Krooninen sairaus

tiivistelmä

hoito

EGFR

-mutant ei-pienisoluinen keuhkosyöpä potilaita kanssa tyrosiinikinaasiestäjiksi erlotinibi tai gefitinibi tuloksia korkea hoitovaste ja pitkäaikainen ilman taudin etenemistä. Huolimatta kehittämiä arkaluonteisia mutaation havaitseminen lähestymistapoja, perusteellisen validoinnissa kliinisessä ympäristössä on toistaiseksi puuttunut. Me suoritettu, hoitopaikassa, järjestelmällinen validointi dideoksi- ”Sanger” sekvensointi ja pyrosekvensointi vastaan ​​massiivisesti rinnakkaisen sekvensointi yhtenä herkimmistä mutaation havaitsemiseen tekniikoita saatavilla. Mutaatiostatuksesta merkinnästä kliinisistä keuhkojen kasvain näytteet paljasti, että kaikki potilaat, joilla on todettu vaste

EGFR

esto, vain massiivisesti rinnakkaissekvensointijärjestelmät havaita kaikki asiaankuuluvat mutaatioita. Sen sijaan dideoksisekvensoimalla jäi neljä vasteen ja pyrosekvensointi jäi kaksi vaste, mikä osoittaa dramaattinen puute herkkyys dideoksisekvensoimalla, joka on laajalti käytössä tähän tarkoitukseen. Lisäksi tarkkaa määrittämistä Mutanttialleelit paljasti alhainen korrelaatio (r

2 = 0,27) histopatologisia arvioiden kasvain sisältöä ja Mutanttialleelit siten kyseenalaistaa käyttö histopatologia kerrostuminen yksilöitä yksittäisten analyyttisten menettelyjen. Tuloksemme viittaavat siihen, että tehostettu analyyttinen herkkyys kriittisesti tarvitaan tunnistaa oikein vastanneiden potilaiden

EGFR

esto. Laajemmin tuloksemme korostavat tarvetta arvioida perusteellisesti mutaation havaitsemisen torjunnan lähestymistavat massiivisesti rinnakkaissekvensointijärjestelmät edellytyksenä mitään kliinisiä toteuttamiseen.

Citation: Querings S, Altmüller J, Ansén S, Zander T, Seidel D , Gabler F, et ai. (2011) benchmarking mutaatio Diagnostics Kliinisen Keuhkosyöpä näytteet. PLoS ONE 6 (5): e19601. doi: 10,1371 /journal.pone.0019601

Editor: Markus Schuelke, Charité Universitätsmedizin Berlin, NeuroCure Clinical Research Center, Saksa

vastaanotettu: 7. joulukuuta 2010 Hyväksytty: 02 huhtikuu 2011; Julkaistu: 05 toukokuu 2011

Copyright: © 2011 Querings et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Saksan Cancer Aid osana osaamiskeskusten Oncology ohjelmassa keskipisteeseen Integrated Oncology Köln – Bonn ja Saksan liittovaltion tiede ja koulutus (BMBF) osana National Genome Research Network -ohjelma (NGFNplus , myöntää 01GS08100 ja 01GS08101) Jürgen Wolf, Peter Nürnberg ja Roman Thomas. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Roman K. Thomas sai tutkimuksen tukea AstraZeneca ja sai luento tai konsultaatiopalkkiot Rochelta Boehringer Ingelheim, Johnson (B) L747_A750del, P753S mutaatio havaitaan kaikki kolme sekvensointimenetelmillä; (C) E746_A750del (Del-1A) mutaation tunnistetaan pyrosekvensointi ja massiivisesti rinnakkaisen sekvensointi; (D) E746_A750del (Del-1B) ainoastaan ​​havaita massiivisesti rinnakkaissekvensointijärjestelmät. del, poistetaan; Mut, mutaatio; WT, villityypin. Nuolet osoittavat aseman odotetaan mutaation merkinannoista.

