Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Keuhkosyöpä edelleen johtava syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti. Radioresistance keuhkosyövän soluissa johtaa kohtuuttoman suuri osuus paikallista alueellista vika. Vaikka säteilyn tiedetään aiheuttavan apoptoosia, meidän tuore tutkimus osoitti, että knockdown proapoptootti- proteiinien Bak ja Bax johti lisääntymiseen autophagic solukuoleman ja keuhkosyövän radioherkkyyttä

in vitro

. Tutkimaan edelleen mahdollisuuksia apoptoosin esto keinona herkistää keuhkosyöpä terapiassa, testasimme M867, uusi kemiallinen ja palautuvia kaspaasi-3-estäjällä, yhdistelmänä ionisoivan säteilyn

in vivo

ja

vuonna vitro

.

menetelmät ja havainnot

M867 vähennetään klonogeeniset hengissä H460 keuhkosyövän soluja (DER = 1,27, p = 0,007) verrattuna vehikkelillä käsiteltyjen käsitellyt solut. Huomasimme, että anto M867 ionisoivalla säteilylle

in vivo

hiiren takajalan keuhkosyöpä malli oli hyvin siedetty, ja tuotti merkittävän kasvaimen kasvun viivästyminen verrattuna säteilyn yksin. Dramaattinen väheneminen kasvaimen verisuonistossa havaittiin M867 ja säteilyn avulla von Willebrand -tekijän värjäystä. Lisäksi Ki67 indeksi osoitti 5-kertainen pieneneminen kasvaimen leviämisen yhdistelmähoitoa saaneiden ryhmässä, vaikka alenemisesta apoptoosin havaittu terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasilla välittämää dUTP nick end merkintöjä värjäystä. Sädeherkistävä vaikutus M867 estämällä caspases validoitiin

avulla

kaspaasi-3 /-7 double-pudotuspelit (DKO) hiiren alkion fibroblasteissa (MEF) solumallin. Yhdenmukaisesti aiempien tutkimuksessa, autophagy osaltaan mekanismin lisääntyneen solukuoleman jälkeen apoptoosin inhibitioon. Lisäksi Matrigel määritys väheni

in vitro

endoteelin tubulussolujen muodostumisen aikana M867 /säteily yhdistelmähoitoon.

Johtopäätökset

M867 parantaa sytotoksista säteilyn vaikutuksia keuhkojen syöpä ja sen verisuonisto sekä

in vitro

ja

in vivo

. M867 on mahdollista pidentää kasvaimen kasvun viivästyminen estämällä kasvaimen proliferaatiota. Kliiniset tutkimukset ovat tarpeen selvittää mahdollisuuksia tämän yhdistelmän potilailla, joilla on paikallisesti edennyt keuhkosyöpä.

Citation: Kim KW, Moretti L, Lu B (2008) M867, Novel selektiivinen kaspaasi-3 Parantaa solukuoleman ja Ulottaa tuumorikasvun viivästyminen Irradiated Keuhkosyöpä mallit. PLoS ONE 3 (5): e2275. doi: 10,1371 /journal.pone.0002275

Toimittaja: Mark R. Cookson, National Institutes of Health, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 helmikuu 2008; Hyväksytty: 17 huhtikuu 2008; Julkaistu: toukokuu 28, 2008

Copyright: © 2008 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee osittain Yhdysvaltain National Cancer Institute (NCI) Grant 1R01 CA125842-01A1. Rahoittajat ollut mitään roolia suunnittelussa ja tutkimuksen tekeminen, että tietojen kerääminen, analysointi ja tulkinta, ja päätös julkaista, hyväksyntää tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin syöpä maailmassa, ja suurin syy syöpään liittyvää kuolleisuutta huolimatta multimodaalisuudesta terapia, jolloin 160390 arvioitiin kuolemista Yhdysvalloissa vasta vuonna 2007 [1]. Koska kasvain vastus rajat tehokkuutta Nykyisten hoitojen [2], [3], [4], kuten sädehoito, tunnistaminen uusien terapeuttisten strategioiden on kriittinen parantaa lopputulosta. Eri solukuoleman prosessien syövän hoidossa, apoptoosin on kaikkein hyvin tutkittu [5]. Apoptoosin aikana, suuria välittäjiä solujen tuhoutuminen ovat efektoreja kaspaasi-3 ja -7, jäsenet kysteiinin aspartaatti proteaasit perhe, jotka pilkkovat proteiineja jälkeen aspartaattitähteen [6]. Vaikka säteilyn tiedetään aiheuttavan apoptoosia, mutta se osuus pieni osa solukuoleman säteilytetty kiinteitä kasvaimia [7], ja meidän tuore tutkimus osoitti, että knockdown proapoptootti- proteiinien Bak ja Bax johti lisääntymiseen keuhkosyövän radioherkkyyttä

