Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

PI3K /AKT /mTOR-reitti on usein väärin säädellystä syövät ja mTOR on osoittanut kykyä moduloida pro-eloonjäämisreittejä. Sinänsä pyrimme määrittämään kykyä mTOR-estäjän Everolimuusi voimistavan antituumorivaikutukset irinotekaanin kolorektaalisyövässä (CRC).

Experimental Suunnittelu

kombinatorisista vaikutukset everolimuusin ja irinotekaanin olivat arvioitiin

in vitro

ja

in vivo

CRC solulinjoissa kätkeminen yleisesti mutaatiot

PIK3CA

,

KRAS

ja /tai

BRAF

. Farmakokineettisesti ohjaama annostelu protokollia everolimuusin ja irinotekaanin perustettiin ja käyttää arvioitaessa in vivo antituumorivaikutukset tekijöille. Lopussa hoidon, 3-6 kasvaimia kohti hoitoryhmään kerättiin biomarkkereiden analyysiin NMR metabolomiikka.

Tulokset

Everolimuusi ja irinotekaani /SN38 osoittivat synergististä antiproliferatiivisia vaikutuksia useisiin CRC solussa linjat

in vitro

. Yhdistelmäefektit everolimuusin ja irinotekaani määritettiin CRC ksenograftimalleissa käyttäen kliinisesti relevantti annostelun protokollia. Everolimuusin osoitti merkittävää kasvaimen kasvun esto yksin ja yhdistettynä irinotekaani HT29 ja HCT116 tuumoriksenografteissa. Metabolomic analyysi osoitti, että HT29-kasvaimet olivat metabolisesti reagoivat kuin HCT116 kasvaimia. Everolimuusi vähensi Glykolyysivaiheen molemmissa kasvaintyypeissä samalla irinotekaanin käsittely johti syvällinen kertymistä lipidien HT29 kasvaimissa osoittaa sytotoksisen vaikutuksen.

Johtopäätökset

kvantitatiivinen analyysi kasvaimen kasvua ja metabolomic tiedot osoittivat että yhdistelmä everolimuusin ja irinotekaanin oli edullisempi

BRAF /PIK3CA

mutantti HT29 tuumoriksenografteja, joka oli additiivinen vaikutus, kuin

KRAS /PIK3CA

mutantti HCT116 tuumoriksenografteja, joka oli vähemmän kuin additiivinen vaikutus.

Citation: Bradshaw-Pierce EL, Pitts TM, Kulikowski G, Selby H, Merz aL, Gustafson DL, et al. (2013) Utilization of Quantitative in vivo farmakologian lähestymistavat arvioida Yhdistelmä vaikutukset Everolimuusi ja irinotekaani hiiri ksenograftimalleja peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (3): e58089. doi: 10,1371 /journal.pone.0058089

Editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 syyskuu 2012; Hyväksytty: 31 tammikuu 2013; Julkaistu: 08 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Bradshaw-Pierce et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Novartis International AG ja University of Colorado Cancer Centerin Grant P30 CA046934. Novartis oli joitakin panos tutkimusasetelma, mutta ei osansa tiedonkeruun analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Olen lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat konfliktit . Osa kustannuksista tutkimuksista saatiin Novartis. Novartis myös kaikki everolimuusi varten tutkimuksia. Tämä ei muuta meidän noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Tällä hetkellä merkittävä keskitytään kehittämään uusia suunnitellut aineet hämmentää signaalitransduktioreaktioteitä tärkeä syövän etenemisessä. Kliininen käyttö Näiden molekyyli- kohdennettujen aineet usein sisältää yhdistelmiä muiden hoitomuotojen ja useat kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet hyötyä lisäämällä signaalitransduktion modulaattorit (STM) ja kemoterapiaa tai sädehoitoa [1] – [5]. Onnistuneen kehittämisen lääkehoitojen ja hoitostrategioita vaatii harkittuja käyttöä nonkliinisissä ja huolellinen tietojen tulkinnassa.

käyttö kvantitatiivisia lähestymistapoja, mukaan lukien käyttö farmakokineettisten tietojen ja määrällisiä toimenpiteitä vastaus, on kriittinen selvittämiseksi vaikutusmekanismit ja parantaa translationaalisen farmakologian tutkimuksessa [6]. Yhteinen puutteena

in vivo

farmakologisissa tutkimuksissa on käyttää annosten ja /tai aikatauluja, jotka eivät ole kliinisesti toteutettavissa, mikä voi johtaa harhaanjohtavia tuloksia tehon ja /tai kehittämiseen biomarkkereita, jotka eivät useinkaan kääntää kliinisen asetus. Tässä esittelemme tutkimus, jossa me määrittää kvantitatiivisesti eduksi lisäämällä pieni molekyyli STM everolimuusi (Novartis, East Hanover, NJ), ja tavanomaisen kemoterapian, irinotekaani (Pfizer Inc, New York, NY), käyttäen annoksia ja aikatauluja meidän prekliinisissä mallien ennustettu saatiin emtrisitabiinialtistukset lähentämällä kuin potilailla.

