Krooninen sairaus

tiivistelmä

Electrical gradientit ovat läsnä monissa kehitysmaissa ja uudistamiseksi kudosten ja kasvainten ympärillä. Jäljittely endogeeninen sähkökentät

in vitro

vaikuttaa voimakkaasti käyttäytymiseen monissa solutyypeissä. Kiinnostavaa, spesifisiin solutyyppeihin siirtää cathodally, toiset anodally ja jotkut polarisoivat niiden pitkä akseli on kohtisuorassa sähköisen vektorin. Nämä silmiinpistävää ilmiöt ovat todennäköisesti

in vivo

merkitystä, koska yksi määräävistä tekijöistä aikana syövän etäpesäkkeiden on kyky vaihtaa houkutteleva ja luotaantyöntävä muuttoliike vastauksena solunulkoiseen ohjausta ärsykkeisiin. Esitämme näyttöä siitä, että kohdunkaulan syövän solulinja HeLa siirtyy cathodally on tasavirtaa sähkökentän fysiologisen voimakkuuden, kun taas voimakkaasti metastaattinen eturauhassyöpä-solulinjaa PC-3-M kulkeutuu anodally. Erityisesti geneettinen häiriö proteiini seriini /treoniini-fosfataasi-1 (PP1) ja sen säädin NIPP1 vähenee suunnattuun vaellukseen näissä solulinjoissa. Toisaalta, indusoituvan ilmentymisen NIPP1 kytketty suuntakytkimen vaste HeLa-solujen cathodal hieman anodal on PP1-riippuvaisella tavalla. Merkillistä, induktio hyperaktiivinen PP1 /NIPP1 Holoentsyymi, siirretään edelleen suunnattuun vaellukseen kohti anodia. Osoitamme, että PP1 yhdessä NIPP1 ylössäätelee signaloinnin jonka GTPaasina Cdc42 ja osoittavat, että farmakologinen esto Cdc42 soluissa yli-ilmentävät NIPP1 talteen cathodal muuttoliikettä. Yhdessä tarjoamme ensimmäinen todiste säätelyyn suuntaava solun siirtolaisuuden NIPP1. Lisäksi olemme tunnistaa PP1 /NIPP1 uutena molekyyli kompassi, joka ohjaa suunnattu Solujen migraation kautta säätelyä Cdc42 signalointi ja ehdottaa tapa, jolla PP1 /NIPP1 voivat edistää muuttavia ominaisuuksia syöpäsoluja.

Citation: Martin-Granados C, Prescott AR, Van Dessel N, Van Eynde A, Arocena M, Klaska IP, et al. (2012) rooli PP1 /NIPP1 in Steering Migration of ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 7 (7): e40769. doi: 10,1371 /journal.pone.0040769

Editor: Maddy Parsons, Kings College London, Iso-Britannia

vastaanotettu: 24 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 13 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 16 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Martin-Granados et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoitti Wellcome Trust myöntää 079518 /z /06 /z CDM ja jonka Development Trust yliopiston Aberdeen kohteeseen JVF. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Solun maahanmuutto on keskeinen rooli monissa prosesseissa, kuten sikiön kehityksen haavan ja mis-säädellään signalointi vastauksia vaeltavien vihjeet voivat aiheuttaa patologioita kuten kasvaimen etäpesäke, tulehdus ja epilepsia [1] – [4]. Epiteelin, endoteelin, hermosolujen ja immuunijärjestelmän solut, muun muassa altistuvat erilaisille ärsykkeille, jotka ohjaavat solujen vaeltamiseen. Sen lisäksi, että laajemmin tunnustettu kemiallisia signaaleja, kuten kasvutekijöiden ja sytokiinien, endogeenisesti tuottamat sähkökentät (EF) ionisen luonteen on mitattu noin loukkaantunut kudoksiin, tulehdus- ja kasvainten [5] – [10]. Nämä sähköiset signaalit voivat toimia suuntaava ohjaavia merkkejä haavan paranemisen aikana, sikiön kehityksen ja tuumorigeneesin [11], siis selvittämisessä molekyylitason mekanismeista soluvasteita EF on suuri merkitys. Hakeminen tasainen, tasavirta (DC) EF soluihin ja kudoksiin

in vitro

jäljittelee vaikutuksia endogeenisen EF [12] ja tämä on tunnistanut useita solun pinnan reseptorien fosforylaation signalointi proteiineja ja toisiolähetit että transdusoivat sähköisiksi signaaleiksi. Esimerkiksi epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) ja integriinit ovat ensimmäisten joukossa anturit sähköiset signaalit useissa solutyypeissä. Poikkeavien eGFR-arvojen translokoituvat tason sisällä lipidikaksoiskerroksen kerääntyä cathodal, apikaalisella puolella soluja. Sillä keratinosyytit ja sarveiskalvon epiteelisolujen tämä tapahtuu 5-10 min EF altistus [13], [14]. Tämän seurauksena, EGF signalointi tulee polarisoitunut, mikä aiheuttaa suuremman cathodal aktivaation ERK1 /2, alavirtaan cathodal polymerointi F-aktiini ja suunnattu muuttoliike [13] – [15]. Samanlaisia ​​havaintoja on raportoitu tukemiseksi cathodal electrotaxis alkioiden ja aikuisten hermoesiastesolut [16]. Lisäksi integriinit α5 ja α5ß1 levittää ja yhteenlaskettu cathodally sidekudosmuodostussoluilla siirryttäessä cathodally, samoin β1-integriini epiteelisoluissa [17], [18]. Lisäksi ehtyminen SS4 integriinin tai lisäämällä anti-integriini β1 alayksikköä vasta-vaimentaa EF-suunnattu muuttoliike [18], [19].

