Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ovatko ADAMTSs perheen eritettyjen proteinaasien Silloin osakkeen LLO protestanttinen puolestaan ​​inase DOMAIN Matrix (MMP). Vaikuttamalla Suuri paneelissa ekstrasellulaarisen substraattien, he hallitsevat useita solun toimintoja, kuten Fusion, tarttuvuus, proliferaatio ja migraatio. Kautta trombospondiinipeptidi motiiveja he myös omistavat antiangiogeenisiä ominaisuuksia. Lue ADAMTSs selvitti RTI listua peräsuolen syövän etenemiseen ja hyökkäystä. Heidän puhdas ilme tutkittu at Sekä mRNA ja proteiini tasoilla. Käyttämällä RT-PCR, ilmaus

ADAMTS-1

,

-4

,

-5

ja

ADAMTS-20

puhdas arvioitu Kolorektaalituumorien eri vaiheessa syöpä ja anatomiset päällä ja solu- linjat 3 eri aggressiivisuus. Yli-ADAMTS-4 ja -5 puhdas vähentynyt erityisesti kudosnäytteitä, kun taas ADAMTS-1 ja -20 prostituoitu Löydetty tuottaa alassäädetty. Western blot-analyysi tukee lisäksi RT-PCR-havainnot, paljastaen lisäksi hajoamista ADAMTS-1 ja -20 syövän. In situ ilmentyminen ja lokalisointi

ADAMTS-1

,

-4

,

-5

ja

-20 puhdasta

myös tutkinut immunohistokemiallisella analyysi. Tuloksemme viittaavat siihen, positiivinen korrelaatio

ADAMTS-4

ja

-5

ilmaisun ja syövän etenemistä, toisin antiangiogeenisiä perheenjäsenet,

ADAMTS-1

ja

-20

, joka prostituoitu Löydetty tuottamaan alassäädetty. Meidän havainnot tukevat käsitystä, että yli-ilmentymisen ADAMTS-4 ja ADAMTS-5 kolorektaalisyövässä saattaa tuottaa mahdollista tulee nvasive mekanismi syöpäsolujen jotta hajota proteoglykaanien ECM.

CITATION: Filou S, RPE Tinou A Kyri on ulou D, D Bounias, Stavropoulos M, Ra viruksen zoula P, et ai. (2015) ADAMTS Expression in peräsuolen syövän. PLoS ONE 10 (3): e0121209. doi: 10,1371 /journal.pone.0121209

Academic Editor: Alberto G. Passi, University of nsubria, ITALIA

vastaanotettu: 01 lokakuu 2014; Hyväksytty: 02 tammikuu 2015; Julkaistu 18 maaliskuuta 2015

Copyright: © 2015 Filou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehtojen mukaisesti Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja Resource hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat Paper.

rahoitus: kirjoittajat ole rahoitusta tai tuki raportti.

kilpailevat Harrastukset: kirjoittajat ovat ilmoittaneet ole kilpailevia joka kiinnostaa olemassa.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi eniten diagnosoidaan usein syöpä ja toiseksi yleisin syy syöpäkuolemista Yhdysvalloissa [1] ja Eurooppa, samoin. Vaikka CRC on ncidence, taloudellisesti kehittyneissä maissa, stabiloidaan tai pikemminkin vähentynyt [2] On vielä käyttäjä kysymys ymmärtämään paremmin biologian angiogeneesin ja invaasio, jotta löydettiin antiangiogeenisten /anti-Israel nvasive molekyylejä. Kertyvät e vidence osoittaa keskeinen rooli proteolyyttisten entsyymien kuten Matrix (MMP) ja läheisesti liittyvät ADAMTSs (a disintegriini- ja on LLO protestanttinen puolestaan ​​inase kanssa trombospondii- motiivi) syövän etenemiseen ja kehitys [3]. Ovatko erilliset ADAMTS ryhmän sinkki-riippuvaisen metalloproteinaasien ja näyttää korkea rauksena yhtäläisyyksiä perheen käärme reprolysiini venomases. Täydellinen ihmisen ADAMTS perhe käsittää 19-geenit [4] (ADAMTS-5 ja ADAMTS-11 on sama Gene), ja vaikka ne ovat liukoisia proteiineja, joista monet näyttävät sitoutuvan solunulkoiseen Matrix kautta trombospondiini motiiveja tai niiden spacer alue [5 -7]. ADAMTS on erilaisia ​​toimintoja, kuten Clementine erityiset Avage Matrix proteoglykaanien aggrekaani, versikaani ja brevican (ADAMTS-1, -4, -5, -8 ja -15) [7-9], angiogeneesin estäminen (ADAMTS-1, -8 ) [8-12] ja kollageenin käsittely (ADAMTS-2, -3 ja -14) [13].