in vitro

[8]. Autophagy, ei-apoptoottisen solukuoleman tyyppi, osoitettiin osaltaan mekanismin lisääntyneen solukuoleman.

Autophagy on evoluutiossa konservoitunut prosessi ja selviytymismekanismi mahdollistaa kierrätyksen pitkäikäisen organellit ja proteiinit [ ,,,0],9], [10]. Autophagy toimii myös itsemurha polku täysin itsestään ruoansulatusta mukaisesti liiallisen rasituksen olosuhteissa [11], [12], joka on luokiteltu ohjelmoidun solukuoleman Type 2 [9], [10]. Aikana autophagy, organelle hajoaminen tapahtuu muodostamalla sytoplasmisen kaksinkertainen kalvo vacuoles, nimeltään autophagosomes ehjillä ytimet [13]. Autophagy sääntely on ollut kasvavaa kiinnostusta, koska sen vaikutuksia kasvainten synnyssä. Lisäksi, pitkittynyt autophagy voi johtaa syöpäsolun kuoleman, mikä johtaa olettamukseen, että autophagy voidaan hyödyntää syövän hoidossa tavoite [14], [15], [16], [17].

edelleen tutkia mahdollisuuksia apoptoosin esto keinona herkistää keuhkosyöpä terapiassa, testasimme M867, uusi kemiallinen ja palautuvia kaspaasi-3-estäjällä [18], yhdistettynä ionisoivan säteilyn

in vivo

ja

in vitro

.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ensisijainen hiiren alkion fibroblasteja (MEF) olivat peräisin villityypin (WT) ja Caspase3

– /- /7

– /- kaksoispoistuma (DKO) hiiret ja kuolemattomiksi transfektiolla plasmidilla, joka sisälsi SV40-T-antigeenin (saatu Dr. Richard Flavell, Yale University, New Haven, CT). MEF-solut viljeltiin DMEM: ssä (Invitrogen Corporation), johon oli lisätty 10% naudan sikiön (FBS), 1% penisilliini-streptomysiiniä ja 0,5 umol /l 2-merkaptoetanolia. H460 keuhkosyövän soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä (Invitrogen, Grand Island, NY) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini-streptomysiinillä 37 ° C: ssa ja kostutetussa 5% CO2: ta. HUVEC saatiin Clonetics ja pidettiin EBM-2 jota on täydennetty EGM-2 MV single erät (BioWhittaker). M867 saatiin Merck Co., Inc.

klonogeeninen määritys

H460 keuhkosyövän soluja käsiteltiin DMSO: lla tai M867 (1,4 nM, 5 nM, ja 10 nM ja 24 tuntia); WT MEF-solut ja kaspaasi 3/7 DKO MEF-soluja käsiteltiin DMSO tai M867 (5 nM ja 10 nM varten 24h); ja MEF-soluja käsiteltiin siRNA: t vastaan ​​kaspaasi-3 ja-7, siRNA: t vastaan ​​Beclin-1 ja ATG5 tai valvontaa. Sitten solut säteilytettiin 0-6 Gy kuten annoksella noin 1,8 Gy /min, käyttäen on

137 Cs säteilyttäjällä (J. L. Shepherd ja Asssociates, Glendale, CA). Säteilytyksen jälkeen soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 8-10 päivää. Solut kiinnitettiin 15 minuuttia 3: 1 metanoli: etikkahappo ja värjättiin 15 minuuttia 0,5%: lla kristallivioletilla (Sigma) metanolissa. Värjäyksen jälkeen pesäkkeet laskettiin käyttäen cutoff 50 eläviä soluja. Eloonjääntifraktio laskettiin (keskiarvo pesäkeluvut) /(solut ympättiin) x (plating tehokkuus (PE)), jossa PE määriteltiin (keskiarvo pesäkeluvut) /(solujen ympätty varten ei säteilytetty tarkastukset). DER laskettiin annos (Gy) säteilyn yksin jaettuna annos (Gy) säteilyn plus M867 (normalisoitu M867 myrkyllisyys) tarpeellisina eloonjääntifraktio 0,25. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja keskiarvo, SD ja P-arvot laskettiin.

