Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

metylaatiotasoilla genomista toistojen kuten pitkät välissä nukleotidin elementit (LINE-1) edustavat maailmanlaajuisia metylaatiostatuksen ja niillä on tärkeä rooli ylläpito perimän vakautta. Tavoitteena oli arvioida LINE-1 metylaatiostatuksen kolorektaalisyövässä (CRC) suhteessa adenomatoottisen ja pahanlaatuinen etenemisen, kudos heterogeenisyys, ja TNM-vaiheessa.

Menetelmät /Principal Havainnot

DNA kerättiin laser-capture mikrodissektion (LCM) normaalista, adenooma, ja syöpä kudosta 25 potilasta TisN0M0 ja 92 ensisijaista CRC potilasta eri TNM-vaiheissa. Parafiinipinnoitettu kudosleikkeet hoidettiin

in-situ

DNA natriumbisulfiittia muutos (SBM). LINE-1 hypometylaatio indeksi (LHI) mitattiin absoluuttinen kvantitatiivinen analyysi metyloitu alleelien (AQAMA) reaaliaikainen PCR; suurempi indeksi osoitti parannetun hypometylaatio. LHI normaalissa, syöpä mesenkymaalisten, adenooma, ja CRC kudos oli 0,38 (SD 0,07), 0,37 (SD 0,09), 0,49 (SD 0,10) ja 0,53 (SD 0,08), tässä järjestyksessä. LHI merkitsevästi enemmän adenooma kudoksessa verrattuna sen vierekkäin normaalin epiteelin (

P

= 0,0003) ja syöpä mesenkymaalisten kudosten (

P

0,0001). LHI eivät eronneet merkittävästi toisistaan ​​adenooma ja varhaisen syövän kudoksen Tis vaiheessa (

P

= 0,20). LHI koholla korkeamman T-vaiheessa (

P

0,04), oli merkitsevästi enemmän paikallisiin imusolmukkeisiin kuin solmu-negatiivinen CRC potilailla (

P

= 0,03), ja merkitsevästi enemmän IV vaiheessa kuin kaikki muut taudin vaiheissa (

P

0,05).

Päätelmä /merkitys

käyttämällä

in-situ

SBM ja LCM solu valinta osoitimme iällä LINE-1 demetylaatio aikana adenomatoottisen muutos paksusuolisyövän epiteelisolujen ja osoittivat, että LINE-1 demetylaatio eteneminen on lineaarinen suhteessa TNM-vaiheen etenemisen.

Citation: sunami E, de Maat M, Vu A, Turner RR, Hoon DSB (2011) LINE-1 hypometylaatio aikana Ensisijainen Colon Cancer Progression. PLoS ONE 6 (4): e18884. doi: 10,1371 /journal.pone.0018884

Editor: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 12 lokakuu 2010; Hyväksytty: 24 maaliskuu 2011; Julkaistu: 14 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 sunami et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimukset tukivat Weil Family Foundation (Los Angeles, CA) ja Leslie ja Susan Gonda (Goldschmied) Foundation (Los Angeles, CA). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Noin 17-18% ihmisen genomin koostuu pitkistä välissä nukleotidin elementti (LINE-1) toistaa. Noin 500000 katkaistu ja 3000 ja 5000 täyspitkä LINE-1-sekvenssit ovat läsnä kaikkialla genomissa [1]. Normaaleissa somaattiset solut, LINE-1s voimakkaasti metyloitu, rajoittaa toimintaa retrotransposal elementtejä ja siten estää genomin epästabiilisuuden [2], [3]. LINE-1-sekvenssit ovat kohtalaisen CpG rikkaita, ja useimmat metyloituja CpG: t sijaitsevat 5 ’alueella ja voivat käyttäytyä sisäisenä promoottorit [2]. LINE-1 metylaatiostatuksen ajatellaan edustavan genominlaajuisia DNA: n metylaatio tila, koska LINE-1-sekvenssit ovat erittäin toistetaan laajalti välissä ihmisen retrotransposoneja. Useat tutkimukset ovat osoittaneet suhteessa tärkeitä genomista tapahtumista peräsuolen syövän synnyn LINE-1 metylointi. Esimerkiksi 18q Heterotsygotian menetys (LOH) (+) peräsuolen syöpä (CRC) osoittavat alemman keskimääräisen LINE-1 metylointi tason [4]. Käänteinen suhteessa on raportoitu välillä LINE-1 metylaation ja mikrosatelliitti epävakaus (MSI) + /CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP) + /BRAF V600E mutaatio CRC [5], [6]. Siellä on viime aikoina raportoitu merkittävä käänteinen korrelaatio tasojen LINE-1 metylaation ja kokonaismäärä kromosomipoikkeavuuksien, mukaan lukien sekä tappiot ja voitot ruuansulatuskanavan tukikudosten kasvaimet (GIST) [7]. Mitä tulee CRC, Bariol et ai. paljasti, että maailmanlaajuinen DNA hypometylaatio taso oli suurempi uudisvaurioiden (mukaan lukien hyperplastic polyyppeja ja adenooma) kuin normaalissa limakalvo [8].