Rooli Proteiinityrosiinin (Tyr) kinaaseja muuttoliike on ollut hyvin tutkittu, kun taas osuus proteiinin fosfataasien on alettu arvostaa vasta äskettäin [20]. Itse asiassa vain fosfataasi tiedetään olevan osallisena electrotaxis on lipidi fosfataasi ”fosfataasi tensin homologi poistetaan kromosomissa kymmenen (PTEN) [7].

Protein seriini /treoniini (Ser /Thr) fosfataasi-1 (PP1) on yksi erittäin säilyneitä entsyymejä tunnetaan ja sillä on keskeinen rooli eri solun prosesseja kuten proteiinisynteesiä, silmukointi, solusyklin etenemisen ja glykogeenin aineenvaihduntaan [21], [22]. Suuri joukko säätelyalayksiköt osakkuusyritysten kanssa PP1 katalyyttinen alayksikkö määrittää sen sijainti solussa ja substraattispesifisyys, välittävä valvontaa nämä monet fysiologisia prosesseja kautta PP1 holoenzymes [22] – [24]. NIPP1 (ydin- estäjä proteiinifosfataasi 1) on erittäin konservoitunut ja ekspressoituvat proteiinin, joka oli alun perin tunnusomaista kuin PP1-inhibiittori [25] – [27]. NIPP1 toimii eräänlaisena tukirakenteen proteiinia, jonka ympärille erilaisia ​​proteiineja, kuten fosfataasit, kinaasit, silmukoinnin tekijät ja kromatiinin määritteet kerätä toiminnallisesti. NIPP1 sisältää kaksi suurta PP1-vuorovaikutuksen sivustoja, jotka asuvat Keski-ja C-terminaaliset domeenit, joukossa aminohappotähteet 200-203, jotka edustavat RVxF-tyyppinen PP1 telakointi sivustolla. Uudemmat tiedot osoittavat, että vaikutukset NIPP1 on PP1 ovat alustaan ​​riippuvaisia: se voimakkaasti estää defosforyloitumista monien PP1 substraattien mutta edistää defosforyloitumista substraattien jotka rekrytoidaan kautta ForkHead Associated (FHA) domain [28]. Mielenkiintoista, PP1 sidottu yli-ilmentynyt villityypin NIPP1 (WT-NIPP1) on erittäin fosforyloitu Thr-320, tavaramerkki, joka inaktivoi PP1, kun taas PP1 sidottu C-päähän katkaistu NIPP1 proteiini (ACk-NIPP1) on pienempi fosforyloitiin Thr -320, mikä on osoitus hyperaktiivinen PP1 /NIPP1 Holoentsyymi [28].

rooli PP1 säätelijänä solun polariteetin ja muuttoliike alkaa syntyä. PP1 on vuorovaikutuksessa useita proteiineja, jotka säätelevät aktiinisytoskeletonin ja edistää muodostumista solun ulokkeita ja kiinnikkeistä [24]. Lisäksi erittäin tuoreessa raportissa on määrittänyt toiminnallista roolia varten PP1 säätelyssä enteerinen hermosolu muuttoliike [29]. Täällä me tutkimme, PP1 ja NIPP1 tasot säätelevät liikkuvuutta ja vaeltamista samansuuntaisesti kohdunkaulan syövän johdettu HeLa-solulinjasta. Lisäksi selvitimme osuus NIPP1 liittyvien PP1 vaeltamista samansuuntaisesti käyttämällä HeLa Tet-Off (HTO) soluja, jotka oli muokattu indusoitavasti ilmaista WT-NIPP1, C-päässä katkaistu NIPP1 (ACk-NIPP1) tai PP1 sitova mutantti of NIPP1 (mNIPP1) [28], [30]. Käytimme DC sähkökentän (EF), kuten helposti mukautuva ohjaus cue tiedetään säätelevän suunnattu solujen vaeltamiseen normaalien ja tuumorisolujen [31], [32]. Tässä osoitamme, että PP1 ja NIPP1 tasoja tarvitaan optimaalisen satunnainen motiliteettia yhden HeLa-solujen ja suunnatun muuttoliike vastauksena DC EF. Vahvistamme, että NIPP1 tasot vaaditaan suuntaava migraatiota testaamalla electrotaxis korkeasti metastaattinen eturauhassyöpä-solulinjaa PC-3-M. Lisäksi osoitamme, että sitoutuminen PP1 NIPP1 toimii kompassi, joka ohjaa suuntaan, jossa solut vaeltavat kautta ekspressiota sääteleviä integriinin ja kasvutekijäreseptorit, ja Cdc42 GTPaasi-aktiivisuus. Nämä tulokset tunnistaa toiminnallista roolia varten NIPP1 solujen maahanmuuton ja paljastaa PP1 /NIPP1 kuin ensimmäinen proteiini Ser /Thr fosfataasi kompleksin ohjaamalla suuntaava vaste solujen sähköisen ohjaavia merkkejä.