Everolimuusi (40-

O

– (2-hydroksietyyli) rapamysiini, RAD001 /Afinitor®) on suun kautta otettava estäjä nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR), joka on nykyisin hyväksytty hoitoon pitkälle edennyttä munuaissyöpää ja progressiivinen neuroendokrii- kasvaimia haiman alkuperää (PNET) [7], [8]. mTOR, seriini /treoniini-kinaasi, on keskeinen säätelijä polkuja, jotka signaalin kasvu, lisääntymistä, eloonjääntiä, aineenvaihduntaa ja angiogeneesissä [7], [9]. mTOR aktiivisuus välittyy kasvutekijän signalointi, ravinteiden ja energian valtiot sekä hypoksinen stressiä. Lisäksi mTOR on keskeinen rooli fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) /AKT reitin, joka on usein väärin säädellystä ja osallinen kasvuun ja etenemiseen useissa syövissä, joten se on houkutteleva terapeuttinen kohde [10], [11]. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että PIK3CA mutaatioiden tai AKT-vaikutusta antaa herkkyyttä mTOR hoito [12] – [15].

PIK3CA

on geeni, joka koodaa PI3K p110 katalyyttinen alayksikkö ja mutaatioiden (eksoni 9 ja eksoni 20) löytyy 10-30% CRC [11], [16], [17].

CRC on kolmanneksi yleisin syöpä tyyppi, osuus on lähes 10% kaikista syöpään liittyvistä kuolemantapauksista Yhdysvalloissa [18]. Vaikka alkuvaiheessa CRC on edullinen 5 vuoden pysyvyys, myöhäisessä vaiheessa tauti kaukaisiin etäpesäkkeitä on 5 vuoden pysyvyys on vain 10%, mikä osoittaa tarvetta parantaa hoito-ohjelmat metastaattisen CRC (metastasoituneen kolorektaalisyövän). Irinotekaani (Camptosar®) on standardi hoito kemoterapeuttisen aineen, jota käytetään hoidettaessa metastasoituneen kolorektaalisyövän. Oletimme, että everolimuusi lisäisi irinotekaanihoitoa johtuen modulaatio efektorien pro-eloonjäämisreittejä ja pyrittiin arvioimaan yhdistelmän hiiren ksenograftimalleja CRC kätkeminen vaikea hoitaa samanaikaista

PIK3CA

ja

KRAS

tai

BRAF

mutaatioita. Lisäksi, koska tunnettujen metabolisia vaikutuksia mTOR-reitin esto, me määrällisesti arvioi metaboliaprofiilien kasvainten hoidettiin kliinisesti relevantteja annoksia everolimuusin ja irinotekaanin ydinmagneettisen resonanssin (NMR).

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

Irinotecan varten

in vivo

tutkimuksissa saatiin Coloradon yliopiston sairaalan apteekki (Aurora, CO) ja SN38 varten

in vitro

tutkimuksissa ostettiin LKT labs (St. Paul, MN). Everolimuusin annettiin suspensiona Novartis. SN38 varastossa ratkaisut

in vitro

kokeita tehtiin DMSO (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Kaikki muut materiaalit hankittiin joko Fisher Scientific tai Sigma (St. Louis, MO), ellei toisin mainita.

Cell Culture

Colon tuumorisolulinjoja, HCT8, HT29, LS180 ja HCT116, olivat hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja niitä on ylläpidettävä kudosviljelylevyille (BD Falcon, San Jose, CA) RPMI (Gibco), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco) ja penisilliini (100 yksikköä /ml) -streptomycin (100 ug /ml; Life Technologies). Soluja rutiininomaisesti seuloa mycoplsma käyttämällä MycoAlert (Lonza). Kaikki solut pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2. Kaikki

in vitro

lääkehoitojen tehtiin käyttämällä täydellistä kasvualustaa.

Sytotoksisuus ja yhdistelmätehosteita

sytotoksisia vaikutuksia määritettiin käyttämällä sulforodamiini B (SRB) määritys. Lyhyesti, 5000 eläviä soluja maljattiin 96-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin yön yli ennen altistusta eri pitoisuuksilla lääkkeitä. Solut altistettiin kasvavia pitoisuuksia everolimuusi (0-200 nM), SN38 (0-8 nM), ja näiden yhdistelmiä. Jälkeen 72 tunnin inkuboinnin väliaine poistettiin ja solut kiinnitettiin kylmällä 10% trikloorietikkahappoa 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa solut pestiin vedellä ja värjättiin 0,4% SRB: ssa 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Solut pestiin uudelleen 1% etikkahappoa, ja tahra liuotettiin 10 mM tris huoneenlämpötilassa ja lukea OD 565 nm: ssä. Tulokset Yhdistetyn hoidon analysoitiin mukaisesti isobolographic menetelmä Chou ja Talalay, käyttäen CalcuSyn ohjelmisto (Biosoft, Cambride, UK). Tuloksena Combination Index (CI) käytettiin kvantitatiivinen mitta asteen tutkimalla eri lääkkeitä. CI-arvo on 1 merkitsee additiivisuuden; CI yli 1, antagonismia; CI alle 1, synergismiä.