Tärkeä ongelma arvioitaessa LINE-1 metylaatiostatuksen CRC on, että CRC on hyvin heterogeeninen ja sisältää erilaisia ​​infiltroituvat solut kuten stroomasolut, lymfosyytit, ja verisuonia. Sidekudosmateriaali komponentti ja laajuus lymfosyyttien tunkeutumisen vaihtelee suuresti CRC. Tämä heterogeenisuus saattaa hämmentää molekyylitason analyysi, erityisesti LINE-1 metylaatiostatuksen, kuten LINE-1 on metyloitu normaaleissa soluissa. Saadakseen tarkka tulkinnat, on sen vuoksi tarpeen eristämiseksi spesifisesti kasvainsolujen kudosnäytteet. Alkuvaiheen CRC primaarikasvaimen analyysi ilman histopatologia-suunnattu mikrodissektion arvioimista perimän metylaatiostatuksen ei ole tarkka. Tämä on erityisen ongelmallista, kun arvioidaan CRC etenemistä ja verrattaessa adenooma syöpään kudokseen. Kestävä ja tarkka tekniikoita tällaisia ​​analyyseja ei ole; Siksi olemme kehittäneet käytännöllinen lähestymistapa. Hyödynsimme laser-capture mikrodissektion (LCM) sato soluihin kiinnostava suoraan ilman saastuminen ei-syöpäsoluja. Natriumbisulfiittia muutos (SBM) genomisen DNA: n on yleisesti käytetty menetelmä erottaa metylaatiostatuksen CpG-saarekkeiden [9]. Tavanomaiset SBM menetelmät johtavat osaksi 84%: sta 96% menetys näytteen DNA [10]. Tämä merkittävä menetys templaatti-DNA edellyttää suuria määriä lähtökudosten näytteen. Voit vähentää menetyksiä näytteen solujen DNA kerättiin LCM kehitimme

in-situ

SBM-protokollaa. DNA muokattiin samalla vangitut solut edelleen kiinnitetty LCM korkki.

Lukuisissa tutkimuksissa on raportoitu tunnistaa CRC-liittyvä epigeneettisellä poikkeavuuksien kuten promoottorialueen hypermetylaatiota tuumorisuppressorigeeneille. Toinen ominaisuus muutos CRC koskevat DNA: n metylaatio tila on maailmanlaajuinen hypometylaatio [11], [12]. Etenemisen LINE-1 hypometylaatio tason kehittämisen aikana CRC pahanlaatuisen ja sairauden etenemisen ei ole tarkasti arvioitu. Määritetään histopatologia liittyy puhkeamista menetys LINE-1 metylaation ja suuntaus LINE-1 metylointi akselia pitkin sairauden vaiheen etenemisen voisi edelleen selkeyttää roolia LINE-1 hypometylaatio CRC tauti. Tässä tutkimuksessa LCM,

in situ

SBM, ja absoluuttisia metyloituja alleelien (AQAMA) käytettiin yhdessä näytteistä potilailta, joilla adenoomia sisältää

in situ

invasiivisia adenokarsinooma (Tis) ja potilailla, joilla on kehittyneempi CRC. Tämä mahdollisti onnistuneen tarkka analyysi LINE-1 hypometylaatio tasot aikana ensisijainen syövän etenemisen välillä etenevä T-vaihetta, imusolmukkeisiin versus imusolmukenegatiivisista sairaus, ja etäinen metastaattinen versus paikallinen ja Paikallista sairaus.

Tulokset

AQAMA lineaarisesti LINE-1 metylointi tason arviointi

ensin arvioitiin tarkkuutta AQAMA arvioitaessa eri tasoilla LINE-1 metylointi. Suuri etu AQAMA on, että kvantitatiivinen mittaus metyloituneiden ja metyloitumattomien alleelien suoritetaan yhdessä PCR-reaktiossa, joka tarjoaa erinomaiset ohjaus verrattuna kahteen erilliseen PCR-reaktiot metyloidulle ja metyloimattoman alleelin analyysi. Kvantifiointia on ehdoton standardi käyrät määrittää kopiomäärän. Jos negatiivinen kontrolli, kokeen reaktio sisälsi yleisen metyloimattoman kontrolli-DNA, joka syntetisoitiin, kuten on kuvattu aikaisemmin julkaistu tutkimus [13]. Jos positiivinen kontrolli, käytimme universaali metyloitua kontrolli-DNA uutettiin periferaalisen veren lymfosyyttejä terveestä luovuttajasta ja käsiteltiin

SSSI metyylitransferaasi.

