Krooninen sairaus

tiivistelmä

LC3s (MAP1-LC3A, B ja C) ovat rakenteellisia proteiineja autophagosomal kalvoja, laajalti käytetty biomarkkereina of autophagy. Olipa nämä kolme LC3 proteiineilla on samanlainen biologinen rooli autophagy epäselviä. Tarkastellaan rinnakkain solunsisäisen ilmentymisen kuviot kolme LC3 proteiinien paneelissa ihmisen syöpäsolulinjoissa sekä normaaleissa MRC5 fibroblasteissa ja HUVEC, käyttäen konfokaalimikroskopialla ja western blot -analyysi solufraktioiden. Sytoplasmassa, oli minimaalinen co-localization välillä LC3A, B ja C värjäys, mikä viittaa siihen, että kyseessä autophagosomes on muodostettu vain yksi kolmesta LC3 proteiineja. LC3A osoitti perinuclear ja ydinvoiman lokalisointi, kun LC3B jakautuiravintoaineiden koko sytoplasmassa ja lokalisoitu nucleolar alueilla. LC3C sijaitsi sytoplasmassa ja voimakkaasti ytimet (pois lukien nucleoli), jossa se laajasti yhteistyössä lokalisoitu kanssa LC3A ja Beclin-1 autophagy aloittamista proteiinia. Beclin 1 tiedetään sisältävän ydin- signaalisekvenssiä. Esto tumasta toiminto Leptomycin B johti tumakertymään kaikista LC3 ja Beclin-1-proteiineja, kun taas Ivermektiini joka estää ydinaseiden tuonti osoitti vähentäminen kertymistä, mutta ei kaikissa solulinjoissa. Koska endogeeninen LC3 proteiineja käytetään suuria merkkiaineiden autophagy kliinisissä tutkimuksissa ja solulinjoissa, on tärkeää tarkistaa vasta-aineiden spesifisyys käytetty, koska kinetiikka nämä molekyylit eivät ole identtisiä ja saattavat olla erillisiä biologisia rooleja. Erillinen subsellulaariseen ekspressiomalleja LC3s luovat pohjan lisätutkimuksia.

Citation: Koukourakis MI, Kalamida D, Giatromanolaki A, Zois CE, Sivridis E, Pouliliou S, et al. (2015) Autophagosome Proteiinit LC3A, LC3B ja LC3C on erilaiset Subsellulaariset Jakelu kinetiikka ja ilmentäminen Cancer Cell Lines. PLoS ONE 10 (9): e0137675. doi: 10,1371 /journal.pone.0137675

Toimittaja: Srinivasa M. Srinivasula, IISER-TVM, Intia

vastaanotettu: 04 heinäkuu 2015; Hyväksytty: 20 elokuu 2015; Julkaistu: 17 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Koukourakis et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: tutkimus on rahoitettu «koulutuksen ja elinikäisen oppimisen – ARISTEIA» projekti, koodi ei 520, ESPA 2007-2013 GGET päätöksen luku 12605 /26.9.2012 (URL: https://www.espa.gr/el/pages/proclamationsfs.aspx?item=1736). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Autophagy on merkittävä solunsisäinen koulutusjakson hajoamista ja kierrätys pitkäikäisen proteiinien ja koko soluelimiin [1,2]. LC3s (MAP1-LC3s) ovat rakenteellisia proteiineja autophagosomal kalvoja. Ihmisen LC3 geeniperheen on kolme jäsentä, LC3A, LC3B ja LC3C, kun taas kaksi versiota LC3A proteiinin on tunnistettu [3,4]. Ihmisen LC3 geeniperheen on kolme jäsenille LC3A, LC3B ja LC3C taas tuoreessa paperi on ilmoitettu viisi jäsentä, LC3A (variantti-1, variantti-2), LC3B, LC3B2 ja LC3C [4]. Lomake LC3-II on yksi tärkeimmistä komponenttien autophagosome kalvon (LC3A-II ja LC3B-II, myös LC3C-II, mutta ei tutkittu tässä), joka sijaitsee sekä sisä- että ulko-sivuston kalvon. LC3-II on johdettu proLC3 ~ 30 kDa proteiinia, sen jälkeen lohkaisu autophagin Atg4 tuottaa aktiivisen sytosolisen muodon LC3-I. Tämä puolestaan ​​aktivoituu Atg7, ja siirretään sitten Atg3, toinen E2-kaltaista entsyymiä, tulossa kalvoon sitoutunut muoto, LC3-II [5]. Sen jälkeen autophagosome muodostumista, LC3-II sijaitsee ulomman sivusto vapautuu sytosoliin ja LC3-II sijaitsevat sisempi sivuston hajottavat hydrolaaseissa [6]. Tässä jälkimmäisessä muodossa, LC3-II paikantuu pallomaisella autophagosomal ja autolysosomal kalvoja, jotka muodostavat sopivan merkkiaine autophagic aktiivisuuden [6,7].

