Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mahasyöpää lukien cardia ja non -cardia tyypit on toinen usein syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti. Osajoukko ei-cardia mahasyövän geneettistä alttiutta loci on käsitelty muun Aasian läpi genomin laajuinen yhdistys tutkimukset (GWASs). Tämä tutkimus oli arvioida vaikutuksia yhden nukleotidin polymorfismien (SNP) pitkän intergeeniset ei-koodaavan RNA: t (lincRNAs) ei-cardia mahasyövän alttius Kiinan väestö. Valitsimme pitkä intergeeniset ei-koodaavaa RNA: t (lincRNAs) sijaitsee ei-cardia mahalaukun syövän riski liittyvät loci ja tunnistettu 10 SNP sijaitsevat lincRNA eksoni alueilla. Tutkimme, onko geneettinen polymorfia lincRNAs eksonit liittyvät ei-cardia mahalaukun syövän riskiä 438 ei-cardia mahasyöpäpotilaista ja 727 verrokkien Kiinan väestön logistisen regressiomallin. Toiminnallinen merkitystä tutkittiin edelleen biokemiallisilla määrityksillä. Huomasimme, että

lincRNA-NR_024015

rs8506AA kantaja oli merkitsevästi yhteydessä jäämisen riskiä cardia mahasyövän (oikaistu riskisuhde [OR] = 1,56, 95% CI = 1,03-2,39 verrattuna rs8506 AG tai GG genotyyppi. Lisäksi kerrostuminen analyysi osoitti, että riski vaikutus oli selvempi alaryhmiä tupakoivien (

P

= 0,001). biokemiallinen analyysi osoitti, että G: stä A emäsmuutos rs8506G häiritsee sitoutumiskohdan has- miR-526b vaikuttaa näin transkriptionaalista aktiivisuutta

lincRNA-NR_024015

ja vaikuttavat solujen lisääntymistä. Nykyinen tutkimus osoitti vankan assosiaatio rs8506G polymorfismi

lincRNA-NR_024015

eksoni ja riski ei-cardia mahasyövässä.

Citation: Fan QH, Yu R, Huang WX, Cui XX, Luo BH, Zhang LY (2014) HAS-miR-526b Binding-Site rs8506G polymorfismin

lincRNA-NR_024015

eksoni Merkitty GWASs altistaa Non-Cardia mahalaukun syöpäriski. PLoS ONE 9 (3): e90008. doi: 10,1371 /journal.pone.0090008

Editor: Xiaoping Miao, MOE Key laboratorio ympäristöä ja terveyttä, School of Public Health, Tongji Medical College, Huazhong tiede ja teknologia, Kiina

vastaanotettu 11 joulukuuta 2013 mennessä; Hyväksytty: 25 tammikuu 2014; Julkaistu: 04 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Fan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Suzhou sosiaalisen kehityksen rahasto Project (SS08047), Jiangsun maakunnassa avain Medical Department vuonna 2011. rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on toiseksi suurin syy syövän kuolemaan maailmanlaajuisesti keuhkosyövän jälkeen vuonna 2010, vaikka kuolleisuus kuolemat , laski hieman 774000 vuonna 1990 noin 755000 vuonna 2010 [1], [2]. Epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että ympäristötekijä, kuten ruokavalio, tupakointi, alkoholijuomat kulutusta ja etenkin infektio Helicobacter pylori liittyy suurempi riski GC [3], [4]. Huolimatta näistä tunnettuja riskitekijöitä, tutkijat edelleen vakuuttunut siitä, että geneettiset tekijät, erityisesti yhden emäksen monimuotoisuus (SNP: t), ovat todennäköisesti keskeinen rooli yksilön riskiä sairastua mahalaukun syöpään kuin vain murto altistuneiden yksilöiden kehittää mahasyöpä [5] .