Seuraavaksi testasimme ovatko perinteisen pyrosekvensointi [22] pystyi vahvistamaan mutaatioiden havaittu dideoksisekvensoimalla ja jos muita mutaatioita löytyisi tällä menetelmällä potilaan kohortissa testattu. Pyrosekvensointi tarjoaa kustannustehokkaan havaitsemiseksi kvantitatiivisesti sekvenssin variantteja ja aiemmin osoitettu, jotta herkkä

KRAS

mutaation havaitseminen kolorektaalisyövässä [12], [25], [26]. Parannettu herkkyys havaita harvinaisia ​​muunnoksia johtuu sukupolven ei-häiritseviä, yksittäiset signaalit mutantti ja villityypin alleelit. Perustimme herkkä (5-10% mutantti alleeli), toistettavissa ja lineaarinen pyrosekvensointi määritykset näkyvin mutaatio kuormittajat

EGFR

ja

KRAS

(täydennyskuvio. S2, S3, S4, S5 , S6, S7, S8, S9, S10). Pyrosekvensointi vahvistanut kaikki mutaatiot havaitaan dideoksisekvensoinnilla (taulukko 1). Olemme kuitenkin myös havaita neljä uutta mutaatiota meidän näytteessä kohortin joka oli jäänyt dideoksisekvensoimalla (taulukko 1, Fig. 1 C ja täydennyskuvio. S3A, S6b, S9A). Olemme esimerkiksi havainneet erlotinibin mutaatio, T790M, kasvaimen näytteestä 10 (80% kasvainsolun pitoisuus) saatiin aikaan uusiutumisen (täydennyskuvio. S6b) ja tämä näyte myös kanna L747_S752del_P753S poistetaan aluksi havainnut dideoksisekvensoimalla (taulukko 1 ja Fig. S4C). Olemme lisäksi havainneet aiemmin huomaamatta G12A korvaaminen eksonissa 2

KRAS

näytteessä 11 (50% tuumorisolujen sisältöä, täydennyskuvio. S9A) ja vahvistanut tämän mutaation kloonaamalla

KRAS

eksoni 2 amplikonien ja myöhemmin dideoksisekvensoinnilla (tuloksia ei ole esitetty).

EGFR

eksonin 19 pyrograms näytettä 27 (40% kasvainsoluja) ja näytettä 05 (50% kasvainsoluja) oli fluoresenssisignaalit osoitus mutaatioiden läsnäolon suhteen, jotka olivat merkittävästi yläpuolella kokeellista kohinaa (Fig. 1C ja täydennyskuvio. S3A). Fragmentti-pituus analyysit

EGFR

eksonin 19 PCR-tuotteiden validoitu tämän poiston näytteestä 27 (täydennyskuvio. S11).

Lopuksi käytimme massiivisesti rinnakkaisen array-pohjainen pyrosekvensointi-synteesin [ ,,,0],20] vahvistaa mutaatio saadut tulokset tavanomaisilla dideoksi ja pyrosekvensointi. Sekvensoimme kaikki 24 yksilöiden keskimäärin kattavuus 1079 × ja vähintään kattavuus 600 × kohti eksonin ja näytteen. Data-analyysi vahvisti läsnäolo

EGFR

ja

KRAS

mutaatioita 13 näytettä aluksi tunnistaa molemmat, dideoksisekvensoinnin ja pyrosekvensointi (taulukko 1). Lisäksi massiivisesti rinnakkaisen sekvensoinnin myös vahvisti neljä ylimääräistä mutaatiota, jotka olivat äskettäin havainnut herkällä pyrosekvensointi:

EGFR

eksonin 19 deleetiot näytteessä 05 ja 27 G12A mutaatio

KRAS

näytteen 11 ja T790M mutaatio

EGFR

näytteessä 10 (taulukko 1). Rinnakkainen luonne sekvensointi lähestymistavan ansiosta tarkkaa määrittämistä ja tunnistamista näiden matalataajuista variantteja. Tarkemmin, olemme tunnistaneet eksonin 19 mutaation näytteessä 05 olevan 9-bp-kehyksen deleetio, joka koodaa aminohappoa poistetaan-substituutio E746_R748del_A750, taajuudella 11%: 1315 lukee (taulukko 1). Lisäksi olemme määrällisesti 12 bp: n poistuman (E746_A750) ja esiintymistiheys on 11% 854 lukee näytteen 27 (Fig. 1 C). G12A substituutio näytteessä 11 esiintyi 21%: lla 1358 lukee ja T790M mutaatio näytteessä 10 esiintyi 20% pois 909 lukee (taulukko 1).