Onko nämä kolme LC3 proteiineilla on samanlainen biologinen rooli autophagy tai muissa polkuja epäselviä. Kirjallisuudessa useimmat tutkimukset keskittyvät yleisesti LC3 lauseke, raportoimatta spesifisyydestä käytetyt vasta-aineet, jotka perustuvat mielivaltainen oletus, että A ja B muodot ovat samanarvoisia. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme, kun laajasti validointi vasta-aineen spesifisyyden, ilmaisu samanaikaisesti kolmen LC3A, B ja C-proteiineja ihmisen syöpäsolulinjoissa, joka esittää erilliset kuviot osa-sijainnista solussa, mikä viittaa siihen, selvä biologinen rooli näiden sisko proteiineja .

tulokset

tunnistaminen LC3A ja B spesifisten vasta

vasta-aineiden spesifisyys testattiin kaupallisen käytettävissä ihmisen rekombinanttiproteiineja LC3A ja LC3B esitetään kuviossa 1A. Anti-LC3A vasta-aineita (ap1805a ja ab62720) ovat spesifisiä proteiinin LC3A ja anti-LC3B vasta-aineita (5F10 ja NB100-2220) on spesifinen proteiinin LC3B. L8918, NB600-1384 ja L7543 voi sitoutua joko LC3A tai LC3B, mutta eri herkkyys, kun taas ab52628 ei havaita joko kaksi isoformia samoissa olosuhteissa.

(A) spesifisyys eri anti-LC3 testattujen vasta-aineiden rekombinantti LC3A ja LC3B proteiineja. (B) toinen LC3A ja LC3B käsittelyn jälkeen 24h bafilomysiini (100 nM) hoitoa gliooman ja rintasyövän solulinjoissa, käyttäen LC3A erityisiä ab62720 ja LC3B erityisten 5F10-vasta-aineita (C) kahdelle immunofluorecence on A549-solulinja käyttäen ab62720 tunnustetaan yksinomaan LC3A proteiinin ja 5F10-vasta-aine, joka reagoi yksinomaan LC3B. Totesi selvästi erillistä ilmaus LC3A vihreä vacuoles kanssa perinuclear /ydinvoiman lokalisointi ja LC3B punaisia ​​vacuoles että on hajanainen, koko solulimassa, lokalisointi. Ei ole olemassa autophagosomes koostuu sekä LC3A ja LC3B proteiineja (c1, c2), kun taas LC3A ja LAMP2a esittävät laajan rinnakkaispaikantumisen (c3, c4). Erillinen identiteetti LC3A ja LC3B autophagosomes vahvistettiin myös happamissa olosuhteissa (c5) ja altistumisen jälkeen bafilomysiini (c6). (D) Double immunofluorecence A549 solulinjassa käyttäen ab62720 tunnustaa yksinomaan LC3A proteiinin ja NB600-1384, joka reagoi sekä LC3A ja LC3B proteiineja. Huomattava, että suurin osa perinuclear /ydin- LC3A (vihreä) vacuoles osoittavat kahden immunofluoresenssilla (keltainen), joka on seurausta kahden LC3A /LC3B reaktiivisuus, joka tuottaa NB600-1384 vasta-ainetta. (E) LC3A ja LC3B siRNA erityisesti estää ilmentymisen LC3A ja LC3B proteiineja, vastaavasti, A549-solulinja (E1,2,3). E4 reaktiivisuus LC3A (ab62720 Ab) ja LC3B (5F10-vasta-aine) on esitetty, seuraavat hiljentäminen LC3A tai LC3B geenien, että A549-solulinja.

keskittyneet sekä LC3A ja LC3B proteiineja analysoimaan autophagic vastauksena bafilomysiini solulinjoissa käyttäen kahta vasta-aineita, jotka selektiivisesti tunnistavat nämä isoformit. Kaksi isoformia osoittivat eri peruslinja ja vasteprofiilin ilmaisu (kuvio 1 B) alle bafilomysiini stressi oli kertymistä LC3A-II ja LC3B-II kaikissa solulinjoissa, mikä viittaa siihen, että molemmat proteiinit voitaisiin käyttää arvioitaessa autophagic flux (kuvio 1 B) . T98G ja BT474 solulinjoilla on korkeampi autophagic vuo (arvioituna joko LC3A tai LC3B immunoblottauksella) verrattuna U87MG ja MDA-MB-231 vastaavasti (kuvio 1 B).