Immunoblottausmääritys

Solut (0,5 x 10

6) käsiteltiin erilaisilla Gy ja huumeita. Ne on kerätty eri ajankohtina, ja sitten pestiin jääkylmällä PBS: llä kaksi kertaa, ennen kuin lisättiin lyysipuskuria (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, 1% NP40, 50 mM NaF, 1 mM Na3Vo4, 1 mM NaMO4 ja cocktail-inhibiittori (Sigma, 5 ui /ml). Proteiinipitoisuus määritettiin kvantitatiivisesti Bio-Rad-menetelmällä. Yhtä suuret määrät proteiinia panostettiin kuhunkin kuoppaan ja erotettiin 12,5% SDS-PAGE-geelissä, minkä jälkeen siirto PVDF-kalvoja ( BIO-RAD). Kalvot blokattiin käyttämällä 5% rasvatonta kuivamaitoa PBS-T 1 h huoneen lämpötilassa. blotit inkuboitiin sitten kaspaasi-3 (Soluviestintä), Kaspaasi-7 (Soluviestintä); LC-3 (Medical Biological Laboratories Co. Ltd), Akt, fosfo-Akt (Ser-473), S6 ribosomaalinen proteiini, ja fosfori-S6 ribosomaalinen proteiini (Ser-240/244) (Cell Signaling) ja Actin vasta 1 tunti 4 ° C. Vuohen anti-kani-IgG toissijainen (1: 5000, Santa Cruse Biotechnologies) inkuboitiin 45 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Immunoblotit kehitettiin käyttäen kemiluminesenssidetektiojärjestelmää (PerkinElmer) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti ja autoradiografialla.

mittaus Apoptosis

Solut (2,5 x 10

5) maljattiin 10 mm ruokia datapisteen. Kun oli kulunut 24 h 37 ° C: ssa inkuboinnin jälkeen H460-soluja käsiteltiin M867 (100 nM: ssa 2 tuntia) ja välittömästi säteilytettiin 5Gy, 10Gy tai 20Gy, ja WT ja Caspase3

– /- /7

– /- DKO soluja säteilytettiin 5Gy tai 10Gy. 24 tunnin kuluttua solut käsiteltiin 1 ml Accutasella (pitämällä kaikki kelluvat solut) ja 4 min ja laskettiin sitten kullekin näytteelle. Solut sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen 1 x Binding Buffer pitoisuudessa ~ 1 x 10

6 solua /ml. 100 ui liuosta (~ 1 x 10

5 solua) siirrettiin 5 ml: ssa FACS-putkessa, lisättiin 1,2 ui anneksiini V FITC ja 1,2 ui PI. Kun oli inkuboitu 30 minuuttia huoneenlämpötilassa pimeässä, 400 ui 1 x Sitova puskuri lisättiin kuhunkin putkeen. Määrä apoptoosi mitattiin käyttäen anneksiini V-fluoreseiini-isotiosyanaatti apoptoosin detektioreagenssipakkaus I (Pharmingen) kanssa virtaussytometrialla.