Tässä tutkimuksessa olemme valmistettiin vaiheittain seokset metyloitu ja metyloitumaton cDNA standardi ja mitataan niitä näytteinä tuntemattomalla metylaatio tasolla. Lineaarisuuden AQAMA määritys LINE-1 metylointi tason (kuva 1) arvioitiin Pearsonin kertoimella lineaarisuus: 0,99 (

P

0,001), joka osoitti erittäin tarkasti erotteleva LINE-1 metylointi tasoeroja.

Plot mitattujen (laatikot) ja odotettu (x) arvojen osoittaa tarkkuus AQAMA LINE-1 määrityksessä.

optimointi

in-situ

SBM asetukset

LCM suoritettiin sadonkorjuun soluihin kiinnostavaan (kuva 2a) saada tarkkoja edustus solujen kyseessä onnistuneen AQAMA mittaukseen. Kolme erilaista näyte kudosta alueilla 10

4, 10

5 ja 10

6 um

2 korjattu 4 pm paksu parafinoidut arkistointi kudoksen (turve) testattiin. Analysoimalla, loimme että 2 x 10

5 um

2 4 pm paksu TURVE johtaa noin 10

5 kopio numerot LINE-1 DNA. Tämä merkitsevästi toistettavissa tasoja DNA LINE-1 metylaatiomääritystä. Sen jälkeen LCM,

in-situ

SBM optimoitiin samalla tavalla kuin tehtiin aiemmissa tutkimuksissa on-slide SBM käyttämällä erityisiä genomisen sekvenssin monistaminen [14]. Muuntokertoimet muunnettua DNA:

in-situ

SBM olivat 18,4 ± 14,9%, 87,8 ± 7,8% ja 94,4 ± 2,1%: iin inkubaation asettaminen 60 ° C: ssa 2, 4 ja 8 tuntia, vastaavasti (kuva 2b). Muuntokursseja lisääntyi kasvu inkubaatioaika, jolloin sen jälkeen 8 tuntia se saavutti noin 95%. Saanto kokonais-DNA (modifioitu ja modifioimaton DNA) ei laskenut kasvaessa inkubaatioajan jopa 8 tuntia (kuvio 2c). Näistä tuloksista inkubointiaika asetus 60 ° C: ssa 8 tuntia valittiin optimaalinen

in-situ

SBM.

A esittää erityinen nouto kohdesolujen LCM. B ja C esitetään tulokset DNA tulosprosentti (%) ja DNA-pitoisuuden (x 10

4 kopiota numerot), vastaavasti, 8 eri näytteitä 3 eri itämisaika.

LINE- 1 hypometylaatio tasot aikana CRC etenemisen

Kaksikymmentäviisi potilasta, joilla TisN0M0 vaurioita on normaali, adenooma (alhainen tai väli-tason) ja ti syöpäsoluja samalla kudoksen osassa valittiin. Käyttäen LCM, neljä eri kudosnäytteistä (normaali limakalvo, adenooma, syövän ja mesenkymaalisten kudosten) kerättiin kunkin potilaan.

In situ

SBM ja LINE-1 AQAMA määritys tehtiin jokaisesta näytteestä. Taso LINE-1 hypometylaatio (LHI) laskettiin Q

unmeth /(Q

unmeth + Q

met), jossa Q

unmeth ja Q

met ovat ehdoton kopio numerot metyloitumattoman ja metyloitu LINE-1, tässä järjestyksessä. Normaalissa limakalvon vieressä tuumorileesioissa ja syöpä mesenkyymiin keskimääräinen LHI oli 0,382 ja 0,366, tässä järjestyksessä. Ei ollut eroa LHI välillä syövän mesenkyymin ja normaalin limakalvon vieressä kasvain. LHI oli merkitsevästi suurempi vierekkäin adenooma ja syöpäkudoksessa alkuvaiheen kuin normaalissa limakalvo (keskiarvo LHI = 0,49, 0,52 ja 0,38, vastaavasti) (kuvio 3). Näistä tuloksista päättelimme, että LINE-1 hypometylaatio tapahtuu alkuvaiheessa CRC kasvaimien syntyyn. Lisäksi nämä kokeet osoittivat tarvetta käyttää yksityiskohtaiset menettelyt DNA kokoelma analysoitaessa LINE-1 metylaatiotasoilla, kuten kohdesolun eristämistä, jonka LCM. Perusteella tämän, LCM käytettiin DNA näytekokoelmatodistuksen kaikissa kokeissa meidän tutkimuksissa.

LINE-1 hypometylaatio ja kudosten heterogeenisuus

analyysissä LHI normaalia, syöpä mesenkymaaliset, adenooma, ja CRC kudos, oli 0,38 (SD 0,07), 0,37 (SD 0,09), 0,49 (SD 0,10) ja 0,53 (SD 0,08), tässä järjestyksessä. Voit testata, onko heterogeenisyys LINE-1 hypometylaatio sisällä kasvain, 20 T3N0 kasvaimet valittiin analysoitavaksi. Näyte-DNA kerättiin luminaalipinnalla ja syvin invasional päällä kunkin kasvaimen. LHI näiden kahden loci verrattiin (kuvio 4). Keskimääräinen LHI oli 0,58 pintaan ja 0,54 syvin loci. LHIs olivat samanlaiset pinnan ja syvimmässä loci ja kasvain heterogeenisyys LINE-1 hypometylaatio ei havaittu.