ADAMTS-1 ja -8 katsotaan tuottaa anti-angiogeenisten tekijöiden, aiheuttaa syntymän vuorovaikutuksen niiden thrombospondin motiiveja ja CD36, kalvon glykoproteiinireseptoria endoteelisolujen [11, 12]. Nämä proteaasit on osoitettu estävän VEGF: n indusoimaa angiogeneesiä in korioallantoiskalvoon (CAM) määritys [10] ja tukahduttaa FGF-2-indusoitu vaskularisaatiota sarveiskalvon taskussa määrityksessä. Kuitenkin ADAMTS-1 pitäisi tuottaa enemmän pidetään lecule anti- tai protestanttisen etäpesäkkeitä vaikutuksia riippuen Clementine Avage sivuston, kun se on Auto-proteolyyttisen Clementine Avage [14]. ADAMTS-8, näyttää myös estävän epidermaalisen kasvutekijän reseptorin signalointi sekä alentuneet fosforyloitua MEK ja ERK [15]. Lisäksi 12q12 paikoitellen Gene ADAMTS-20 on havaittu hedelmien osalta toiselle siirtäminen ja muut muutokset ihmisen maligniteettien [16-19] ja myös useita patologisia tiloja, kuten Parkinsonin tauti [20].

On runsaasti e vidence osoittamalla ADAMTS jotka vapautettiin ihmisen syövässä. Todellakin, aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ADAMTS-20 yli-ilmennetään Brain ja rintakarsinoomissa, mikä viittaa tämä protestanttinen tease Se voisi olla rooli syövän etenemiseen. For ADAMTS-1, se on osoitettu, että yli-ilmentyminen sen täyspitkän isoformi lisää kasvaimen kasvua ja edistää keuhkojen etäpesäkkeiden TA3 maitorauhasen solujen tai Lewis-keuhkosyövän solut, kun se on havaittu, vähentynyt ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, haiman kasvaimet ja eturauhassyövän solulinjoissa [21, 22]. On myös osoitettu, että ADAMTS-1, -5, -9, -12, -15 ja -18 Gene promoottorit ovat hypermetyloitunut peräsuolen syöpä, viitaten siihen vähentynyttä ilmentymistä näiden entsyymien tässä valtiossa [23]. Lisäksi molemmat ADAMTS-15 ja -18 geenit tehdään usein mutaatiot peräsuolen syövän solut, mutta ei e vidence ole vielä esittänyt niiden vaikutusta ilmentymistä tai toimintaa entsyymien. Sen sijaan, ADAMTS-4 ja -5 Onko yläreguloituja glioblastoomat (GBM), mahdollisesti rooli lisääntynyt hajoaminen brevican mikä lisää mahdollisuuksia nvasive [24, 25]. Lisääntynyt versikaani, joka voi tuottaa liittyvät ADAMTS moduloitu ilmaisua, on myös havaittu koiran paksusuolen adenoomien ja karsinoomien [26]. Ei dekoriini versikaani mutta kertyminen liittyy syöpään mammographically havaittu korkea tiheys ja pahanlaatuiset-esiintyvät mikrokalkit ei-kouraantuntuva rintakarsinoomista [27].

päästääkseen paremmin osaksi, onko todennäköistä, että yliekspressoitu versikaani tuottaa hajoavan ADAMTS kuten syöpä nvasive mekanismi, lue tutkittiin ADAMTS-1, -4 ja -5 ilmaisun Healthy ja syöpä- paksusuolen kudoksiin, ja myös koolonsyöpäsolulinjoissa Eri metastaattisen potentiaalin. Koska Tutkimuksen tavoitteena puhtaan paljastaa potentiaalisia kehittää uusia anti-ole ainoa nvasive mutta myös anti-angiogeeninen hoitoja, The ADAMTS antiangiogeenisestä alaryhmä puhdas ilme myös arvioitu. Lisäksi, koska ADAMTS-1 anti-angiogeeninen vaikutus välittyy sen trombospondiini motiivien [11] ja ADAMTS-20 sisältää 14 toistoa se, arvioitiin myös sen koko solun tasot neoplastisten ja Healthy paksusuolen.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Kanin polyklonaalisia vasta-aineita, ab28284 (vastaan ​​N-terminaalinen pää ADAMTS-1), ab84792 (vastaan ​​C-pään ADAMTS-4), ab41037 (vastaan ​​tähteet 600-700 of ADAMTS-5) ja ab60148 (vasten katalyyttinen domeeni ADAMTS-20) prostituoitu ostettiin Abcam (Cambridge, UK) ja vuohen anti-kani-lgG conjucated kanssa o xidase puhtaana EMD llipore Corporation (salon llerica, Massachusetts, USA). Hiiren anti-tubuliini (T9026) ja o xidase konjugoitu anti-hiiri-IgG (A4416) Prostitute saatiin Sigma-Aldrich Inc. (St. Luis, USA). Paljasta hiiri ja kani Erityiset HRP /DAB IHC Detection Kit (ab94710) puhtaana Abcam. Kokonais-RNA uutettiin puhtaasta jäädytettyä kudosta ja viljeltiin soluja käyttäen NucleoSpin Macherey-Nagel (Düren, Saksa) Extraction Kit, seuraten valmistajan protokollaa. RT-PCR puhdasta saatu Takara (Otsu, Shiga, Japani) Askeleen RT-PCR kit, käytetään tuoreita paksusuolikudos ja Takara PrimeScript 1

st juosteen cDNA-synteesi kit ja Finnzymes (Espoo, Suomi) DyNAzyme II DNA lymerase kit, joita käytetään soluviljelmässä. Ihmisen Alukkeet kaikille prostituoitu suunniteltu molekyylit laboratoriossa käyttäen PerlPrimer Program. Kaikki muut kemikaalit käytetään koko tutkimuksen prostituoitu paras viruksen ilable analyysilaatuista.

Tutkimukset

Solut

Cell Cultures.