Toistaiseksi kanssa ennen seuraavan sukupolven transcriptome sekvensointi (RNA-Seq), on ollut syvällinen muutos meidän ymmärtämään koko joukko transkription poikkeavuuksia sairaus, mukaan lukien uudet opintosuoritusotteet ja koodaamattomasta RNA: t (ncRNAs) ei mitata tavanomaisilla analyysit [6] – [9]. Kaikkien sillä hetkellä tunnettu luokat ei-koodaavat RNA: t molekyylejä, nämä on kutsuttu pitkään välissä ncRNAs (lincRNAs) pitempi kuin 200 nukleotidiä (nt), jotka ei ole avoimen lukukehyksen, ja eivät ole päällekkäisiä proteiinia koodaavan geenien [7], [10]. Ryhmät lincRNAs on hyvin tunnettu jossain määrin ja osoitettiin korreloivan tärkeisiin solun prosesseja, kuten painamista, X-kromosomin inaktivaatioon, pluripotenttisuus ylläpito, ja kopioinnin säätely [10] – [15]. Lisäksi kehittyvien näyttöä säädeltyyn lincRNA ilmaisun lukuisissa syövissä ovat nousseet lincRNA uutena näkökulma biologian, jossa näyttöä siitä, että suuri rooli osallistuminen lincRNA ihmisen kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeiden [16], [17]. Itse asiassa hyvin kuvattu esimerkiksi

hotair

on tutkittu panoksia vaiheittaista etenemistä tumorigeneesin [11], [18], joissa korostetaan lncRNAs syövän biologian. Lisäksi pitkän ei-koodaavan RNA

MALAT1

(etäpesäke liittyvä keuhkoadenokarsinooma transkriptio 1), on usein misregulation ja ennakoiva markkerin erilaisia ​​ihmisen paksusuoli-, rinta- ja eturauhassyövän [19] – [ ,,,0],22]. Kuitenkin mekanismit tietty toiminto lincRNAs syövän kehittymisessä ei ole täysin hahmoteltu.

Viime vuosikymmenellä useita puolueeton genomin laajuinen yhdistys tutkimukset (GWAS) ovat laajentaneet ymmärrystämme geneettistä vaihtelua liittyvien eri tyyppisiä sairauksia ja syöpiä korkea suoritusteho teknologioita [23]; kuitenkin vähintään yksi kolmannes tunnistetut muunnokset ovat ei-koodaavia välein [24]. Äskettäin kaksi GWAS kävi ilmi, että useat alttius vaara lokuksen, jotka liittyvät ei-cardia mahasyövän (NCGC) riski kiinalaisessa väestöstä. Bioinformatiikan analyysi on paljastanut lukuisia lincRNAs lähellä näitä loci. Lisäksi useat asiaa yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) sijaitsee eksoni alueilla lincRNAs jotka voivat yhdistää NCGC havaittu; kuitenkin, yhdistyksen geneettisen vaihtelun lincRNAs eksonit ja syöpäalttiutta on harvoin raportoitu.

Tässä tutkimuksessa olemme arveltu, että SNP eksoni alueella lincRNAs voi muuttaa ekspressiotasot ja siten voi myötävaikuttaa NCGC. Tämän hypoteesin testaamiseksi teimme sairaalan johdolla tapauskontrollitutkimuksessa tutkimaan assosiaatioita näiden SNP ja alttius NCGC on Kiinan väestön.

Materiaalit ja menetelmät

oppiaineista

Kaikki koehenkilöt nykyisessä tutkimuksessa olivat etnisesti homogeenisen han-kiinalaisten lukien 438 NCGC potilasta ja 727 tervettä verrokkia. Potilaat, jotka leikattiin klo Affiliated sairaala Soochow University (Suzhou) on peräkkäin rekrytoitiin 2003-2009, joiden vaste oli 94%. Potilaat olivat Suzhoun kaupunkiin ja sen lähialueilla, ja ei ollut ikä, sukupuoli, ja histologia rajoituksia. Tiedot koskevat kliiniset piirteet potilaista on koottu taulukkoon 1. kasvain, solmu, etäpesäkkeitä (TNM) luokitus ja tuumorin luokitus arvioitiin mukaan vuonna 2002 Yhdysvaltain sekakomitean Cancer Staging järjestelmään. Väestön kontrollit olivat syöpää vapaa asuvien ihmisten Suzhou alueella; ne valittiin ravitsemuksellinen kyselyssä saman ajan kuin tapaukset kerättiin. Kontrollinäytteissä oli saatavilla meille aikaisemmista tutkimuksista, jotka valittiin satunnaisesti tietokannan, joka koostuu 3500 yksilöistä fyysinen tarkastus [25] – [27]. Mittaus seerumin H.pylori immunoglobuliini G NCGC potilaiden ja verrokkien määritettiin entsyymi-immunologinen määritys (ELISA). Tutkimus hyväksyttiin lääketieteen eettinen komitea Soochow yliopistosta. Kaikki osallistujat olivat geneettisesti jotka eivät liity etnisten Han kiinalaisia ​​ja kukaan oli verensiirron viimeisen 6 kuukauden aikana. On antanut kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen, jokainen osallistuja oli määrä haastattelussa strukturoidun kyselylomakkeen kerätä valittuja tietoja, ja lahjoittaa 5 ml ääreisverenkierron.