immunoblottauksella

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille 24 tuntia ennen käsittelyä kunkin lääkkeen yksinään tai yhdessä 24 tuntia. Solut raaputettiin RIPA-puskuria, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita, EDTA, NaF, ja natriumortovanadaatti. Yhteensä proteiini määritettiin käyttämällä Pierce 660 nm Protein Assay (Pierce, Rockford, IL). Kolmekymmentä mikrogrammaa kokonais-proteiinia ladattiin 4-12% gradienttigeeliä, elektroforeesi ja siirrettiin nitroselluloosalle käyttäen iBlot järjestelmä (Invitrogen, Carlsbad, CA). Membraanit blokattiin yhden tunnin ajan huoneenlämmössä Licor estopuskuria (Licor, Lincoln, NE) ennen yön yli inkubaation 4 ° C: ssa yksi seuraavista vasta-aineiden: pS6RP, tS6RP, Pakt, Takt, Perk, Terk, p21, PARP , aktiini ja α-tubuliinin (Cell Signaling, Beverly, MA). Kaikki vasta-aineita käytettiin yhdellä 1:1000 laimennus paitsi Perk, jota käytettiin 1:2000. Seuraavat primaarisen vasta-aineen inkuboinnin jälkeen blotit pestiin TBS-Tweenillä (0,1%), sitten inkuboitiin sopivan sekundaarisen vasta-aineen 1:15,000 (Licor, Lincoln, NE), yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kolmen lisäpesun blotit kehitettiin käyttäen Licor Odyssey (Licor, Lincoln, NE).

Eläimet

Nainen kateenkorvattomiin nude-hiiriin, 5-10 viikkoa vanhoja, hankittiin National Cancer Institute. Eläimiä pidettiin 3-5 häkkiä polykarbonaattia häkeissä ja jota pidetään 12 tunnin valo /pimeä sykli. Ruoka ja vesi annettiin

halun

. Kaikki tutkimukset hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) ja suoritetaan noudattaen NIH ohjeet Hoito ja käyttö Laboratory Animals, ja Eläimiä pidettiin laitoksessa akkreditoitu American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care .

kasvain, joissa tutkimuksissa, solut otettiin talteen ja suspendoitiin uudelleen 01:01 seos seerumitonta RPMI ja Matrigel (BD Bioscience). Yksi miljoonaa solua injektoitiin subkutaanisesti jokaisen takana kylkeen hiirillä. Tuumoritilavuudet mitattuna digitaalinen jarrusatulat, laskettiin

V

(mm

3) = pituus x (leveys)

2 x 0,5236.

Farmakokineettinen tutkimus

farmakokineettinen tutkimus everolimuusin suoritettiin hiirillä HT29 kasvaimia (keskimääräinen volyymi -300 mm

3). Hiiriä käsiteltiin joko 2,5 tai 10 mg /kg everolimuusia päivässä 7 päivän ajan letkulla suun kautta. Kolmea hiirtä annostasoa kohti tapettiin sydämen stick exsanguination 30 minuuttia, 2, 4, 6 ja 24 tuntia lääkkeen antamisen jälkeen 7. päivänä plasma- ja kasvainkudoksen olivat snap-jäädytettiin nestemäisessä N

2 ja säilytettiin -70 ° C: ssa kunnes analysoitiin.

Everolimuusilla mitattiin plasmasta ja kasvainten LC /MS /MS-analyysissä. Analyyttiset standardit, laadunvalvonta (QC) ja tuntematonta olivat kaikki valmistettiin lisäämällä 200 ui tuntematon tai piikki tyhjä plasma tai tuumori homogenaatti (100 mg /ml vedessä) näytteet 1,5 ml: n mikrosentrifugiputkeen. Näytteet uutettiin lisäämällä 1 ml metyyli-tert-butyylieetteri (MTBE), jota seurasi 10 min Vortex-sekoitusta. Näytteet sentrifugoitiin 13000 rpm 10 minuutin ajan ja supernatantti kerättiin ja 900 pl siirrettiin puhtaaseen lasiseen koeputkeen. Näytteet haihdutettiin kuiviin käyttämällä pyöröhaihdutinta, jota seuraa uudelleen suspension 100 ul: ssa 50% asetonitriiliä /50% 10 mM ammoniumasetaattia ja siirrettiin automaattisen näytteenottolaitteen pulloihin analyysiä varten. Massaspektrit ekstrahoiduilla näytteitä saatiin sijoitukset MDS Sciex 3200 Q-TRAP kolmoiskvadrupolisen massaspektrometriä (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA), jossa on turbo lonSpray lähde käyttöliittymät Agilent 1200 Series Binary Pump SL HPLC-järjestelmää (Santa Clara , CA) kantavassa ala- ja ylärajojen määritysrajan määritystä varten olivat 1 ja 5000 nM, vastaavasti. Tarkkuus (% RSD), joka perustuu analyysiin standardeista ja laadunvalvonnan näytteet tässä määrityksessä olivat 90,7% ja 5,5% plasman ja 93,0% ja 4,2% kasvaimen. Tarkemmat tiedot löytyvät Supplement S1 (jakso SA.1.).