LC3A ja LC3B ilmentävät autophagosomes

Konfokaalimikroskopia kaksinkertaisella LC3A /B immunofluoresenssilla käyttäen LC3-tyyppinen spesifisten vasta-aineiden, paljasti, että LC3A ja LC3B autophagosomes ovat erillisiä ja ettei autophagosomes ilmensivät sekä proteiineja (kuvio 1C1 ja 1C2). Tämä havainto oli yleinen kaikissa solulinjoissa tutkittiin. Rinnakkaispaikantumisen analyysi paljasti prosentuaalinen 1%, kun taas LC3A /LAMP2A rinnakkaispaikantumisen kontrollisoluissa oli suurempi kuin 20% (kuvio 1c3 ja 1C4).

identiteetti on LC3A verrattuna LC3B autophagosomes vahvisti myös sen jälkeen, kun tiivistämisen autophagy happamissa olosuhteissa (kuvio 1C5) ja sen jälkeen autophagy vuon esto altistuminen bafilomysiini (Kuva 1C6). Sitä vastoin ei-spesifisten vasta-aineiden on todettu suuri päällekkäin ilmaisu, tuloksena kaksi tunnustamista LC3A ja LC3B vasta-aineella (kuvio 1D1 ja 1d2).

käyttäminen siRNA varten LC3A ja LC3B, nämä erityisesti estetty kertymistä ja LC3A tai LC3B autophagosomes, vastaavasti (kuvio 1E1, 1E2 ja 1E3). Hiljentäminen LC3A tai LC3B vahvisti menetys Vastaavien proteiinien Western blot (kuvio 1E4).

Sytoplastiset LC3A ja LC3B lokalisointi kuviot

jakautuminen LC3A ja LC3B sytoplasmassa oli varsin selvä. LC3A lähinnä kertynyt perinuclear alueella, kun taas LC3B oli tasaisesti koko sytoplasmassa. Tämä ilmiö näkyi kaikissa solulinjoissa tutkittiin ja, mikä näkyy sytoplasman ilmaisun intensiteetin analyysi, perinuclear LC3A saavutettu jopa 90% (vaihteluväli 60-90%) koko proteiinin sytoplasmisen sisältöä (Kuva 2A1-2A7). Joskus pieni LC3A + autophagosomes sisältyvät LC3B + autophagosomes näkyivät sytoplasmassa (kuvio 2A1 ja 2A2).

(A) konfokaali kaksinkertainen immunofluoresenssimenetelmällä varten LC3A (vihreä) ja LC3B (punainen) erilaisissa solulinjoissa. Pani merkille LC3A kertymistä perinuclear alueella, kun taas LC3B on jaettava koko sytoplasmaan (A1-7). LC3 aggregaatteja, viittaavia pienten LC3A + autophagosomes sisältyvät LC3B + autophagosomes, ovat joskus läsnä (laatikot A1,2). Western blotit vahvistavat ydinaseiden läsnäolo LC3A tumissa, pääasiassa LC3A-II muoto (A8). (B) nucleoli värjätään MIB1 /vihreä (B1), The LC3B /punainen (B2), mutta ei LC3A /violetti-vasta-aine (B3); LC3A erityisiä ap1805a ja LC3B erityisten 5F10-vasta-aineita käytettiin. Tämä vahvistetaan kaksinkertainen immuunivärjäykseen LC3A /MIB1 (B4), LC3B /MIB1 (B5) ja LC3A /LC3B (B6). Pani merkille, että LC3B värjää sisäinen nucleolar alueilla, kun taas MIB1 reuna. (C) aktinomysiini D vahingot nucleoli ja häiritsee nucleaolar LC3B ja MIB1 lokalisointi (C1). Happamissa olosuhteissa (pH = 6,5; C2) tai hypertermia (40 ° C; C3) ei kumota jakelu LC3B on nucleoli eikä LC3A tumissa. Lamin käytetään myös verrokkina vahvistaa läsnäoloa ydinten vain tumafraktios-.

Nuclear LC3A ja LC3B lokalisointi kuviot

LC3A paikannettiin selvästi ytimet kaikki syövän solulinjoissa tutkittiin, kuten HUVEC n ja ihmisen MRC5 fibroblast linja (Kuva 2A1-2A7). Western blot-analyysi jälkeen kolminkertainen fraktioinnin (ydin–pelletti-supernatantti) osoittivat selvästi läsnä LC3A proteiinien ytimien selvemmäksi LC3A-II muoto, joka oli huomattavampi glioblastoomasoluissa (kuvio 2A8).

LC3B oli huonosti ilmaistu tumissa, mutta voimakkaasti ilmaistu nucleolar alueilla, alueella, joka oli negatiivinen LC3A. Nucleolar vahva värjäytyminen näkyy 60-95% solun riippuen solulinjasta. Esimerkiksi A549 keuhkosyövän solulinjaa osoittaa tämän värjäyskuvion vuonna 60% viljellyistä soluista, kun taas tämä on peräti 95% vuoden keuhkosyövän H1299 solulinjaa. Kuva 2B1-2B6 esittävät tyypillistä ilmentymiskuvio 4-väri konfokaalimikroskopia. Ki67 tahrat nucleoli ja colocalizes kanssa LC3B, mutta ei LC3A. Solujen käsittely Actinomycin D (kuvio 2C1) vaurioittava nucleoli johtivat puutteeseen LC3B ja Ki67 lokalisointi ytimet. Sitä vastoin solujen altistaminen happamille olosuhteille (pH = 6,5) tai hypertermia (40 ° C) 24 tunnin ajan ei kumota jakautuminen LC3B on nucleoli tai LC3A tumissa (kuvio 2C2 ja 2C3). Western blot analyysi tumafraktios- vahvisti läsnäolo LC3B proteiinin (kuvio 3).