Tulokset

PP1 ja NIPP1 tarvitaan Random ja vaeltamista samansuuntaisesti HeLa ja PC-3-M solut vasteena sähköiselle ohjaavia merkkejä

aivan äskettäinen tutkimus on osoittanut, että hoito enteerinen hermostopienasoluille kanssa okadahapon, estäjä proteiini fosfa- 1 ja 2A, indusoi suuntaamaton solu ulokkeita ja satunnainen solujen liikkumista [29]. Siksi tutkimme mahdollinen rooli PP1 säätelyssä vaeltamista samansuuntaisesti kohdunkaulan epiteelin karsinooman johdettu HeLa Tet-Off (HTO) solut vasteena sähköiselle ohjaavia merkkejä. Tämän testasimme vaikutus aikaisemmin validoitu siRNA: iden kohdistaminen kaikki kolme PP1 isoformit satunnainen motiliteettia yksittäisiä soluja ja suunnatusta vaeltavien solujen vaste käytetylle EF (electrotaxis) [33]. PP1-proteiinin tasot alenivat 85% 48 tunnin kuluttua transfektion (Fig. 1A). Koska EF, sekä valvonta- ja PP1 pudotus (KD) vaeltaneet solut satunnaisesti (Fig. 1 B). Kun DC EF sovellettiin, 82% ± 5 ohjaus siRNA vaeltaneet solut cathodally (punainen, oikealle) (Fig. 1 B, katso video S1). EF käsittely lisäsi etäisyyttä siirtynyt, nopeus siirtymisen ja directedness valvonnan siRNA soluja (Fig. 1 C). Kuitenkin PP1 ehtyminen täysin heikentynyt electrotaxis, 57% ± 2 PP1 siRNA vaeltaneet solut cathodally (punainen, oikea) ja 43% ± 2 anodally (musta, vasen) (Fig. 1 B, C, katso video S2). Lisäksi havaitsimme, että solut köyhdytetty PP1 näytetään vähemmän solu- ulokkeita ja enemmän stressiä kuituja verrattuna ohjata siRNA soluihin (Fig. 1 D). Erityisesti menetys PP1 pieneni filopodia muodostumista käsittelemättömiä ja EF-käsitellyt solut (Fig. 1 E).

. Hoito vanhempien HeLa Tet-Off (HTO) soluja siRNA voimakkaasti kuluttaa PP1 tasoja 48 tunnin kuluttua transfektion. Endogeeninen PP1 tasot näkyviksi PP1 tunnistavien vasta-aineiden kaikki isoformit. B. Plot kaaviot osoittavat, että menetys PP1 heikentää solujen kykyä siirtyä kohti katodia. Jokainen rivi edustaa muuttoliike lentorata yhden solun. Lähtökohtana jokaiselle solujen vaeltamiseen raita on origossa. Cell kappaleita ääriasentojen oikealle näkyvät punaisella ( ”C”, katodi) sekä vasemmalle näkyvät mustina ( ”A”, anodi). EF-käsittelemättömät solut testattiin kontrolleina. Ohjaus siRNA solut vaeltavat voimakkaasti kohti katodi; PP1 siRNA käsitellyt solut eivät kykene siirtymään vastauksena DC EF. Vaaka näyttää etäisyyden vaelsivat um. C. PP1 ehtyminen vähentää voimakkaasti etäisyyttä siirtynyt, nopeus, ja directedness vastauksena fysiologisen DC EF. Virhe palkit ovat S.E.M.

p

arvot merkittäviä eroja matkan, nopeuden ja directedness näkyvät. D. lokalisaatio endogeenisen PP1 ja jakelu rihmamaisia-aktiini hallinnassa ja PP1 köyhdytettyä soluja käsiteltiin DC EF. Endogeeninen PP1 tasot näkyviksi PP1 tunnistavien vasta-aineiden kaikki isomuodot (vihreä) ja polymeroidut aktiini havaittiin käyttämällä rodamiinifalloidiinia (punainen). Ytimet on värjätty DAPI (sininen). Nuolet merkitsevät soluja, joilla on vahva lasku PP1 tasot korreloivat puutteita muodostumiseen aktiini rikas ulokkeita. Kuvat ovat näytetään. Mittakaava on 50 pm. E. numerot solujen filopodia kvantitoitiin laskemalla 100 solua. Virhe palkit ovat S.E.M.

p

arvot merkittäviä eroja on esitetty. Kuvat esittävät yksityiskohtaa solun ulkonemia ohjaus siRNA ja PP1 siRNA soluja. Nuolet merkitsevät lukuisia filopodia kontrollisoluissa ja ääriviivat alueilla, joilla on suuri puute filopodia solussa reunoilla PP1 siRNA soluissa.

