Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

aktivoituminen MAPK ja PI3K /AKT /mTOR reittejä on osallisena useimpien syöpien. Aktivoivat mutaatiot molemmissa näistä reiteistä on kuvattu peräsuolen syöpä (CRC), mikä osoittaa niiden potentiaalia terapeuttisina kohteina. Tässä tutkimuksessa arvioitiin yhdistelmä PI3K /mTOR-estäjä (PF-04691502 /PF-502) yhdessä MEK estäjän (PD-0325901 /PD-901) in CRC solulinjoissa ja potilaasta johdettujen CRC -tuumoriksenografti mallit (PDTX) .

Materiaalit ja menetelmät

antiproliferatiivisia vaikutuksia PF-502 ja PD-901 arvioitiin yksittäisinä aineina ja yhdistelmässä vastaan ​​paneelin CRC solulinjojen eri molekyyli- taustoja. Synergy arvioitiin käyttämällä Bliss Summautuvuus menetelmällä. Valituilla solulinjoissa, tutkimme yhdistelmä vaikutukset muuhun efektoreja immunoblottauksella. Yhdistelmä sitten arvioitu useissa täysin geneettisesti selityksin CRC PDTX malleja.

Tulokset

in vitro

kokeet osoittivat monenlaisia ​​IC

50-arvot sekä aineina solulinjan paneelista. Yhdistelmä PF-502 ja PD-901 osoitti synergististä antiproliferatiivista aktiivisuutta Bliss arvojen lisäaineen välillä. Kuten odotettua, p-AKT ja p-ERK oli vaimentua PF-502 ja PD-901, vastaavasti. Vuonna PDTX malleissa jälkeen 30 päivän altistuminen PF-502, PD-901 tai yhdistelmä, yhdistelmä osoitti entisestään vähentää kasvaimen kasvua verrattuna joko monoterapiana riippumatta KRAS tai PI3K mutaatiostatuksesta riippumatta.

johtopäätökset

yhdistelmä PI3K /mTOR ja MEK estäjän osoitti parannettu antiproliferatiivisia vaikutuksia vastaan ​​CRC solulinjoja ja PDTX malleja.

Citation: Pitts TM, Newton TP, Bradshaw-Pierce EL , Addison R, Arcaroli JJ, Klauck PJ, et al. (2014) Dual farmakologinen kohdistaminen MAP Kinase ja PI3K /mTOR Pathway prekliinisissä malleissa peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (11): e113037. doi: 10,1371 /journal.pone.0113037

Editor: Marie-Josée Boucher, Université de Sherbrooke, Kanada

vastaanotettu: 19 kesäkuu 2014; Hyväksytty 17. lokakuuta 2014; Julkaistu: 17 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Pitts et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Pfizer Inc ja University of Colorado Cancer Centerin Grant P30 CA046934. Rahoittajat oli vähäinen rooli tutkimuksen rakennetta ja päätös julkaista. Rahoittajat ollut mitään roolia tietojen keruu ja analysointi, tai valmisteen käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: tekijät Tämän käsikirjoituksen lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat kilpailevia intressejä: Pfizer tukee taloudellisesti SGE varten onkologian apurahoja. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Kaksi eniten osallisena solureiteillä syövissä ovat fosfatidyyli-3-kinaasien (PI3K) ja mitogeeni aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK) polkuja. Luokan I (PI3K) ovat heterodimeerisiä lipidejä kinaaseja, jotka käsittävät sääntely- p85-alayksikköä ja katalyyttinen p110 alayksikköä [1]. PI3K fosforyloi 3-hydroksyyliryhmän fosfatidyyli, osallistuvat eri signalointipolkujen tärkeitä syövän kuten proliferaatiota, erilaistumista, kemotaksista, selviytyminen, salakuljetuksen ja glukoosihomeostaasiin [2], [3]. Koska se on erilaisia ​​solujen toiminta, PI3K akseli on erittäin osallisena ihmisen syövissä; jopa 30% kaikista ihmisen syövistä on mutaatio PI3K-reitin komponentin [4]. Peräsuolen syöpä (CRC),

PIK3CA

geenin, joka koodaa p110α katalyyttinen alayksikkö luokan I PI3K: t, on havaittu olevan mutatoitunut 10-20% CRC Tuumorinäytteet [5].

myötävirtaan komponentti PI3K signalointireitin on nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR). Solujen kasvu on yksi tärkeimmistä toiminnoista säännellään mTOR; aktivointi mTOR kautta PI3K /AKT-reitti on kriittinen solun tasapainossa ravinteiden otto ja kasvu, ja poikkeava hyperactivation tämän reitin myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn [6], [7]. Rooli mTOR näiden solujen toimintoja tekee siitä houkuttelevan kohteen estoon; koska kehitys rapamysiinin neljäkymmentä vuotta sitten, monet ensimmäisen ja toisen sukupolven mTOR estäjät on syntetisoitu ja ovat eri vaiheissa kliinistä ja prekliinistä tutkimusta [8], [9].