Mitatut LHI arvoja T3N0 CRC kasvaimissa vertaamalla saatujen solujen pinnalta luminaali kasvaimen alueelta syvä invaasio kasvain alue.

LINE-1 hypometylaatio ja CRC vaiheessa

arvioimiseksi muuttamista LINE-1 hypometylaatio tasot mukaan syövän etenemiseen, korrelaatio Dukes vaiheiden ja LHI analysoitiin. Dukes A (n = 38), Dukes B (n = 18), ja Dukes C (n = 29) näytteet valittiin (kuvio 5c). Keskimääräinen LHI in Dukes A, B, ja C oli 0,533, 0,607, ja 0,621, tässä järjestyksessä. Dukes B ja C kasvainten verrokkeja useammin LHI kuin Dukes kasvaimia. Suhde LINE-1 metylointi ja T-vaiheen (T1 (n = 24), T2 (n = 21), T3 (n = 21), ja T4 (n = 26)) sekä N-vaiheessa (N0 ( n = 57) ja N1 (n = 35)) analysoitiin. Kasvu LHI mukaisesti tuumori-invaasio (kuvio 5a) ja ero LHIs välillä imusolmukkeiden positiivinen ja negatiivinen tapauksissa (kuvio 5b), arvioitiin. Keskimääräinen LHI T1, T2, T3 ja T4 on 0,50, 0,58, 0,60, ja 0,65, vastaavasti. LHI oli merkittävästi suurempi (

P

= 0,03) tapauksista, joissa positiivisia imusolmukkeita (LHI = 0,64) kuin negatiivinen imusolmukkeet (LHI = 0,54). Ennustaminen imusolmukestatuksesta olisi kliinisesti merkityksellisiä, ja näin ollen vastaanottimen toiminta-käyrä (ROC) analysoitiin erottaa, jos etäpesäke positiivinen voi olla prognostinen indikaattori ensisijaisen CRC avulla LHI (kuvio 6). T-vaiheen eteneminen korreloi merkittävästi kasvaessa LHI (

P

= 0,01). Analysoimme myös tapauksia kaukaisiin taudin leviämisen (Dukes D, n = 6), ja näissä tapauksissa verrokkeja useammin LHI verrattuna Dukes C CRC (

P

= 0,05) yksinään ja kaikille muille Duke vaiheet (

P

0,0001). ROC piirrettiin osoittaa tarkkuutta ennustamiseksi solmukohtien osallistuminen LHI (kuvio 6). Tämä osoitti, että ennustearvo herkkyys oli 0,77, joiden spesifisyys 0,62. Siellä oli merkittävästi pienempi LHI varten oikeanpuoleinen versus vasemman puoleinen paksusuoli (

P

0,05). Ei kuitenkaan ole merkittäviä eroja ei havaittu LHI erilaistumisen asemasta tai sukupuolesta.

In A, B ja C erot näkyvät välillä Duke vaiheessa T-vaihe ja N- vaihe, vastaavasti.

x-akseli edustaa 1-spesifisyyttä ja y-akselin herkkyys. Alue käyrän alla (AUC) laskettiin 0,69. P = 0,003.

Nämä analyysit osoittivat lineaarinen positiivinen suhde etenemistä LINE-1 hypometylaatio ja CRC vaiheessa etenemistä.

Keskustelu

muuttaminen DNA: n metylaatio kuviot on tutkittu monenlaisia ​​syöpä [15]. Hypermetylaatiota erityinen syöpään liittyvän geenin promoottori alueille ja maailmanlaajuinen DNA hypometylaatio aikana syövän etenemistä on nyt esitetty merkittävä ominaisuus syöpiä [16], [17]. Hypometylaatio LINE-1 DNA toista, joka muodostaa 20% genomin on ehdotettu korvikkeena maailmanlaajuinen DNA hypometylaatio [5], [18], [19], [20]. Yang et ai. osoittivat, että genominlaajuisten metylaatio voidaan arvioida arviointi [21]. Alu toistot ovat Sinesin monimutkaisempia, ja monipuolinen kuin linjat. Luotettava metylaatio määrityksiä tutkimaan Alu eivät ole hyvin perusteltuja. Tarkka määritys edustava maailmanlaajuinen metylaation ilmiötä ei ole olemassa; kuitenkin, LINE-1 voi toimia sekä korvike.