Caco-2, DLD-1 ja HT-29 koolonsyöpäsolulinjoissa prostituoitu hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Aggressiivisuus solulinjojen on Ala Caco-2 soluja ja enemmän HT-29-solut. DLD-1 ja HT-29-solut Prostitute viljeltiin RPMI 1640-alustassa, jossa on 2 mm: n L-glu tamine ja jota oli täydennetty 10 mM HEPES, 1 mm: n natriumpyruvaattia, 4,5 g /l glukoosia, 1,5 g /l natriumbikarbonaattia ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS), tarvittaessa suosituksen mukaisesti ATCC. Caco-2-solut Prostitute viljeltiin Eaglen Minimum Essential Medium, jossa oli Earlen BSS ja 2 mm: n L-glu tamine (EMEM) ja jota oli täydennetty 1,0 mm natriumpyruvaattia, 0,1 mm ei-välttämättömiä aminohappoja, 1,5 g /l natriumbikarbonaattia ja 20% naudan sikiön seerumia Kun tarvitaan, kuten myös suosittelemia ATCC. Prostitute Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa, 5%

2 ja 100% kosteus.

Solulyysis.

Pelletit viljellyistä Solut, jotka käsitelty prostituoitu ppro taessa hajotuspuskuria, joka sisälsi 25 mm Hepesiä, 150 mm NaCI: a ja 5 mm EDTA: ta 10% glyserolia ja 1% Triton X-100. Uuttaminen prostituoitu suoritettiin 30 minuuttia 0 ° C: ssa vorteksoimalla 4 sekuntia 10 minuutin välein, läsnäolo fosfotyrosyyliproteiinien kuulo sphatase estäjä Na

3Vo

4 (50 mm) ja seuraavista protestanttisen tease estäjät: aprotiniini (1250 ug /ml), Pefablock (1000 mg /ml), leupeptiiniä (10 mM), sentrifugoinnin jälkeen 10.000 rpm: llä 5 minuutin ajan.

Tutkimukset ihmisnäytteillä

Potilaat.

prostituoitu syöpä paksusuolen kudokset saatiin potilailta (38 potilasta, keski-ikä: 73, ikäryhmä: 50-81), joille tehtiin leikkaus takia peräsuolen syöpä. Am potilaiden vaiheen (Duke), kolmetoista potilasta vaiheen B, kaksitoista potilaiden vaiheen C ja neljä potilasta vaiheen D prostituoidun mukana tässä tutkimuksessa. Potilaat sisällytettiin tutkimukseen muiden vapaa prostituoitu tauti ja kärsi koskaan ennen mitään of Disease. Terve paksusuolen kudokset (N = 6) prostituoitu sisältyy myös Tutkimuksemme. Tämän tutkimuksen suunnittelu oli hyväksynyt eettinen komitea yliopistollisen sairaalan Patras, Kreikka, ja puhdas kirjallinen suostumus on saatu kaikki potilaat tulevat tutkimuksessa.

sarjauuttaminen solunulkoisen ja soluun liittyvä komponentteja kudoksista.

kerätyt normaali ja syöpä- paksusuolen kudoksiin prostituoitu kuutioiksi ja peräkkäin uutetaan 10 Vois 10 mm dinatriumfosfaatti, 0,14 M NaCl, pH 7,4 (PBS), 4 M Butterfly n nidine hydrokloridi (GdnHCl) – 0,05 M natrium Cetate pH 5,8 ja 4 GdnHCl M-0,05 M natrium-Cetate 1% Triton X-100, jotta saadaan liukoinen ja kalvoon sitoutuneet muodot ADAMTSs. Uuttaminen Prostitute suoritettiin 24 tunnin ajan 4 ° C: ssa varovasti ravistellen, läsnäolo seuraavista protestanttisen puolestaan ​​inase estäjät: ε-amino-n-kapronihappoa (0,1 M), PMSF (0,4 mM), N-e thylma imidi (10 mM), dinatrium EDTA (10 mM) ja syntymä on midine-HCl (5 mM). Uutteet prostituoitu kerätään ja säilytetään -20 ° C: ssa käyttöön asti [28-30]. Uutto protokolla puhdas suunniteltu siten pelata lisinä ADAMTS olemassa vapaita muotoja kudoksissa ja pitäisi tuottaa uutettu PBS (a SSO aloitteen ehdot), mistä ADAMTS vuorovaikutuksessa muiden solunulkoisten makromolekyylien on tuottaa uutettu 4M GdnHCl (di SSO aloitteen olosuhteissa) ja ADAMTS olemassa solukalvojen on tuottaa uutettiin erityisesti GdnHCl 4M-1% Triton X-100.

immunohistokemia.

immunohistokemia (IHC) puhdasta suoritettiin 5 um: n leikkeitä leikattiin formaliinilla, parafinoidut lohkojen kuten aiemmin on kuvattu [29], käyttämällä ensisijaista polyklonaalisia vasta-aineita ADAMTS-1, -4, -5 ja -20 laimennettu 1: 6250, 1: 2000, 1: 650 ja 1: 6250 vastaavasti, TBS, joka sisälsi 1 % (w /v) BSA: ta. Saatu antigeeniyhdistelmät prostituoitu näkyviksi inkuboimalla vuohen anti-kani HRP on njugate ja värjäämällä puhdas kehitettiin DAB /vetyperoksidi IHC Kit (Abcam) mukaan valmistajan ohjeiden. Lopuksi osat prostituoitu vastavärjättiin hematoksyliinillä. Positiivinen värjäys puhdas sijoitettiin mukaan koko intensiteetti jokainen osioista.