MAPK /ERK (MEK) kompleksit ovat komponentteja Ras /Raf signalointi akselilla. Signalointi tämän reitin johtaa lisääntyneeseen leviämisen ja kestävyys apoptoosin, kun taas konstitutiivisen aktivaation edistää chemoresistance useisiin syöpiin [10], [11]. Mutaatiot KRAS, sääntelyviranomaisten tai BRAF (kaikki ylävirtaan MEK kompleksit) ovat hyvin yleisiä CRC, ja on löydetty 50-60% kasvaimen näytteistä [12], [13]. Erilaisia ​​aineita on kehitetty, jotka kohdistuvat EGFR, RAS, RAF, tai MEK, joista monet ovat kliinisissä tutkimuksissa ja joista osa on jo hyväksytty [14].

Ylikuuluminen välillä PI3K /AKT /mTOR reitti on olemassa: esimerkiksi PI3K voidaan aktivoida RAS, ja tuumorisuppressorigeenin tuberiini (negatiivinen säätelijä mTOR) on suora substraatti ERK [15] – [17]. On havaittu myös, että co-esiintyminen muutoksia PI3K-AKT-mTOR ja RAS-RAF-MEK reittejä esiintyy kolmasosa CRC näytteitä, mikä viittaa siihen, että samanaikainen estäminen molempien reittien saattaa olla tarpeen terapeuttista hyötyä [12]. Lisäksi ajatellaan, että RAS-RAF-MEK signalointi akseli voi toimia korvaavana mekanismi estämällä PI3K-AKT-mTOR koulutusjakson, ja päinvastoin [18], [19]. Todisteet laaja cross-talk välillä reittejä on aiheuttanut suurta kiinnostusta samanaikainen esto, jossa on useita erilaisia ​​strategioita nyt kehitteillä [20].

tutkia tehoa samanaikaisesti eston sekä PI3K-AKT-mTOR ja RAS-RAF-MEK reittejä, tutkimme yhdistelmä PF-04691502 (PF-502), jossa PD-0325901 (PD-901). PF-502 on suun kautta otettava, tehokas ATP-kilpailukykyinen kinaasin estäjä sekä luokan I PI3K: t ja mTOR [21], [22]. Eräässä äskettäin valmistunut vaiheen I kliinisen tutkimuksen, PF-502: n havaittiin olevan hyvin siedetty kanssa väsymys, vähentää ruokahalua, pahoinvointi hyperglykemia, ihottuma, oksentelu, ripuli ja limakalvojen tulehdus on yleisimmin nähty haittavaikutuksia. Kuitenkin suurin osa näistä oli asteen 1 tai 2. [23] PD-901 on erittäin voimakas, suun kautta, pienimolekyylisiä estäjä MEK1 ja MEK2 joka osoitti jonkin verran aktiivisuutta aikaisen vaiheen kliinisissä tutkimuksissa ja liittyi toksisuudet ominaisuus tämän luokan aineita : ihottuma

, ripuli, väsymys, pahoinvointi ja näköhäiriöt, [24]. PD-901 on parhaillaan faasin I kliinisissä kokeissa hoitoon CRC yhdessä PKI-587 (PF-0521384), kaksi PI3K /mTOR-estäjä niiden teho on samanlainen PF-502 [24] – [26]. Yksi etu tämä yhdistelmä on, että estämällä alkupään PI3K, palaute säätelyä AKT upon mTOR esto vältetään [27].

Nykyisessä tutkimuksessa kuvaamme tehostetun antituumorivaikutuksen dual PI3K /mTOR-estäjä PF-502 ja MEK estäjä PD-901

in vitro

ja

in vivo

malleissa paksusuolisyövän.

Materiaalit ja menetelmät

kemikaalit ja reagenssit

PF-04691502 (PF-502) ja PD-0325901 (PD-901) toimitti Pfizer Inc. (San Diego, CA). Sillä

in vitro

työtä sekä agentit liuotettiin 100% DMSO: ssa pitoisuudessa 10 mM. Sillä

in vivo

tutkimuksissa, PF-502 suspendoitiin 0,5% metyyliselluloosaa vedessä, ja PD-901 suspendoitiin 0,5% hydroksipropyylimetyyliselluloosaa, 0,2% tween-80 vedessä.

