Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ymmärtäminen ajureita etäpesäke ihmisen syövässä on tärkeää kehitysmahdollisuuksia hoitomuotoja etäpesäkkeitä. Rooli menetys TGFp tuumorisuppressorin toimintaa metastaattisen prosessi on pohjimmiltaan tunneta.

Menetelmät /Principal Havainnot

Hyödyntämällä

in vitro

ja

in vivo

tekniikoita, olemme osoittaneet, että menetys TGFp tuumorisuppressorin signalointi on tarpeen sallia viimeinen vaihe metastaattisen prosessin – asuttaminen metastaattisen sivuston. Tämä työ osoittaa ensimmäistä kertaa, että TGFli reseptorin saattamisen johtaa vähentyneeseen metastaattisen kolonisaation. Lisäksi olemme tunnistaneet uuden TGFli /PKA tuumorisuppressoriproteiinia polku, joka toimii suoraan tunnetun solun selviytymisen mekanismi, joka vastaa korostaa kanssa surviviiniproteiiniperheestä /XIAP riippuvainen inhibitio kaspaasien em apoptoosin. Välisen yhteyden TGFp /PKA transduceome signalointi ja valvonta etäpesäkkeiden kautta solukuoleman induktioon osoitettiin TGFli reseptori palauttaminen kanssa aktivoituminen TGFp /PKA-reitin reseptorin puutos metastasoitunut koolonkarsinoomasoluissa johtaa valvontaan poikkeavan solun eloonjäämisen.

Päätelmä /merkitys

Tämä työ vaikuttaa ymmärrystämme mahdollisia mekanismeja, jotka ovat kriittisiä kasvun ja ylläpidon etäpesäkkeitä sekä ymmärrystä romaanin TGFp toimivat metastaattinen vaimennin. Nämä tulokset esitetään mahdollisuus, että regenerointi heikennettyä TGFp signaloinnin olisi tehokas kohde hoidossa etäpesäke. Työmme osoittaa kliinistä potentiaalia kehittää anti-metastaasien hoito perustuu estoon tämän erittäin tärkeän poikkeava solu selviytymismekanismi jonka monipuolinen TGFp /PKA transduceome aiheuttama kautta. Kehittäminen tehokkaita hoitoja etäpesäkkeitä on pakottava tarve, koska etäpesäkkeet ovat merkittävä kuolinsyy kiinteiden kasvainten.

Citation: Chowdhury S, Howell GM, Rajput A, Teggart CA, Brattain LE, Weber HR, et al. (2011) Identification of a Novel TGFp /PKA Signaling Transduceome välittämisessä solujen elinajan säätelyssä ja metastaasin in Colon Cancer. PLoS ONE 6 (5): e19335. doi: 10,1371 /journal.pone.0019335

Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 helmikuu 2011; Hyväksytty: 27 maaliskuu 2011; Julkaistu: 03 toukokuu 2011

Copyright: © 2011 Chowdhury et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health myöntää CA72001 ja CA38173 kohteeseen MGB. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia, joilla on korkea ilmaantuvuus maailmanlaajuisesti [1] ja on toiseksi korkein syy syövän liittyvän kuoleman aikuisten keskuudessa Yhdysvalloissa [2]. CRC voidaan parantaa leikkauksella ja multimodaalinen hoito noin puolet yksilöiden tämän sairauden (vaiheiden I-III). Kuitenkin etäpesäkkeitä kaukaisiin elimiin (vaihe IV) on yleisin syy hoidon epäonnistumisen [2]. Viimeaikainen työ on korostanut, että on tärkeää kehitystä sopimatonta solujen selviytymisen signalointi eri vaiheiden metastaattisen prosessin. Erityisen huomionarvoista yhteydessä selviytymisen signalointi Metastasoituneessa prosessissa on merkitystä poikkeavan solun selviytymisen onnistunut kolonisaation metastaasien distaalisessa elimissä [3]. Tärkeää on, molekyylitason mekanismit alkuvaiheessa etäpesäkkeiden kriittinen diagnosoinnin ja hoidon ei ymmärretä hyvin [1]. Useat keskeiset toimijat kuten Bcl-2, estäjä-of-apoptoosin (IAP) proteiinien XIAP ja surviviinin sekä fosfoinositidi 3-kinaasi (PI3K) – AKT /PKB jotka lähettävät antiapoptooppinen signaaleja edistämisessä syöpäsolujen kasvua ovat sekaantuneet etäpesäke [4], [5].