Lisäksi validointi aiemmin havaitaan mutaatiot rinnakkaissekvensointijärjestelmät tunnistettu

EGFR

eksonin 19 deleetiot näytteessä 31 ja 13a, jotka olivat erottaa kokeellista kohinaa sekä perinteisessä dideoksi ja pyrosekvensointi analyysejä. Rinnakkaissekvensointijärjestelmät käytössä havaitseminen E746_A750del näytteen 31 taajuudella 6% 1081 lukee (taulukko 1 ja kuvio. 1D). Yllättäen tämä näyte oli arvioitu sisältävän 60% tuumorisolujen histopatologisesti (taulukko 1). Samoin, flowgrams näytteen 13a (5% kasvainsoluja) paljasti 12 bp: n poistuman (L747_A750del_T751P) taajuudella noin 8% 658 lukee (taulukko 1). Tämä mutaatio oli sama kuin jo havaittu dideoksisekvensoimalla toisen näytteen saman potilaan (näytteet 13b), joilla on korkeampi kasvaimen pitoisuus (70%), joka on saatu aikaan uusiutumisen (taulukko 1). Siten ei validointi kaikki muut mutaatiot, jotka oli kutsuttu dideoksisekvensoimalla (n = 12) ja pyrosekvensointi (n = 16), massiivisesti rinnakkaisen sekvensointi tunnistaa kaksi muuta mutatoitunut näytettä, jotka oli jäänyt kahden muun menetelmistä riittämättömän herkkyys (taulukko 1 ja täydentävä taulukko S5).

seuraavaksi analysoidaan laadukasta 454 sekvensointi lukee (Phred pisteet 30), jossa tavoitteena on havaita T790M mutaatioita esiintyy matalilla taajuuksilla yksilöiden ennen hoidon. Eksoni 20 oli peitetty kohteena on keskimäärin syvyys 1018 lukee alueella kodonin 790. Potilailla, joiden kasvaimet olivat deleetion eksonissa 19 tai L858R havaitsimme huomattavasti korkeampi (p = 0,03) määrä lukee sisältävän T790M mutaation verrattuna potilaille, joilla on villityypin

EGFR

(EGFR mut: keskiarvo = 2,5 /1000; alue 0-7,5 /1000; EGFR paino: keskiarvo 0,8 /1000 (0-2,3 /1000). Toteamme, että nämä alleelifrekvenssit ovat alueella teknologisen rajan tarkkuuden. kuitenkin määrä lukee kanssa T790M ylitti kynnyksen mutaation soittamalla 27% näytteistä on deletoitu eksonissa 19 tai L858R mutta missään näytteessä ilman

EGFR

mutaatio (täydennyskuvio. S12).

yhdessä massiivisesti rinnakkaissekvensointijärjestelmät havaintojen mukaan yhteensä 18 mutaatioiden

EGFR

ja

KRAS

tuloksena herkkyys on 67% varten dideoksi- sekvensointi ja 89% varten pyrosekvensointi (taulukko 1 ja täydentävä taulukko S5). huolimatta pienuus meidän vedostulostus, nämä tulokset korostavat dramaattinen puute herkkyys dideoksisekvensoimalla kliinisessä mutaation havaitsemiseen.

herkkyys mutaation havaitseminen funktiona kasvain solun sisällön

Tumor-solun sisältö on kriittinen parametri suorittamiseksi mutaation havaitseminen syövän [20], ja se on perusta mikrodissektion-pohjainen kasvain-solujen rikastumista. Siksi pyrki analysoida kolmen mutaation analyysimenetelmät funktiona histopatologisesti arvioidaan kasvaimen solun sisällön. Kasvaimen keskimääräinen pitoisuus näytteiden, joiden osalta on mutantti dideoksisekvensoimalla oli 78% (vaihteluväli 35-95%) ja 71% (vaihteluväli 35-95%), kun kyseessä on pyrosekvensointi (Fig. 2A). Kaikki näytteet, joissa dideoksisekvensoimalla oli jäänyt mutaatioita, sisälsi 80% kasvainsoluja tai vähemmän. Sitä vastoin yksilöitä, jotka pyrosekvensointi oli jäänyt mutaatioita oli 60% kasvaimen sisältöä tai vähemmän (Fig. 2A).