Lisäksi tutkimme kuitenkin mahdollisen roolin PP1 Interactor NIPP1 muodostumiseen aktiini ulokkeita ja satunnaisessa ja vaeltamista samansuuntaisesti HTO soluja. Ensinnäkin, me tutki NIPP1 tarvitaan muuttoliikkeen testaamalla vaikutuksesta aiemmin validoitu siRNA: iden kohdistaminen NIPP1 [34]. NIPP1 proteiinin tasot alenivat 80% 48 tunnin kuluttua transfektion (Fig. 2A). Koska EF, sekä valvonta- ja NIPP1 pudotus (KD) vaeltaneet solut satunnaisesti (Fig. 2B). Läsnäollessa EF, ohjaus solut osoittivat voimakasta cathodal muuttoliike; 87% ± 4 ohjaus siRNA vaeltaneet solut cathodally (punainen, oikea) ja 13% ± 4 anodally (musta, vasen) (Fig. 2B; katso video S3). Kuitenkin NIPP1 KD solut osoittivat paljon pyöristettyjä cathodal muuttoliike, 57% ± 3 NIPP1 siRNA vaeltaneet solut cathodally (punainen, oikea) ja 43% ± 3 anodally (musta, vasen) (Fig. 2B, C ja katso video S4). Lisäksi ilman EF kahden kertaisesti alentunut nopeus ja siten etäisyys solumigraation nähtiin NIPP1 siRNA-soluissa verrattuna ohjata siRNA käsiteltyjen solujen (kuvio. 2C). Pienentynyt nopeus ja etäisyys muuttoliikkeen aiheuttama menetys NIPP1 oli vielä suurempi soluissa alttiiksi EF joka osoitti nelinkertaista lasku solujen vaeltamiseen ja yli kaksinkertainen lasku nopeus siirtolaisuuden EF hoidettuun kontrolliryhmään siRNA soluja (Fig. 2C). Yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien DC EF edistänyt aktiini polymerointi ja muodostumista aktiini-rikas solu ulkonemiin ohjaus HTO soluissa (Kuva. 2D). Kuitenkin NIPP1 KD soluja oli vähemmän solu- ulokkeita (Fig. 2D). Erityisesti, kyky muodostaa filopodia in NIPP1 KD-soluissa on vaarantunut vakavasti käsittelemättömissä ja EF-käsitellyt solut (Fig. 2E).

. Hoito vanhempien HeLa Tet-Off (HTO) soluja siRNA voimakkaasti kuluttaa NIPP1 tasoja 48 tunnin kuluttua transfektion. Solulysaatit analysoitiin SDS /PAGE: lla ja immunoblottaus. Vyöhykettä, jotka vastasivat kaikkia PP1 isoformit havaittiin ja GAPDH käytettiin latauskontrollina. B. Plot kaaviot osoittavat, että menetys NIPP1 heikentää solujen kykyä siirtyä kohti katodia. Ohjaus siRNA solut vaeltavat voimakkaasti kohti katodi; NIPP1 siRNA käsitellyt solut osoittavat paljon pienempi cathodal vasteen. Vaaka näyttää etäisyyden vaelsivat um. Asteikot ovat erilaiset kaavioita, jotta muun muassa kappaleet jokaisen solun määritetään. C. NIPP1 ehtyminen vähentää voimakkaasti etäisyyttä siirtynyt, nopeus, ja directedness vastauksena fysiologisen DC EF. Tiedot on saatu vähintään kolmen kokeen. Virhe palkit ovat S.E.M.

p

arvot merkittäviä eroja matkan, nopeuden ja directedness näkyvät. D. lokalisaatio endogeenisen NIPP1 ja jakelu rihmamaisia-aktiini hallinnassa ja NIPP1 köyhdytettyä soluja käsiteltiin DC EF. Endogeeninen NIPP1 tasot tunnistettiin kanin anti-NIPP1-vasta-aine (vihreä) ja polymeeristen aktiini havaittiin käyttäen rodamiinifalloidiinia (punainen). Tumat värjätään DAPI (sininen). NIPP1 paikantuu tumaan in EF-käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen ja sen tasot vähenevät siRNA. Mittakaava on 50 pm. E. numerot solujen filopodia kvantitoitiin laskemalla 100 solua. Virhe palkit ovat S.E.M.

p

arvot merkittäviä eroja on esitetty. Kuvat esittävät yksityiskohtaa solun ulkonemia ohjaus siRNA ja NIPP1si RNA soluista. Nuolet merkitsevät lukuisia filopodia kontrollisoluissa ja ääriviivat alueilla, joilla on suuri puute filopodia solussa reunoilla NIPP1 siRNA soluissa.

edelleen vahvistaa tietomme ja sulkea pois mahdolliset off-tavoite vaikutukset siRNA kohdistaminen NIPP1 myös tutkinut electrotactic vaste erittäin metastaattinen ihmisen eturauhassyövän solulinjaa PC-3-M, köyhdytetty NIPP1 tasojen kautta ilmentymisen shRNA kohdistaminen NIPP1 jälkeen IPTG hoidon. NIPP1 pitoisuus väheni noin 70%, kun 5 päivää IPTG hoidon (Fig. 3A). Osoitamme ensimmäistä kertaa, että PC-3-M-soluissa näyttää erittäin vankka electrotactic vastaus kohti anodia kuten osoitetaan vahvasti negatiivinen directedness -0,9 (Fig. 3B, C ja katso video S5), ja että menetys NIPP1 vähentää voimakkaasti suuntaava vaste näiden solujen DC EF (Fig. 3B, C, ja katso video S6).