Western blot-analyysit

Noin 20 ug proteiinia, kvantifioitiin käyttämällä Bradfordin menetelmällä (BioRad), kudoksista ja solu- kulttuureissa uutteet, ja solun viljelmät Media Prostitute saostetaan 5 tilavuudella etanolia, liuotetaan 20 ul: aan Laemmlin näytepuskuria ja niitä sovelletaan lya crylamide geelielektroforeesilla (Page) geeleillä 10% pitoisuus crylamide kuten aikaisemmin on kuvattu [28]. Makromolekyylit Prostitute siirretään sitten lyvi nylidene di fluoridi (PVDF) (Immobilon-P, joka llipore) vakiovirralla 80 ovat 4 ° C: ssa 20 h 0,05 M Tris /HCl, pH 8,3 ja kalvot prostituoitu pestiin 0,14 M NaCl 0,01 M fosfaattipuskuria (PBS), pH 7,2, joka sisälsi 0,1% (v /v) Tween-20 (PBS-T). Kun oli salvattu 5% naudan seerumin albumiinia (BSA) PBS-T, kalvot Prostitute upotetaan liuokseen vasta-aine joko ADAMTS-1, -4, -5 tai -20 oli laimennettu 1: 5000, 1: 500, 1: 250 ja 1: 5000 vastaavasti, PBS: ssä, joka sisälsi 1% naudan seerumin albumiinia (BSA) PBS-T ja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Toistuvan pesut PBS-T, kalvoja Prostitute inkuboitiin asianmukaisen Toissijainen vasta-ainetta laimennettuna 1: 10000 PBS-1% BSA: ta, inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja pestiin PBS-T: llä. Immunoreagoimaan nauhat prostituoitu näkyviksi parannettu huomiota liittimet tuottava entsyymi menetelmä (ECL) (Amersham, UK), mukaan valmistajan ohjeiden ja sähköpostitse LTISTUKSEN Agfa Curix röntgenfilmeissä, aika vaihteli 1-30 min, riippuen kokeessa.

RNA ja RT-PCR-analyysejä

tuore paksusuolen kudoksiin Prostitute jauhettiin nestemäisessä typessä ja viljeltiin prostituoitu Solut altistettiin Total RNA käyttäen NucleoSpin liuuttovälinepakkausta kuvaama valmistajan ohjeiden ja käsitelty RNaasittomalla DNaasi poistaa kontaminoivan genomisen DNA: n. Paksusuolen kudoksiin, puhdasta juosteen cDNA syntetisoitiin 80 ng kokonais-RNA: 50 ul: ssa reaktioseosta komponenttien yksivaiheiseen RT-PCR kit, mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tämä sisältämä reaktioseos lisäämällä 1 uM ja tunnetta ntisense alukkeet on esitetty taulukossa 1. vahvistus puhdasta suoritettiin GeneAmp 2400 lämpösyklilaitteessa (Perkin-Elmer Co.) ja reaktiota profiilin, jota käytetään kaikkien alukkeiden asettaa puhdasta: 95 ° C 10 min aktivointiin DNA lymerase ja inaktivoitumisen kääntää TRANSLATION_LANGUAGE nscriptase ja sitten 25-35 sykliä, riippuen Analysis, 94 ° C 30 sekuntia, 52-58 ° C riippuen aluke 1 min ja 72 ° C: ssa 1 min Phi loitto. Soluviljelmien, Two vaihe RT-PCR puhdas soveltavaan ja Ensimmäisen juosteen cDNA puhdasta syntetisoitu 1 ug kokonais-RNA 20 ul reaktio komponenttien PrimeScript 1

st juosteen cDNA-synteesi kit, käyttämällä satunnaisia ​​6mers, mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sitten 100 ng monistettua cDNA prostituoidun 50 ui reaktiossa komponentteja DNA lymerase kit. Tämä reaktio sisälsi lisäksi 0,5 uM sense- ja ntisense alukkeet on esitetty taulukossa 1. vahvistus puhdasta suoritettiin GeneAmp 2400 lämpösyklilaitteessa (Perkin-Elmer Co.) ja reaktiota profiilin, jota käytetään kaikkien alukkeiden asettaa puhdasta: 95 ° C 2 min, 94 ° C 30 sekuntia, 52-58 ° C riippuen alukesettiä 1 min ja 72 ° C 1 min Phi rengas laajennus ja puhdas toistetaan 25-35 sykliä, riippuen Analysis. Reaktion tuotteet Prostitute erotettiin elektroforeesilla 2% (w /v) garose Gelstar Stain geelejä, jotka sisältävät vitamiinia ei Alize monistetut cDNA-fragmentit UV. Geelit prostituoitu sitten skannattu ja bändit prostituoitu analysoitu densitometrisesti. Qu Antiokian tative eroista prostituoitu normalisoitua cDNA näytteitä sisällyttämällä GAPDH kaikissa kokeissa.

Tilastollinen analyysi

Normaalius jakelun puhdasta arvojen testattu Kolmogorov-Smirnov testi. Tulokset prostituoitu analysoitiin tilastollisesti käyttämällä paritonta t-testiä ryhmien välisten erojen.

P ≤0.05

puhdasta pidetään tilastollisesti merkitseviä.

