Expression Assay.

Reaaliaikainen qRT-PCR analyysi PTEN mRNA

jotta voidaan havaita mRNA FFPE kudoksista, cDNA-synteesi suoritetaan High Capacity cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems, CA, USA) satunnaisia ​​alukkeita. Sillä qRT-PCR-analyysi, räätälöityä reaaliaikainen PCR-alukkeita ja koettimia PTEN ja sisäisen valvonnan geeni β-aktiini käytettiin (Applied Biosystems CA, USA). Alukkeet suunniteltiin saada niin pieniä amplikoneihin kuin mahdollista, koska huoli hajoaminen mRNA FFPE kudoksissa [52]. Sekvenssit näitä alukkeita /koettimia on lueteltu taulukossa 2. qRT-PCR suoritettiin ABI 7500HT väline mRNA erityisten alukkeiden TaqMan Gene Expression Assay seuraavissa olosuhteissa: 50 ° C, 2 min käänteisen transkription; 95 ° C, 10 min; 95 ° C, 15 s; 60 ° C, 1 min 40 sykliä (n = 3). Expression of PTEN mRNA normalisoitui mukaan sisäisen β-aktiini ohjaus, ja suhteellinen ilmaisun arvot piirrettiin.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen GraphPad Prism-ohjelmiston 5.0 . Geenien ilmentyminen ACt arvoja miRNA kustakin näytteestä laskettiin normalisoimalla mukaan sisäisen valvonnan RNU6B ilmaisun, ja suhteelliset kvantifioinnin arvot piirrettiin. Erot kasvaimen ja normaaleissa kudoksissa analysoitiin pariksi Studentin t-testiä. Kaplan-Meier selviytymisen dikäyrät arvioimaan ekspressiotasoja miR-200c ja miR-205 eloonjäämisaste. Parittomia Studentin t-testiä käytettiin analysoimaan ero PTEN värjäytymisen välillä kasvain ja normaaleissa kudoksissa. Tilastollinen merkitsevyys perustettiin P 0,05 jokaisessa testissä.

tukeminen Information

Kuva S1.

suhde miR-205 ilmaisun ja eri vaiheissa kohdun limakalvon syöpä. miR-205 ilmentyminen ilmaistiin normalisoitui sisäinen kontrolli RNU6B geeni. (A) Yksisuuntainen ANOVA testiä käytettiin analysoimaan yhdistys miR-205 ilmentymisen vaiheessa I, vaihe II, vaihe III ja vaihe IV kohdun limakalvon syöpään. (B) Parittomia Studentin t-testiä käytettiin analysoimaan yhdistys miR-205 ilmentymisen vaiheessa I IV.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0035158.s001

(TIF) B

Kiitokset

kirjoittajat kiittää Haiyan Zhai, Stephanie Burke, Saira Mahmud, ja Penelope Georgakopoulos teknistä apua ja hyödyllisiä kommentteja. Kiitämme tohtori Xiao Xu (Biostatistics Core varten Digestive Diseases Research kudostenhankintaryhmällä Facility Stony Brook University) hänen apu tilastolliseen analyysiin. Arvostamme kriittinen arvio Ms Sonya Lorrain ja ehdotuksia meidän arvioijat.