. Hoito PC-3-M-solujen IPTG indusoi NIPP1 ehtyminen. Solulysaatit analysoitiin SDS /PAGE: lla ja immunoblottaus. Vastaavat juovat PP1 isoformit havaittiin ja GAPDH: ta käytettiin loading ohjaus. B. Plot kaaviot osoittavat, että menetys NIPP1 heikentää kykyä PC-3-M-solut siirtymään anodally. Migration trajectories seurattiin kolmen tunnin ajan. Lähtökohtana jokaiselle solujen vaeltamiseen raita on origossa. Cell kappaleita ääriasentojen oikealle näkyvät punaisina ja ne vasemmalle näkyvät mustina. Katodi on merkitty ”C”, ja anodi ”A”, kun DC EF levitetään soluihin. Ohjaus salattu PC-3-M-solut siirtyvät voimakkaasti anodally (negatiivinen directedness arvo); solut, jotka ilmentävät shRNA kohdistaminen NIPP1 osoittavat paljon pienempi anodal vasteen. Vaaka näyttää etäisyyden vaelsivat um. Asteikot ovat erilaiset kaavioita, jotta muun muassa kappaleet jokaisen solun määritetään. C. NIPP1 ehtyminen voimakkaasti alentunut etäisyyden vaelsivat ja directedness vastauksena fysiologisen DC EF. Tiedot on saatu vähintään kolmen kokeen. Virhe palkit ovat S.E.M.

p

arvot merkittäviä eroja matkan, nopeuden ja directedness näkyvät.

Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että sekä PP1 ja NIPP1 tarvitaan Suunnatun vaeltavien vaste HeLa ja PC -3-M solut DC EF.

PP1 /NIPP1 OHJAUSPOLJIN Cell Migration

Seuraavaksi otimme käänteinen lähestymistapa ja tutkitaan vaikutus yli-ilmentymisen NIPP1 ja sen sitoutumisen PP1 EF aiheuttama vaeltamista samansuuntaisesti. Tätä varten käytimme aiemmin tunnettu HeLa Tet-Off (HTO) solulinjat, jotka ilmentävät kolme erilaista NIPP1 variantteja ilman doxycylin (Fig. 4A) [28], [30]. Kolme päivää sen jälkeen, kun doxycyclin poistamisen väliaineen, ilmaus NIPP1 varianttien arvioitiin Western-blottauksella (kuvio. 4B). Nämä variantit sisältyy FLAG-merkitty WT-NIPP1, joka liittyy (osittain) aktiivinen PP1, C-terminaalisesti koloja FLAG-NIPP1 (ACk-NIPP1), joka on kompleksoitunut konstitutiivisesti aktiivista PP1 ja pisteen mutantti (mNIPP1), josta puuttuu toiminnallinen RVxF-tyyppinen PP1 sitova motiivi ja siksi vain marginaalisesti sitoutuvat PP1 (Fig. 4A).

. Cartoon endogeenisten NIPP1 ja eri FLAG-merkittyä NIPP1 variantit ilmaisi jälkeen doxycyclin poiston HeLa Tet-Off (HTO) solulinjat. Kaikki kolme NIPP1 vaihtoehdot ovat forkhead liittyvä verkkotunnus (FHA). Konsensus PP1-sitoutuva sekvenssi, RVTF in villityypistä-NIPP1 on mutatoitu RATA in FLAG-mNIPP1 variantti. C-terminaalinen auto-inhibitorisen (ID) domeeni ei sisälly FLAG-leimattua ACk-NIPP1 proteiinia, jolloin ilmaus konstitutiivisesti aktiivisen PP1 /NIPP1 holoentsyymin. B. ilmentäminen NIPP1 variantteja vahvistettiin Western-blottauksella poistamisen jälkeen doxycyclin. Solulysaatit analysoitiin SDS /PAGE: lla ja immunoblottaus. Vastaavat juovat PP1 isoformit havaittiin ja GAPDH: ta käytettiin loading ohjaus. C. NIPP1 ilmaisun ja lokalisointi HTO soluissa varmistettiin ICC EF-käsiteltyjen ja käsittelemättömien HTO soluja. Anti-FLAG-vasta-aineen ja rodamiinifalloidiinia on käytetty havaitsemaan FLAG-leimatun NIPP1 variantit (vihreä) ja F-aktiini (punainen). Tumat värjättiin DAPI. Yli-ilmentynyt NIPP1 paikantuu tumaan in EF-käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen. Mittakaava on 50 pm. Juoni kaaviot osoittavat, että EF fysiologista vahvuutta (200 mV /mm) indusoi selvästi vaeltavia vasteita HTO soluissa, jotka ilmentävät eri NIPP1 variantteja. EF-käsittelemättömät HTO solut näkyvät valvontaa. Migration trajectories seurattiin kolme tuntia poissa ja läsnä EF. Jokainen solu kanta 0 h on sijoitettu alkuperä (0, 0). Solut jonka pää kanta on oikea ovat värillisiä punaista ja ne vasemmalle näkyvät mustina. Katodi on merkitty ”C”, ja anodi on merkitty ”A”, kun DC EF levitetään soluihin. Vaaka näyttää etäisyyden vaelsivat um. Huomaa, että asteikot ovat erilaisia ​​joukossa kaavioita, jotta muun muassa kappaleet jokaisen solun määritetään.