LINE-1 hypometylaatio ei ole spesifinen syöpäsoluja, ja noin kolmasosa LINE-1 on metyloitumaton normaalissa limakalvolla ja syövän mesenkyymisolujen [22], [23]. Mahdollista saastumista näytteen DNA, joka koostuu syövästä yhdessä mesenkymaalisten solujen, kuten fibroblastien tai lymfosyytit, voivat näin ollen aiheuttaa virheellisiä tuloksia. Tästä syystä, erityisesti LINE-1 metylointianalyysi, tarkka eristäminen kohdesolujen on erittäin tärkeää. Minimoida pilaantuminen ja saada solujen kiinnostava vain, me onnistuneesti integroitu LCM in LINE-1 metylointi analysoidaan tässä tutkimuksessa. Arvioimme

in-situ

SBM yhdistettynä LCM lähestymistapana parantaa DNA metylaatiomääritystä tehokkuutta, mikä mahdollistaa arviointia solujen tietyistä histopatologisesti määritelty kohdealueilla hyvin varhaisessa vaiheessa ensisijainen CRC kehitystä. Tuoreessa tutkimuksessa on esittänyt tiettyjä todisteita siitä, että tulokset ovat vertailukelpoisia onko macrodissection tai LCM käytetään [24]. Tämä on kuitenkin hyvin riippuvainen herkkyyttä. Käsite LCM kuitenkin state-of-the-art ja parempi macrodissection kun pieni kohdekudoksessa panos näytteen DNA-analyysiä varten halutaan. Ensinnäkin, kun alkuvaiheen pieniä vaurioita tarpeen arvioida ja vain pieniä alueita tiettyjen syöpäsolujen ovat käytettävissä analyysiin, mikroskopia-ohjattu cell pick-up tarjoaa tarkkuuden ja hallinnan tulevan näytteen DNA. Toiseksi, LINE-1 metylointi ei ole syöpää erityisiä ja, kuten tuloksemme osoittavat, löytyy syövän strooman kudoksessa. Nykyisellä käsitys kasvaimen microenvironment ja kasvaimen strooman heterogeenisuus on erittäin tärkeää suorittaa LCM analyysi tietyssä kudoksessa DNA haku. Myös LINE-1 metylointi voidaan odottaa vaihtelevan viereiseen ”normaali” solujen primaarisen kasvaimen koska valomikroskoopilla patologia analyysi ei ole aina tarkka tunnistaa varhaisessa vaiheessa syöpäsolujen muutoksen.

In situ

SBM suunniteltiin perustuen paikan slide SBM [14], joka mukailtu käsite ilmoittama Nuovo et al [25]. Paikan slide SBM on tehokas menettely metylointianalyysi turpeella; kuitenkin, kun on-dian SBM näyte tulee liian liimaa lasilevyllä, mikä vaikeuttaa LCM tehokkaasti vangita kohdesoluihin ajoittain.

In situ

SBM eliminoi lukuisia DNA eristys ja puhdistus vaiheet klassinen SBM, jotka ovat suurin syy DNA: n häviäminen arvioitaessa pieniä määriä DNA rajoitettu määrä soluja. Tutkimuksemme kuvailee

in situ

hoidossa kudosten /solujen suoraan bisulfiitti määrityksessä integroitu LCM. Rajoituksena kokeessa on, että analyysi metylaatiostatuksen yksittäisten solujen edelleen vaikeaa, koska DNA alentava luonne SBM-protokollan ja rajoitettu DNA metylointianalyysi.

yhdistäminen LCM,

in situ

SBM, ja AQAMA määritys, LINE-1 hypometylaatio osoitettiin alhaisen tai keskitason luokan adenooma, varhaisessa peräsuolen kasvaimien syntyyn kuten aiemmin osoittaneet [5], [6]. Merkittävä väheneminen LINE-1 metylointi mitattiin vertaamalla adenooma viereisen normaalin epiteelin. Mitään merkittävää eroa osoitettiin, kun adenooma verrattiin vierekkäin syöpä- Tis vaiheessa kudos, joka oli myös hiljattain raportoitu by Kwon et al [26]. Tämä tulos eroaa tutkimuksista Ibrahim et al. ja Irahara et al. että löytyi huomattavia eroja LHI välillä peräsuolen adenoomien ja CRC [24], [27]. On tärkeää huomata, että näissä tutkimuksissa ei määritä TNM-vaiheessa näytteitä. Ei-merkitsevä ero adenooma ja syövän kudoksissa tutkimuksessamme selittyy käyttämällä heterogeeninen syövän kudokset varhaisessa syövän vaiheessa (

in situ

karsinooma, Tis). Tuloksemme vahvistavat, että LINE-1 metylaatiotasoilla vaihtelevat eri TNM-vaiheissa. Kun LHI adenoomissa verrattiin pitemmälle CRC näytteitä tutkimuksessamme erot olivat merkittäviä (tietoja ei esitetty). Tämä osoittaa, että metyloitumattomat LINE-1 ei saa olla tärkeä rooli prosessin aikana, kun adenooma solut saavat heidän ensimmäinen invasiivisen aktiivisuuden.