Cell linjat ja kulttuuri

Ihmisen peräsuolen syövän solulinjat saatiin American Type Culture Collection, DSMZ tai Korean Cell Line Bank. Geo-solut, kuvattu aiemmin [28], ystävällisesti toimitti tri Fortunato Ciardiello (Cattedra di Oncologia Medica, Dipartimento lääketieteellistek- Chirurgico di Internistica Clinica e Sperimentale ”F Magrassi eA Lanzara” Seconda Università degli Studi di Napoli, Napoli, Italia). KM12L4, KM12C, ja KM20, kuvattu aiemmin [29], olivat kaikki ystävällisesti Scott Kopetz (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX). Kaikki solut viljeltiin rutiininomaisesti RPMI 1640. Kaikki alustaan ​​lisättiin 10% FBS: ää, 1% penisilliini-streptomysiiniä, ja 1% MEM ei-välttämättömiä aminohappoja. Kaikki soluja pidettiin 37 ° C: ssa atmosfäärissä, joka sisälsi 5% CO

2. Solut testattiin rutiininomaisesti läsnä mykoplasman (MycoAlert, Cambrex BioScience). Kaikki CRC solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa on täysin selvitetty ja niiden aitous Coloradon yliopiston Cancer Center DNA Sequencing and Analysis Core.

sulforodamiini B (SRB) ja CyQuant soluproliferaatiomäärityksissä

Cells ympättiin 96-kuoppaisille selvää levyille 2000-8000 solua kuoppaa kohti, riippuen solulinjan ominaisuuksia. Sillä CyQuant määritystä, solut maljattiin musta seinät levyt. 24 tunnin kuluttua soluja inkuboitiin 72 h väliaineeseen tai vaihtelevia konsentraatioita PD-901 (0,015 umol /L-1 umol /l) tai PF-502 (0,08 umol /L-5 umol /l), yksittäisinä aineina tai yhdistelmänä. Sillä CyQuant määritystä levyt valmistettiin ja lukea mukaan valmistajan protokollan (Life Technologies, Carlsbad, CA). Sulforodamiini B-määritys (SRB) suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [30]. Lyhyesti, solut kiinnitettiin 10% tricholoracetic acidat 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan, pestiin 3 x vedellä, ja kuivattiin huoneenlämpötilassa. Sitten ne värjättiin sulforodamiini B (SRB) liuosta (0,4% w /v SRB 1% etikkahapossa) 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pestiin 3 x 1% etikkahappoa, ja jäljellä oleva SRB liuotettiin 10 mM puskuroimattomalla Tris- . Absorbanssi luettiin 492 nm, käyttäen Synergy 2 levynlukijaa (Biotek, Winooski, VT). Data oli normalisoitiin absorbanssin ilman lääkettä (ND). Yhdistelmä vaikutus analysoitiin käyttäen Bliss Summautuvuus mallia kuten aiemmin on kuvattu [31].

kaspaasi 3/7 Activity

kaspaasin Glo 3/7 luminesenssikoe (Promega, Milwaukee, WI) käytettiin indikaattorina apoptoottisen aktiivisuuden kautta kaspaasi 3 ja 7-aktiivisuus. Solut ympättiin valkoinen seinät levyille 2000-8000 solua kuoppaa kohti, riippuen solulinjan ominaisuuksia. 24 tunnin kuluttua soluja inkuboitiin osoitetun ajan pisteeseen väliaineeseen tai vaihtelevia pitoisuuksia PD-901 tai PF-502, yksittäisinä aineina tai yhdistelmänä. Aineisto esitetään kertamuutosta, normalisoitu kontrolliin.

klonogeeninen määritykset

Solut ympättiin 2000 solua per kuoppa 6-kuoppaiselle levylle ja annettiin kiinnittyä yön yli. PD-901 tai PF-502 lisättiin yksittäisinä aineina tai yhdistelmänä ja inkuboitiin 72 tuntia. 72 tunnin kuluttua solut pestiin täyteen kasvatusliuokseen ja media ilman lääkeainetta lisättiin takaisin vielä 72 tuntia. Solut kiinnitettiin 100% metanolissa 30 minuutin ajan ja värjättiin 2% kristalliviolettia. Kristallivioletti- liuotettiin sitten 1% etikkahappoa, ja supernatantti siirrettiin 96-kuoppaiselle levylle. Absorbanssi luettiin 565 nm, käyttäen Synergy 2 levynlukijaa (Biotek, Winooski, VT). Tiedot on normalisoitu hallita.