lokalisointi kolmesta eri NIPP1 variantteja tutkittiin immunosolukemiallisella. Samanlaisia ​​endogeeniseen NIPP1, FLAG-merkitty W.T- ja ACk-NIPP1 olivat paikallisia voimakkaasti tumaan in EF-käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen (Fig. 4C, solu kuvat). Perinuclear värjäys FLAG-merkitty PP1 sitova mutantti NIPP1 (mNIPP1) havaittiin myös (Fig. 4C, solu kuvat).

Seuraavaksi testasimme onko yhdistys PP1 kanssa NIPP1 vaikuttaa electrotaxis of HTO solujen . Ilman EF, solujen vaeltamiseen suunnattiin satunnaisesti kaikissa solutyypeissä (kuvio. 4C, ”no EF” alat). Kuitenkin HTO solut, jotka ilmentävät FLAG-merkitty NIPP1 variantit osoittivat joukko eri käyttäytymistä EF. 72% ± 3 vanhempien HTO vaeltaneet solut cathodally (oikealla) ja 28% ± 3 anodally (vasemmalla) ja esittää directedness 0,27 ± 0,05 (Fig. 4C; katso video S7). Yli-ilmentymisen villityypistä-NIPP1 siirsivät cathodal vastaus hieman anodal, jossa vain 35% ± 12 liikkuvien solujen cathodally ja 65% ± 12 anodally ja directedness on -0,12 ± 0,05 (Fig. 4C; katso video S8). Lisäksi yli-ilmentyminen ACk-NIPP1 indusoi voimakkaan siirtymän suuntaava vastausta. Vain 16% ± 5 soluista siirtyneet cathodally jossa merkittävä 84% ± 5 liikkuvien solujen anodally antaa voimakkaasti käänteinen directedness of -0,55 ± 0,04 (Fig. 4C; katso video S9). Mielenkiintoista, yli-ilmentyminen mNIPP1 ei vaikuttanut cathodal muuttoliike ja solut käyttäytyi samalla tavalla vanhempien HTO soluihin; 80% ± 13 siirtynyt cathodally ja 20% ± 13 anodally, ja näytetään vahva cathodal directedness 0,52 ± 0,1 (Fig. 4C; katso video S10).

Nämä tulokset osoittavat, että valvonta suunta siirtolaisuuden NIPP1 riippuu sen yhdessä PP1. Kun NIPP1 yliekspressoitui ja kykenee sitomaan PP1, The cathodal muuttoliike siirtynyt hieman anodal. Lisäksi induktio konstitutiivisesti aktiivisen PP1 /NIPP1 Holoentsyymi indusoi vielä vahvempi anodal vastausta. Kuitenkin PP1 sitova mutantti NIPP1 aiheutti cathodal muuttoliike, samanlainen vanhempien soluihin.

PP1 /NIPP1 Controls sentrosomimäärän Positioning aikana Migration

korrelaatio asema sentrosomimäärän ja suunta solumigraation on havaittu useissa solutyypeissä [35]. Monissa tapauksissa sentrosomimäärän sijaitsee takana etureunan ja edessä tumassa. Siksi meidän vieressä pyrittiin vahvistaa saadut tulokset mitataan suuntaava vastetta HTO solujen yli-ilmentävät FLAG-merkitty NIPP1 variantteja tutkimalla oliko korrelaatio asema sentrosomimäärän ja suunnan solun liikkeen HTO soluissa. In HTO soluissa (ei EF) sentrosomien sijoitettiin sattumanvaraisesti (Fig. 5). Sentrosomien vanhempien solujen EF polarisoitunut cathodally (Polarisaatioindeksi (PI) = 0,46 (ks koemenettelytavat) Fig. 5). Kuitenkin solut yli-ilmentävät villityypistä-NIPP1 näkyy lähes sama jakelu sentrosomien kohti katodi ja anodi (PI = -0,09; Fig. 5). Häiriöt EF aiheuttaman cathodal centrosomal polarisaation soluissa yli-ilmentävät WT-NIPP1 oli riippuvainen PP1 sitoutumisesta NIPP1 koska solut yli-ilmentävät mNIPP1 polarisoitunut niiden sentrosomien kohti katodi (PI = 0,77), samoin kuin vanhempien soluja (PI = 0,46; Fig. 5) . Kiehtovan, induktio konstitutiivisesti aktiivisen PP1 /NIPP1 Holoentsyymi indusoi sekä vahva anodal polarisaatio sentrosomien (PI = -0,23) ja vahva anodal solujen kulkeutumista (kuviot. 4C, 5). Nämä havainnot osoittavat, että sijoittaminen sentrosomimäärän muuton aikana kuvastaa vaeltamista samansuuntaisesti HeLa-soluissa. Mikä tärkeintä, nämä tiedot osoittavat, että yhdistys PP1 kanssa NIPP1 ohjaa kytkintä anodal sentrosomimäärän polarisaatio ja anodal muuttoliike, luultavasti kuvastaa sitoutuminen vastaavien solun tukirangan koneiden molemmissa prosesseissa.