(A, B, C) 24 h inkubaation Leptomycin B 10 ng /ml, tulokset ydin- kertyminen LC3A, LC3C ja Beclin-1 keuhkojen A549, H1299 ja glioblastom U87, T98 solulinjat. (D) 24 inkubaatio Ivermektiini on 100 mikrog /ml, vähensi ydin- ilmaus LC3A /Beclin-1 A549 ja H1299 solulinjojen ja lisäsi perinuclear kertyminen LC3A että H1299 solulinjassa. (E) Western blotit ydin- solu murto confirm kertymistä LC3s ja Beclin-1 keuhkoissa ja glioblastoomasolulinjoissa inkubaation jälkeen Leptomycin B. vähentäminen proteiinien inkubaation jälkeen Ivermektiini ei ollut johdonmukainen kaikissa solulinjoissa.

ilmentäminen LC3C

LC3C selvästi ilmoitti sytoplasmassa ja intensiivisemmin ytimet soluja (kuvio 4A). Western blot-analyysi osoitti selkeän läsnäolon LC3C vuonna tumafraktios- (kuvio 4E). Ei ollut selvää lokalisointi nucleolar alueilla ja kaksinkertainen immunofluoresenssilla LC3B siellä selvästi puute collocalizaton vuonna nucleoli ja sytoplasmassa (kuvio 4B). Vuonna kaksinkertainen immunofluoresenssilla, LC3C oli laajasti yhteistyössä lokalisoitu kanssa LC3A ydinvoiman alueella (kuvio 4C ja 4D), kun taas niiden rinnakkaispaikantumisen oli minimaalinen sytoplasmassa. Näkyvä ilmaus LC3C tumissa vahvistettiin myös Western blot analyysi (kuvio 4E). Nämä havainnot vahvistettiin kaikissa solulinjoissa tutkittiin. Taulukossa 1 on yhteenveto selvä lauseke kaavoja LC3A, LC3B ja LC3C.

(A) Sytoplastiset ja tumavärjäystä of LC3C (punainen) in U87 solulinjassa. (B) Double LC3C (punainen) ja LC3B (vihreä) immunovärjääminen U87 soluissa osoittaa puute kolokalisaation kahden proteiinien, sekä sytoplasmassa ja ydinvoima /nucleolar alueilla. (C, D) Double LC3C (punainen) ja LC3A (vihreä) immunovärjäyty- osoittaa kolokalisaation kahden proteiinien, pääasiassa ydinalan (U87 ja T98 solulinjoilla). (E) Western blot varten LC3C ydinalan (N), Pellet (P) ja liukoista (S) osa U87 ja T98 soluja. ”M” on markkeri ja Lamin käytetään ohjaimen vahvistaa läsnäoloa ytimien vain tumafraktios-.

LC3 nucleo-soluliman kaupan

Soluja inkuboitiin 24 kanssa Leptomycin B, nimenomaan ja tehokkaan estäjän CRM1 /exportin 1 polulla tumasta. 10 ng /ml 24 h inkubaation kertyminen LC3A ytimet lisättiin, mikä viittaa siihen, tukos LC3A puristamiseen kinetiikan ytimistä (kuvio 3A). Kiinnostaa, LC3A tumakertymään osoitti intensiivisen kolokalisaation kanssa autophagy signalointi proteiini Beclin-1, ja vastaavat kinetiikka alle Leptomycin B altistus (kuvio 3B). Samanlaisia ​​kinetiikka ja rinnakkaispaikantumisen kuvioita Beclin-1 vahvistettiin, että LC3C proteiinin (kuvio 3C).

Ivermectin, toisaalta, on voimakas estäjä Importiini

α Twitter /

β

(Imp

α Twitter /

β

1) ydinvoiman tuonnin riippuvainen liikenteen. Soluja inkuboitiin 24 kanssa Ivermectin eri pitoisuuksina. Jälkeen 24 inkuboitu 100 ug /ml, kertyminen LC3s ja Beclin-1 ytimet on vähentynyt, kun taas sytoplasminen värjäys lisättiin (kuvio 3D ja 3E). Havainnot kuitenkin vaihteli keskuudessa solulinjat, kuten lasku ilmaisu ei vahvistettu kaikille proteiineille kaikkiaan solulinjoissa.