Terapeuttinen Study

Kun HT29 ja HCT116 kasvaimet saavuttivat keskimäärin tilavuuden ~325 mm

3 eläimet satunnaistettiin neljään hoitoryhmään (n = 9-10 hiirtä per ryhmä): (i) ajoneuvot, (ii) 5 mg /kg everolimuusia (RAD) letkulla suun kautta (PO) päivittäin, (iii) 10 mg /kg irinotekaania (IRI) kerran viikossa laskimoon (iv) häntälaskimoinjektio, ja (iv) yhdistelmä RAD ja IRI. Everolimuusia, laimennettiin steriiliin veteen, ja irinotekaani, laimennettiin steriiliin 0,9% suolaliuosta, annettiin 4 ml /kg. Eläimiä käsiteltiin 28 päivän ajan. Tuumoritilavuudet ja ruumiinpaino mitattiin 2-3 kertaa viikossa. Päivänä 28 hoidon 3-6 eläintä ryhmää kohti tapettiin, noin 24 tuntia everolimuusia hoidon, ja kasvaimet korjataan metabolomic analyysiä.

NMR-Based Metabolomiikka

metabolomic analyysiä, eläimet olivat paastosi 4 tuntia sitten sai 250 mg /kg [1-

13C] glukoosi (Cambridge Isotopes, Cambridge, MA), jonka IV injektiona 60 minuuttia ennen kasvaimen sadonkorjuuta. Snap-jäädytetty kasvain näytteet tehtiin kaksivaiheinen happokäsittely menettely (käyttäen 8% perkloorihappoa) aiemmin vahvistettu ja laajalti julkaistu [19] – [22]. Lisätietoja voi löytyä myös Supplement S1 (jakso SA.2.).

Data Analysis

Plasma ja kasvainten farmakokineettiset parametrit laskettiin noncompartmental analyysi WinNonlin. Everolimuusin plasma data sovitettiin kahden osaston malliin ensimmäisen asteen imeytymistä ja simulaatioita plasmapitoisuudet 5 mg /kg everolimuusin suoritettiin SAAM II versio 2.1 (Epsilon ryhmä, Charlottesville, VA /University of Washington) .

Yksisuuntainen ANOVA analyysien kanssa Tukey post-testiä käytettiin määrittämään välillä tilastollista merkitystä useita ryhmiä. Analyysit tehtiin Prism versio 4.02.

P

arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Kaikki määrälliset metabolomic aineistoja sisällytettiin erikoisvalmisteinen metabolisen vuot analysaattorit ja dataliitynnät ja esitetään metabolisen lämmön karttoja [23].

Tiedot ovat peräisin in vivo tutkimuksessa mallinnettiin arvioida terapeuttista hyötyä lisätä everolimuusin kohteeseen irinotekaani. Mallia käytettiin samanlainen kuin aiemmin julkaistu malli arvioitaessa yhdistelmähoitoa [24]. Joitakin muutoksia tehtiin ja yksityiskohdat mallin löytyy Supplement S1 (jakso SA.3.) Ja täydennysosa S2. Kaikki mallinnus suoritettiin yksittäisen eläimen kasvaimen tilavuus tiedot ja mallinnetaan SAAM II versio 2.1.

Tulokset

In vitro Activity

synergiavaikutuksen everolimuusi (RAD) ja SN38 arvioitiin CRC solulinjoissa, HT29 (

BRAF

mt;

PIK3CA

mt, p53 mt), HCT116 (

KRAS

mt,

PIK3CA

mt ), HCT8 (

KRAS

mt) ja LS180 (

KRAS

mt;