immunoblottauksella ja vasta-aineen Array

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan. Sitten soluja inkuboitiin 24 tuntia joko PD-901 tai PF-502, tai yhdistelmä. Sitten solut pestiin PBS: llä ja lyysattiin RIPA-puskurilla (Cell Signaling, Danvers, MA). Sonikoinnin jälkeen ja sentrifugoinnin, yhteensä 30 ug proteiinia lysaattia ladattiin NuPage geeli (Life Technologies, Carlsbad, CA), elektroforeesi ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille käyttämällä iBlot (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kalvo blokattiin ja koetettiin yön yli primaarisilla vasta-aineilla, pestään 10 minuuttia 3 × kanssa, ja koetettiin DyLight toissijainen vasta (Soluviestintä, Danvers, MA), ja kuvattiin käyttäen Licor Odyssey (Licor, Lincoln, NE). Kaikki ensisijainen vasta-aineet hankittiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA) ja laimennettu kohti valmistaa ohjeita. Vasta-aineen matriisi, leikattiin kasvaimia lyysattiin RIPA-puskuriin käyttäen FastPrep24 kudoshomogenisaattorilla (MP Biologicals, Santa Ana, CA). Proteiinipitoisuus oli tasoittunut ja lisättiin PathScan Stressi ja apoptoosi Signaling Vasta Array kohti valmistaa ohjeita. Array kehitettiin käyttäen Licor Odyssey (Licor, Lincoln, NE). Intensiteetti kunkin täplän analysoitiin käyttämällä Image Studio -ohjelmiston (Licor, Lincoln, NE) ja tiheys kunkin täplän oli piirrettynä.

Patient johdettuja Vieraslajisiirteen Studies

Viisi kuuden viikon ikäisiä naispuolinen atyymisissä nude-hiiriä (Harlan Labs, Indianapolis, iN) käytettiin kaikkien eläinkokeissa häkissä ryhmissä 5, jota pidetään 12 tunnin valo /pimeä sykli, ja annettiin steriiliä ruokaa ja vettä

halun

. Potilas johdettu ksenograftit muodostettiin kuten aiemmin on kuvattu [28]. Lyhyesti, kasvain näyte kerättiin aikaan leikkauksen peräisin suostuu potilaan Coloradon yliopiston sairaalan. Kasvain materiaali jälkeen jäljellä histopatologiset analyysi leikattiin 2-3 mm

3 kappaletta, upotettuna Matrigel, ja istutettiin ihonalaisesti kylkeen viisi nude-hiirten. Sen jälkeen kasvaimet laajeni ainakin F3 sukupolvi, ne irrotettiin, leikkaus, ja ruiskutetaan vasempaan ja oikeaan kylkiin noin 25 hiirtä kutakin ksenograftin tutkimus (50 yhteensä kasvaimia jaettu neljään ryhmään: Ajoneuvojen ohjaus, PF-502 monoterapiana PD-901 ainoana lääkkeenä, ja PF-502 /PD-901 yhdistelmä). Kun keskimääräinen tuumorin koko saavutti tilavuus on noin 200 mm

3, hiiret satunnaistettiin neljään eri ryhmään. Hiiriä seurattiin päivittäin myrkytysoireiden ja punnitaan kahdesti viikossa. Hoitoa annettiin kerran päivässä (10 mg /kg PF-502 ja /tai 1,0 mg /kg PD-901) oraalisella letkuruokinnalla. Kasvaimen tilavuus (yhtälöä tilavuus = (pituus x leveys

2) x 0,52) arvioitiin kahdesti viikossa digitaalisella jarrusatulat käyttäen Tutkimuksen johtajan ohjelmistopaketti (Studylog Systems, South San Francisco, CA). Kasvaimen kasvu määritettiin kunkin kasvaimen sovittamalla kasvaimen tilavuus dataa hoitojakson ajan eksponentiaalinen kasvu yhtälön SAAM II v. 2.3. (Sen Epsilon ryhmä, Charlottesville, VA). Lopussa hoidon, hiiret tapettiin CO

2 yliannos seuraa niskanmurrolla ennen poistamista kasvainten tarkempaa analysointia.

Data Analysis

Yksisuuntainen ANOVA analyyseja Tukey testin jälkeen määrittämiseen käytettiin välillä tilastollista merkitystä useita ryhmiä. Analyysit tehtiin Prism versio 5.0,

p

arvojen 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Ethics lausunto

Kaikki eläin työ ja hoito tehtiin suuntaviivojen mukaisesti ja Instituutioannissa Animal Care ja Käytä komitea (IACUC). Erityisellä hyväksynnällä hiiren kokeiluja saatiin protokollan 51410 (08) 1 E nimeltä ”kehittäminen ja ylläpito Primary GI kasvain Bank for Designing Rational Hoito käyttämällä Mouse Tumor Eksplan-”. Kaikki kohtuulliset pyrittiin parantamaan kärsimystä, mukaan lukien anestesia kivuliaita menettelyjä. Ihmisen kasvaimet saatiin käyttämällä Colorado Multiple Institutional Review Board (COMIRB) hyväksytyn tutkimussuunnitelman numero 08-0439. Suostumus kasvain haku kirjoitettiin.