(A) välinen korrelaatio arvioitu kasvaimen solun sisällön ja todellisen taajuuden mutatoitujen alleelien määritetään massiivisesti , rinnakkaissekvensointijärjestelmät tiedot. Musta, mutaatiot havaitaan dideoksi ja pyrosekvensointi; Green, mutaatiot havaitaan pyrosekvensointi, mutta jäi dideoksisekvensoimalla; Punainen, mutaatiot vain havaita rinnakkaissekvensointijärjestelmät. (B) herkkyys dideoksisekvensoimalla, pyrosekvensointi ja massiivisesti rinnakkaissekvensointijärjestelmät potilailla, joilla on vahvistettu kliinistä hoitovastetta erlotinibin.

vieressä arvioineet korrelaatio kasvaimeen solun sisällön ja mutatoituja alleeleja määritetty by massiivisesti rinnakkaissekvensointijärjestelmät (Fig. 2A). Havaitsimme alhainen korrelaatio määritetään analyyttisesti alleelin taajuus ja kasvain-solun sisällön (

r

2

= 0,27,

p

= 0,029). Merkillistä, herkkyyden erilaiset lähestymistavat määritetään laskenta mutantti ja villityypin alleelit havaita massiivisesti rinnakkaissekvensointijärjestelmät primäärikasvaimissa olivat erittäin samanlaisia ​​kuin alkuperäisessä alleelin sekoittamalla kokeita (Täydentävä kuviot. S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10): 29% dideoksisekvensoimalla ja 11% pyrosekvensointi (taulukko 1 ja kuvio. 2A). Alleelifrekvenssien mutaatioiden saapuvat pyrosekvensointi mutta ei dideoksisekvensoimalla vaihteli välillä 11% ja 21% (Fig. 2A). Mutaatiot vain havaita massiivisesti rinnakkaisia ​​sekvensointi tapahtui alleelifrekvenssien alle 10% (taulukko 1 ja kuvio. 2A). Huomiota herättävää on, kasvain pitoisuus näissä tapauksissa oli arvioitu olevan 60% ja 5%, vastaavasti. Näin ollen, histopatologiset arvioita kasvain-solujen sisältö eivät ennusta taajuuden mutanttialleelia, kun taas kyky havaita mutaatioita rajoittaa alleelin esiintymistiheys, mutta ei kasvain solun sisällön.

EGFR mutaatioita ja kliinisten tulosten

Edellinen analyysejä yhdistyksen

EGFR

mutaatioita ja kliinisen hyödyn aiheuttama

EGFR

esto on ajoittain tuottanut ristiriitaisia ​​tuloksia siitä, että joissakin tutkimuksissa on raportoitu puute tällaisen yhdistyksen [ ,,,0],27], [28], [29] Tällaiset epäjohdonmukaisuuksia saattavat johtua epäonnistumisesta havaitsemaan mutaatioita riittävän herkkyyden ja tarkkuuden. Mikä tärkeintä, meidän kohortin vain massiivisesti rinnakkaissekvensointijärjestelmät pystyi havaitsemaan herkistävän

EGFR

mutaatio

kaikki

potilaat, jotka olivat kokeneet osittainen vaste (mukaan RECIST kriteerien) minkä erlotinibin ( kuva 2B). Sen sijaan vain 7 pois 11 potilailla, joilla on vahvistettu PR havaittiin dideoksisekvensoimalla ja 9 11 tunnistettiin pyrosekvensointi (Fig. 2B). Huolimatta siis pienen koon meidän potilaan kohortin, nämä tulokset tukevat käsitystä, että valtavia eroja herkkyydessä voimakkaasti vinoon yhdistyksen välillä läsnäolo