tuumorisuppressorigeeneille (APT) edistää apoptoosin vasteena stressille. Epäonnistuminen apoptoosin indusoitumista erilaisiin solun vahinko on pitkään tunnustettu edistää kasvaimen synnyssä. Yksi esimerkki TSG menetys edistää syövän muodostumisen ja etenemisen on TGFp signalointi [2]. TGFp signalointireitin on edistänyt sekä negatiivisesti ja positiivisesti säätelyssä kasvun esto, proliferaation, replikointi, invaasio, etäpesäke, apoptoosin, immuunivalvonnan ja angiogeneesin yhteydessä riippuvaisella tavalla [6]. TGF estävä /tuumorisuppressoriproteiinia vasteita, laskivat etenemistä ja myöhäisessä vaiheessa maligniteetteja usein vioittuneet tavalla, joka tukee ja metastaasit [6]. Vaikka korruptio TGFp vastausten tueksi etäpesäkkeitä merkitsee läsnäolo funktionaaliset reseptorit näissä soluissa, on yhtä selvää, että on olemassa huomattava määrä malleja vaihtelevat siirtogeenisiä hiiriä ihmisen syövän ksenograftien osoittaa, että menetys, tai vaimennus, reseptorin ilmentymisen laajalla erilaisia ​​kasvaintyyppien johtaa lisääntyneeseen maligniteetin [7], [8], [9], [10]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että jotkut alaryhmiä syöpien ovat noudattaneet polku kohti pahanlaatuinen etenemistä muun muassa menettäisi TGFp reseptorin ilmentymisen kun taas toiset ovat, on vielä määrittelemätön muoti, väärinkäytetty TGFli signalointi ajaa pahanlaatuinen etenemistä. On useita esimerkkejä TGFp reseptorin hiljentäminen kliinisistä näytteistä osoittaa, että TGF-reseptori RI ja /tai RII (nimetty TGFβRI ja TGFpRII vastaavasti) downregulation ovat varhainen tapahtumia onkogeneesiin ja häviäminen reseptorin ilmentymisen epigeneettisellä hiljentäminen korreloi pahanlaatuinen etenemistä alaryhmiin useiden syöpien [11], [12].

Olemme osoittaneet, että TGFli signalointi varhaisessa vaiheessa ei-metastaattinen paksusuolisyöpä malli johtaa solun kuolemaan koolonkarsinoomasoluissa vastauksena stressiin yhdessä inaktivaation Pakt ja ekspressiota inhiboivan IAP-proteiinin surviviiniperäistä [13]. Kompleksin muodostuminen surviviinin ja toisen IAP proteiinin XIAP sytoplasmassa vastauksena stressiin mahdollistaa vakauttamiseen XIAP ja estämällä sen efek- ja pyöveli kaspaasi tavoitteet estävät solujen kuolemaan [14]. Siksi, koska hallitseva rooli PI3K /AKT signalointi solujen selviytymisen mekanismeja ja yhdistyksen XIAP ja surviviinille syövän etenemisessä [5], me posited häviäminen TGFp signalointi voi osaltaan parantaa XIAP /surviviinin ilmentymisen ja siten menetys TGFp signalointi voi olla avain poikkeava selviytymismekanismi salliessa metastaattista kasvua distaalisessa elinkohdissa toisin kuin nykyiset että TGFli TSG on ensisijaisesti portinvartija estämään kasvaimen synnyssä.

TGFli signalointi on osoitettu aktivoivan cAMP- riippuvainen proteiini Kinase A (PKA) [15]. PKA on hallitseva rooli integrointi useiden signaalitransduktion verkkoja [16] mukaan luettuna kyky häiritä XIAP /surviviiniperäistä kompleksin kautta fosforylaation surviviinin on Ser

20 [17].

molekyylitason mekanismeja että TGFp välittämää downregulation IAP tutkittiin, jotta voidaan määrittää vaikutusten TGFp reseptorin signalointi on etäpesäkkeitä on metastasoitunut potilaalle tehdä mallin paksusuolen syöpä. Nyt raportoivat tunnistamisen uusi TGFp /PKA /AKAP välittämä transduceome että suppenee XIAP toiminto säätelyssä poikkeavan solun selviytymistä. Lisäksi olemme osoittaneet, että TGF-reseptori pelastus erittäin metastaattinen solujen epigeneettisellä vaiennettu TGFp reseptoreihin johtaa laski etäpesäkkeitä on TGFli /PKA-signalointireitin riippuvainen mekanismi on erittäin metastaattinen potilaalle tehdä paksusuolensyöpä mallien in vivo. Rescue erityisten tuumorisuppressorin näkökohtia TGFp signalointireitin voi tarjota terapeuttisia etuja eivät markkinoi solujen eloonjäämistä ja metastaattisen vaikutukset TGFp. Jos nämä TGFli tuumorisuppressoriproteiinia vaikutuksia voidaan jäljitellä myöhäisessä vaiheessa kasvaimia, terapeuttinen arvo vastaan ​​metastaattisen CRC voisi lopulta saada.