. DC EF polarizes sentrosomien katodiin vanhempien HTO soluissa katsottuna laskemalla solut 5 alueilla, ylhäältä (t), Right (katodi in EF-käsitellyissä soluissa), pohja (b), vasemmalle (anodi EF käsiteltyjä soluja ) ja keskustan tuman (merkitty valkoinen piste). B. Vanhempien solut ja mNIPP1 solut asemoimaan sentrosomien cathodally EF, kun taas yli-ilmentyminen villityypistä-NIPP1 häiritsee cathodal centrosomal polarisaatio ja yli-ilmentyminen ACk-NIPP1 siirtää cathodal polarisaatio sentrosomien on anodal. 100 solut laskettiin kussakin tapauksessa ja tulokset ilmoitetaan prosentteina.

esto Cdc42 Kääntää NIPP1 aiheuttama Anodal Migration ja Centrosomal Polarisaatio

Vaikutukset NIPP1 muodostumista filopodia (Fig. 2), suunta solumigraation (Fig. 4C) ja sentrosomimäärän paikannus fysiologisessa EF (Fig. 5) ovat riippuvaisia ​​PP1. Mielenkiintoista on, että genomin laajuinen profilointi HTO solujen paljastui, että NIPP1 vaikuttaa myös ilmentyminen useiden geenien PP1-riippuvaisella tavalla [30]. Se on vakiintunut, että GTPaasi Cdc42 ohjaa filopodial laajennus ja sentrosomimäärän paikannus siirryttäessä soluissa [36] – [38], ja että vaeltamista samansuuntaisesti sarveiskalvon epiteelisolujen vastauksena DC EF ohjataan Cdc42 /Rho kytkin [39 ]. Yhdessä nämä tiedot johtavat houkutteleva hypoteesi, että NIPP1 aiheuttama anodal polarisaatio välittää signaloinnin kautta Cdc42. Testata tätä käsitettä, ensin analysoidaan luettelo geenien merkittävästi voimistuvan yli-ilmentyminen WT-NIPP1 tai ACk-NIPP1, mutta ei mNIPP1, kaikki verrattuna vanhempien HTO solulinjassa [30] ja julkaisemattomia tietoja (katso materiaalit ja menetelmät). Mielenkiintoista on, löydettiin 24 geenejä, jotka osallistuvat solun tukirangan dynamiikka, soluväliaineen vuorovaikutuksia ja Cdc42 polku, ja aktivoidaan yliekspressio WT-NIPP1 tai ACk-NIPP1, mutta ei mNIPP1 (taulukko 1).

Seuraavaksi mittasimme Cdc42 GTPaasi aktiivisuus HTO solujen fysiologinen EF ja todentaa, onko mitattu aktiivisuus estyi erityiseen ja solun läpäisevä Cdc42 GTPaasina estäjä ML141 (CID2950007) [40]. Huomasimme, että DC EF indusoi pieni mutta merkittävä lisäys Cdc42 GTPaasi toimintaa kaikissa HTO soluissa (kuvio. 6A; p 0,001) ja että hoito näiden solujen 10pM ML141 poistetaan kokonaan Cdc42 GTPaasi aktiivisuutta (p vertailu- näytteiden puuttumisen ja läsnäolon ML141 olivat kaikissa tapauksissa 0,01). Mielenkiintoista, esto Cdc42 ei vaikuttanut cathodal kulkeutumista vanhempien solujen (directedness = 0,42 ± 0,06; Fig. 6B; katso video S11). Kuitenkin kääntyminen EF-ohjannut maahanmuuttoa yliekspressio villityypistä-NIPP1 otettiin talteen estämällä Cdc42 (directedness = 0,29 ± 0,05; Fig. 6B; katso video S12). Samoin EF alttiina ACk-NIPP1 soluja, jotka kulkeutuvat anodally, menetetään tämä vasteen Cdc42 inhiboitui ML141 ja jopa näkyy kohtalainen cathodal vaste (directedness = 0,2 ± 0,1; Fig. 6B; katso video S13). EF-stimulaation näissä soluissa (+ ML141) edistää muodostumista rasitukseen liittyviä säikeitä (tuloksia ei ole esitetty), ja indusoi solujen leviämisen ja poimutuskokoonpanosta yhdessä kupliminen aktiinisytoskeletonin (tuloksia ei ole esitetty). Monissa tapauksissa, joissa voimakas ruffling havaittiin, solut irtosi. Nostamalla osa-G1 väestöstä (kuolleet solut) ML141-esikäsitellyt ACk-NIPP1 solut (määritetty virtaussytometrialla) voi mahdollisesti selittää alhaisen muuttoliikkeen ja irtoaminen havaittu näissä soluissa. Sen sijaan, ML141 ei aiheuttanut vika elinkelpoisuus vanhempien, mNIPP1 ja villityypistä-NIPP1 soluja (Kuva. S1).