PIK3CA

mt). Kaikille

in vitro

kokeita SN38 sijasta käytettiin irinotekaanin koska SN38 on irinotekaanin aktiivisen metaboliitin. HT29 olivat herkkiä SN38 ja everolimuusi ja lisäämällä everolimuusin että SN38 tarjotaan yleensä vahvasti synergististä vaikutusta HT29, HCT8 ja HCT116 solujen Cl-arvot vaihtelevat 0,1-0,7 (kuva 1). Lisäys everolimuusin että SN38 hoitoa LS180 soluissa ei ollut yhtä selkeä kuin CI-arvot vaihtelivat suuresti 0,3-1,4. Western blot -analyysit osoittavat, että pieninä pitoisuuksina, everolimuusi (20 nM) kykenee estämään ribosomaalisen fosfo-S6-kinaasi (pS6RP) kaikissa solulinjoissa ja SN38 (4 nM), aiheuttaa lisää p21 HCT116 ja HCT8 soluja (kuvio 2) . Ei p21 oli mitattavissa HT29 annoksilla everolimuusin ja irinotekaanin käytetty. Pieni määrä pilkotun PARP (MW 89) havaittiin SN38 käsitelty HCT8 soluja, mutta ei HT29 tai HCT116.

kombinatorisista antiproliferatiivisia vaikutuksia arvioitiin HT29, HCT116, HCT8 ja LS180-solujen arvioimiseksi potentiaali lisäaine tai synergistiset vaikutukset. Kasvun esto mitattiin sulforhodmine B-määritys (SRB) jälkeen 72 tunnin inkubaation SN38 (0, 2, 4 tai 8 nM) ja RAD (0, 2, 20 tai 200 nM – merkitty Triangels alla kuvaajat). Tiedot kuvaajat on keskiarvo ± keskihajonta, joka on vähintään 3 erillisestä kokeesta. Yhdistelmä-indeksi (CI) arvot laskettiin kaikkien yhdistelmiä ja arvot ± keskihajonta esitetään värilliset taulukoissa kunkin kaavion .. the% CV rinnakkaiskokeista vaihteli 5-40% ja oli keskimäärin -20% siksi, me todennut, että CI-arvot 1,2 pidetään vastakkaisia, 1,2 CI 0,8 ovat lisäaine, ja CI 0,8 synergisyyteen. Huomaa, että SN38 on käytetty

in vitro

määrityksissä sijasta irinotekaanin koska se on vaikuttava metaboliitti.

Akt, p-Akt, PARP, halkaistut PARP, yhteensä ribosomaalinen S6 kinaasin ( S6), ribosomaalinen fosfo-S6-kinaasi (PS6), ERK, p-ERK, p21 ja α-tubuliinin mitattiin kaikki rivit 24 tuntia sen jälkeen hoidon RAD (20 nM), SN38 (4 nM) tai yhdistelmä kaksi. Molekyylimassat esitetään vieressä proteiinin nimen suluissa. Huomaa, että SN38 on käytetty

in vitro

määrityksissä sijasta irinotekaanin koska se on vaikuttava metaboliitti.

Farmakokinetiikka-Directed annostelu Everolimuusi ja Irinotekaanin

in vivo

tutkimuksissa, loimme annoksia everolimuusin ja irinotekaanin hallinnoida hiirille, jolla odotetaan riskien tai alle kliinisesti saavutettavissa tasoilla. Ihmisen farmakokineettiset tiedot everolimuusin [25], [26] ja irinotekaani /SN38 [27] – [30] kerättiin kirjallisuudesta ja esitetään taulukoissa 1 ja 2 vastaavasti.

määrittää sopivan annoksen everolimuusin hiirillä, teimme farmakokineettinen tutkimus everolimuusin HT29 kasvain hiirille. Plasmassa vakaassa tilassa ja kasvaimen pitoisuus-aika-profiilit esitetään Supplement S3 kuvissa SC.2. A B ja ei-tilamalleista farmakokineettiset parametrit esitetään taulukossa 1 ja taulukossa C.1 Supplement S3. Tulokset osoittivat, että 10 mg /kg hiirillä johtaa vakaan tilan vapaa plasma-altistus (AUC

ss, vapaa = 116 ng * h /ml), joka on välillä saaneilla ihmisillä on kliinisesti käytetyt annokset 5-10 mg /kg vuorokaudessa (AUC

ss, vapaa = 60-178 ng * h /ml). Sitoutuminen plasman proteiineihin arvot 99% ja 75% käytettiin laskettaessa vapaa plasmassa hiirillä ja ihmisillä vastaavasti [31], [32]. Kuitenkin in vivo tehotutkimuksissa päätimme käyttää 5 mg /kg (AUC

ss, vapaa = 37 ng * h /ml) varovaisia ​​saavuttaa liikaa ainoana lääkkeenä toimintaa, joiden avulla olisi vaikea arvioida yhdistelmäefektit. Aiemmat tutkimukset everolimuusin hiirillä HCT116 tuumoriksenografteja osoitti yksittäisen aineen aktiivisuus (45-55% kasvaimen kasvun esto) everolimuusin klo 10-12 mg /kg [33], [34].