SNP Selection

Kaikki julkaistut kirjallisuus tutkivat yhdistyksen välillä geneettinen alttius ja NCGC riski olivat oikeutettuja. Etsimme tutkimuksia jopa elokuu 2013 käyttäen PubMed tietokannasta ja Web of Science. Merkitykselliset hakutermejä olivat ”genomin laajuinen yhdistys tutkimuksessa”, ”GWAS”, ”NCGC”, ”mahasyöpä”, ”mahasyöpä”, ja ”Aasian”. Olemme myös itse etsinyt viiteluetteloihin valituissa artikkeleita. Olemme ensinnäkin ulkopuolelle joitakin artikkeleita skannaamalla otsikoita ja tiivistelmiä tutkimuksista, joita ei ole kirjoitettu Englanti. Sitten, kun luet koko tekstin jäljellä artikkeleita, tunnistimme lopullinen määrä tutkimuksia. Kaikki valitut tutkimukset täyttivät seuraavat kriteerit: (1) tuloksista tutkittu perustui GWAS suhteessa NCGC ihmisillä; (2) artikkelit julkaistiin Englanti; (3) viimeisimmän tutkimukset valitaan päällekkäisten tietojen ja päällekkäistä tietojen; (4) GWAS suoritettiin käyttäen siru teknologiaa. Suurimmat hylkäämiskriteerejä olivat (1) arvioita, ohjeita, kirjeitä, ja pääkirjoitukset; (2) kaksoiskappale tiedot; (3) ei tapaus-verrokki suunnittelu; ja (4) päällekkäin olevat tiedot tai tiedot polkumyynnillä uusin raportteja. Seuraavaksi keitetty alttiuslokukset tunnistaa GWAS varten NCGC valituilla artikkeleita, 4 lincRNAs jotka eivät mene päällekkäin minkään tunnustettu geenien sisällä 1 megatavun valikoima näiden lokusten, kumpaankin suuntaan (yhteensä span 2 MB) on lopulta tunnistettu ihmisen lincRNAs tietokantaan [28]. Lisäksi Haploview ohjelmisto 4.2 käytettiin bioinformatiikan analyysi haplotyypin lohkon perustuu Kiinan Han Beijing (CHB) väestö tietojen HapMap (HapMap Data Release 27 vaiheen II + III, helmikuussa 2009 annetun NCBI B36 kokoonpano, dbSNP B126). Nämä SNP vähäisiä alleelifrekvenssit yli 5% Kiinan väestöstä uutettiin. Oli kolme haplotyypin lohkoa Kiinan väestön (kuvio 1A). Haplotyypin-koodaus SNP valittiin kanssa Haploview ohjelmiston 4.2 Tagger ohjelma; todettiin, että rs11752896, rs11752942, rs4714336 ja rs4711631 kattoi haplotyypin lohkossa 1 on 100% taajuus (rs11752896 ja rs11752942: D ’= 1,0, r

2 = 1,0, rs11752896 ja rs4714336: D’ = 1,0, r

2 = 1,0; rs11752896 ja rs4711631: D ’= 1,0, r

2 = 1,0). Lisäksi rs2467950, rs2450764 ja rs9312, rs8506 kattoi haplotyyppi lohkossa 1 klo 100%: lla (rs2467950 ja rs2450764: D ’= 1,0, r

2 = 1,0; rs9312 ja rs8506: D’ = 1,0, r

2 = 1,0). SNP rs2304285 ja rs2477757 ulkopuolella lohkoja. Siksi SNP rs11752896, rs2467950, rs8506, rs2477757 ja rs2304285 valittiin viisi mahdollista toiminnallinen SNP eksoni valitun lincRNAs analysoitava niiden yhdistysten mahasyöpäriski.