Tulokset

ADAMTSs ilmentymistä koolonsyöpäsolulinjoissa

RT-PCR-analyysit.

ollakseen NVE stigate ilmenee, ADAMTSs CRC, lukea tutkittiin niiden ilmentymisen RNA ja proteiini tasolla kolme koolonsyöpäsolulinjaa. Tulokset ilmoitetaan Tämä RNA tasolla, ADAMTS-1 ilmentymisen puhdas hieman riippuvainen syöpäsolujen aggressiivisuus; sen puhtaana ei havaittu tuottavan ilmaistaan ​​Caco-2, kun se osoitti heikkoa ilmentymistä DLD-1, joka kasvoi hieman puhdasta HT-29 Cells. Lisäksi HT-29-solut viljeltiin seerumin läsnä ollessa, ADAMTS-1 ilmentymisen puhdasta Löydetty koholla (Fig. 1). Päinvastoin, korkea ADAMTS-4 RNA prostituoidun Kolme Löytyy kaikissa solulinjoissa. Kuitenkin ADAMTS-4 Löydetty puhdasta ilmentyminen tuottaa lisääntynyt aggressiivisuus liittyvistä tavalla, erityisesti kun soluja viljeltiin ilman seerumia. Lisäksi, lukuun ottamatta DLD-1 solut, lisääntyneen ekspression ADAMTS-4 puhdas havaittu Prostitute Kun Soluja viljellään seerumin läsnä ollessa (Fig. 1 c). Kuten on esitetty kuviossa. 1E, no ADAMTS-5 Löytyi puhdas ilmentymistä Caco-2 solut, kun taas sen puhtaana pääasiassa havaittiin HT-29 Cells. Toisin, ADAMTS-1 ja -4, ADAMTS-5 Löytyi puhdasta ilmaisua tuottaa säädellä vähentävästi solut viljeltiin seerumin. A Different lauseke, joka havaittiin puhtaan ADAMTS-20. Kuten on esitetty kuviossa. 1G, DLD-1 ja HT-29-solut, puhdasta Löydetty se tuottaa ilmaistaan ​​vain silloin, kun niitä viljeltiin ilman seerumia. Kuitenkin seerumin läsnäolo ei näyttänyt yhtymäkohta ADAMTS-20 ilmentyminen Caco-2 solut.

Semi-qu Antiokian tative RT-PCR analyysi (A) ADAMTS-1, (C) ADAMTS-4 (E) ADAMTS-5 ja (G) ADAMTS-20 viljellyissä soluissa (valkoinen /musta sarake, läsnäolo /poissaolo seerumin). Arvot Ovatko GAPDH-normalisoitu keskiarvo ± S.D. (B) ADAMTS-1 (D) ja ADAMTS-4 (F) ADAMTS-5-proteiinin solun jakautuminen ja uutteet Media Soluja viljeltiin. (S

+/-: läsnäolo /poissaolo seerumia) *

P

≤0.05; tilastollisesti merkitseviä eroja verrattuna Soluja viljeltiin seerumin läsnä ollessa. **

P

≤0.05; tilastollisesti merkitseviä eroja verrattuna Caco-2 solut, ***

P

≤0.05; tilastollisesti merkitseviä eroja verrattuna DLD-1 solut. Vertailun vuoksi solujen tubuliinin immunoidentifikaatiolla uutteita puhdas sisältyvät B, D ja F.

Western Blot-analyysit.

ADAMTS-1 havaittu radioaktiivista vuodelta puhtaana DLD-1 ja HT 29 solulinjat, kuten bändi 80 kDa solussa uutteet, kun taas vain fragmentteja ADAMTS-1 35 kDa prostituoidun havaittu Media (Fig. 1b), riippumatta läsnäolo seerumin. Nämä fragmentit voivat tuottaa tuotteita joko autokatalyyttisesti jalostettu ADAMTS-1 tai katalyyttisesti käsitelty ADAMTS-1 MMP. Koska tällaiset fragmentit havaitaan prostituoitu ei vain ulkoinen ja sisäinen Esimerkiksi solusta, ovat ne enemmän mahdollisia johtuvat MMP toimintaa. Caco-2-solulinjoissa, kun tämä on puhdasta tease LLO protestantti Vain havaittu seerumin läsnä ollessa samaan molekyylipainon muodossa kuin muissa Molemmat solulinjat (Fig. 1b). Lisäksi bändi on 65 kDa havaittiin puhdasta otteita DLD-1 solut viljeltiin ilman seerumia.

ADAMTS-4 havaittiin radioaktiivinen vuodelta puhtaana DLD-1 ja HT-29 solulinjojen ja läsnä ei tai seerumia, koska bändi 90 kDa, sisäinen ja solun ulkopuolelle (Fig. 1 d). Kun kyseessä on Caco-2 solut, 90 kDa puhdas Vain havaittu solussa uutteet, kun taas solu Media ylimääräisenä MMU radioaktiivisella vuodelta bändi 50 kDa puhdasta havaittu, luultavasti seurauksena omaa autokatalyyttisen aktiivisuutta (Fig. 1 d).