. Vaikutus ML141 on Cdc42 GTPaasi toimintaa stimuloimattomissa viljeltyjen solujen täydellistä alustaa ja EF stimuloiman HTO yliekspressoiviin soluihin FLAG-NIPP1 proteiinin variantteja. Tasot Cdc42-GTP määräytyy G-LISA vanhempien, villityypistä-NIPP1, ACk-NIPP1 ja mRATA solujen puuttuessa tai läsnä DC: EF ja soluissa esikäsiteltiin 10 uM ML141 ennen sähköstimulaation.

p

arvot vanhempien ja villityypistä-NIPP1 ja vanhempien on ACk-NIPP1 täydellisessä väliaineessa oli 0,1 ja 0,01, tässä järjestyksessä;

p

vertailu- näytteiden puuttuessa ja läsnä ML141 olivat kaikissa tapauksissa 0,01. B. Cdc42 esto pelastaa cathodal polarisaatio ja tämä korreloi sentrosomimäärän paikannus. Directedness arvot muutolle EF käsiteltyjä soluja inkuboitiin ML141. Cdc42 esto pelastaa positiivinen solu directedness laski villityypistä-NIPP1 yli-ilmentymisen. Voimakkaasti negatiivinen directedness arvo näytetään ACk-NIPP1 solujen lähenee 0, kun soluja esikäsitellään Cdc42-inhibiittori. Yksinkertaisuuden directedness arvojen puuttuessa EF on vanhempien, villityypistä-NIPP1, ACk-NIPP1, ja mNIPP1 ja ilman ML141 ei ole sisällytetty kaaviossa. Nämä olivat ilman ML141, -0,07 ± 0,04; 0,05 ± 0,09; -0,08 ± 0,05 ja -0,01 ± 0,04, tässä järjestyksessä; jossa ML141 oli -0,07 ± 0,04; 0,09 ± 0,05; -0,07 ± 0,05 ja -0,01 ± 0,04, tässä järjestyksessä. Koska EF-arvot olivat kaikissa tapauksissa hyvin lähellä 0 eroja ja neljä riviä ei ollut tilastollisesti merkitsevä tapauksiin. Aineisto määrällisesti vähintään kolmesta kokeesta. Virhe palkit ovat S.E.M.

p

arvot merkittäviä eroja directedness näytetään. Polarisaatio indeksi sentrosomien ohjeiden mukaisesti laskettuna materiaaleja ja menetelmiä. Polarisaatio indeksi WT-NIPP1 ja ACk-NIPP1 solujen tulee samanlainen polarisaatioindeksi vanhempien solujen kun soluja käsitellään Cdc42-inhibiittori ML141.

Inhibition of Cdc42 GTPaasi soluissa, jotka yliekspressoivat NIPP1 mutta eivät kykene sitovat PP1 (mNIPP1) ei vaikuttanut heidän vahva cathodal muuttoliike (directedness = 0.57 ± 0,03; Fig. 6B; katso video S14). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että kytkintä suuntaan EF muuttoliikkeelle aiheuttama yliekspressio NIPP1 riippuu yhdistys NIPP1 kanssa PP1 ja että se välittyy Cdc42 GTPaasi aktiivisuutta.

tutki myös estämällä Cdc42 in HTO solut voitaisiin palauttaa polarisaatio sentrosomien kohti katodi WT-NIPP1 ja ACk-NIPP1 soluissa. Osoitamme, että Cdc42 esto lisäsi centrosomal PI vanhemmaissolujen tasolle verrattavissa havaittiin mNIPP1 soluissa (PI = 0.76 kummassakin tapauksessa), talteen cathodal centrosomal polarisaatio WT-NIPP1 soluja (PI = 0,59) ja useimmat silmiinpistävän, indusoi voimakas polarisoituminen sentrosomien kohti katodi ACk-NIPP1 soluja (PI = 0,62) (Fig. 6B). Nämä havainnot osoittavat, että EF aiheuttama centrosomal polarisaatio kohti katodi on Cdc42 GTPaasia riippumaton. Kuitenkin anodal polarisaatio sentrosomien havaittu WT-NIPP1 ja ACk-NIPP1 soluissa edellyttää sekä sen yhdessä PP1 ja Cdc42 GTPaasi toimintaa.

Keskustelu

Tarkemmin, huomasimme, että molemmat PP1 ja NIPP1 positiivisesti