In vivo

SN38 tiedot arvioitiin määritellä irinotekaaniannosta voidaan käyttää, koska se on aktiivinen metaboliitti irinotekaanin ja karboksyyliesteraasin muuntaminen irinotekaanin SN38 vaihtelee hiiressä ja ihmisessä. Perustuen ihmisen ja hiiren farmakokineettiset tiedot on kerätty kirjallisuudesta tietoja [27] – [30], [35] – [40], valitsimme annoksella 10 mg /kg irinotekaania annetaan laskimoon kerran viikossa (taulukko 2). 10 mg /kg iv-annos oli arvio, jolloin saatiin vapaa altistuminen SN38 välillä on havaittu ihmisillä (hiirillä: AUC

vapaa = 7,5-25,8 ng * h /ml; ihmisissä: AUC

ilmaiseksi = 4,4-18,6 ng * h /ml annokset vaihtelevat 125-350 mg /m

2). SN38 plasman proteiineihin sitoutumisaste on 96,6-98,6% hiiriä ja 98% ihmiselle käytettiin laskettaessa vapaa jae yhteensä pitoisuuksia [37].

-tuumoriksenografti vastaus Everolimuusi ja irinotekaanihoitoa

teho everolimuusin, irinotekaanin ja näiden kahden yhdistelmä määritettiin HT29 ja HCT116 tuumoriksenografteissa. Kuvio 3A esittää kasvaimen kasvun profiilit kaikissa hoitoryhmissä molempien kasvaintyyppien. Everolimuusi aiheutti samanlaisia ​​ja tilastollisesti merkitsevä (p 0,05 vs. kontrolli) kasvun estäminen sekä HT29 (keskimääräinen kasvaimen kasvun estäminen, TGI = 40%) ja HCT116 (keskiarvo TGI = 44%) kasvaimia taas irinotekaani aiheutti merkittäviä kasvun estäminen vain HT29 kasvaimissa (keskiarvo TGI = 39%; p 0,05). Lisäys everolimuusin irinotekaanille merkittävästi vähensi HT29 (keskimäärin TGI = 64%) ja HCT116 (keskiarvo TGI = 61%) tuumoriksenografteja (P 0,05 vs. kontrolli).

(A) HT29 ja HCT116 -tuumoriksenografti kasvukäyrät. Eläimiä käsiteltiin 28 päivän ajan ajoneuvoja, RAD, IRI, tai yhdistelmä RAD + IRI. Data edustaa keskiarvoa ± SEM 9-12 kasvainten per ryhmä.

* P 0,05 versus ajoneuvoon. (B) Farmakokineettiset-farmakodynaaminen mallinnus suoritettiin voitaisiin arvioida määrällisesti intensiteetti RAD + IRI yhdistelmän HT29 ja HCT116 tuumoriksenografteissa. Tämä on graafinen esitys vuorovaikutuksen termi (ψ) varten RAD + IRI yhdistelmä. Kukin pylväs ψ arvoa yksittäisen kasvaimen. ψ arvot 1,3 ovat synergistisiä, 1,3 ψ 0,7 ovat lisäaine, 0,7 ψ 0 ovat alle lisäaine, ja ψ 0 ovat vastakkaisia.

Modeling kasvaimen kasvua profiilit ja käsittelyn vaikutus ilmeni, että yhdistelmä everolimuusin ja irinotekaanin oli keskimäärin lisäainetta (keskiarvo ψ = 0.9) in HT29 kasvaimissa (kuvio 3B). Jokainen kasvain mallinnettiin erikseen ja 10 HT29 kasvaimia, 1 osoitti synergistisen vasteen, 8 osoitti lisäaineen vasteen ja 1 oli vähemmän kuin additiivinen, mutta ei vihamielinen. ψ edustaa termiä käytetään matemaattisen mallin kuvaamaan kombinatorisista vaikutus, missä ψ 1,3 on synergistinen; 1.3 ψ 0,7 edustaa lisäaineen vuorovaikutus, 0,7 ψ 0 on pienempi kuin additiivinen vaikutus ja ψ 0 on antagonistic. Tiedot mallintamiseen ja yksittäisten kasvainten tiedot ja sopii löytyy lisäosassa S1, jakso SA.3., Ja täydennysosa S2. Kasvu profiilit HCT116-ksenografteista olivat paljon vaihtelevampi kuin HT29 kasvaimia. Näin ollen, vaikka keskimääräinen kasvaimen kasvun inhibitiota yhdistelmän hoito näyttää samanlaiselta kahden kasvaintyypeissä (TGI = 64% vs. 61%), ja HCT116 kasvaimen etu oli keskimäärin vähemmän kuin lisäaineen (keskimäärin ψ = 0,5). Jälleen kukin kasvaimen kasvua profiili mallinnettiin erikseen ja 3 kasvaimia todettiin additiivinen vaikutus, 5 olivat alle lisäainetta ja 2 olivat vastakkaisia.