ADAMTS-5 havaitaan radioaktiivinen vuodelta puhtaana vyöhykkeenä 74 kDa, kaikissa kolmessa solulinjoissa viljellään missään olosuhteissa (Fig. 1 F). Lisäjuovaa erikokoisia, pienempi kuin muoto radioaktiivisen vuodelta, Prostitute havaittu solujen uutteet HT-29 ja pääasiassa Caco-2-solut viljeltiin ilman seerumia. Kiinnostavaa kyllä, ei mmu on pieni bändi radioaktiivisen dating SIZE puhdas havaittu Media mitään näistä soluviljelmissä. Kuitenkin ADAMTS-5 radioaktiivisen vuodelta puhtaassa muodossa myös havaita solun, HT-29 Cells viljellään seerumin läsnä ollessa ja DLD-1-solulinjat. Lisäksi HT-29-solut viljellään seerumin läsnä ollessa, lisää kaistoja pienempiin prostituoitu myös havaita solun, mikä viittaa siihen, translaation jälkeisestä katkaisu entsyymin johtuvat joko sen oman toiminnan tai autokatalyyttisen MMP toimintaa.

Toisin kaikki muut ADAMTSs tutkittu, ADAMTS-20 ei ole puhdasta proteiinia havaittiin näissä Kolme koolonsyöpäsolulinjoissa.

in situ ilmentyminen ADAMTS-1, -4, -5 ja -20 IHC

ADAMTS-1, -4, -5 ja -20 in situ ilmaisun ja lokalisointi Seuraava puhdas analysoidaan paksusuolen kudososat parafinoidut lohkot, käyttäen vasta-aineita ppro kaista. Vahva värjäys ADAMTS-1 havaittu puhdasta Healthy paksusuolen, pääasiassa lihas- kerroksia ja kudoksessa nnective kahden kerroksen välillä (Fig. 2A, Healthy). CRC, ADAMTS-1 osoitti Voimakas ilmentyminen lihaskudoksen (nuoli kuvassa. 2A, St. C) ja Ala pääasiassa sytoplasmista ilmentymistä syöpäsoluissa vaiheen C yksilöitä. Vähentynyt tai ei värjäytymistä ADAMTS-1 havaittu puhdasta lihasta kudosnäytteiden vaiheen B (Fig. 2A, St. B) ja muissa vaiheissa yksilöt (C ja D), tässä järjestyksessä. Värjäys ADAMTS-4 in Healthy paksusuolikudos havaittu puhdasta Kaksi kerrosta musculariksesta Externa eikä BMU cosae (Fig. 3A, Healthy). Varhainen syövän vaiheittain, vaiheiden ja B, ADAMTS-4 näytteillä vastaava ilmaisu kuvio ADAMTS-1, koska se osoitti värjäämällä strooman (nuolet kuvassa. 3A, St., St B) ja melko himmeämpi tai ei värjäytymistä syövässä solut (arrowheads kuvassa. 3A ja St. B St., vastaavasti). Kuitenkin yksilöiden C ja D vaiheissa, syöpäsolut osoittivat Clare tavaa potentiaalia sytoplasmista ekspressiota ADAMTS-4 (arrowheads kuvassa. 3A St. C ja D ja niiden St. takkakasetti vastaavasti). Lisäksi vähemmän tai ei lainkaan ilmentymistä ADAMTS-4 puhdas strooman havaittu yksilöiden solujen vaiheittain C ja D, vastaavasti (nuolet kuvassa. 3A ja St. St.C D, vastaavasti). Kuten ADAMTS-5, Low melko puhdas värjäytyminen havaittiin pituussuunnassa kerroksen muscularis Externa in Healthy paksusuolen yksilöt (nuoli kuvassa. 3B, Healthy). CRC, ei värjäystä ADAMTS-5 havaittiin joko puhtaassa tai strooman neoplastisissa epiteelisoluissa vaiheessa yksilöt (nuoli ja nuolenkärki kuvassa. 3B, St.A, vastaavasti), kun taas ekspressio ADAMTS-5 puhtaana havaittu strooman solut vaiheen B yksilöt (nuoli kuvassa. 3B, St. B). Kuten ADAMTS-4, ADAMTS-5 oli myös vahva sytoplasmista värjäytymistä syöpäsoluissa vaiheen C ja D yksilöt (arrowheads kuvassa. 3B St.C St. ja D, vastaavasti) eikä ilmaisun strooman vaiheessa D. Lopuksi ADAMTS- 20 oli myös alhainen värjäytymistä pituussuunnassa kerroksen muscularis Externa in Healthy paksusuolen yksilöt (Fig. 2B, Terve), kun taas CRC sen puhtaana havaitaan vain syöpäsoluissa vaiheen B ja lähinnä vaiheessa C yksilöt (arrowheads kuvassa. 2B, St. St.B ja C, vastaavasti).

Terve paksusuolen kudoksessa ja syöpä- paksusuolen vaiheen B ja C, värjättiin ADAMTS-1 (A) ja ADAMTS-20 (B). (A, suurennos, x4, anatominen sivusto, umpisuoli, suurennos, x4, anatominen sivusto, umpisuoli, suurennos, x4, anatominen sivusto, peräsuolen ja B, suurennus, x4, anatominen sivusto, umpisuoli, suurennos, x20, anatominen sivusto, umpisuoli, suurennos, x20, anatominen sivusto, peräsuolen). Sisäkkeet A ja B (kaikki suurennos, x10) esittävät limakalvon ja ei bmucosa kerros. Nuolet Terve paksusuolen osoittavat ilmentymisen ADAMTS lihasmassaan. Nuolet syöpä paksusuolen osoittavat ilmentymisen ADAMTS stroomassa, ja nuolenpää osoittaa ekspressiota ADAMTS syöpäsoluissa.