Tulokset

TGFli aktivoi PKA paksusuolen syöpäsoluissa

kriittinen raportti Simeone laboratorio totesi, että TGFli signalointi aktivoi PKA vuonna Mv1Lu soluissa ja välittää valvonta TGFp kasvua estävän vastauksia [15]. TGF aktivaatio PKA välitti Smad riippuva, ​​syklisen AMP (cAMP)-riippumatonta mekanismia. Tämä nosti esiin mahdollisuuden, että TGFp signalointi välittämää valvonnasta poikkeavan solun eloonjäämisen havaittiin varhaisessa vaiheessa TGFp herkkiä FET paksusuolisyöpä malli saattaa liittyä aktivointi PKA. Oletimme, että TGFli aktivoi PKA FET solujen cAMP itsenäinen, Smad riippuvainen mekanismi. Tätä varten, FET-soluja käsiteltiin TGF (5 ng /ml) ja tiettyinä aikoina, ja proteiinikinaasi-määritys suoritettiin mittaamiseksi PKA aktiivisuuden (kuvio 1A). Seuraavat TGF hoito, PKA aktiivisuus kasvoi noin 2-kertaiseksi 15 min ja 4-kertainen 1 h. Havaittiin, että TGF-välitteisen PKA aktivointi poistetaan kokonaan seuraavan solujen esikäsittely H89 (15 uM), farmakologinen PKA-inhibiittori [15]. TGF aktivaatio PKA oli pitoisuudesta riippuvainen (kuvio 1 B), jossa maksimaalinen aktiivisuus FET soluissa havaittiin 5 ng /ml TGF. Sen vahvistamiseksi, että aktivointi PKA oli alavirtaan Smad aktivaation TGFli, havaitsimme, että esikäsittely H89 ei ollut vaikutusta fosforylaatiota Smad2 mukaan TGFp käyttämällä immunoblot-analyysillä (kuva S1). Kehitimme vakaa PKA katalyyttinen α alayksikköä shRNA Knockdown FET soluissa (nimetty FET PKACatα KD) validoimiseksi H89 vaste geneettisesti (kuva S2). TGF hoitoa varten tiettyinä aikoina kyennyt aktivoimaan PKA että knockdown soluissa verrattuna vankka aktivaatio vanhempien FET solujen (kuvio 1 C). Aktivointi PKA mukaan TGFp on osoitettu olevan cAMP riippumaton Mv1Lu soluissa [15]. Klassinen PKA aktivointi liittyy cAMP sitoutumisen sääntelyn alayksiköt PKA käynnistää dissosiaatiota katalyyttisen alayksiköiden. Vaihtoehtoinen mekanismi PKA aktivointi liittyy yhdistys IKB kanssa PKA katalyyttinen alayksiköissä, ylläpitää näin aktiivisessa tilassa PKA. Kun IkB hajoaminen, on aktivointi PKA riippumaton cAMP aktivointi [18]. Me määritellä, onko aktivointi PKA mukaan TGFp riippuu cAMP aktivaation FET soluissa käsittelemällä soluja TGFB ja mittaamalla cAMP-tasot käyttämällä ei-radioaktiivista cAMP entsyymi-immunomääritys (kuvio 1 D). Havaittiin, että TGF voinut lisätä cAMP-tuotantoa verrattuna Forskolin hoitoa, joka tarjosi merkittävän kasvun cAMP-tasot kuin odotettiin. Seuraavaksi tutkimme IKB-proteiinin seuraavat TGF hoitoon määrättyinä aikoina onko aktivointi PKA mukaan TGFp johtui IKB hajoamisen (kuvio S3). IKB pysyivät ennallaan seuraavien TGF hoitoa. Siksi PKA aktivoidaan TGFli on cAMP ja IKB-riippumattomalla tavalla FET solujen kanssa raportin Zhang et al (2004). Edelleen vahvistaa toiminnallinen merkitys TGFp välitteisen PKA aktivaation, transkriptiotekijä CREB testattiin, joka on tunnistettu suoraan kohde cAMP-PKA-signalointireitin [15]. Havaitsimme, että TGFli pystyi stimuloimaan fosforylaatiota CREB (kuvio 1 E) ilman muutosta kokonaismäärä CREB tasot (tuloksia ei ole esitetty). Solujen esikäsittely H89, jota seuraa TGF altistus vähensi merkittävästi fosforylaatiota CREB. Zhang et al (2004) korostanut aktivoitua Smad3 vuonna TGFli välittämän PKA aktivointia. Kehitimme vakaa shRNA Smad3 Knockdown FET soluissa (nimetty FET Smad3KD) (kuva S4). TGF hoito näillä Smad3 pudotus solut kyennyt aktivoimaan PKA (kuvio 1 F) osoittaen riippuvuus TGFp välitteisen PKA aktivoinnin Smad3 kuin aiemmin ilmoitettua [15].