(A) Kytkentäepätasapaino (LD) kartta valittujen SNP

lincRNA-NR_024015

eksoni. Se osoitti, että rs11752896, rs11752942, rs4714336 ja rs4711631 ovat LD D ’= 1; rs2467950 ja rs2450764 ovat LD D ’= 1; rs9312 ja rs8506 ovat LD D ’= 1. (B) tasot ydinvalvonnasta transkriptin (

U6

), sytoplasman ohjaus transkripti (

GAPDH

mRNA), ja

lincRNA -NR_024015

arvioitiin RT-qPCR ydin- ja sytoplasman jakeet. Tiedot ovat keskiarvo ± keskivirhe keskiarvon. Tulokset esitetään prosentteina

U6

,

GAPDH

ja

lincRNA-NR_024015

tasoilla ja koko tasot jokaiselle vietiin 100%. (C-D)

In silico

ennustaminen taitto rakenteiden aiheuttamien rs8506G A

lincRNA-NR_024015

. Vuori juoni on xy-kuvaaja, joka edustaa sekundaarirakenteissa lukien MFE rakenne, termodynaaminen kokonaisuus RNA rakenteiden (PF), ja centroid rakenne tontti korkeus versus asentoon. ”MFE” edustaa vähintään vapaa energia rakenne; ”Pf” ilmaisee partitiofunktion; ”Guldinin” edustaa centroid rakenne.

Genotyyppausanalyysiin

Genome DNA eristettiin ääreisverenkierron lymfosyyttien tutkimuksen aiheista. Alleelispesifisen MALDI-TOF-massaspektrometriaa käytettiin genotyypin markkereita käytetään yhdistyksen analysoidaan, kuten aiemmin on kuvattu [27], [29]. Yhteensä 60 näytettä valittiin satunnaisesti suoralla sekvensoinnilla vahvistaa genotyypin tulokset massaspektrometrianalyysissä, ja tulokset olivat 100% sopimukseen. Noin 10% näytteistä oli myös satunnaisesti valitun varten sokkoutetuilla toista genotyyppausvaiheen ilman tietoa edellisen genotyypityksen tulokseen tai asema on tapaus ja valvontaa, ja tulokset olivat 100% sopimukseen.

Cell Culture

293T tai HGC-27-solut ostettiin Cell Bank of Type Culture Collection Kiinan tiedeakatemia, Shanghai Institute of Cell Biology, ja siirrostettiin vähemmän kuin 6 kuukautta. 293T tai HGC-27-solut ylläpidettiin DMEM korkea glukoosi (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) tai RPMI 1640 -elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) ja 50 ug /ml streptomysiiniä (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) 37 ° C: ssa, kun läsnä oli 5% CO

2.

Solunosafraktiointi

HGC- 27-soluja viljeltiin kostutetussa inkubaattorissa 2 päivää. Sillä subsellulaarifraktiointikokeet, jopa 2 x 10

6 soluja käytettiin. Soluliman ja tumaekstrakteilla rintasyöpään solut kerättiin käyttäen Nuclear /sytosoliin fraktiointi Kit (BioVision, USA) mukaan valmistajan ohjeiden.

In silico

ennustaminen Folding Structures indusoima Rs8506G A

LincRNA-NR_024015

Koska tietyt rakenteet ovat todennäköisesti avainasemassa biologisissa toimintoja; Näin käytimme RNAfold ja SNPfold algoritmeja ennustaa oletetun vaikutuksen rs8506G A paikallisen taitto rakenteet

lincRNA-NR_024015

analysoimalla 61-emäsparin alueita reunustavien polymorfismin.

rakentaminen Reporter plasmidit

kaksi reportteri plasmideja, jotka sisältävät 160 bp

lincRNA-NR_024015

eksoni-alueen fragmentti, joka reunustaa rs8506G tai rs8506A alleelin syntetisoitiin Genewiz Company (Suzhou, Kiina) ja kloonattiin sitten psiCHECK- 2 perusvektoriin (Promega, Madison, WI) (kuvio 1 B). Tuloksena rakentaa kanssa

lincRNA-NR_024015

rs8506 SNP (psiCHECK-2-lincRNA-rs8506G ja psiCHECK-2-lincRNA- rs8506A) varmistettiin sekvensoimalla.