Autophagy Pitoisuus

MEF-soluihin transfektoitiin 2,5 ug: GFP-LC3 ilmentymisen plasmidi (lahja tri Norboru Mizushima) [19] käyttäen Lipofectamine-reagenssia (Invitrogen Life Technologies). 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin 5Gy säteilyn kanssa tai ilman annoksen M867. 24 tunnin kuluttua ja 48 h, fluoresenssi GFP-LC3 havaittiin konfokaali läpivalaisun.

siRNA Transfektio

siRNA vastaan ​​hiiren kaspaasi-3 ja-7, Beclin, ja ohjaus siRNA ostettiin Santa Cruz Biotekniikka. siRNA ATG5 (hiiri) syntetisoitiin Dharmacon Research. Sense- ja antisense-juosteet ATG5 aloitettiin nukleotidin 5′-AACUUGCUUUACUCUCUCAUCAUU-3 ’(sense) ja 3′-UUUUGAACGAAAUGAGAGAUAGU-5’. (Antisense) Solut transfektoitiin 25 nM siRNA: iden käyttämällä LipofectAMINE 2000 transfektoituja soluja käytettiin kokeisiin 24 tunnin kuluttua.

endoteelisolujen Morphorgenesis määritys: kiemuratiehyessä Formation

HUVEC kasvatettiin -70% konfluenssiin käsiteltiin 5 nM M867, 3GY tai yhdistelmähoitoa. Sitten solut trypsinoitiin ja laskettiin. Ne ympättiin 48000 kuoppaa kohti 24-kuoppaisille levyille päällystettiin 300 ul: Matrigel (BD Biosciences). Nämä solut läpikäyvät erilaistumista kapillaarimaisen putkirakenteissakin ajoittain havaita mikroskoopilla. 24 myöhemmin solut värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H baareja, SD (

P

= 0,007). Näkyy ovat keskiarvo +/- keskihajonta kolmesta erillisestä kokeiden toisto. (B) anneksiini-V-määritys osoittaa apoptoosin taso H460: lla käsiteltyjen solujen joko ohjaus, 100 nM M867: ssa 2 tuntia, säteily (5, 10 tai 20 Gy), ja molemmat modality. Tämä tehtiin kolmena kappaleena ja keskiarvo kolmesta syystä laskettiin. Pylväät, keskiarvo; baareja, SD.

Yhdistetty M867 /sädehoitoa pidentää kasvaimen kasvun viivästyminen ja on hyvin siedetty keuhko ksenograftimallia

Todettuaan tehokkuus

in vitro

varten M867 aiheuttama säteilylle herkäksi keuhkosyöpään solujen, hiiren takaraajojen ksenograftimallissa syntyi tutkia säteilyn vastaus M867

in vivo

. H460 keuhkosyövän solut injektoitiin subkutaanisesti kateenkorvattomiin nude-hiiriin, ja kasvainten annettiin kasvaa noin 7 päivää tuottaa kasvaimen keskimääräinen tilavuus 0,25 cm

3 ennen hoitoa. Hoitoryhmien koostui ajoneuvon hallinnan, M867, ajoneuvon plus säteilyä, ja yhdistelmä M867 plus säteilyä. M867 annettiin päivittäin 2 mg /kg vatsaonteloon 7 peräkkäisenä päivänä. Takajalkojen H460 kasvain hiirissä käsiteltiin kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Kasvun viivästyminen laskettiin päivien tarvitaan saavuttamaan kasvaimen 2 cm

3 hoitoryhmissä suhteessa kontrolliin kasvaimia. Kuten kuviossa 2A on esitetty, merkittävä tuumorin kasvun viivästyminen nähtiin yhdistelmähoidon M867 ja säteilyn verrattuna sädehoidon (26 vs. 20 päivää, p 0,005), ja M867 yksin ei vaikuttavat merkittävästi myös kasvaimen kasvua verrattuna kontrolliin (~ 4 päivää viive, p = 0,003). Tämä viittaa siihen, että M867 voisi lisätä tuumorivaste yhdessä sädehoidon. Lisäksi, kehon painon muutokset olivat myös seurataan hiirillä arvioida, onko hoito M867, säteilyä tai yhdistelmähoito tuotti systeemisen toksisuuden (kuvio 2B). Vain minimaalinen laihtuminen nähtiin 10 päivän kuluessa yhdistetyn M867 ja sädehoitoa. Painon muutoksia tämän ajanjakson jälkeen näkyy kasvaimen kasvua. Kuten odotettua, yhdistelmä hoitoryhmässä, mikä oli eniten pitkittynyt kasvaimen kasvun hidastuminen, oli pienin painon nousu.