EGFR

mutaatioiden ja vastaus erlotinibille. Potilaat, joilla on

EGFR

-wild-tyypin kasvaimet ja

KRAS

-mutant kasvaimia, jotka olivat saaneet erlotinibi näytteillä stabiili tai etenevä sairaus (taulukko 1) mukaisesti aikaisempien raporttien [30].

keskustelu

Täällä näytämme miten rajallinen herkkyys menetelmiä, ovat laajalti käytössä kliinisiin mutaatio diagnostiikan voisi johtaa kriittistä epätarkkuus geneettinen potilaan kerrostumista. Erityisesti alhainen herkkyys dideoksisekvensoimalla johti misdiagnoses 6 24 keuhkosyövän yksilöitä. Jos läsnä on

EGFR

mutaatio oli ollut kriteerinä, joiden käsittely

EGFR

estäjiä, neljä potilasta ei olisi saanut oikean hoidon. Huolimatta siis pienen koon meidän vedostulostus, nämä tulokset korostavat riittämättömyys dideoksisekvensoimalla kliinisen syövän geenimutaatio diagnostiikassa. Sitä vastoin tavanomaiset pyrosekvensointi tarjotaan parannettu herkkyys on vain kaksi potilasta on misdiagnosed. Lisäksi massiivisesti rinnakkaisen sekvensointi voimakkaasti ja tarkasti tunnistaa kaikki mutaatiot läsnä aineisto. Me osoittavat lisäksi, että rinnakkaissekvensointijärjestelmät havaitsee ennestään T790M mutaatioita 27% osa

EGFR

-mutant potilaille [31]. Nämä tulokset tukevat päätelmää, että massiivisesti rinnakkaisen sekvensointi on herkin nykyisin käytettävissä oleva tekniikka kliinisessä mutaatio diagnostiikan ja viittaavat siihen, että pyrosekvensointi voisi olla vaihtoehto dideoksisekvensoinnille.

Vaikka monia tekniikoita on syntynyt viime vuosina vastaamaan alati kasvava tarve tarjota tarkkoja kliinisiä mutaatio analyysien onkologit, yksikään näistä on systemaattisesti verrataan massiivisesti rinnakkaisen sekvensoinnin menetelmä, jolla on korkein herkkyys kliinisen mutaation havaitsemiseen tasalla. Ekstrapoloimalla eroja kuten ne, jotka tässä tutkimuksessa havaittu suuri määrä syöpäpotilaiden maailmanlaajuisesti osoittavat, että monet potilaat ovat viivästyy vuosittain. Siten huolellisesti kehitetty diagnostisia lähestymistapoja (sisältäen perusteellinen validaation massiivisesti rinnakkaisen sekvensointi) auttaa kohdistaminen tehokasta hoitoa oikealle potilasryhmässä.

Mikrodissektiomenetelmiä on sovellettu laajasti lisäämään osa kasvainsolujen tietyssä mallin järjestyksessä parantaa herkkyyttä dideoksisekvennoinnilla. Tunnistaminen kasvaimen-rikas alueilla on edellytys tällaista menettelyä. Löysimme kuitenkin vain alhainen korrelaatio kasvaimeen solun sisällön ja Mutanttialleelit. Oletamme, että rutiini tutkimus histopatologisten osia ei voi tarkasti arvioida aste ”pilaantuminen” mutanttialleelin terveiden sivullisten solujen (esim. Normaali keuhkokudoksessa), joka peittää taajuus mutanttialleelin. Siten mikrodissektion voi vain osittain pelastaa rajallinen herkkyys dideoksisekvensoimalla ja siksi myös validoitu huolellisesti vastaan ​​massiivisesti rinnakkaisen sekvensoinnin.