Transient transfektoinneilla ja Lusiferaasimäärityksiä

Bioinformatics analyysi paljasti, että rs8506G polymorfismi paikantaa sitoutumiskohdan mikroRNA on-miR-526b (https://snpinfo.niehs.nih.gov/). Siten jäljittelee ja inhibiittorit on-miR-526b (GenePharma Co, Shanghai) levitettiin vaikutuksen analysoimiseksi on-miR-526b on psiCHECK-2-lincRNA-rs8506 reportterigeenejä

in vitro

. 293T tai HGC-27-solut ympättiin 24-kuoppalevyille (1 x 10

5 solua kuoppaa kohti) ja viljeltiin 60-70% konfluenssiin ennen transfektiota; Sitten solut transfektoitiin reportteri Edellä kuvatut plasmidit käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA), kuten aiemmin on kuvattu [25]. Kuhunkin kuoppaan, co-transfektio suoritettiin käyttäen 800 ng plasmidin DNA: ta ja 0, 1, tai 40 pmol microRNA on-miR-526b matkii (Shanghai GenePharma Co., Ltd.), ja tai ilman 40 pmol on-miR -526b estäjä, mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin Dual-Luciferase Reporter määritystä (Promega, Madison, WI, USA) käyttäen TD-20/20 luminometrillä (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA, USA), ja tulokset normalisoitiin suhteessa aktiivisuus

Renilla

lusiferaasigeeniin. Jokainen ryhmä mukana 6 rinnakkaisnäytteiden ja itsenäinen kolmena kokeet suoritettiin.

ilmentämisvektori Hakemisto Rakentaminen

lisätutkimuksia roolin

lincRNA-NR_024015

syövän etenemiseen, täysikokoisen cDNA

lincRNA-NR_024015

kätkeminen rs8506G ja rs8506A alleelien syntetisoitiin Genewiz Company (Suzhou, Kiina) ja sitten kloonattiin pcDNA3.1 vektoreihin. Tuloksena rakentaa kanssa

lincRNA-NR_024015

rs8506 SNP (pcDNA-lincRNA-rs8506G ja pcDNA-lincRNA-rs8506A) varmistettiin sekvensoimalla.

RNA: n eristäminen ja kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

Kolmekymmentäkaksi NCGC kudosnäytteet saatiin koepaloja yksittäisten potilaiden ja säilytettiin -80 ° C: ssa ennen analyysiä. Kokonais-RNA saatiin näistä syöpäkudokset kanssa TRIzol reagenssilla (Molecular Research Center, Inc.). cDNA tuotettiin mRNA: sta, käyttäen satunnaislukua aluketta ja Superscript II (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) suoritettiin määrällisesti suhteellisen geeniekspression

lincRNA-NR_024015

, käyttäen ABI Prism 7500 Sequence Detection järjestelmän (Applied Biosystems), joka perustuu SYBR vihreä menetelmää, ja

GAPDH

käytettiin sisäisenä viitteenä geenin kussakin reaktiossa.

Cell Näkyvyys määritys

96-, tasapohjaisille levyille (BD Biosciences, Bedford , MA), 100 ui HGC-27-solut kotransfektoitiin pcDNA-lincRNA-rs8506SNP ja on-miR-526b tai ohjaus jaettiin osiin kuhunkin kuoppaan. Solujen elinkelpoisuus mitattiin Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratory, Kumamoto, Japani), joka perustuu valmistajan ohjeita.

Tilastollinen analyysi

Erot jakaumat valittujen Taustamuuttujat tapausten ja kontrollien välillä, sekä alleeli ja genotyyppi taajuudet arvioitiin kaksipuolinen chi-neliö kokeet. Ehdoton logistinen regressio malleja käytettiin arvioitaessa yhdistysten genotyyppien SNP kanssa mahalaukun syövän riski mukaan kertoimet suhdeluvut (OR) ja niiden 95% luottamusväli (CI), jonka jälkeen jaottelu analyysi iän, sukupuolen, tupakoinnin ja juomisen tila. Regressiomalli käytettiin trendi testissä, sekä arvioimaan mahdollisia kerrannaisvaikutuksia ja lisäaine geeni-geeni ja geeni-ympäristötekijä vuorovaikutusta. Lisäksi tiedot olivat edelleen ositettu alaryhmien klinikan-patologinen muuttujia. Tilastollinen teho laskettiin soveltamalla PS ohjelmisto (https://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSampleSize, näytetty 14 joulukuu 2010). Yksisuuntainen ANOVA testiä käytettiin vaikutuksen arvioimiseksi eri SNP on

lincRNA-NR_024015

transkriptin ilme. Kaikki testit olivat kaksipuolisia käyttämällä SAS-ohjelmistoa (versio 9.1, SAS Institute, Cary, NC, USA).