Tulokset

vaikutuksia PF-502 ja PD-901 yksittäisinä aineina proliferaatioon paksusuolisyövän solulinjojen

CRC solulinjoja altistuvat kasvavia pitoisuuksia PF-502 ja PD-901: ssa 72 tuntia, proliferaatio arvioidaan ja IC

50-arvot laskettiin keskiarvo leviämisen rinnakkaisessa kokeessa. Kuten on esitetty kuvioissa 1 ja 2 oli yli 10-kertainen ero IC

50-herkkien ja resistenttien CRC solulinjat, jotka eivät korreloineet mutaatiostatuksesta asema KRAS, BRAF tai PIK3CA. Neljä CRC solulinjat vaihtelevalla genotyypit valittiin lisäanalyysiä varten.

Solut maljattiin 96-kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan. Solut altistettiin kasvavia pitoisuuksia yhdistettä 72 tunnin ajan, ja proliferaatio arvioitiin käyttämällä CyQuant määritystä. Proliferaion testit suoritettiin kolmena kappaleena ja IC

50-arvot laskettiin keskiarvo leviämisen. Mutaatiostatuksesta asema KRAS, BRAF, ja PIK3CA ovat värillisiä ruutuja.

Solut maljattiin 96-kuoppalevyille ja annettiin tarttua 24 tuntia. Solut altistettiin kasvavia pitoisuuksia yhdistettä 72 tunnin ajan, ja proliferaatio arvioitiin käyttämällä SRB-määritystä. Proliferaatiomääritykset tehtiin kolmena kappaleena ja IC

50-arvot laskettiin keskiarvo leviämisen. Mutaatiostatuksesta asema KRAS, BRAF, ja PIK3CA ovat värillisiä ruutuja.

Kombinatoriset vaikutukset PI3K /mTORi PF-502 ja Meki, PD-901 kolorektaalisyövässä solulinjoissa

LOVO (KRAS

G13D /PIK3CA

WT), HCT116 (KRAS

G13D /PIK3CA

H1047R), WIDR (BRAF

V600E /PIK3CA

P449T), ja Geo (KRAS

G13D /PIK3CA

WT) valittiin edelleen yhdistelmä-analyysi.

Jokainen 4 CRC solulinjoja altistettiin vaihtelevia pitoisuuksia PI3K /mTORi, PF-502 ja Meki PD 901 yksittäisinä aineina tai yhdistelmänä 72 tunnin ajan. Proliferaatio arvioitiin käyttämällä CyQuant määritystä ja eston arvot on esitetty kuviossa 3A. Yhdistelmä osoitti suurempi vaikutus proliferaation esto kaikki neljä CRC testatuissa solulinjoissa eri pitoisuuksina. Tämä tieto vahvistettiin CRC solulinjoissa käyttäen Bliss Summautuvuus mallia. Bliss-arvot laskettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät sekä pisteet kullekin yhdistelmän on esitetty kuvassa 3B. HCT116, WIDR ja GEO molemmat osoittavat keskimäärin Bliss tulokset hieman yli 1 osoittavat additiivista suuremman vaikutuksen (1,08 ± 0,09, 1,11 ± 0,08, 1,08 ± 0,08, vastaavasti) kun taas LOVO osoittivat suunnilleen additiivinen vaikutus (1,019 ± 0,08,). Sen määrittämiseksi, yhdistelmän vaikutusta havaittu liittyi peruuttamattomasti lisäkasvun estäminen, joka on klonogeeniset määritys suoritettiin. Neljä CRC solulinjoja altistettiin 0,6 umol /l PF-502 ja 0,3 umol /l PD-901 yksittäisinä aineina ja yhdistelmässä. Kaikki neljä solulinjat näytteillä vähenemiseen kyky muodostaa klooneja yhdistelmän versus joko ainoana lääkkeenä taas HCT116, GEO, ja WIDR osoittanut tilastollisesti merkitseviä eroja. (Kuva 4).

LOVO (KRAS

G13D), HCT116 (KRAS

G13D /PIK3CA

H1047R), WIDR (BRAF

V600E /PIK3CA

P449T), GEO (KRAS

G13D). Solut altistettiin eri yhdistelmiä PF-502 ja PD-901: ssa 72 tuntia. (A) Fraction esti sen piirretään altistuminen monoterapialla ja yhdistelmä. (B) Bliss additiivisuuteen laskettiin ja arvioida kombinatorisista vaikutuksia. Keskimäärin autuus tulokset piirrettiin.

(A) LOVO, (B) HCT116, (C) WIDR, ja (D) GEO maljattiin 6-kuoppalevyille ja altistuvat ainoana lääkkeenä PI3K /mTORi PF-04691502, The Meki, PD-0325901 tai yhdistelmänä 72 tunnin ajan. Drug poistettiin ja korvattiin media mahdollistaa uusiutumista klooneja. Sitten solut värjättiin kristallivioletilla ja valokuvataan. (E) Kristallivioletti liuotettiin 1% etikkahappoa, ja absorbanssi määritettiin levylukijalla. Aineisto normalisoitiin valvoa ja piirretään. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SD, ANOVA Tukeyn oikaistun p-arvot: *