H460 keuhkosyövän soluja ksenosiirrettyjä ihonalaisesti kateenkorvattomissa hiirissä. Jälkeen 6-8 päivää, hiiriä käsiteltiin päivittäin 7 päivää, ajoneuvon ohjaus, M867 (2 mg /kg), ja sen jälkeen käsiteltiin 1 tunnin kuluttua lääkkeen hoidon 2 Gy säteilyn päivittäin yli 5 päivän ajan. Kasvain leikattiin kun saavutettu kooltaan noin 2,5-3,0 cm

3 ja kasvaimen kasvun viivästyminen määrittelemät päivien tarvitaan saavuttamaan kasvaimen 2 cm

3 mitattiin. (A) Kasvaimet mitattiin säännöllisesti ja kasvun viivästyminen laskettiin hoitoryhmissä suhteessa kontrolliin kasvaimia. Yhdistetty bi liikennemuotojen hoidon aiheuttama selvästi kasvaimen kasvun viivästyminen verrattuna säteilyllä yksin (26 vs. 20 päivää, p 0,005). (B) Kehon painot mitattiin 5 päivän välein ja painon suhde laskettiin suhteessa lähtötasoon verrattuna.

M867 vähentää kasvaimen leviämisen indeksin huolimatta vähentyneen merkittävästi apoptoosin säteilytetty H460 hiiren ksenografti

määrittämiseksi mekanismi, joka edistää kasvaimen kasvua viivytystä yhdistelmähoidosta, Ki67 proliferatiivinen indeksi tutkittiin kiinteillä H460 tuumorisektioiden kaikissa hoitoryhmissä. Kuten kuviossa 3A on esitetty, M867 ja säteilyn yhdistelmän hoito johti 6-kertainen (15% vs. 92%, p 0,001) ja 2-kertainen (15% vs. 33%, p 0,001) vähenemiseen jakautuviin soluihin verrattuna kontrolliin ja säteily yksin ryhmiä, vastaavasti. Me seuraavaksi arvioidaan apoptoosin tasoa kiinteiden H460 kasvainleikkeissä käyttämällä TUNEL värjäystä. Kuten kuviossa 3B on esitetty, käyttämällä TUNEL värjäys yhdistetty M867 ja säteily-hoito johti kahden kolmasosan väheneminen apoptoosin (4,5% vs. 15%, p 0,008), verrattuna säteilyn yksin.

histologisen osat saatiin kasvaimia hiiristä kussakin hoitoryhmässä päässä kasvaimen tilavuus tutkimuksessa. Positiivisten solujen pisteytettiin ja piirretään keskiarvoistamalla kolme toistuvat arvioinnit. (A) Keskimääräinen Ki67 proliferatiivinen indeksi kussakin testiryhmässä määritettiin prosenttia Ki67-positiivisten solujen kohti mikroskooppisen kenttään. Tämä toistettiin kolmesti. Pylväät, keskiarvo; baareja, SD. (B) TUNEL värjäys suoritettiin myös tuumorisektioiden, ja apoptoottisten indeksi oli niinikään laskettiin prosenttia positiivisten TUNEL värjättyä solua mikroskooppisen kenttään. Sarake, keskiarvo; baareja, SD.

M867 vähentää verisuonten tiheyden säteilytettyä keuhkojen kasvain malli ja herkistää HUVEC säteilylle

Koska kasvaimen verisuonisto on kohteena syövän hoidossa, hiiriä käsiteltiin samalla tavalla kuin kasvaimen kasvun viivästyminen tutkimus ja kiinteiden keuhkojen tuumorisektioiden määrittämiseen käytettiin vaikutusten M867 ja säteilyn kasvainten verisuonistossa

in vivo

. Diat kustakin hoitoryhmässä analysoitiin seuraavia von Willebrand -tekijän (vWF) värjäytymistä verisuonitiheydessä tutkimusta, kuten kuvassa 4A. Alusten lukumäärä per mikroskooppinen kenttä määritettiin sitten kussakin testiryhmässä. Yhdistelmähoito on M867 ja säteilyn (1,3; SD = 0,57) johti dramaattiseen 5-kertainen pieneneminen keskimäärin aluksia kohti mikroskooppisen kenttään verrattuna kontrolliin (6; SD = 1; p 0,002) ja ~2- kertainen vähennys suhteessa pelkkään sädehoitoon (2,3; SD = 0,57; p 0,007) (kuvio 4A).