P

0,05 käytettiin kriteerinä tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

genotyypit ja riski kuin cardia mahasyövän

Tässä tutkimuksessa viisi SNP genotyypattiin tapausten ja kontrollien välillä. Kuten on esitetty taulukossa 2, on merkittävä yhdessä NCGC riski havaittiin rs8506G 0,05). Siten voimme päätellä, että geneettinen muunnos rs8506G polymorfismi

lincRNA-NR_024015

näyttelee merkittävästi osallisena välittämässä riskiä NCGC.

ositus Analyysi Rs8506G genotyypit ja vaara NCGC

lisäksi suorittaneet kerrostuminen analyysi assosiaatiot variantin genotyyppien ja riski NCGC mukaan alaryhmien kliinis piirteitä NCGC tässä tutkimuksessa. Kuten taulukosta 3, merkittävä assosiaatio variantin genotyyppien ja riski NCGC havaittiin henkilöillä, joilla on tupakoinnin (säädetty OR = 2,48, 95% CI = 1,63-3,78, tasalaatuisuus testi

P

= 0,001) , mikä viittaa siihen, että tupakointi moduloi assosiaatiota

lincRNA-NR_024015

rs8506G muunnos genotyypit ja riski NCGC. Mitään merkittävää yhdistys löytyi muiden alaryhmien.

Cellular karakterisointi

LincRNA-NR_024015

tasot ydinvalvonnasta transkriptin (

U6

), sytoplasminen ohjaus transkripti (

GAPDH

mRNA), ja

lincRNA-NR_024015

arvioitiin RT-qPCR ydin- ja sytoplasman murto HGC-27-soluissa, vastaavasti. Tulokset osoittivat, että

GAPDH

mRNA yksinomaan havaittu solulimafraktio, kun taas ydin-säilyttänyt

U6

todettiin pääasiassa löydetty tumafraktios-. Ja

lincRNA-NR_024015

ilmentyminen oli pääasiassa sytoplasmista (kuvio 1 B).

In silico

Analyysi vaikutus Rs8506G A

LincRNA-NR_024015

Folding

Käyttämällä RNAfold ja SNPfold algoritmeja

in-silico

analyysi, ennustimme paikallisia rakennemuutoksia on

lincRNA-NR_024015

aiheuttama rs8506G polymorfismi sijaitsee eksoni alueella

lincRNA-NR_024015

. Kuten kuviossa 1C on esitetty ja D tulokset viittaavat siihen, että G: n pohja muutos rs8506G genotyypit vaikutus

LincRNA-NR_024015

Expression häiritsemällä sitoutuminen Has-miR-526b

in vitro

Kaksi lusiferaasireportterigeenillä konstruktioita sisälsi rs8506G tai alleelin analysoitiin ohimenevästi kotransfektoimalla kanssa matkivat ja estäjä on-miR-526b, jotka ensi kädessä sitoutuminen rs8506G polymorfiselle by bioinformatiikan analyysi. Tuloksena lusiferaasin aktiivisuuden osoitti, että HEG-27-soluihin väliaikaisesti kotransfektoidaan on-miR-526b matkii ja rakentaa sisältävät rs8506G alleeli esiintyi merkittävästi vähentää lusiferaasiaktiivisuuden, pitoisuudesta riippuvalla tavalla, ja on-miR-526b estäjät merkittävästi päinvastaiseksi ja voimistuvan toimintaansa. Ei kuitenkaan selvää muutosta havaittiin reportterigeenin A alleeli käsiteltiin on-miR-526b jäljittelee tai inhibiittorit (

P

0,05) (kuvio 2A). Samat tulokset havaittiin myös silloin, kun nämä kokeet toistettiin käyttämällä 293T-soluja (kuvio 2B).

edustaja kuvaaja lusiferaasin aktiivisuuden variantin alleelin lusiferaasireportteri- geenejä, joissa on

lincRNA-NR_024015

eksoni-alue ulottuen 160 emäsparin reunustavat rs8506G polymorfismi segmenttien HEG-27 (A) ja 293T-solut (B). Tulokset on esitetty prosentteina suhteessa lusiferaasiaktiivisuutta (Renilla lusiferaasiaktiivisuus mitattiin ja normalisoitiin tulikärpäsen lusiferaasi). Suhteellinen lusiferaasin aktiivisuus psiCHECK-2-

lincRNA-NR_024015

-G-alleeli psiCHECK-2-

lincRNA-NR_024015

-A-alleeli konstruktioita kotransfektoitu on-miR-526b matkivat ja estäjä. Kuusi rinnakkaista kunkin ryhmän ja koe toistetaan vähintään kolme kertaa. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM. Tähti osoittaa merkittävä muutos (

P

0,001). (C)