Lisääntynyt heterogeenisyys löytyy suurempia, kehittynyt vauriot on osoitus siitä, että on olemassa alaryhmiä CRC että pystyvät pitämään metylaation LINE-1. Toisaalta, havaitsimme, että kaksi Dukes vaiheessa D tapauksia oli LHI 0,9, joka oli nähnyt vain tässä alaryhmässä. Heterogeenisuus on tunnettu kliininen ongelma, koska sairauden lopputulos vaihtelee suuresti CRC potilaille, joilla on sama TNM-vaiheessa. Monimuotoisuus LHIs sisällä eri vaiheissa tutkimuksessamme voi heijastaa tätä. Mekanismeja, jotka kontrolloivat ylläpito LINE-1 metylointi ja miten ne vaikuttavat kasvaimen etenemistä on vielä tuntematon.

Laajassa tutkimuksessa Baba et al [28], joka on suhteessa taudin vaiheessa on kuvattu suurempi LINE- 1 demetylaatio in kehittyneempää tautien vaikka erot olivat hyvin vähäisiä. Lisäksi mukaan tutkimuksen tulokset, LINE metylaatiotasoilla olivat korkeampia vaiheen II tauti verrattuna vaiheeseen I. Tässä tutkimuksessa analysoitiin koko kudosleikkeiden ilman mikrodissektion. Yksi syy siihen, että erot olivat pieniä ja II vaiheen osoittivat korkeampia LINE-1 metylointi voi olla aste mesenkyymisolun DNA saastumisen näytteen DNA. Tuloksemme osoittivat, että ei ole vain vieressä normaali limakalvo, mutta myös mesenkymaalisten solujen syöpä, osoittavat noin kolmasosa LINE-1 hypometylaatio. Tämä tukee painottaa, että erityiset kohdesolu eristäminen on välttämätöntä. Prognostiset arvo LINE-1 metylaatiotasoilla CRC on raportoitu [29]; kuitenkin, vaihtelu kasvaimet voivat olla seurausta strooman /mesenkymaaliset komponentti saastumista [30].

Tutkimuksemme osoittaa selvästi portaittain positiivinen lineaarinen suhde menetys LINE-1 metylaatio T-, N-, kuten sekä M-vaiheessa. Tasot LINE-1 demetylaatio voi siis olla hyödyllistä useissa kliinisissä tilanteissa. Preoperatiivisen analyysi kulutustarviketta koepala, joka voidaan ennustaa T-vaiheen (Tis vs. T1 tai T1 vs. T2) voi olla hyötyä päättää endoskooppiset resektio (ts transanal limakalvon poisto peräsuolesta syövät) voidaan yrittää vs. avoin resektio leikkauksen, joka liittyy paljon suurempi sairastavuus /kuolleisuus. N-vaiheen ennuste voitaisiin valita CRC potilaita testata tehokkuutta neoadjuvant terapian. Lisäksi M-vaiheen ennuste voidaan käyttää biomarkkerina tekemään ylimääräisiä metastaattisen preoperative kuvantaminen PET-CT lisäksi Standardin työstämisen. Sen arvioimiseksi, onko preoperative Tuumorinäytteiden materiaalia luminaalipuolella on edustava, arvioimme kasvain heterogeenisyys. Vertailtaessa syvimmästä ja pinnan kasvaimen paljasti, että kasvain heterogeenisyys LINE-1 metylaatiostatuksen on suhteellisen hienovarainen. Tulokset viittaavat siihen, että CRC koepalanäytteistä kerättyjä kolonoskopia ovat edustavia ja voidaan käyttää arvioitaessa kasvaimen LINE-1 metylaatiostatuksen analyysi. Keskimääräinen LHI vaihteli merkitsevästi imusolmukkeisiin ja imusolmukenegatiivisista CRC; jolloin ROC-analyysi osoitti syrjivä tuloksia. Oli päällekkäisyys LHI arvojen N + ja N0 luokat sekä herkkyys ja tarkkuus olivat suhteellisen alhaiset. Tämä näkyi myös T- ja M-vaiheen syrjintää. Suuremmat tutkimuksia tarvitaan määrittämään hyödyllisyyttä LHI yhtenä biomarkkeri tai yhdessä muiden biomarkkerit.