Terve paksusuolen kudoksessa ja syöpä- paksusuolen vaiheen A, B, C ja D, värjättiin ADAMTS-4 (A) ja ADAMTS-5 (B). (A, suurennos, x4, anatominen sivusto, umpisuoli, suurennos, x10, anatominen sivusto, umpisuoli, suurennos, x20, anatominen sivusto, umpisuoli, suurennos, x4, anatominen sivusto, peräsuoli, suurennos, x20, anatominen sivusto, peräsuolen ja B, suurennos, x4, anatominen sivusto, umpisuoli, suurennos, x10, anatominen sivusto, umpisuoli, suurennos, x20, anatominen sivusto, umpisuoli, suurennos, x4, anatominen sivusto, peräsuoli, suurennos, x10, anatominen sivusto, peräsuoli), värjättiin ADAMTS- 5. Sisäkkeet osoittavat, että limakalvon eikä bmucosa kerros Terve paksusuolen (suurennos, x10) ja sytoplasman lokalisaation ADAMTS-4 soluja syövän vaiheessa C ja D (suurennus, x20 ja x40, vastaavasti). Sisäkkeet osoittavat B Mucosa eikä bmucosa kerroksen Terve paksusuolen (suurennos, x10) ja sytoplasmista lokalisaation ADAMTS-5 syöpäsoluissa vaiheen C (suurennos, x20). Nuolet Terve paksusuolen osoittavat ilmentymisen ADAMTS lihasmassaan. Nuolet syöpä paksusuolessa osoittavat ilmentymistä ADAMTS vuonna strooman, vaikka nuolenpäitä osoittavat ilmentymistä ADAMTS syöpäsoluissa.

ADAMTSs ilmentymistä paksusuolensyöpä kudoksissa

RT-PCR-analyysit.

RNA tasot ADAMTSs prostituoidun tarkastellaan Healthy umpisuoli, sigmasuolessa ja peräsuolessa. Kaikista tutki proteaaseja, ADAMTS-1 osoitti korkein ilmentymä (yli kaksinkertainen sisäisen valvonnan-GAPDH), kun taas ADAMTS-5 vähemmän puhdas protestanttinen ilmaistaan ​​tease (lähes taso Zero taistelija) (tuloksia ei ole esitetty). RT-PCR osoitti analyysit että

ADAMTS-1

puhdasta alassäädetty syövässä yksilöiden tahansa vaiheessa verrattuna Terve paksusuolen, joilla on suurimmat de prässi noin 20% siinä vaiheessa yksilöt (Fig. 4A). Nämä tiedot ovat yhtäpitäviä aikaisempien tutkimusten jossa

ADAMTS-1

oli todettu tuottavan alassäädetty monissa syöpätyyppien [21, 22]. A Different ilme kuvio

ADAMTS-1

puhdasta havaitun varten

ADAMTS-4

ja-

5

, joka prostituoitu havaitaan tuottavan yli-ilmentynyt vaiheessa C yksilöt; lähes 14-kertaiseksi ja 20-kertaiseksi verrattuna Terve paksusuolen kudosta, vastaavasti (Fig. 4C, E). Nämä tiedot prostituoidun kanssa Edelliset tutkimukset muiden syöpien, jos ADAMTS-4 ja -5 oli todettu tuottavan yli-ilmentynyt, jotta hajota ECM proteoglykaanien, kuten agreecan ja versikaani levittämään litate syöpäsoluinvaasiota [24, 25 ]. Seuraamalla samaa koe- protestanttisen menettelyn osalta

ADAMTS-20

, sen puhtaana Löytyy koholla vaiheessa A ja B yksilöitä verrattuna terveiden kudosten 50% ja 100%: lla, mutta vaiheessa C yksilöt se osoitti de prässi 20% (Fig. 4G).

Semi-qu Antiokialainen tative RT-PCR-analyysi (a) ADAMTS-1, (C) ADAMTS-4 (E) ADAMTS-5 ja (G) ADAMTS-20. Arvot Ovatko GAPDH-normalisoitu keskiarvo ± S.D. Proteiini jakelu (B) ADAMTS-1 (D) ADAMTS-4, (F) ja ADAMTS-5 (H) ADAMTS-20. *

P

≤0.05; tilastollisesti merkitseviä eroja verrattuna terveisiin kudoksiin. **

P

≤0.05; tilastollisesti merkitseviä eroja verrattuna vaiheeseen A. ***

P

≤0.05; tilastollisesti merkitseviä eroja verrattuna vaiheeseen B. Healthy umpisuoli, Sigmoid paksusuolen ja peräsuolen kudosten Näkyvät;

C-

: Duke CRC vaiheissa. Nuolet ndicate massan kulkeutumista molekyylimarkkereita. PBS, GdnHCl ja Triton Ovatko peräkkäinen talteen käytetty Solutions (Text tasaisempia).

Western Blot-analyysit.

ADAMTS-4, -5 ja -20 prostituoitu havaittu umpisuoli, sigmoid ja peräsuolen, kun taas ADAMTS-1 puhdasta havaittiin vain sigmoid ja umpisuoli. Kuitenkin he erosivat toisistaan ​​uuttuvuuden paljastaa Erityyppiset vuorovaikutusten ja /tai lokalisointi näiden entsyymien sisällä paksusuolikudos.