Keskustelu

Ihmisillä LC3 geeniperheen viisi jäsenet, LC3Av1 ( variantti 1, NM_032514), LC3Av2 (variantti 2, NM_81509), LC3B (NM_022818), LC3B2 (NM_001085481) ja LC3C (NM_001004343). Geneloc for LC3A on 20.q11.22 ottaa huomioon, että MAP1LC3B on 16q24.2 ja MAP1LC3C on 1q43. Sekä LC3A ja LC3B ilmentyvät differentiaalisesti normaaleissa kudoksissa [3,4,7,8]. Lisäksi LC3C (kolmas isoformi LC3 perhe) uskotaan olevan heikosti tai ei ilmenny useimmissa normaaleissa kudoksissa [3,4,7]. Kuitenkin vain LC3A (variantti 1), LC3B ja LC3C on näyttää olevan post käännös muutos ja luoda lomake-II [4]. Edelleen, menee takaisin kirjallisuudessa [3,7,8] post käännös sivusto MAP1LC3B vain ei ole säilynyt. Esimerkiksi hän et al. 2003 [3] kertoi, että olennainen sivusto erillisten jälkeisen käännös muuttaminen MAP1LC3B on Lys-122 sijaan säilytetty Gly-120, joka ilmoitti, että MAP1LC3A ja MAP1LC3C. Toisaalta Tanida et al. 2005 [8] on raportoitu, että karboksyylipää MAP1LC3B lohkaistaan ​​paljastamiseksi Gly (120) edelleen ubiquitylation reaktioita. Näiden kahden julkaisun saumat, että MAP1LC3B tuottavat LC3B-II, kun taas translaation jälkeisen modifikaation sivusto ei säilynyt.

kirjallisuudessa parhaiten tutkittu endogeeninen autophagic markkeri on LC3B. On kuitenkin korostettava, että suurin osa tutkimuksia käyttää anti-LC3 vasta oletetaan olevan anti-LC3B eikä anti-LC3A, ilman validoitu erityisluonteensa [9,10,11]. On olemassa suuri identiteetti välillä LC3A ja LC3B isoformin, mikä osoittaa, että epitooppeja käyttää kehittämään spesifisiä vasta-aineita ovat ratkaisevan tärkeitä. Saamiemme tulosten jotkut vasta-aineet eivät ole erityisiä, tunnustaa molemmat isoformit, joissa on vaihteleva herkkyys, kun taas toiset pystyvät havaitsemaan erityiset isoformit LC3A ja LC3B. Joka tapauksessa, eritellään LC3-tyyppinen tutkittu olisi tarpeeton, jos todellakin eri LC3 proteiinit oli sama ekspressiokuviota ja biologian normaaleissa ja syövän kudoksissa. Tämä ei kuitenkaan pidä paikkaansa, kuten on esitetty nykyisessä tutkimuksessa.

Edellisessä tutkimuksessa meidän [12], tutkimalla autophagic vuota hiirikudoksissa jälkeen eri korostaa, immunoblottauksella työ osoitti, että LC3A proteiini seuraa erillisiä kuvioita of LC3A-I ja LC3A-II muutokset maksan, keuhkojen, munuaisten ja sydämen kudosten hiirillä. Tämä korosti LC3A on myös korostettava indusoituva ja on tiettyjä malleja ilmentymisen sen liukenevat ja autophagosome sitoutunut muoto. Tässä in konfokaalimikroskopia käyttäen validoitu erityinen anti-LC3 vasta vahvistimme, että LC3A ja LC3B autophagosomes ovat erillisiä, ei koskaan jossa on sekä proteiinien ja on erilaiset subsellulaariset jakeluun. LC3A vallitseva perinuclear ilmaisu eroaa melko homogeeninen jakautuminen LC3B koko sytoplasmassa, mikä viittaa selvä biologinen rooli kahden autophagosome tyyppiä. Kiinnostaa, paperissa Bai et al. 2012 [4]. LC3A ja LC3B usein yhteistyössä lokalisoitu samassa puncta nälkään olosuhteissa (67%), kun taas pohjapinta olosuhteissa kolokalisaation oli 13% Saos-2-soluissa. Totesimme myös, vuonna konfokaalimikroskopia, satunnaista rinnakkaispaikantumisen on LC3A ja LC3B, antaa vaikutelman suuri LC3B + autophagosome sulattamaan LC3A + yksi.

sytoplasminen biologiaa LC3 välittämä autophagy on hyvin tutkittu. Rooli LC3s tumissa epäselviä. Karim et al ensin havainnut LC3-II proteiinin muodossa ytimet rotan maksasoluilla [13], joka on sopusoinnussa meidän julkaisemattomia kokemusta BALB /c-hiiri hepatosyyteissä. Drake et ai raportoi, että vaikka LC3A ja B eivät jaa mitään tunnettua tumalokalisaatiosignaalin, ydin- vienti signaali voi olla, joka sijaitsee tähteiden 63-73 ihmisen LC3 [14]. EGFP-LC3 proteiini paikannettiin selvästi ytimet COS-7-soluissa. Esillä olevassa tutkimuksessa käyttämällä erilaisia ​​syöpäsolulinjoissa, sekä normaalin ihmisen fibroblastien ja endoteelisolujen, olemme vahvistaneet ydin- läsnä kaikki kolme LC3 proteiineja. Oli kuitenkin silmiinpistävä ero lokalisoinnin LC3B proteiini, joka edullisesti lokalisoitu nucleolar alueilla, kun taas A- ja C-muotojen olivat paikallisia extra-nucleolar ydin- alueella. Rooli tämän LC3B nucleolar ilmaus on edelleen mysteeri, aivan kuten rooli LC3A ja LC3C muualla ydin. He et ai ehdotti, että ydin- LC3 voi osallistua valvontaan soluproliferaation promyelosyyttileukemian [15].