vaikutukset everolimuusin, irinotekaanin ja näiden kahden yhdistelmä kasvaimen aineenvaihduntaan mitattiin alaryhmässä eläinten tutkimuksen lopussa. Metabolinen profiilit määritettiin

1H-,

13C-

31P NMR. Kuvio 4 esittää metabolisen lämpöä karttoja kuvaavien aineenvaihdunnan muutoksiin joukossa hoitoryhmissä suhteessa kontrolliryhmään HT29 ja HCT116 ksenograftit. Vaikutukset everolimuusin glukoosiaineenvaihduntaan, laskevan laktaatti ja glykolyysin, olivat samanlaiset HT29 ja HCT116 kasvaimia, sopusoinnussa kasvaimen kasvua vaste havaittiin kahdessa kasvaimen tyyppiä. HT29 kasvaimia esiintyi voimakkaampaa vaste irinotekaani hoitoa, joka on useimmiten liittyvät lipidien kerääntymistä, erityisesti poly-tyydyttymättömiä ja fosfolipidejä, jotka voivat liittyä lisääntyneeseen solun hajoamista ja nekroosia. Tämäkin on sopusoinnussa kasvaimen kasvua profiilit HT29 ja HCT116 kasvaimia, jotka osoittivat, että HT29 kasvaimia vastasi irinotekaani kohtelustaan ​​HCT116 kasvaimia ei. Yhdistelmä everolimuusin irinotekaanin liittyy lisääntynyt lipidien kertymistä, kalvo hajoaminen (lisääntynyt GPC ja vähentynyt PC /GPC) ja jossain määrin vähentynyt glykolyysin HT29 kasvaimia. Sama vaste ei havaittu HCT116 kasvaimissa, vaikka keskimääräinen kasvaimen kasvun inhibition yhdistelmähoidon, jolloin saatiin sama tulos. Kaiken HT29 kasvaimet olivat metabolisesti reagoivat kaikki kohtelun kuin HCT116 kasvaimia.

1H-,

13C, ja

31P-NMR-tulokset esitetään keskiarvona ± SEM 3- 6 mittauksia. Metaboliitit, niiden suhteet ja metabolisen vuot oli ryhmitelty perustuu niiden biokemiallisten merkitystä. Kontrolliryhmän kaikki solunsisäiset metaboliittitasoihin on annettu umol per gramma solujen märkäpainoa ja metaboliitin suhteet ovat unitless. Metaboliareittiä jotka koskemattomiksi joiden hoito keltaisina karttoja. Väheneminen metabolisen loppupiste on merkitty punaisella, kun taas kasvu vihreät täplät. Tilastollinen merkitys metaboliitin muutokset perustuvat monimuuttujamenetelmin aineenvaihdunnan -virtausnopeuk- p 0,02. Vuorovaikutteinen metaboliaprofiilin array tietokanta oli erikoisvalmisteinen pohjainen [23].

Keskustelu

Uusien terapeuttisten ja hoitostrategioita edellyttää prekliinisissä. Usein, vaikuttava prekliininen aktiivisuus lupaavia uusia aineita ja aineiden yhdistelmien ei käännä elinkelpoisille kliinisiä hoitoja. Rational tutkimuksen suunnittelu kanssa määrällinen lopputuloksista on kriittinen tehokkaan kääntämistä yhdistelmästrategioista ja biomarkkerit tehon [6], [41]. Yleisenä tavoitteena Tutkimuksen tässä kuvatut oli määrällisesti selvittää kombinatorisista vaikutus everolimuusin ja irinotekaanihoitoa hiirimalleissa CRC, kätkeminen vaikea hoitaa genotyyppejä, hyödyntäen farmakokineettinen-ohjattu annostusohjetta. Perustuen ihmisen ja hiiren farmakokineettiset tiedot, loimme annoksia everolimuusin ja irinotekaanin käytettäväksi prekliinisissä

in vivo

tutkimuksista saadaan vastuut välillä havaittuun ihmisillä. On tärkeää huomata, että me korjataan yhteensä pitoisuudet vapaata tai sitoutumattoman jakeet tehtäessä vertailuja farmakokineettisten tietojen hiiressä ja ihmisessä. Tämä on kriittinen, koska plasman proteiineihin sitoutumisen usein vaihtelee lajien ja teoriassa vain sitoutumattoman osuuden lääke on saatavilla vuorovaikutukseen mielenkiinnon kohteena.