p

, 0,05, **

p

0,01, ***

p

0,001 vs ajoneuvo, #

p

, 0,05, ##

p

0,01, ###

p

0,001 vs PF-502,

p

, 0,05,

p

0,01,

p

0,001 vs PD-901. Kaikki tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

ominaista myös vaikutukset PI3K /mTORi, PF-502 ja Meki, PD-901 vakiintuneisiin alavirtaan efektoreja asiaa polkuja. PF-502: n on osoitettu laskevan AKT, 4EBP1 ja S6RP fosforylaatio [22], kun taas PD-901 inhiboi fosforylaatiota ERK [32], [33]. Validoida vaikutuksia näillä 2 aineita ja selvitetään, osuuskunnan vaikutus, modulaatio loppupään tavoitteita MAPK ja PI3K polkuja analysoitiin. Kuten on esitetty kuviossa 5, käsittelemällä PF-502 tai PD-901 indusoi laskua Pakt, pS6RP, P4EBP1, ja Perk vastaavasti. Kiinnostavaa kyllä, kun altistuminen Meki, PD-901 havaitsimme selvempi lasku pS6RP kuin mitä havaittiin PF-502 käsitellyt solut kolmessa neljästä CRC solulinjat. Nämä vähennykset olivat pääosin pidettiin yhdistelmä.

Apoptosis on parannettu altistuksen jälkeen yhdistelmä PF-502 ja PD-901 kolorektaalisyövässä solulinjoissa

klonogeeniset tiedot osoittivat, että yhdistelmä johti jatkuvaa antiproliferatiivisia vaikutuksia, joten mittasimme apoptoosin toisena fenotyyppisiä päätepiste. Siksi meidän alttiina neljä CRC solulinjat 0,6 umol /l PF-502 ja 0,3 umol /l PD-901 yksittäisinä aineina ja yhdistelmässä 24 tuntia. Apoptoosi mitattiin Caspase Glo 3/7 määrityksessä. Kuten on esitetty kuviossa 6, vaikka oli suuntaus kohti lisääntynyttä apoptoosia yhdistelmän kanssa kaikissa solulinjoissa, on WIDR soluissa nämä vaikutukset olivat tilastollisesti merkitseviä verrattuna sekä yksittäisinä aineina.

Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SD, ANOVA Tukeyn oikaistun p-arvot: *

p

, 0,05, **

p

0,01, ***

p

0,001 vs ajoneuvo, #

p

, 0,05, ##

p

0,01, ###

p

0,001 vs PF-502,

p

, 0,05,

p

0,01,

p

0,001 vs PD-901. Kaikki tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

antituumorivaikutukset PF-502 ja PD-901 potilaan peräisin tuumoriksenografteja

Seuraava Vahvista antituumorivaikutuksia havaittu meidän

in vitro

mallissa, otimme esiin neljä potilasta johdettu tuumoriksenografteja (PDTX) mallit vaihtelevalla mutaatiostatuksesta asema PI3K /mTORi, PF-502 Meki, PD901 tai yhdistelmä. Anti-kasvain Kunkin yhdisteen vaikutukset arvioitiin määrittämällä kasvuvauhti kunkin kasvaimen kussakin hoitoryhmässä. Kuten kuviossa 7A, vain CUCRC040 malli (

KRAS

G12V /PIK3CA

E542G) osoitti merkittävää hyötyä yhdistelmähoidon yli ainoana lääkkeenä hoitoja (p 0,05). Yhdistelmä hoito oli tilastollisesti merkitsevä CUCRC108 (KRAS

G12C) ja CUCRC125 (KRAS

WT) PDTX malleja kontrolleihin verrattuna, mutta ei verrattuna monoterapiana hoitoryhmään (kuvio 7B-C). Ja mitä CUCRC042 (KRAS

G13D) malli oli suhteellisen reagoimaton kaikki hoidot (kuvio 7D). Kasvaimen kasvu käyrät on esitetty kuvassa S1.

Jokainen piste edustaa yhden kasvain. Kasvaimen kasvu ± keskihajonta edustaa baarissa ja kahvat. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SD, ANOVA Tukeyn oikaistun p-arvot: * P 0,05 vs. kontrolli;

† P 0,05 vs. 901;

‡ P 0,05 vs. 502.