olivatko tunnettu ydinvoiman liikenteen reittejä ovat mukana nucleo-sytosolin kaupan LC3s. Ydin- proteiini tuonnin ja viennin reitin välittämä tumahuokonen komplekseja (NPC) tutkittiin käyttäen agentti Leptomycin B, sienilääke antibiootti, että nimenomaan ja estää voimakkaasti CRM1 /exportin 1 reitin ydinvoiman vienti suoraan sitomalla CRM1 proteiini [16 17]. Sen jälkeen 24 inkuboitu keuhkojen ja glioblastoomasolulinjoissa huomattava kertyminen LC3A, LC3C ja Beclin-1-proteiineja oli ilmeistä konfokaalimikroskopiaa, joka vahvisti myös western blot -analyysin. Tämä on ristiriidassa sen havainnon kanssa, Drake et al [14], jossa on lyhyt 3h inkubointi COS-7 ja HeLa-solujen kanssa Leptomycin ei johtanut EGFP-LC3 tumakertymään. Beclin-1 sisältää leusiinirikkaita tumasta signaali ja häiriöt CRM1 toiminta johtaa ydinaseiden kertymistä Beclin-1 [18]. Kiinnostaa, Beclin-1 co-paikantuu ytimet kanssa LC3A ja LC3C, vaikka ei näkyvästi kolokalisaation todettiin sytoplasmassa. Olipa Beclin-1 sitoutumisen LC3 tarvitaan ydin- sisäänkäynnin monimutkainen vaatii lisätutkimuksia.

Ivermectin, toisaalta, on voimakas estäjä Importiini

α Twitter /

β

(Imp

α Twitter /

β

1) ydinvoiman tuonnin riippuvainen kuljetus, ilman vaikutusta sisältävien proteiinien tumalokalisaatiosignaalin (NLSs) tunnustettu erilaisissa ydinalan tuonti väyliä [19] inkubointi syöpäsolulinjoissa Ivermectin, johti vähentyneeseen ekspressioon LC3s ja Beclin-1 ytimet, seurauksena kuitenkin, että vaihteleva keskuudessa solulinjat ja proteiinit tutkittiin.

Koska endogeeninen LC3 proteiinit ovat tärkeitä markkereita autophagy, on tärkeää tarkistaa vasta-aineiden spesifisyys suorituksessa käytetty kokeita LC3A tai LC3B käsittely vastauksena eri tyyppistä stressitekijöitä. Nämä molekyylit eivät ole identtisiä ja saattavat olla erillisiä biologisia rooleja, ei hyvin selvitetty vielä. Nucleolar LC3B lokalisointi ja ydinvoiman LC3A, LC3C ja Beclin-1 kertymistä nykyisiin tutkimuksessa luoda perusta lisätutkimuksia selvä biologinen rooli näiden proteiinien voi olla normaaleissa ja syövän kudoksissa.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjaviljelmien

keuhkosyöpä solulinjat A549 (ihmisen keuhkojen adenokarsinooma, CLS GmbH, Saksa), ja H1299 (ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, ATCC), glioblastoomasolulinjoissa U87MG ( ihmisen glioblastooma-astrosytooma, CLS GmbH, Saksa) ja T98G (ihmisen glioblastooma multiforme, ATCC), rintasyöpä solulinjat (HER2 + BT474, HER negatiivinen MDA-MB-231, DA3, ATCC), sekä alkion MRC5 fibroblastien solu- linjojen ( CLS Cell Line Service, Saksa) viljeltiin käyttäen DMEM Peruselatusaineen (31885-023, Gibco). HUVEC-soluja (CLS Cell Line Service, Saksa) viljeltiin keskipitkän (EBM ™ -2 Basal Medium kanssa EGM ™ -2 SingleQuots ™ kasvutekijöiden, Lonza) jälkeen on tutkittu. Pohjapinta viljelyalustaa täydennettiin 10% FBS: ää (FB-1000/500, Biosera), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (15140-122, Gibco) ja 2 mM L-glutamiinia (25030, Gibco). Soluja pidettiin vakio-olosuhteissa, 37 ° C, 5% CO2: ssa kostutetussa ilmakehässä ja käytettiin saavuttaessaan 70-90% konfluenssiin.