LincRNA-NR_024015

ekspressiotasot kolmekymmentäkaksi ei-cardia mahasyöpäpotilaista eri rs8506G genotyyppien (15 rs8506GG, 11 rs8506AG ja 6 rs8506AA); tiedot ovat keskiarvo ± keskivirhe keskiarvon. (D) HEG-37-solut kotransfektoitiin pcDNA-lincRNA-rs8506G tai pcDNA-lincRNA-rs8506A kanssa on-miR-526b. 24 tunnin kuluttua solut kerättiin, RNA uutettiin ja reaaliaikaisen PCR suoritettiin. Tiedot ovat keskiarvo ± keskivirhe keskiarvon. ”Tähti” edustaa

P

0,05. (E) Cells ”leviämisen osuus oli merkitsevästi esti kun solut cotranfected

lincRNA-NR_024015

, jotka sisälsivät rs8506G alleeli on-miR-526b. Solujen lisääntyminen suoritti solunelinkykyisyysmääritys ja vaikutus tuli ilmi päivä 2. Kuusi rinnakkaista kunkin ryhmän ja koe toistetaan vähintään kolme kertaa. Tiedot ovat keskiarvo ± keskivirhe keskiarvon. ”Tähti” edustaa

P

0,05.

Association of Rs8506G genotyypit kanssa

LincRNA-NR_024015

Expression

Keräsimme 32 kasvaimen kudokset käsittelemättömän NCGC potilailla, joilla on eri genotyypit ja suoritettiin reaaliaikainen PCR-vaikutusten arvioimiseksi on

lincRNA-NR_024015

rs8506G A

lincRNA-NR_024015

ilmentymistä. Tulos osoitti, että potilailla, joilla on rs8506AG ja rs8506AA genotyypit ilmaisivat merkittävästi suurempi

lincRNA-NR_024015

mRNA-tasot (keskiarvo ± SEM) verrattuna kantajia rs8506GG genotyyppi (AG: 0,029 ± 0,005, AA: 0,040 ± 0,005; GG: 0,019 ± 0,004;

P

= 0,023), kuten kuvioissa 2C.

Vaikutus miRNA-riippuvaisen asetus

LincRNA-NR_024015

Expression soluproliferaatioon

Tutkimme lisäksi, onko

lincRNA-NR_024015

rs8506G genotyyppien seurata vaikutuksia soluproliferaatiota

vitro

. Kuten kävi ilmi, kuviossa 2D,

lincRNA-NR_024015

ilmentyminen väheni 24 h transfektion soluihin väliaikaisesti kotransfektoitiin pcDNA-lincRNA-rs8506G ja on-miR-526b verrattuna ko-transfektoitiin pcDNA-lincRNA- rs8506A ja on-miR-526b (

P

0,001). Solujen vähentynyt ilmentyminen

lincRNA-NR_024015

oli heikko solujen kasvu verrattuna transfektoiduissa soluissa pcDNA-lincRNA-rs8506A ja on-miR-526b päivästä 2 (

P

= 0,004 ) (kuvio 2E).

Dicussion

Tässä sairaalan johdolla tapauskontrollitutkimuksessa sisälsivät yhteensä 438 potilasta ja 727 tervettä verrokkia, ryhmämme löysi rs8506G A liittyy riskit NCGC. Tuloksemme osoittivat, että kohteet kuljettavat rs8506AG ja rs8506AA genotyyppien ollut merkittävä lisääntynyt riski NCGC verrattuna GG genotyypin (

P

0,05). Lisäksi ilmeni, että korkean riskin vaikutus tämän polymorfismin oli selvempi tupakoinnin aiheista. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus kattavasti arvioida assosiaatiota variantit eksoni on lincRNA ja riskin NCGC.

Toisena luokan sääntely ei-koodaavaa RNA: iden, lincRNAs, juuri muuttanut eturintamassa ei-koodaava RNA tutkimus. Nämä mRNA-molekyylit, joilta puuttuu merkittävä avoimen lukukehyksen, yleensä rajattu, saumattu ja polyadenyloitu ovat sekaantuneet monenlaisia ​​solun prosesseja, kuten ydin- arkkitehtuuri, geeniekspression säätelyä, immuunivalvonnan tai alkion kantasoluilla pluripotentti-. Kourallinen tutkimukset ovat osoittaneet lincRNAs Uutena näkökulma biologian eri sairaustiloissa, ja muutokset ekspressiotasot lincRNAs voivat edistää syövän biologian transkription, transkription jälkeisellä ja epigeneettiset tasolla [18], [30] – [32]. Yksi merkittävä lincRNA,