Yhteenvetona tutkimus osoitti, että LINE-1 metylaatiostatuksen korreloi patologinen vaiheessa CRC. Lisäksi sen tarkka analyysi LCM tai vastaavilla tekniikoilla on välttämätöntä, koska tukea mesenkymaalinen ympäröivään kudokseen kasvainsolut selvästi voi vaikuttaa tuloksiin. Puhkeamista LINE-1 demetylaatio tapahtuu hyvin varhain, kun normaali peräsuolen limakalvon kehittyy osaksi adenooman alhaisen tai keskitason dysplasia. Tulokset osoittivat selvästi ja merkittävästi lineaarinen korrelaatio etenemisen menetys metylaation LINE-1 elementti etenemiseen CRC taudin (kuvio 7) osalta T- sekä N- ja M-vaiheen. Nämä havainnot viittaavat siihen jatkuvaa vähenemistä genomista metylaation aikana CRC kehitystä, mikä osoittaa, että korkeat epigenomic ja siten genomisia tapahtumat ovat keskeisiä piirteitä syövän etenemisen.

Materiaalit ja menetelmät

Measurement of LINE- 1 hypometylaatio

metylaatiostatuksen LINE-1 arvioitiin AQAMA määritys tarkan arvion CpG-saarekkeen metylaatiotasoilla [31]. Ennen suorittamista AQAMA määritystä LINE-1 metylaatiostatuksen, SBM levitettiin kutakin DNA-näytettä kuten aikaisemmin on kuvattu [32]. AQAMA vaatii yhden eteenpäin ja yhden käänteisen alukkeen, joka kohdesekvenssin monistamiseksi riippumaton metylaatiostatuksen, kuin eteenpäin ja taaksepäin-aluketta sarjaa eivät sisällä CpG. Metylaatiostatuksen arvioidaan kaksi pientä ura-sitovia (KTK) molekyyli, joka sisältää koettimia (Applied Biosystems): yksi metylaatiospesifisen ja yksi unmethylation erityisiä. 5′-aluke, 3 ’aluke, metylaatiospesifinen koetin ja unmethylation-spesifinen koetin on lueteltu seuraavasti: 5′-GGGTTTATTTTATTAGGGAGTGTTAGA-3′ (eteenpäin), 5’-TCACCCCTTTCTTTA ACTCAAA-3 ’(taaksepäin), FAM-5′ -TGCGCGAGTCGAAGT-3′-MGB-BHQ ja VIC-5′-TGTGTG AGTTGAAGTAGGG-3’-MGB-BHQ. Reaktioseos kunkin AQAMA PCR koostui DNA-templaattia, 0,4 umol /l ja eteenpäin ja taaksepäin-aluketta, 1,4 yksikköä

iTaq

DNA-polymeraasia (Bio-Rad, Hercules, CA), 350 umol /l jokainen deoksinukleotiditrifosfaatti ja 0,025 pmol kutakin MGB koetin 5 mmol /l Mg

2+. PCR-monistus suoritettiin pre-sykli lämpöä aktivointi-DNA-polymeraasia 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä denaturointi 95 ° C 15 sekuntia, pariutuminen ja ekstensio 60 ° C: ssa 60 sekuntia. Absoluuttinen kopioluku kussakin näytteessä määritettiin käyttämällä standardikäyrää perustettu monistamalla kuusi näyte kopioita malleja tunnettujen kopiomääränä (10

* 6-10

* 1: sta). Olemme aikaisemmin kuvanneet synteesimenetelmiä standardinäytteen tunnettuja kopioluvulla AQAMA määrityksessä [31]. Jos negatiivinen kontrolli, kokeen reaktio sisälsi yleisen metyloimattoman kontrolli-DNA, joka syntetisoitiin, kuten on kuvattu aikaisemmin julkaistu tutkimus [13]. Jos positiivinen kontrolli, käytimme universaali metyloitua kontrolli-DNA uutettiin periferaalisen veren lymfosyyttejä terveestä luovuttajasta ja käsiteltiin

SSSI metyylitransferaasi

. Lyhyesti,

SSSI metyylitransferaasi

käsitelty, bisulfiitti muutettu, luovuttaja PBL-DNA monistettiin PCR: llä alukesetin luoda standardinäytteen täysin metyloitu LINE-1. Rakentamiseen standardinäytteen varten metyloimattoman LINE-1 käytettiin Universal metyloimattoman kontrolli-DNA, joka oli valmistettu kuten aiemmin on kuvattu [13]. Täysin metyloidun ja metyloitumattoman PCR-tuote ligoitiin pCR 2.1-TOPO-kloonausvektoriin (Invitrogen); kloonit transformoitiin

Escherichia coli

DH5-a-soluja; ja viljelmiä laajennettiin kuten aiemmin on kuvattu [33]. Plasmidit, jotka sisältävät kohdegeenin puhdistettiin ja kvantifioidaan UV-spektrofotometrillä. Tätä käytettiin tekemään laimennussarja tunnettujen kopioluvun rakentaa Standardikäyrien absoluuttisia. Kaikki kvantitatiivinen PCR määritykset suoritettiin sokkona ilman tietoa näytteen identiteettiä. Keskiarvot laskettiin kolmena kappaleena reaktioita. LINE-1 hypometylaatio indeksi (LHI) kunkin näytteen laskettiin seuraavasti: LINE-1 LHI = metyloimaton kopiomäärä /(metyloitu kopiomäärä + metyloitumaton kopioluku).