Kemikaalit

soluviljelmiä käsiteltiin erikseen määritellyllä 24 h inkubaation aikaa Leptomycin B (L2913, Sigma-Aldrich), jonka lopullinen pitoisuus on 20 ng /ml ja Ivermectin (I8898, Sigma-Aldrich) lopulliseen konsentraatioon 100 ug /ml.

tunnistetiedot LC3A, B ja C spesifisten vasta-aineiden

testata spesifisyyden kaupallisesti saatavilla vasta-aineita, jotka koskevat niiden spesifisyyttä LC3A tai LC3B seuraavia vasta-aineita käytettiin kaupallisesta saatavilla ihmisen rekombinanttiproteiineja LC3A (H00084557-P01, Abnova) ja LC3B ( H00081631-P01, Abnova):

kanin polyklonaalinen ja LC3A (1: 30,000, ab62720, Abcam, synteettinen peptidi PSDRPFKQRRSFADR konjugoitu KLH kysteiinitähde linkkeri, vastaa aminohappoja 2-15 of Human MAP1LC3A)

kanin polyklonaalinen ja LC3A (1: 2500, 1805a, Abgent, synteettinen välillä 97 ~ 120 aminohappoa C-pään katkaisukohta ihmisen pilkkoa-LC3A käytettäväksi epitoopin) B

kanin monoklonaalista on LC3A (1: 1000, ab52628, Abcam) B

kanin polyklonaalinen ja LC3B (1: 5,000, NB600-1384, Novus, synteettinen peptidi tehty N-terminaalinen alue ihmisen LC3, isoformi B-proteiini),

kanin polyklonaalinen ja LC3B (1: 5,000, L7543 Sigma-Aldrich, synteettinen peptidi, joka vastaa aminohappoja 2-15 ihmisen LC3B, konjugoitu KLH) B

kanin polyklonaalinen ja LC3B (1: 5000, NB100-2220, Novus, synteettinen peptidi tehty N-terminaalinen osa ihmisen LC3B proteiinisekvenssin tähteiden 1-100) B

kanin polyklonaalinen LC3 ( 1: 5,000, L8918, Sigma-Aldrich, synteettinen peptidi, joka vastaa aminohappoja 36-49 ihmisen LC3A isoformin a, konjugoitu KLH kautta C-terminaalinen kysteiini).

hiiren monoklonaalinen vasta-aine on LC3B (1: 5000, 5F10, Nanotools, synteettinen peptidi tehty N-terminaalinen osa ihmisen LC3B proteiinia).

osalta anti-LC3C anibody, käytimme kanin polyklonaalista (18726-1-AP, Proteintech Europe) vasta-ainetta. Spesifisyys anti-LC3C käytetty vasta-aine on aiemmin raportoitu (https://www.ptglab.com/Products/Search.aspx?key=LC3C).

Altistuminen bafilomysiini

LC3A ja LC3B analysoitiin solulinjojen altistuminen autophagy häiritsevää ainetta bafilomysiini [8]. Bafilomysiini A on erityinen estäjä vakuolaarisen tyyppiä H (+) – ATPaasi (V-ATPaasi) soluissa, estää happamoituminen soluelimiin sisältävien tätä entsyymiä (kuten lysosomeihin ja endosomeihin) ja lisäksi estää fuusio autophagososomes kanssa lysosomeihin [8]. Arviointi suoritettiin 24 tunnin inkuboinnin jälkeen soluja 100 nM bafilomysiini.

SDS-PAGE ja immunoblottaus

Solut pestiin kahdesti PBS: llä ja lyysattiin sakkaroosi-pohjainen hajotuspuskuria (0,25 M sakkaroosia , 25 mM Tris-HCI, pH 7,4), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (täydellinen mini proteaasiestäjäseostabletit, Roche Diagnostics GmbH) ja fosfataasi-inhibiittorit (fosfataasinestäjällä cocktail, Cell Signaling Technology). Differentiaalinen sentrifugoinnin kokosolulysaateista johti ydin-, supernatantti (sytoplasminen-vesiliukoinen proteiinit) ja pelletti (membraaniproteiinit) fraktioita. Proteiini kvantitointi suoritettiin Pierce ™ BCA Protein Assay Kit (# 23225, Thermo Scientific).

Proteiininäytteet erotettiin epäjatkuva SDS-geeleissä käyttäen 10% erottaa geelin Beclin-1 kun taas LC3A, LC3B ja LC3C 12,5% -erotusgeeliä käytettiin. Lisäksi 5% -vertailugeeliä käytettiin. Neljäkymmentä nanogrammaa analysoitujen näytteiden geelillä. Immunoblottaus suoritettiin käyttäen PVDF-PSQ kalvoja (Millipore Corp.). Sitten kalvot estettiin 5% rasvatonta kuivamaitoa 150 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 (TBS) ja 0,1% (v /v) Tween-20 huoneen lämpötilassa 2 tuntia, minkä jälkeen hybridisaatio yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden. Sitten membraanit hybridisoitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa sekundaarisen vasta-aineen, vuohen polyklonaalista kanin lgG-HRP (1: 3,000, Biorad, 1706515, USA), tai vuohen polyklonaalista hiiren IgG-HRP (1: 3,000, Biorad, 1706516, USA). Bändejä kehitettiin käyttämällä Chemidoc MP Imaging System (Biorad, USA).

Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat: i) kanin polyklonaalinen ja LC3A (1: 1,000, ab62720, Abcam, synteettinen peptidi PSDRPFKQRRSFADR konjugoitu KLH jonka kysteiinitähde linkkeri, vastaa aminohappoja 2-15 of Human MAP1LC3A), ii) hiiren monoklonaalinen vasta-aine LC3B (1: 1,000; LC3B 5F10 Nanotools), iii) kanin polyklonaalisia vasta-aineita MAP1LC3C (1: 1,000, ProteinTechLab) ja iv) kanin polyklonaalinen vasta-aine Beclin-1 (1: 2,000, A303-673A, Bethyl Laboratories, Inc., USA) B

Jokainen näistä blotteja haihdutettiin sitten, kuivattiin yön yli, uudelleen hybridisoitiin hiiren monoklonaalisella vasta-aineella Actin beta (1: 5000, NB600-501, Novus Biologicals).

siRNA

LC3A siRNA: ita, yhdistettiin kuin (5′-GCGAGUUGGUCAAGAUCAUTT-3 ’), (5′-GCUUCCUCUAUAUGGUCUATT-3′ ), (5’-CCUGCUGUGUGGUUCAUCUTT- 3 ’), (5′-GCUGUAAGGAGGUACAGCATT-3′), ja LC3B siRNA olivat vastaavasti yhdistettiin kuin (5’-GCCCUCUACUGAUUGUUAATT-3 ’), (5′-CUCCCUAAGAGGAU CUUUATT-3′), (5’-GCCUGUGUUGUUACGGAAATT- 3 ’). Nämä syntetisoi Shanghaista GenePharma Co., Ltd (Kiina). Näitä käytettiin 20-50 nM solujen transfektoimiseksi käyttäen HiPerfect (QIAGEN) 24 tunnin ajan, kun taas hiljentämisen tehokkuutta siRNA: iden vahvistettiin sekä konfokaalimikroskopialla ja western blot 24 tunnin kuluttua.

konfokaali immunofluoresenssilla ja Kuva-analyysi

Immunofluoresenssivärjäystä, soluja kasvatettiin nro 1,5 lasipeitinlevyille, kiinnitettiin 3,7% paraformaldehydillä /PBS, pH 7,4, 20 min 37 ° C: ssa ja sitten läpäiseviksi PBS /0,1% v /v Triton X- 100, pH 7,4, 5 min ajan huoneenlämpötilassa. Lisäksi, soluja blokattiin PBS /5% w /v BSA: ta, pH 7,4 20 minuuttia ja värjättiin eri primaaristen vasta-aineiden: anti-Ki67 (MIB1) hiiren monoklonaalinen (1: 150, DAKO), anti-LC3A kanin polyklonaalista (1 : 500; Abcam), anti-LC3C kanin polyklonaalista (1: 200; Proteintech Europe), anti-LC3B hiiren monoklonaalinen (1: 200, Nanotools) ja anti-Beclin-1 kanin polyklonaalista (1: 100, ab62557, Abcam) ja 1 h huoneen lämpötilassa.

Solut pestiin PBS: ssä, pH 7,4, inkuboitiin asianmukaisten CF 488 ja 564 sekundaarisia vasta-aineita RT: ssä ja DNA vastavärjättiin Hoechst 33342 (1 ug /ml; Sigma-Aldrich). Kun lopulliset pesujen peitelaseja asennettu kotitekoinen Mowiol kiinnitysväliaine. Imaging suoritettiin räätälöidyn Andor vallankumous Spinning Disk konfokaali System rakennettu jalusta (IX81, Olympus), jossa 60x objektiivi ja digitaalikameran (Andor Ixon + 885) (CIBIT Facility, MBG-Duth). Kuvan hankinta suoritettiin Andor IQ 2 -ohjelmisto. Optiset leikkeitä tallennetaan joka 0,3 pm. Kaikki konfokaalimikroskopia kuvat esitellään tässä työssä ovat 2D enimmäisvoimakkuutta ennusteita z-pinon kuvia ja kuvan analyysi saatujen tietojen sarjaa on suoritettu käyttämällä ImageJ 1.47v (National Institute of Health, USA). Co-lokalisointi analyysi kuvia ja laskentaa Pearsonin kerroin analysoitiin kuvien tehtiin käyttämällä yhdistelmää rinnakkaispaikantumisen Finder ja Coloc 2 lisäosia ImageJ.

Ethics

Tutkimus on hyväksytty jonka Traakian Demokritos-yliopisto Research eettisen komitean.

Kiitokset

Tutkimus on rahoitettu «koulutuksen ja elinikäisen oppimisen-ARISTEIA» projekti, koodi ei 520, ESPA 2007-2013 GGET päätös numero 12605 /26.9.2012