FET soluja käsiteltiin TGF (5 ng /ml ) aktivoitu PKA ajassa (A) ja pitoisuus (B) riippuvaisella tavalla. PKA-estäjä H89 (15 uM) käytettiin estämään PKA aktivointia. Forskoliinin (10 uM) käytettiin positiivisena kontrollina. Vertailu vanhempien FET ja FET PKACatα KD solujen TGFli välittämää PKA aktivaation (C). Knockdown katalyyttisen α-alayksikköä kumonnut PKA aktivoinnin TGF. PKA aktivaatio TGFp on riippumaton cAMP sukupolven määritettynä cAMP-määritys (D). TGF johtaa CREB aktivaation FET soluissa (E). Aktiini käytettiin lastaus kontrollina Western blot. PKA aktivaatio TGFli on Smad3 riippuvainen määritetty knockdovvn Smad3 FET soluissa (F). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.E.M. (n = 3). Kaikki kokeet on toistettu kolme kertaa itsenäisesti.

TGFli /PKA signalointi välittämä XIAP downregulation

XIAP ja surviviinista ovat hyvin tunnettu IAP perheenjäsenten äskettäin dokumentoitu etäpesäkkeinen geenit [5]. Niiden yhteisiä rooli solun eloonjäämisen edistämisessä ja etäpesäkkeiden antaa vahva perusta kohdistamista ilmentymisen ja /tai aktiivisuuden näiden IAP: t on edennyt pitkälle syöpä. Varhainen tapahtuma liittyy PKA aktivointi on fosfory- surviviinispesifisten on Ser

20 sytosoliin, mutta ei mitokondrioissa [17]. Tämä fosforylaatio surviviinin on osoitettu häiritä sitovan rajapinnan XIAP, mikä XIAP hajoamista. Tuloksemme sekä aiemmat raportit osoittavat, että PKA aktivointi vastaus on varhainen tapahtuma seuraavat TGF hoitoa ja se saavuttaa maksimaalinen tasoilla 1 h TGFp hoitoa. Oletimme, että TGFli aiheuttaa irtoamisen poikkeavan solun eloonjäämisen stimuloimalla PKA välittämää häiriöitä XIAP /surviviinin monimutkainen. FET-soluja käsiteltiin TGF määritetyn kertaa ja sen jälkeen määrittämällä XIAP ja surviviinin (kuvio 2A ja S5). TGF hoito vaimentua sekä XIAP ja surviviini on tiettyinä aikoina. Koska surviviini fosforylaatio on jo osoitettu liittyvän PKA aktivointia keskityimme huomiomme sääntelystä XIAP. Hajoaminen XIAP esti H89 esikäsittely ennen TGFli altistuminen tiettyinä aikoina (kuvio 2B). Tutkia spesifisyyden vasteen, vertasimme vaikutus TGFp FET PKACatα KD soluja ja vanhempien FET solujen (kuvio 2C). TGF hoito ei vaikuttanut XIAP proteiinin tasot FET PKACatα KD soluissa osoittaa riippuvuutta PKA katalyyttinen alayksikkö in TGFli rustokadon XIAP proteiinia. Vahvista spesifisyyden TGFp /PKA-reitin tähän vastauksen, FET Smad3 KD solut käsiteltiin TGFli varten tiettyinä aikoina ja XIAP proteiinin ilmentyminen määritettiin (kuvio 2D). Yhdenmukainen Smad3 riippuvuuden TGFp välittämän PKA aktivointi, vakaa shRNA knockdovvn Smad3 kumotaan XIAP downregulation. Proteasomaalisten estäjä (MG132) käytettiin määrittämään, onko menetys XIAP riippui proteasomaalisten hajoamista (kuvio 2E). Havaittiin, että esikäsittely FET solujen MG132 (15 uM) 1 tunti ennen TGFli käsittelyä kokonaan poisti XIAP hajoaminen osoittaa, että XIAP hajoaa sisällä proteasomin. PKA on tärkeä säätelijä proteasomaalista aktiivisuutta ja PKA: n on osoitettu samanaikaisesti puhdistaa kanssa proteasomin [19], [20]. Oletimme, että TGFli /PKA säätelyyn of proteasomaalista toiminta voi tarjota toisen kerroksen valvonnan IAP ilmentymisen (yli PKA aiheuttama fosforylaatio surviviinispesifisten on Ser

20). Aiemmin raportit osoittavat, että PKA fosforyloi Rpt6 ATPaasi, joka avautuu ja kuljettaa alustojen proteasomista ja tämä fosforylaatio parantaa kymotrypsiini proteasomaalisten toimintaa proteasomin [21]. Tämän vuoksi päätimme onko TGFli välittämä PKA aktivointi pystyy lisäämään kymotrypsiinin kaltaisia ​​proteasomaalista jossa käytetään proteasomaalista aktiivisuusanalyysiä. TGF hoito FET solujen selektiivisesti stimuloi kymotrypsiinin kaltaisia ​​vaikutuksia Proteasomin sisällä 1 h (kuvio 2F). H89 esikäsittely ennen TGFli altistumista kumosi kokonaan pohjapinta taso proteasomaalisten kymotrypsiinin kaltaisia ​​vaikutuksia ja täysin poisti stimuloivia vaikutuksia TGFp on proteasomin.