Yhdistelmä PF-502 ja PD-901 estää pro-selviytymisen reittejä ja vaikutuksia apoptoottisten merkkiaineiden PDTX malleissa

arvioimiseksi vaikutukset signalointipolkujen että PI3K /mTORi, PF-502 ja Meki, PD-901 PDTX malleissa, vasta-array käytettiin lysaatit kasvainten kerätään ryhmän kunkin mallin lopussa tutkimuksen. Kasvaimet lyysattiin RIPA-puskuriin ja levitetään PathScan Stressi ja apoptoosi Signaling Vasta Array tasaisin pitoisuuksina. Taulukot tehtiin näkyviksi Licor Odyssey ja tiheys /intensiteettiä päällekkäisiä paikkoja kolmesta eri kasvaimia normalisoida ajoneuvon hallinnan ja piirretään. Tasot Perk ja Pakt määrä väheni PD-901 ja PF-502 hoitoryhmissä, verrattuna kontrolliin, että CUCRC040, CUCRC108 ja CUCRC125 PDTX malleja, mikä on sopusoinnussa kasvaimen kasvua profiilit ja vaste havaittiin näissä hoitoryhmissä ( Kuva 8A-B ja kuviossa S2). Lisäksi downregulation Perk ja Pakt pidettiin yhdistelmän ryhmissä näissä malleissa. Kuitenkin vain CUCRC040 malli oli tason lisäansiot yhdistelmässä ryhmässä itse asiassa alempi kuin sekä monoterapiana aseita. CUCRC042 kestävä malli ei osoittanut laskua Perk tai Pakt (kuvio 8A-B ja kuva S2). Mielenkiintoista on, että CUCRC042 hoito PD-901 johti kasvuun Pakt ja kasvu pBAD (kuvio 8B-C ja kuvio S2).

Yhteensä proteiini puhdistettiin PDTX lopussa hoidon ja arvioidaan stressiä ja apoptoosin vasta-array. Tiheys paikkoja saatiin, ja piirretään. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SD, ANOVA Tukeyn oikaistun p-arvot: *

p

, 0,05, **

p

0,01, ***

p

0,001 vs ajoneuvo, #

p

, 0,05, ##

p

0,01, ###

p

0,001 vs PF-502,

p

, 0,05,

p

0,01,

p

0,001 vs PD-901. Kaikki tiedot on edustaja kolme erillistä kasvainten kustakin ryhmästä.

Keskustelu

noin 40% paksusuolen ja peräsuolen syöpiä satamiin mutaatio KRAS geeni aiheuttaa tämän polku on konstitutiivisesti aktiivinen. Muut mutaatiot tämän reitin, kuten RAS (sääntelyviranomaisten ja HRAS) ja BRAF muodostavat toisen 1-3% ja 5-15%: lla [34], [35]. PIK3CA mutaatioita esiintyy noin 15% paksusuolen ja peräsuolen syöpiä, ja näistä 8-9% on mutaatioita sekä PIK3CA ja KRAS [34], [36]. Molempien suurten pro-eloonjäämisen /proliferatiivinen reittejä aktiivinen peräsuolen syöpiä, lisäksi rajat talk /palaute, joka tapahtuu näiden reittien, on perusteita kohdistaa molemmat reitit kanssa pienmolekyylisalpaajien.

inhibiittorit RAS /RAF /MEK-reitin ovat olleet jo yli vuosikymmenen ajan ja sama edustaja kliiniset tutkimukset ovat olleet pääosin pettymys. Esimerkiksi vaiheen II tutkimuksessa CI-1040, ensimmäisen sukupolven MEK estäjä, pitkälle peräsuolen syöpä ei osoittanut merkittävää antituumorivaikutus. Kuitenkin uudempi vaiheen II tutkimuksessa, jossa toisen sukupolven MEK estäjä selumetinib oli samanlainen aktiivisuus kuin kemoterapeuttisen aineen kapesitabiinilla CRC potilailla [37], [38]. Vaatimaton tulokset ainoana lääkkeenä MEK estoon ja peräsuolen syöpiä, näyttää ilmeiseltä, että yhdistelmähoito olisi tutkittava.

Lukuisat prekliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että kohteena sekä RAS /RAF /MEK ja PI3K /AKT /mTOR-reitin on edullisempaa lukuisia kasvaintyypeissä [39] – [42]. Vuonna munasarjasyöpä yhteistyössä kohdentamiseen PI3K /mTOR ja RAS /MEK-reitin osoittautui olevan synergistinen proliferaation esto ja solukuoleman induktioon [42]. Samoin pohjapinta-, kuten rintasyövän malleja, parannettu proliferaation esto ja apoptoosin lisääntyminen havaittiin

in vitro

ja kasvaimen kasvun inhibition havaittiin

in vivo

[39] . Suurin osa tiedoista kolorektaalisyövässä on ollut KRAS mutantti malleissa, koska tällaiset potilaat tarvitsee uusia Uusien hoitomuotojen. Roper

et. al

. osoittivat, että yhdistelmä PI3K ja MEK esto edistää apoptoosin ja kasvaimen regressio hiirimalleissa peräsuolen syöpiä [41]. Toinen tutkimus paksu- PDTX malleja, osoitti enemmän kasvaimen pysähtymiseen vaikutus, ja vähän regressio ehdottaa tätä yhdistelmää hoito ei saa kääntää kestäviä terapeuttisia vaikutuksia [40].