(A) histologinen osat saatiin kasvain hiirtä kussakin hoitoryhmässä päässä

in vivo

kasvaimen tilavuus tutkimuksen, ja värjättiin verisuonten käyttämällä vasta-ainetta varten vWF. Verisuonet kvantitoitiin valitaan satunnaisesti 400 × kentät ja laskemalla verisuonten kenttää kohden. Tämä tehtiin kolmena kappaleena ja keskiarvo kolmesta syystä laskettiin. Pylväät, keskiarvo; baareja, SD. (B) Ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) käsiteltiin 5 nM M867 ja sitten heti säteilytetään joko 0 tai 3 Gy. Kuusi tuntia myöhemmin solut käsiteltiin trypsiinillä ja maljattiin uudelleen 24-kuoppaisille levyille päällystettiin Matrigel. 24 tunnin kuluttua solut kiinnitettiin ja värjättiin H baareja, SD.

tutkimiseksi edelleen vaikutusten M867 ja säteilyn verisuonten muodostumista, ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC) käytettiin tutkimaan tubulukset muodostumiseen angiogeneesikohtia toiminnon

in vitro

. Endoteelisolujen morphogenesis määritys tehtiin tutkia kykyä käsiteltyjen HUVEC tuottaa kapillaarimaisen putkimainen rakenteita. Edustava kuva ja keskimääräinen määrä lasketaan putkien kolme erillistä (x100) kentät on esitetty kuviossa 4B ja C, vastaavasti. Hoito M867 yhdistetään säteilylle merkittävästi vähentynyt kiemuratiehyessä muodostumista verrattuna säteilyn yksin (5,7 vs. 1,7, p 0,001). Ei hoitoa ohjaus oli 13 tubulukset (SD = 1,0) kohden mikroskooppinen kenttä ja M867 yksin oli 9 tubulukset (SD = 1,0), mikä viittaa anti-angiogeeninen vaikutus M867 lisäksi radio-herkistymistä.

Kaspaasi 3 /7 puutos edistää säteilyn herkkyyttä autophagy induktion puuttuessa apoptoosin

vahvistaa, onko inhibitio kaspaasien edistäneet sädehoitoa, kaspaasi-3/7 puutosta (DKO) MEF-soluja käytettiin. Nämä solut eivät kykene apoptoosiin, koska niiltä puuttuu kaspaasien 3/7, kun taas WT MEF voi (kuvio 5A ja 5B). Kuten kuviossa 5C esitetään, WT MEF käsiteltiin M867 olivat herkempiä säteilylle verrattuna WT MEF käsiteltiin DMSO (DER = 1,2 5 nM M867, p = 0,017, ja DER = 1,62 ja 10 nM M867, p = 0,001). Ei ollut mitään merkittävää eroa eloonjäämisennustetta kaspaasi DKO MEF käsitelty millään annoksella M867 verrattuna DMSO: hon. Lisäksi WT MEF-soluja, jotka on transfektoitu kaspaasi-3/7 siRNA esitetty myös merkittävä kasvu säteilyn herkkyys, mikä viittaa siihen, että nämä tulokset eivät johdu klonaalisen vaihtelun näiden solujen (tuloksia ei ole esitetty). Perustuen edellisessä tutkimuksessa oletamme, että tehostettu säteilyn herkkyys kaspaasi DKO solut voivat johtua vaihtoehtoisten ohjelmoitua solukuolemaa, kuten autophagy [8]. Tämän hypoteesin testaamiseksi, WT ja kaspaasi 3/7 DKO solut transfektoitiin GFP-LC3 plasmidiin. Solut, joissa pistemäinen GFP signaloinnin laskettiin kuten autophagic soluja, koska ominaisuus lysosomaalisen lokalisaation LC3 proteiinin aikana autophagy [19]. Jälkeen WT ja kaspaasi DKO solut altistettiin 5Gy säteilyn osuus solujen GFP punctates nousivat noin 3-kertaisesti säteilytettyjen kaspaasi DKO soluja, verrattuna säteilytettyjä WT-soluja (30% vs. 10%, vastaavasti) (kuvio 6A ). Klo 48 h säteilyn osuus autophagic solujen kasvoi noin 55% vuonna kaspaasi DKO soluissa verrattuna 15% WT valvontaa. Nämä tulokset vahvistettiin myös tason arvioimiseksi jalostettujen LC3 proteiinia, jossa kaspaasi DKO-solut osoittivat lisääntynyttä tasoa LC3-I ja II proteiinit säteilytyksen jälkeen, verrattuna WT-solut (kuvio 6B). Koska mTOR polku tiedetään säännellä aloittamisen autophagy, tutkimme Akt /mTOR signaloinnin määrittämällä tasot fosfo-Akt ja fosfo-S6 on säteilytetty WT ja kaspaasi DKO MEF-soluissa. Kuten on esitetty kuviossa 6C, fosfo-proteiinit kasvoi säteilytettyjen WT-solut, kun ne olivat vähentyneet säteilytettyjen kaspaasi DKO MEF-soluja. Nämä tiedot viittaavat siihen, että pro-autophagic signalointi on säädellään ylöspäin säteilytettyyn kaspaasi DKO soluja.