TGF (5 ng /ml) käsittely osoitti kertaa downregulates XIAP vuonna FET-solut (A) ja tämä vaikutus välittyy PKA esikäsittelynä kanssa PKA estäjän H89 ennen TGFli altistumista kumoaa XIAP tappio (B). Vakaa shRNA Knockdown PKA katalyyttisen alayksikön FET soluissa johtaa kumota XIAP tappio (C). Vakaa shRNA knockdovvn Smad3 johtaa kumoamisesta XIAP tappion FET soluissa (D). TGF (5 ng /ml) välittämä XIAP downregulation on proteasomaalista tapahtuma. Esikäsittely proteasomaalisten estäjän MG132 (15 uM) kumosi XIAP tappio TGF (E). TGF aktivaatio PKA johtaa aktivaatioon kymotrypsiinin aktiivisuus sisällä proteasomin ja tämä vaikutus on kumottu H89 (F). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.E.M. (n = 3). Aktiini käytettiin lastaus kontrollina Western blot. Kaikki kokeet on toistettu kolme kertaa itsenäisesti.

Yhdessä nämä tiedot johtavat siihen olettamukseen, että TGFp /PKA signalointi säätelee XIAP ilmaisu useilla tasoilla aktivointi PKA johtaa fosforylaatioon keskeisten proteasomaalisten komponentteja, edistää proteasomaalisten hajoamista XIAP.

AKAP säätelee TGF /PKA välittämä XIAP downregulation

on runsaasti A-kinaasin ankkurointi proteiinit (AKAPs), joka lokeroida PKA ja muiden entsyymien läheisyyteen erityiset soluorganellit suorittamiseksi entsyymiä toiminto. Oletimme, että AKAPs ovat kriittinen osa TGFli /PKA välittämän XIAP downregulation. On hyvin dokumentoitu, että solunosasijaintia PKA säätelyalayksiköt (PKARI ja /tai PKARII) välittyy vuorovaikutusten AKAPs [22]. AKAP estäjä Ht31, synteettinen kilpirauhasen ankkurointi peptidin on osoitettu olevan erittäin voimakas kilpaileva estäjä PKARII /AKAP vuorovaikutusta, mikä estää PKA ankkurointi [23]. Sen varmistamiseksi, että Ht31 on erityisesti suunnattu AKAP-PKA vuorovaikutukset, teimme PKA aktiivisuuden määritykset FET solujen laajuuden määrittämiseksi PKA aktivointi esikäsittelyn jälkeen Ht31 (25 uM) ennen TGF altistusta (kuvio 3A). Suostumuksella aiemmissa tutkimuksissa [15], Ht31 onnistui torjunnassaan TGFp välittämän PKA aktivointia. Koska AKAP-PKA vuorovaikutus näyttää olevan edellytys TGFli välittämän PKA aktivointia, päättelimme, että nämä vuorovaikutukset saattavat myös tarvita alavirran signalointia johtavia tapahtumia XIAP tappio (kuvio 3B). Lisääminen Ht31inhibitor 1 h ennen TGFli myöntämisestä tietyille kertaa täysin kumosi XIAP menetys.

AKAP estäjä Ht31 (25 uM) hoito 1 h ennen TGFli altistumista kumoaa TGFli välittämää PKA aktiivisuuden (A) ja TGFp välittämä XIAP tappio (B). AKAP149 siRNA pudotus tehtiin FET-solut (C). Knockdovvn AKAP149 johtaa kumota TGFp välittämän PKA aktiivisuuden (D) ja XIAP downregulation (E). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.E.M. (n = 3). Aktiini käytettiin lastaus kontrollina Western blot. Kaikki kokeet on toistettu kolme kertaa itsenäisesti.