ANRIL

, oli toiminnallisesti liitetty syövän etenemisen, tyypillisesti tukahduttaa epigeneettiset geenien ilmentymisen sitoutumalla ja rekrytointi chromatin muokkaamalla kompleksit [33], [34]. Toinen kuuluisa esimerkki on lincRNA,

GAS5

; geneettisten poikkeavuuksien tässä lincRNA lokuksessa on havaittu monissa kasvaintyypeissä, mukaan lukien melanooma, rinta-, ja eturauhassyövät [35] – [37]. Nämä linjat todisteet tukevat tärkeydestä lincRNAs Solubiologian ja syövän synnyn. Äskettäin kaksi GWASs on raportoitu osajoukko NCGC herkkyys loci (5p13.1, 3q13.31, 8q24.3, 6p21.1 ja 7p15.3), joka liittyy kehityksen NCGC. Bioinformatiikan analyysi paljasti useita lincRNAs suljettu näihin loci. Lisäksi useat asiaa yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) sijaitsee eksoni alueilla lincRNAs jotka voivat yhdistää NCGC tunnistettiin. Kuten me kaikki tiedetään, viime vuosikymmenen aikana, saatavuuteen laajamittaisten RNA sekvensoinnilla, se on nyt tulossa huomattavan selvää, että tuhannet sairauteen liittyvien geneettisiä variantteja asunut ulkopuolella geenien tai jopa ei-koodaava selostukset on jo saatu Genome Project nisäkkäillä [24]. Viimeaikaiset kehittyvien todisteita ovat osoittaneet yhdistyksen välillä SNP asunut lincRNAs ja ihmisen syövissä. Esimerkiksi, perustuen 1000 Genomes tiedot, Guangfu Jin ja colleages ovat havainneet, että alueet lncRNA oli SNP: tiheys samanlainen proteiinia koodaavien alueiden ja edelleen selityksin fenotyypin liittyvän SNP: iden raportoitu GWAS on lncRNA alue voi edistää eturauhasen riski [ ,,,0],38]. Eräs viimeaikainen tutkimus myös, että geneettistä vaihtelua on

lincRNA-uc003opf.1

geeni liittyy suurentunut riski sairastua ruokatorven okasolusyöpä Kiinan väestö [39]. Yhdessä nykyisen tutkimus on yhdenmukainen aiempien päätelmien mukaan

lincRNA-NR_024015

oli kohtalaisen runsaampaa sytoplasmassa kuin tumassa fraktioitua mahalaukun syöpäsoluja, mikä viittaa siihen, että tehtävä tämän lincRNAs kohdistuu sytoplasmassa . Tuloksemme tarjosi vahvan riittävässä hypoteesia varten sytoplasman sääntelyä, jossa

lincRNA-NR_024015

rs8506G SNP voi vaikuttaa ilmaus tämän lincRNA muokkaamalla sitoutumiskohdan on-miR-526b.

Tässä tutkimuksessa, meidän tulos yhdistyksen välillä geneettisen polymorfismin eksoni alueisiin lincRNA ja alttius NCGC oli aluksi saatu Chinese populaatioissa. Suhteellisen suuri otoskoot käytetään pienensi syrjäisimpien alueiden, jotka voidaan havaita tilastollisesti. Lisäksi olemme saavuttaneet tutkimus teho on yli 90% (kaksipuolinen testi, α = 0,05) havaitsemisessa OR = 1,28 varten rs8506AG + AA genotyyppien (esiintyi 42,5% keskuudessa kontrollit), verrattuna rs8506GG genotyyppi. Huomattavaa on, että yhdistys on biologisesti uskottava ja on sopusoinnussa havaintojen meidän toiminnallisten tutkimusten.

Yhteenvetona tämän tutkimuksen toimittanut ensimmäiset todisteet että geneettinen polymorfismit eksoni alueilla lincRNAs keskeisessä asemassa välittämisessä yksittäisissä alttius NCGC. Tuloksemme tukevat edelleen hypoteesia, että geneettiset variantit lincRNA eksoni alueet voivat vaikuttaa microRNA-säätelyyn ja liittyy riski GC. Meidän havainnot takaa validointi suurempi, mieluiten väestöpohjainen, tapausverrokkitutkimukset, sekä hyvin suunniteltu mekaaniset tutkimukset.