(A) WT ja kaspaasi 3/7 DKO MEF inkuboitiin anneksiini V-fluoreseiini ja propidiumjodidilla 24 h kuluttua säteilytys ja analysoitiin FACScan. Data on esitetty keskiarvona kolmesta kokeesta S.D. (B) Kaspaasi pilkkominen määritettiin immunoblottauksella katkaistun kaspaasi-3: sen jälkeen, kun WT tai kaspaasi 3/7 DKO MEF-soluja käsiteltiin 0, 2,5, 5, 7,5, ja 10 Gy. Solut kerättiin sen jälkeen, kun 24. (C) säteilylle herkäksi WT tai kaspaasi 3/7 DKO MEF. Solut säteilytettiin osoitetun säteilyannoksen ja käsiteltiin DMSO-kontrollin tai M867 (annosalue 5-10 nM 24 tuntia). 10 päivän jälkeen pesäkkeet värjättiin ja teki. Raportoidut arvot ovat keskiarvoja ± S.D. kolmen erillisen kokeiden toisto.

(A) GFP-LC3 transfektoidut WT tai kaspaasi 3/7 DKO MEF-soluja käsiteltiin ja ilman 5 Gy ja sitten tutkittiin fluoresenssimikroskopialla 24 tunnin kuluttua. Prosenttiosuus solujen pistemäisiä GFP-LC3 fluoresenssi laskettiin suhteessa kaikki GFP-positiiviset solut. Virhe palkit näytetään keskimääräisenä S.D. (B) LC-I ja -II ilmentyminen määritettiin Western blot käyttämällä lysaatit WT ja kaspaasi 3/7 DKO MEF-soluja käsiteltiin 0 tai 5 Gy 24, 48 h. Aktiini koetettiin osoittaa yhtä suuri kuormitus. (C) näytetään myös immunobloteista fosfo-Akt ja p-S6 käyttämällä lysaatit WT ja kaspaasi 3/7 DKO MEF-solut käsiteltiin 0 tai 5 Gy 30 min. (D) WT ja kaspaasi 3/7 DKO MEF-solut transfektoitiin joko ohjaus siRNA tai 25 nM siRNA: ita vastaan ​​suunnattujen ATG5 ja Beclin-1 tai (E), jotka on transfektoitu vektorilla tai ATG5 ja Beclin-1-cDNA: n sisältävät plasmidit. Sitten ne säteilytettiin 0-6 Gy. 8 päivän jälkeen, pesäkkeet värjättiin ja teki. Arvot ovat keskiarvo ± S.D. kolmen erillisen kokeiden toisto.