ADAMTS-1 Vain puhdas havaittu PBS ja GdnHCl /Triton Terve otteita sigmoid ja umpisuoli, kuten kaistan 120 kDa ja 11 kDa, joka edustaa piilevä entsyymin muodosta ja keskeneräisen tuotteiden synteesin, kun taas yksikään uutteet sisälsi radioaktiivista vuodelta muodossa (80 kDa) entsyymin. (Fig. 4b). ADAMTS-1 piilevä puhtaassa muodossa myös havaittu syövän umpisuoli vaiheen B, käyttäen Creative di SSO Että olosuhteissa osoittaa se vuorovaikutuksessa ECM komponentteja, kuten TIMP-3 tai A2- makroglobuliinissa, joka ylläpitää entsyymiä sen inaktivoidun muodossa. Peräsuolen syöpä vaiheessa puhdasta C havaitaan GdnHCl kuin uutteet 35 kDa fragmenttiin, mahdollisesti johtuvat MMP aktiivisuutta (Fig. 4b). Kuva A Different puhdasta saatu sigmoid, jos ADAMTS-1 puhdas Ei havaittu missään vaiheessa syöpään. Siten se voi tuottaa väitti ADAMTS-1 Rooli CRC riippuu klo suuressa määrin anatomiset päällä.

Voit Jatka, piilevä muoto ADAMTS-4 puhdas havaittu Triton uutteet kaikki kolme anatomista Sites terve paksusuolen vyöhykkeenä 110 kDa. Kuitenkin PBS: ssä ja GdnHCl uutteet Sekä umpisuoli ja peräsuolen, radioaktiivinen vuodelta entsyymin muodosta (90 kDa) ja useita fragmentteja eri molekyyli- kokojen ja kaksi erillistä fragmentit 60 kDa: n ja 70 kDa: n Prostitute havaittu, vastaavasti (Fig. 4D). Päinvastoin, ADAMTS-4 puhdas havaitaan vaiheessa B ja C yksilöt lähinnä sen oleva radioaktiivinen vuodelta. Vaiheessa B umpisuoli yksilöitä, radioaktiivinen vuodelta entsyymin muodosta puhdasta havaittu PBS ja GdnHCl uutteet, kun taas vaiheessa C peräsuolen yksilöitä, lukuun ottamatta radioaktiivisen vuodelta muodossa puhdasta Löytyy PBS uutteet ylimääräinen bändi 110 kDa, mikä sen piilevä muoto , puhdas myös havaittiin kaikissa Tree uutteet.

seuraamalla samaa koe- protestanttisen menettely, ADAMTS-5 radioaktiivinen dating havaittu puhtaana ja PBS GdnHCl Terve uutteet paksusuolen myös kaikkien syövän vaiheissa kuitenkin koskevien vaiheen liittyvistä lisääntynyt immunoreaktiivisuus (Fig. 4F).

Lopuksi western blot-analyysi paljasti piilevä muoto ADAMTS-20 (161 kDa) PBS ja GdnHCl uutteet anatominen Kolme Sites of Healthy kudosten, että sigmoid jotka sisältävät pienin määrin. Kiinnostavaa kyllä, se myös puhdasta havaittu syövän kaikissa vaiheissa, kuitenkin eroja sen uuttuvuuden ja molekyylimuotoja. Vuonna vaiheessa sigmoid yksilöitä, piilevä muoto entsyymin erottaa puhtaasta PBS uutteet, mikä osoittaa, että se oli melko vapaasti Tämä kudoksessa. ADAMTS-20 fragmentteja havaittiin prostituoitu GdnHCl ja GdnHCl /Triton uutteet (Fig. 4 H). Otteet GdnHCl vaiheessa B umpisuoli yksilöitä, yhden 60-kDa fragmentti puhdasta saatu, kun taas PBS ja Gdn-HCl otteita vaiheen C peräsuolen yksilöitä, ylimääräinen pienempi 50 kDa fragmentti puhdasta saatu.

Keskustelu

Kertyvät e vidence of ADAMTSs vaikutuksia ihmisen maligniteettien on osoittanut niiden merkittävä rooli syövän etenemiseen [21, 24, 25]. Yli-ilmentyminen näiden proteaasien on yhdenmukainen vaatimusten karsinooman solut poistaa proteoglykaanien ECM, kuten aggrekaania ja versikaani täydentävänä mekanismi kollageenin hajoamista kollagenaaseihin ja gelatinaasien. Näin ollen, lisääntynyt ilmentyminen versikaani on havaittu neoplasioiden paksusuolen ja peräsuolen [26, 30]. Muita merkittäviä tieto antaisi tutkimus ADAMTSs ilmaisun CRC, koska mahdollinen hajoaminen versikaani johtaisi radioaktiivisten dating versikaani fragmentteja vakiintuneiden rooleja syövän etenemistä [14]. Toisaalta, joidenkin jäsenten ADAMTSs perhe, ne ilmoitetaan olevan mahdollisesti antiangiogeenistä rooli, ovat epigeneettiseltä vaiennettu Löytyy eri syöpätyyppejä, mukaan lukien CRC [12]. Tässä tutkimuksessa, mahdollinen modulaatio ADAMTS-1, -4, -5 ja -20 jakelun ja ilmentymisen paksusuolen syöpä verrattuna puhtaaseen Terve paksusuolen tutkittu.