LCM

LCM oli käytetään DNA näytekokoelmatodistuksen kaikissa kokeissa tutkimuksessamme. Periaatteet ja teknisen perustan LCM kuvataan yksityiskohtaisesti Fend F et al. [34]. Solut kerättiin LCM joka satamat digitaalisen kamerajärjestelmän, joka havaitsee valittujen solujen. Tämä mahdollistaa, että sama määrä neliön mikrometriä soluja voidaan poimia jokaisesta näytteestä.

In situ

SBM määritys optimointi

mittaamiseksi LINE-1 hypometylaatio index jälkeen mikrodissektion käyttäen LCM kehitimme

in-situ

SBM menettely perustuu aikaisemmin käyttöön liukuvat SBM tekniikalla.

In situ

SBM suunniteltiin analysoimaan metylaatiostatuksen geenien pieni määrä DNA saadun formaliinilla TURVE.

In situ

SBM pyritään poistamaan DNA eristämisen ja puhdistamisen vaiheita, jotka suoritetaan ennen varsinaista SBM klassisen menettely, joka on tärkein syy DNA: n häviäminen.

In situ

SBM sisältää kolme vaihetta; denaturointia DNA, SBM ja kokoelma muunnetun DNA. Ensin solut microdissected päässä parafiini ja nesteytyksestä kudosleikkeiden että tarttuu korkki käytetään LCM inkuboidaan 0,2 mol /l NaOH huoneenlämmössä 15 minuuttia. Sitten näytteet korkki inkuboidaan 3 mol /l natriumbisulfaattiliuosta 0,5 mmol /l hydrokinonia (pH 5) pimeässä. Kolme Inkuboinnin asetus testattiin koskien muuntokurssit (korko muutos sytosiini urasiileiksi) ja saannot muunnettua DNA ja inkubointia asettaminen 60 ° C: ssa 8 tuntia valittiin optimaalinen (katso tulokset jakso). Inkubaation jälkeen näytteet korkki huuhdottiin tislatulla vedellä, liotettiin 0,3 mol /l NaOH: lla 15 min desulfonate muutettu sytosiinit, ja sitten suola tislattuun veteen 60 ° C: ssa 2 tunnin ajan. Lopuksi lisättiin 50 ui lyysipuskuria, joka sisälsi 4 ug proteinaasi K, 2,5% Tween 20: tä, 50 mmol /l Tris, ja 1 mmol /l EDTA: a, lisättiin korkkia ja inkuboitiin 50 ° C: ssa 24 tunnin ajan ja sen jälkeen lämpöä deaktivointi proteinaasi K: 95 ° C: ssa 10 min. Kussakin myöhemmässä AQAMA reaktio, 1-2 ui lysaattia käytettiin mallina ilman DNA: n puhdistusta.

Ethics lausunto

turvenäytteet CRC saatiin potilailta, joille tehtiin kolektomian tai proctectomy vuosina 1995 ja 1998 Saint Johnin Health Center /John Wayne Cancer Institute, Santa Monica, CA. Tutkimus tarkasteli ja hyväksynyt Saint Johnin Health Center /John Wayne Cancer Institute ”Institutional Review Board (IRB) ja Länsi IRB. Kirjallinen suostumus saatiin potilailta.

TURVE CRC yksilöitä

Kaikki kudosnäytteet oli vahvistettu 10% puskuroituun formaliiniin 24 tunnin ja parafinoidut. Sillä LCM seurasi

in-situ

SBM ja LINE-1 metylointianalyysi by AQAMA, kohdissa (4 pm) leikattiin mikrotomin kustakin TURVE lohkon. Solut kerättiin kanssa Veritas® automatisoitu LCM järjestelmän (Life Technologies). Yksi eduista tämä järjestelmä on, että se mahdollistaa valvonnan neliön mikrometriä solujen poimitaan kunkin näytteen. Arvioimaan eroja LINE-1 metylaatiostatuksen normaalin limakalvon, adenooma, syöpä ja syövän mesenkymaalisten sidekudoksen, 25 näytettä varhaisen CRC adenooma (TisN0M0) valittiin patologi (RRT) erikoistunut CRC, joka sisälsi kaikki neljä näistä kudosta luokkia. Tutkia pahanlaatuinen muutos, 94 kirurgisesti resektoitiin CRC näytteet hankittiin tutkimaan muuttamista LINE-1 metylaatiostatuksen mukaisesti syövän etenemiseen. LCM tehtiin molemmissa tutkimusryhmissä. Korrelaatio kliinis-patologinen vaiheessa kuten T vaiheessa imusolmukestatuksesta ja Dukes vaiheessa ja LINE-1 metylointi indeksin analysoitiin.

Tilastollinen

Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona +/- SD, ja prosentit tarvittaessa.