Autophagy muuttaa säteilyn herkkyys kaspaasi 3/7 vajaiden solujen

Voit selvittää autophagy on mekanismi vastaa korkeampia radioherkkyyttä havaittiin kaspaasi DKO soluissa, ilme ATG-5 ja Beclin-1, kaksi olennaista autophagy proteiinit [21], [22], [23], tippuu alas villityypin ja kaspaasi DKO soluja. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että siRNA vastaan ​​Beclin-1 ja ATG-5 nimenomaan vaimentua endogeenisen proteiinin ilmentymistä [8]. Kuten on esitetty kuviossa 6D, hoitoon kaspaasi DKO solujen siRNA: t on suunnattu ATG-5 ja Beclin-1 poisti herkistävän vaikutuksen tuloksena kaspaasi-3/7 poistetaan ja aiheutti merkittävää kasvua klonogeenisten solujen eloonjääminen verrattuna kontrollieläimiin siRNA hoitoon kaspaasi DKO soluja (DER = 1,34, p = 0,008). Toisaalta yli-ilmentyminen Beclin-1 ja ATG-5 kaspaasi DKO soluissa aiheutti merkittävän kasvun klonogeeniset solukuolemaan kohdistuu kasvavia säteilyannoksen verrattuna Beclin-1 ja ATG-5 yliekspressio WT soluissa (DER = 1,32, p = 0,008) ( Kuva 6E). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että lisääntynyt radioherkkyyttä kaspaasien DKO soluissa on riippuvainen keskeinen autophagy molekyyleihin.

Keskustelu

Tässä raportissa ensin osoitti M867 hoito johti tehokasta säteilylle herkäksi keuhkojen syöpäsolut

in vitro

. Mahdollinen terapeuttisia vaikutuksia M867 sitten osoitettiin käytettäessä

in vivo

hiiren takajalan kasvain malli. In vitro kokeet osoittivat, että kaspaasi-3/7 null MEF-solut olivat herkempiä sytotoksisille säteilyn, johtuen pääosin autophagy. Tämä tutkimus viittaa myös siihen, että M867 vaikutukset verisuonistoon voivat edistää havaitusta kasvusta keuhkojen kasvaimen kasvun viivästyminen vastauksena säteilylle.

Samanaikainen kemosädehoito on tukipilari edenneen keuhkosyöpää, mutta ennuste niille potilaille pysyy maailmanlaajuisesti huono. Siksi uusia strategioita tarvitaan parantamaan nykyistä hoidon tehokkuudesta kohdentamalla ei-apoptoottisen solukuoleman koska apoptoosi on rajoitettu seuraaviin tavanomainen hoito. Viime aikoina on ollut suuri korostetaan autophagy kuin syöpähoidon kohde, osittain lähtöisin havaintojen syöpähoitoihin aiheuttama autophagy, kuten säteilytettyjä syöpäsoluissa [17], [24]. Osoitimme äskettäin, että autophagy voidaan laukaista estämällä nisäkkään kohde tai rapamysiini (mTOR) reitin [17] tai estämällä proapoptoottisten proteiinien Bak /Bax parantaa säteilyn vaikutukset

in vitro

[8]. Erittäin houkutteleva kohde on apoptoottisen reitin on kaspaasi-3, joka on keskeinen rooli apoptoosin hallitseva efektori kaspaasi mukana proteolyyttisen proteiinin substraatteja, mukaan lukien solun tukirangan proteiinit, kinaasit ja DNA: n korjaukseen entsyymejä. Tässä tutkimuksessa kartoitettiin mahdolliset vaikutukset kaspaasi-3 estoa keuhkosyöpä vastaus säteilyn avulla romaanin estäjä M867. Olemme osoittaneet, että anto M867 yhdistelmänä ionisoivan säteilyn laski dramaattisesti selviytymisen H460 keuhkosyövän soluja (kuvio 1), annoksesta riippuvalla tavalla. Huomattavaa on, että havaitsimme lisääntynyttä sytotoksisuutta pitoisuus suurempi kuin 10 nM meidän klonogeeniset määrityksessä. Kuitenkin, on osoitettu, että M867 on voimakas ja palautuva kaspaasi-3-estäjällä (IC

50 0,0001 uM), ja vähemmän voimakas kaspaasi-7-inhibiittori (IC

50 0,036 uM) [18]. Lisäksi huomasimme, että sädeherkistävä vaikutus M867 on riippuvainen kaspaasi-3 ja -7, kuten yhtiö ei ole sen vaikutus kaspaasi 3/7 DKO soluja.