Koska AKAP perheeseen kuuluu yli 50 jäsentä [24], haasteena oli tunnistaa yksittäisen AKAP joka vastaaminen TGFp /PKA vaikutuksia XIAP . Sen jälkeen, kun alustava seulonta läsnäolo eri AKAP perheenjäsenten FET-soluissa, havaitsimme AKAP149 proteiinin ilmentymistä näissä paksusuolen syöpäsoluja. AKAP149 (kutsutaan myös D-AKAP1 ja AKAP121 hiiren) on tunnistettu membraanin proteiini mitokondrioiden [25]. On raportoitu, että mitokondrion AKAP121 on mukana kohdistettu cAMP aktivoitu PKA ulomman mitokondriokalvon (OMM), ja sillä on rooli mitokondrioiden biogeneesin ja selviytymistä [26]. Oletimme, perustuu käsitykseen, että mitokondrioiden XIAP ja surviviini siirtyä sytoplasmaan jälkeen stressivaste joka AKAP149 voidaan säännellä TGFli /PKA välittämän XIAP hajoamista. Ekspression AKAP149 pieni häiritsevä RNA (siRNA) esti TGF-välitteisen PKA aktivaation (kuvio 3C-D). Lisäksi havaitsimme, että TGFli kyennyt downregulate XIAP proteiinia AKAP149 siRNA pudotus soluja verrattuna vanhempien FET ohjaus soluja (kuvio 3E). Tämä pro-apoptoottista funktiota AKAP149 on vastakohtana tunnetun funktion mitokondrion AKAP121 (tai sen ihmisen homologi-AKAP149) edistää selviytymistä.

vieressä kyseenalaiseksi vaikutus AKAP149 oli valikoiva tässä TGF /PKA vaikutus . Vaikka AKAP-PKA vuorovaikutus on maailmanlaajuinen ilmiö, validointi AKAP149 kuten selektiivisesti säätelemällä TGFli /PKA signaloinnin olisi uusi laajennus ymmärrystämme TGFp /PKA välittämän XIAP downregulation. AKAP220 on osoitettu säätelevän proteiinifosfataasi 1 (PP1) aktiivisuus koordinoimalla sijainnin PKA ja PP1 katalyyttinen alayksikkö [27]. Me tukkinut ilmaus AKAP220 FET solujen AKAP220 siRNA. Nämä transfektoidut solut, kun käsiteltiin TGF ei ollut vaikutusta joko induktioon PKA toiminnan tai XIAP downregulation (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä AKAP rakennustelineet on keskeinen rooli TGFp /PKA-reitin välittämä XIAP downregulation kanssa mitokondrioiden lokalisoitu AKAP149 välttämättömiksi TGFp /PKA välittämä vaste.

osallistuminen PP2A in TGFp /PKA välittämä XIAP downregulation

on havaittu, että aktivointi PKA johtaa inaktivoimiseksi AKT kautta defosforylaatio proteiinifosfataasi 2A (PP2A) [28]. Tämä johti hypoteesiin, että TGFp aktivaatio PKA vastaa tukahduttamisesta AKT aktivaation että meidän aiemmin raportoitu seurauksena TGFp signaloinnin [13]. Niinpä päätimme PP2A aktiivisuutta FET soluissa (kuvio 4A). TGF hoitoon määrättyinä aikoina lisännyt merkittävästi PP2A toimintaa. PP2A estäjä okadahappo (OA, 50 nM) pystyi täysin poistamaan PP2A aktivointi, jotka saivat pelkkää tai esikäsitellä ennen TGF altistumista. Seuraavaksi testasimme rooli TGFp välittämisessä AKT inaktivaatioon ja XIAP tappio (kuva 4B). Havaittiin, että TGFli välittämä defosforylointia AKT on PP2A riippuvaisen heijastuu kyky OA estää TGFp välittämää defosforyloitumista AKT. XIAP downregulation Lisäksi poistettiin OA hoito. Vaikka PP2A on tuumorisuppressori valvontaan osallistuvien useiden solujen eloonjäämisreittejä [29], dokumentointi rooli subverting solujen eloonjäämistä signalointi sisällä TGFp-reitti on uusi laajennus PP2A-toiminto.

FET-soluja käsiteltiin joissa TGF (5 ng /ml) osoitetun ajan ja PP2A aktiivisuus määritettiin käyttäen PP2A aktiivisuusanalyysiä protokollaa kuvatulla materiaalit ja menetelmät (A). PP2A-inhibiittorin okadahapon (OA, 50 nM) käytettiin estämään PP2A. Esikäsittely OA ennen TGF (5 ng /ml) käsittely kumottu TGFli välittämää XIAP menetys ja defosforylointia AKT (B). Vakaa shRNA knockdovvn PP2A katalyyttisen α-alayksikköä tehtiin FET soluissa (C). Knockdovvn PP2A katalyyttisen α-alayksikköä johti kumota TGFp (5 ng /ml) välittämä XIAP downregulation vaikuttamatta PKA aktiivisuuden (D-E). XIAP immunosaostus tutkimuksissa FET soluissa käsitelty TGF (5 ng /ml) tai esikäsitelty H89 tai Ht31 1 h ennen TGF altistumista. XIAP irtoamisen Pakt seuraavista TGFli hoitoon tarkoitettu aika (F). Inhiboivaa PKA aktiivisuutta H89 tai AKAP-PKA vuorovaikutus Ht31 kumoaa TGFp välittämä XIAP-Pakt dissosiaatiota.