Toinen usein keskusteltu aihe on kysymys siitä, genotyypityksen tai sekvensoinnin saattaisi olla optimaalinen strategia kliinisen mutaation havaitseminen syövän. Vaikka tulokset viittaavat siihen, että pyrosekvensointi on herkkä, tarkka ja kustannustehokas tapa analysoida valtaosa näytteitä tuumorin pitoisuus 20-70%, muita menetelmiä, mukaan lukien ne, jotka perustuvat genotyypin, voi suorittaa yhtä hyvin. Mikäli jo tunnettuja hot-spot mutaatioita lukittu nukleiinihappo (LNA) lähestymistavat pystyvät havaitsemaan Mutanttialleelit esiintyvät taajuuksilla niinkin alhainen kuin 0,1% [14], [16]. Muita tekniikoita, jotka saattavat olla kliinisessä sovellus sisältää immunohistokemiallisesti käyttämällä

EGFR

mutaatio-spesifisten vasta-aineiden [32], tai sovelletaan molekyylimajakoissa kytketty loisteputki kuvantamisen [33]. On kuitenkin tärkeää pitää mielessä, että luontainen kyvyttömyys genotyypitysmenetelmiä kattamaan kaikki kliinisesti merkittävää mutaatioita, lisää mitään analyyttistä välinpitämättömyys. Näiden ajatusten pohjalta, suosimme sekvensointi perustuva mutaatio havainnoinnin genotyypitys. Vaikka näytekoko on liian rajoitettu kattavasti laskea herkkyys ja spesifisyys mutaation havaitseminen, uskomme, että silmiinpistävää alemmuuden tavanomaisten Sangerin sekvensoinnin havaita terapeuttisesti merkityksellisinä onkogeenimutaatiot on huomattava käytännön merkitys molekyyli- patologien ja kliinisen onkologit.

Yhteenvetona olemme osoittaneet kuinka sekvensointiteknologioihin huonompi herkkyys voi epäonnistua havaita kliinisesti merkittäviä onkogeenimutaatiot syöpäpotilailla. Yhteenvetona toteamme, että mitään uutta menetelmää kliinisessä mutaation diagnostiikan tulisi perusteellisesti validoitu massiivisesti rinnakkaissekvensointijärjestelmät jotta oikean geneettisen analyysin pohjana molekyylirakennetta täsmähoitoihin.

tukeminen Information

Kuva S1.

herkkyys tutkimus dideoksisekvennoinnilla ja pyrosekvensointi. Eri seoksia PCR-tuotteiden villin tyypin tai G12S mutantti NSCLC solulinjoja käytettiin määrittämään herkkyyden raja dideoksisekvensoinnilla (~20-30%) ja pyrosekvensointi (-5%). Mutaatio merkinannoista on merkitty tähdellä vuonna dideoksi elektroferogrammit (vasemmanpuoleiset paneelit) ja punaiset nuolet ohjelmiin (oikea paneeli). Mut, mutaatio; WT, villityypin.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0019601.s001

(TIF) B Kuva S2.

Herkkyys ja lineaarisuus testaus

EGFR

eksoni 19 pyrosekvensointi määrityksessä. Seokset E746_A750del (Del-1a) mutantti ja villityypin PCR-tuotteiden NSCLC solulinjoja käytettiin analysoimaan mutaatio määritysrajan ja määrityksen lineaarisuus. Määritys on herkkä vähintään 5-10% mutatoitujen alleelien. Mutaatio merkinannoista on merkitty punaisella nuolilla. del, poistetaan; Mut, mutaatio; WT, villityypin.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0019601.s002

(TIF) B Kuva S3.

pyrosekvensointi analyysi

EGFR

eksonissa 19. NSCLC kasvain näytteissä. (A)

EGFR

eksonin 19 deleetio tunnistettu näytteessä 50% kasvainsolujen sisältöä jota ei aiemmin ollut tunnistettu dideoksisekvensoimalla; (B) Ei merkittäviä mutaation havaitsemisen näytteessä 13a 5% kasvain solun sisällön. Odotettu asema mutaation merkinannoista on merkitty punaisella nuolella. del, poistetaan; Mut, mutaatio; WT, villityypin.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0019601.s003

(TIF) B Kuva S4.

Pyrograms on

EGFR

eksoni 19 mutantti NSCLC solulinjassa ja kasvain näytteitä. (A) Del-B mutaation solulinjassa HCC827; (B-D) Kasvaimen yksilöitä, joiden korkea kasvainsolun sisältö mahdollistaa tarkka luonnehdinta yksilön mutaation;