Nykyisessä tutkimuksessa hyödyntää sekä peräsuolen syöpä solulinjat ja PDTX malleja osoittaa, että PI3K /MEK yhdistelmähoito on aktiivisempi kuin yhden aineella malleissa CRC erottuva molekyyli taustoja. Sekä PF-502 ja PD901 näytteillä ainoana lääkkeenä aktiivisuutta suuressa paneelissa paksusuolisyövän solulinjojen riippumatta RAS tai PIK3CA mutaatiostatuksesta riippumatta. Kun yhdistelmä testattiin KRAS mutantti, BRAF mutantti tai KRAS /PIK3CA kaksoismutantit oli parannettu yhdistelmä vaikutus eri pitoisuuksina HCT116, WIDR ja GEO osoittaen hieman vankempi yhdistelmä vaikutus verrattuna LOVO. Kyky muodostaa pesäkkeitä altistuminen yhdistämisen myös heikentynyt osoittaa, että esto näistä reiteistä johtaa sytotoksiseen sijaan sytostaattinen fenotyyppi. Tätä tukevat myös apoptoosin lisääntyminen yhdistelmässä. On mielenkiintoista huomata, että kun hoidon Meki, PD901, merkitty väheneminen havaittiin pS6RP kolmessa neljästä CRC solulinja malleja. Tämä saattaa johtua siitä, että TORC1 toimintaa, joka vaikuttaa S6 fosforylaatio on lähentyminen piste, joka sisältää useita vastavirtaan signalointireittien joissakin kasvaintyypeissä. Esimerkiksi MAPKi herkkä melanooma, käsittelemällä Rafi tai Meki, johtaa laski PS6, kun taas tunteeton mallit eivät pienene fosforylaatiota havaitaan [43]. Sama voi olla totta kolmen PD-901 herkkä CRC solulinjoissa (HCT116, LOVO, ja WIDR) toisin kuin vastustuskykyisempiä CRC solulinja, GEO, mikä saattaa osoittaa, että vähentynyt pS6RP voi toimia merkkinä reagointikykyä.

Seuraavaksi siirtynyt meidän

in vitro

data

in vivo

käyttämällä CRC PDTX malleja. Nämä mallit on ajateltu tarjota huomattavia parannuksia tyypillinen solulinjan ksenografteja, vaikka kliininen validointi on käynnissä [40], [44]. Samanlainen

in vitro

data oli heterogeeninen vastauksia yhdistelmä hoidon yksi malli, CUCRC040, mikä osoittaa tilastollisesti merkitsevän yhdistelmän vaikutus. Tämä oli toisin kuin CUCRC108 ja CUCRC125 malleja, joissa yhdistelmä oli tilastollisesti erilainen kuin ajoneuvon ja CUCRC042 joka ei esiintynyt hoidon vaikutuksia. Kiinnostavaa kyllä, tämä kestävät PDTX malli, näytteille kasvu Pakt kun käsitelty Meki, PD-901, joka oli liittynyt lisääntyminen pBAD on proteiini, joka voi olla anti-apoptoottisia vaikutuksia ja johtaa tehostetun solujen eloonjäämistä [45]. Tämä voi olla syytä jatkaa otaksutuksi vastus mekanismi.

Huolimatta kovasta prekliinisissä todisteita tukemaan yhteistyössä kohdentamiseen PI3K /mTOR ja MAPK reittejä useissa kasvaintyypeissä, varhainen tulokset kliiniset kokeet ovat osoittaneet sekoitettu menestys [46 ] – [48]. Yhdistelmät oli yleensä hyvin siedetty ja terapeuttisia annoksia saavutettiin varhain näyttöä antituumorivaikutuksen potilailla, joilla on edennyt melanooma ja heikompilaatuisen vakavien munasarjasyövän, kun taas potilailla, joilla peräsuolen syöpä kasvaimen kutistuminen harvoin dokumentoitu.

yhdessä faasin I tutkimuksessa, peräsuolen syöpä potilaille tehtiin mahdollisille molekyylitason profilointi mutaatioita KRAS, BRAF, PIK3CA ja ekspressiotasot PTEN ja pMET. Nämä potilaat olivat tarjottiin first-in-ihmisen faasin I tutkimuksissa tulosten perusteella näiden muuttunut geneettinen /proteiinin ilmentymisen profiilit. Valinnat sisältyvät toisen sukupolven anti-EGFR-mAb: t (jos KRAS villityypin), PI3K koulutusjakso estäjät (jos PIK3CA mutaatio tai matala PTEN lauseke), mTORC1 estäjä plus anti-IGF1 R mAb (jos alhainen PTEN lauseke), PI3K koulutusjakso estäjät plus MEK estäjät (jos KRAS tai BRAF-mutaatio), BRAF estäjä (jos BRAF-mutaatio) ja anti-HGF-mAb (jos korkea pMET ilmaus) [49].