edelleen vahvistaa asemaa PP2A in TGFp /PKA signalointi, me syntyy vakaa shRNA PP2A katalyyttinen alayksikköä knockdown FET soluissa nimetty FET PP2A Cat KD (kuvio 4C). TGF hoito FET PP2A Cat KD solut osoittivat PKA aktivointi osoittaa, että PKA aktivaatio on ylävirtaan PP2A aktivaation (kuvio 4D). Kuitenkin vakaa shRNA knockdovvn PP2A katalyyttisen alayksikön poistetaan kokonaan TGFli välittämä XIAP eston ja osoitti jatkuvaa fosforylaation AKT samoin (kuvio 4E). FET PKACatα KD-soluja käsiteltiin TGF osoitti myös jatkuvaa fosforylaation AKT (tietoja ei esitetty).

Vaikka esto AKT aktivointi olisi mahdollista monia vaikutuksia solujen eloonjäämistä, yksi vaikutus, joka on erityisen kiinnostava, koska niihin liittyviä että TGF /PKA toiminto on yhteydessä, että se kohdistuu XIAP vakautta. Aiemmassa tutkimuksessa on todettu, että XIAP fosforyloituu AKT on Ser

87, joka johtaa lisääntyneeseen vakauttamiseen XIAP ja laski apoptoosin munasarjasyövän solujen vastauksena sisplatiinin [30]. Me perusteltu, että PP2A estäminen AKT-vaikutusta voivat edustaa ylimääräisen mekanismi häiriöitä vakauttaminen XIAP joka on kohdistettu TGFp /PKA-reitin kautta tehostaminen PP2A toimintaa. Tätä varten FET soluja käsiteltiin TGFli tai esikäsitelty erilaisilla TGFli /PKA-reitin inhibiittorit ennen TGFli altistumisen määrättyinä aikoina ja immunosaostettiin varten XIAP ja immunoblotattu mahdollisesti sitoutuneet proteiinit XIAP. Löysimme yhdistys XIAP kanssa Pakt (kuvio 4F). Seuraavat TGF hoidon, oli merkittävä dissosiaatio XIAP-Pakt monimutkainen. Kuitenkin, esikäsittely H89 tai Ht31 ennen TGF altistumisen kumosi kokonaan XIAP-Pakt dissosiaatio kahden proteiinin osoittaa, että TGF /PKA signalointi-välitteisen inaktivoinnin AKT horjuttaa XIAP mikä sen proteasomaalisten hajoamista. Siksi käytetään estäjä ja vakaa knockdown tutkimuksia, me korostaa romaani toteamisesta TGFli /PKA signalointi välittää menetyksen XIAP proteiinin jonka PKA-PP2A riippuvainen tukahduttaminen AKT aktivointi johtaa XIAP menetykseen.

TGFli reseptorin saattamisen johtaa pieneni metastaattinen kolonisaatio: Vaikutus TGFli /PKA signalointi

Olemme kehittäneet teknologiaa potilaalle tehdä paksusuolen istuttaminen ihmisen paksusuolen syövän linjojen kateenkorvattomissa hiirissä, joka mahdollistaa toistettavissa kvantitatiivinen analyysi etäpesäke maksaan ja keuhkoihin [31], [ ,,,0],32], [33]. Metastaattista kuvio näkyy tässä mallissa järjestelmä heijastaa luonnetta metastaaseja ihmispotilaille. Erittäin metastaattinen GEO paksusuolensyöpä soluja käytettiin edelleen ymmärtää vaikutusta TGFp /PKA signalointia etäpesäkkeitä. GEO-soluja on vaimennettu TGFβRI ilmaisun ja siten vaimennetaan TGFp tuumorisuppressoriproteiinia signalointi sekä [8]. Olemme hyödyntäneet paksusuolen ortotooppinen implantaatio ihon alle kasvanut ksenograftien kuvaamaan tekijöitä, jotka vaikuttavat laajuus etäpesäkkeitä maksaan ja keuhkoihin vaikuttamatta hyökkäystä ensisijaisessa kasvaimen [31], [33]. GEO-soluja havaittiin olevan erittäin metastaattinen tässä potilaalle tehdä mallia heijastuu metastasoituneen kolonisaatio 53% istutettu eläinten (taulukko 1). Rescue reseptori vaimennus GEO soluissa transfektion TGFβRI ekspressiovektorin (nimetty GEORI) johti vähentämiseen metastaattisen esiintyvyys noin 20%: lla eläimistä istutettiin vaikuttamatta hyökkäystä at alkuperäisellä alueella sekä GEO ja GEORI transfektoidaan eläimet synnyttivät invasiivisia primäärikasvain 100% istutettujen eläimistä. GEO istuttaa eläimille kehittyi vankka maksan etäpesäkkeiden verrattuna GEORI (kuvio 5A). Hematoksyliinillä ja eosiinilla (H & E) värjäys osoittaa maksan etäpesäkkeiden GEO-soluissa on esitetty kuviossa 5B. Luonnehdinta GEO kasvaimia osoittivat lisääntynyttä solujen selviytymistä signalointia, mikä heijastuu pienempi TUNEL hinnat suhteessa GEORI kasvaimia osoittaa tukahduttaminen metastaattisen kolonisaatio TGFli tuumorisuppressoriproteiinia signalointi liittyy tukahduttaminen solujen selviytymistä signalointi in vivo (kuvio 5C-D). Edelleen, ei muutosta Ki67 IHC värjäytyminen ei havaittu erittäin metastaattinen GEO ja huonosti metastasoituneen GEORI primaarikasvainten osoittaa eroa proliferaationopeus in vivo välillä GEO ja GEORI kasvaimet (kuvio 5E-F). In vivo tulokset osoittavat, että palauttaminen TGFp reseptorin estää metastaattinen toimivalta GEO soluissa tasolla metastaattisen siirtokuntien vastakohtana estämään hyökkäyksen.