Testasimme everolimuusi ja irinotekaanin yhdistelmän

in vivo

kahdessa solulinjassa ksenograftimalleja CRC, HT29 ja HCT116. Yhdistelmä oli hyvin siedetty kuin merkittäviä paino muutoksia ei havaittu (Supplement S3 kuva SC.2.). Arviointi tutkimuksen loppuun kasvaimia koskevien tietojen kustakin kasvaintyyppi osoittaa everolimuusihoidon ja irinotekaanin lukemiin tilastollisesti merkitsevä tuumorin kasvun estämistä ja aste vaste näyttää samanlaisia ​​kahdenlaisia. Kuitenkin tässä osoitamme, että arvioimalla kunkin kasvaimen kasvua profiili, tilavuus funktiona ajan, voimme valaista eroja kasvun ja vastaus kahden kasvaimen tyyppiä. Kautta matemaattinen mallintaminen valvonnassa, monoterapialla ja yhdistelmä käsivarret Tutkimuksen pystyimme arvioida määrällisesti vuorovaikutus kahden yhdisteen ja totesi, että HT29 kasvaimissa,

BRAF

ja

PIK3CA

mutantti, yhdistelmä oli lisäaineen ja HCT116 kasvaimissa,

KRAS

ja

PIK3CA

mutantti, yhdistelmä oli varsin vaihteleva, mutta vähemmän kuin lisäaine keskimäärin. Sen lisäksi, että arvioidaan kasvaimen kasvun me kvantitatiivisesti vaikutukset hoitojen kasvaimen aineenvaihduntaan käyttäen NMR-pohjainen metabolomiikan.

Metabolisesti, HT29 ksenograftit olivat joustavampia kuin HCT116 ksenografteja. HT29 kasvaimia, mutta ei HCT116 kasvaimia, irinotekaanikohortissa ryhmässä näkyy tyypillinen metabolisen allekirjoituksen Sytostaattihoidossa lipidien kerääntymistä ja fosfolipidien, maininta sytotoksisuuden /kuolion [42]. Tämä tulos on yhdenmukainen kasvaimen kasvua profiilit, mikä osoittaa, HT29 kasvaimia vastaa irinotekaani hoitoon (TGI = 39%, p 0,05), mutta ei HCT116 kasvaimet (TGI = 17%). Nämä tulokset myös samaa mieltä

in vitro

tiedot, jotka osoittavat HT29 (IC 50 = 3 nM) on herkempi kuin HCT116-soluissa (IC50 300 nm), SN38 hoitoon. Mukaan meidän simulaatiot (Supplement S2), vapaa pitoisuudet SN38 plasmassa vaihtelivat 1300 7.25e-4 nM 24 tunnin aikana, jonka keskimääräinen pitoisuus 4-18 nM, mikä on selvästi alle arvioitu IC50 HCT116 solut. Samankaltaisuudesta huolimatta kasvaimen kasvun estäminen profiilit everolimuusin käsiteltyjen HT29 kasvaimet ja HCT116 kasvaimet (TGI = 41% vs. 44%, vastaavasti), HT29 kasvaimia esiintyi hieman enemmän metabolisesti reagoiva kuin HCT116 kasvaimia. Jotkut lasku Glykolyysivaiheen mitattiin sekä HT29 ja HCT116 kasvaimia, mutta kasvu GPC ja joitakin lipidien kertymistä havaittiin myös HT29 kasvaimia. In vitro, HT29 olivat reagoiva everolimuusille kohtelun kuin HCT116-solut, koska IC50 lisääntymistä oli pienempi (1,2 nM vs. 25 nM) ja suurempi p-S6RP esto havaittiin 20 nM.

In vivo,

samanlaisia ​​vasteita eston p-S6RP ja sykliini D1 havaittiin HT29 ja HCT116 kasvaimet (Supplement S3 kuva SC3 ja SC4); kuitenkin, toimenpiteet p-S6RP ei voi olla käyttökelpoinen keino arvioida tehoa. Aiemmin julkaistu tutkimus osoitti, että everolimuusi kohtelu sekä herkkä ja kestävä linjat voivat johtaa yhteensä defosforylointia S6K1 ja S6 [33].

spekuloida, että jotkut tehoa Everolimuusin havaittu HCT116 kasvaimet voivat liittyä antiangiogeeninen vaikutukset everolimuusin. Antiangiogeeninen vaikutus everolimuusipitoisuuksia on aiemmin raportoitu [33], [43] ja antiangiogeenisten vaikutukset olisivat paljon vaikeampi havaita koko kasvain metabolomiikan, kuten suoritetaan tässä, koska osa endoteelisolujen verrattuna kokonais-kasvain kudos on melko pieni. Lisätodisteita tukemaan tätä voidaan johtaa everolimuusin farmakokineettistä tietoa. Vapaa plasmassa tuotetaan 5 mg /kg: n annoksella eläimiämme vaihteli 0,2-6 nM (C

min C

max), jonka keskimääräinen vapaa pitoisuus (C

ss, avg) noin 1,5 nM, joka on riittävä estämään HT29 kasvua, mutta ei HCT116, ja aiemmat tiedot raportoivat voimakas anti-proliferatiivista aktiivisuutta everolimuusin VEGF ja bFGF stimuloidun endoteelisolujen (HUVEC) ja IC50-arvot 0,1-0,8 nM [33].