Comparison of GFP kuvien metastaattisen eteneminen maksaan GEO ja GEORI hiiriä ( A). GEO Colon Cancer Liver H & E-värjäystä osoittaa maksan etäpesäke (B). Vertailu primaarituumorin osien GEO ja GEORI hiirillä TUNEL määrityksessä värjäystä mainitut materiaalit ja menetelmät määrittää niiden apoptoottisen hinnat (C). Apoptoottiset hinnat kvantitoitiin (D). Vertailu primaarituumorin osien GEO ja GEORI hiirillä Ki-67 värjäystä mainitut materiaalit ja menetelmät määrittää niiden hinnat leviämisen (E). Lisääntyminen hinnat kvantitoitiin (F). TGF-reseptorin saattamisen johtaa muutokseen PKA aktiivisuuden. Vertailu PKA aktiivisuuden erittäin metastaattinen GEO soluja vs. huonosti metastasoituneen GEORI soluja (G) ja erittäin metastaattinen CBS soluja vs. huonosti metastasoituneen CBSRII soluja (H). Vertailu TGFp (5 ng /ml) altistumisen välillä GEO ja GEORI soluja (I) ja CBS ja CBSRII soluja (J). PKA-estäjä H89 kumottu TGFli välittämää XIAP menetys GEORI ja CBSRII soluja (K).

Avain hyödyntämään tukahduttaminen etäpesäke mukaan TGFp signalointi on selvittää sellaisten molekyylitason mekanismi, jolla etäpesäke on estetty. Perustuen lasku metastaattisen ilmaantuvuuden kanssa TGFli reseptorin saattamisen johtaa pelastamaan TGFp signalointi, me arveltu, että TGFli /PKA välittämä XIAP downregulation edellyttää ehjää TGFli signalointi mekanismi, joka on menetetty erittäin metastaattinen GEO soluja. Kuitenkin pelastaminen TGFp signaloinnin reseptori saatetaan käyttökuntoon GEORI soluissa mikä alentaa metastaattisen esiintyvyys pitäisi lisätä TGFli /PKA signalointi ja sen myöhemmät vaikutukset XIAP. GEO-solujen heikennetyillä TGFli signalointi ei ollut PKA aktivointi TGF altistus (kuvio 5G). Kuitenkin GEORI solujen toiminnallinen TGFli signalointi johtuu reseptorin saattamisen ollut vankka kasvu PKA aktivoitumisen TGFli joka oli noin 4 kertaa suurempi kuin kontrolli. Toinen koolonkarsinoomasolulinja (CBS-solut) heikennetyllä TGFpRII signalointi [34] osoittivat myös vähentää etäpesäkkeiden jälkeen pelastus-reseptorin puutos (tuloksia ei ole esitetty). Samanlainen vasteen PKA aktiivisuuden havaittiin erittäin metastaattinen CBS soluja verrattuna huonosti metastaattista CBSRII solujen jälkeen TGFli hoidon in vitro (kuvio 5H).

Tämän havainnon, me arveltu, että erittäin metastaattinen GEO ja CBS solujen olisi vastustuskykyinen TGFp /PKA signalointia rustokadon XIAP proteiinia. Me perusteltu, että kyvyttömyys TGFp signalointi aiheuttaa PKA aktivaatio näissä soluissa johtuen reseptoriin inaktivoitumisen myös estää sen myöhemmät vaikutukset XIAP jolloin näitä soluja enemmän metastasoituneen lisäämällä pro-eloonjäämisen signalointi. Vaikka GEO ja CBS molemmat osoittivat mitään vastausta TGFli hoitoon tiettyinä aikoina (Kuva 5I-J), GEORI ja CBSRII solut osoittivat XIAP downregulation samankaltaisia ​​hoitoja (Kuva 5I-J).