Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Angiogeneesi on välttämätön kasvulle ja etäpesäkkeiden syöpä. Vaikka antiangiogeenisiä aineita, erityisesti verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) inhibiittorit, ovat osoittaneet yhden aineen aktiivisuus, on huomattavaa kiinnostusta yhdistää nämä uudet lääkkeet tavanomaisen kemoterapian reagenssien saavuttaa optimaalinen kliininen teho. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida hyödyt yhdistelmähoidon verisuonten endoteelin kasvutekijän trap (VEGF-trap) gemsitabiinin kanssa keuhkojen kasvain malli.

Methods

lusiferaasia ekspressoivan Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) kautta luotiin C57BL /6J hiiriä ja kasvain hiiret satunnaistettiin ohjaus, VEGF-Trap, gemsitabiini ja VEGF-Trap /gemsitabiini yhdistelmä ryhmiä. Kasvaimen kasvua ja eläinten eloonjäämisen seurattiin. Kasvain mikroverisuonitiheys ja soluproliferaatiota arvioitiin CD31 ja Ki-67 immunohistokemiallinen analyysi. TUNEL-määritys suoritettiin havaitsemiseksi apoptoottisia soluja. Proteiini tasot sykliini D1, prokaspaasia 3, Bcl-2, MMP2 ja MMP-9 kasvaimen uutteet tutkittiin Western blot.

Tulokset

VEGF-trap yhdessä gemsitabiinin osoittivat paransi merkittävästi kasvaimen kasvun inhibition ja pitkäaikaiseen hiiren eloonjäämisen verrattuna VEGF-Trap tai gemsitabiinin monoterapiana. VEGF-Trap /gemsitabiini yhdistelmähoito paitsi esti voimakkaasti tuumoriangiogeneesissa ja solujen lisääntymistä, mutta myös lisääntynyt solujen apoptoosin kasvainkudosten sisällä. Lisäksi yhdistelmähoito merkittävästi alassäädetty ilmentymisen lisääntymistä, anti-apoptoosin ja invaasio liittyviä proteiineja.

Johtopäätös

Yhdistelmähoitoa käyttäen VEGF-trap ja gemsitabiini parantanut anti-kasvain teho on keuhkosyöpä malli ja VEGF-Trap /gemsitabiini yhdistelmä voisi edustaa lupaavaa strategia hoidossa ihmisen keuhkosyöpää.

Citation: Zhou S, Yang Y, Yang Y, Tao H, Li D, Zhang J, et al. (2013) Yhdistelmähoito VEGF-trap ja Gemsitabiini johtaa parempiin antituumoriteholla in a Hiiri Keuhkosyöpä Model. PLoS ONE 8 (7): e68589. doi: 10,1371 /journal.pone.0068589

Editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 6. kesäkuuta 2013. Julkaistu: 09 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Shanghai ”Science and Technology Innovation toimintasuunnitelma” koe-eläin tutkimushanke (nro 10140900400), National Natural Science Foundation of China (nro 31000527), Shanghai Health Bureau Research Fund nuorille tutkijan (tri Shuang Zhou) ja Hongkong Scholar ohjelma (nro XJ2011025). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut. Junli Zhang työskentelee Yantai Rongchang Biotekniikka, Ltd. Eli Lilly and Company Shanghai edellyttäen gemsitabiini (Gemzar) tätä tutkimusta varten. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Angiogeneesi on prosessi uusien verisuonten muodostus nykyisistä verisuonistoon. Se on tärkeä prosessi kehityksessä pahanlaatuisia kasvaimia kuin uudisvaurioiden täytyy perustaa oman verenkiertoa kasvaa yli 1-2 mm halkaisijaltaan [1]. Hallitseva säätelijänä kasvaimen angiogeneesi on verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) [2], [3], joka on keskeinen angiogeeninen tekijä, jonka tiedetään olevan läsnä koko kasvaimen elinkaaren [4]. Sen jatkuva ilme, yhdessä geneettisen pysyvyyden VEGF-reseptorien endoteelisoluissa, tekee suoria ja jatkuva tukahduttaminen VEGF kanssa merkitsevät kasvainten vastaisen strategian [3], [4]. Rooliin angiogeneesin kasvaimen kasvua ja etenemistä vakiintunut, antiangiogeenisestä aineina ovat saaneet paljon laajaa huomiota, mutta kliininen strategioita käytetään optimaalisesti kehitetään vielä [5].

Antiangiogeeninen agentti verisuonen endoteelin kasvutekijä trap (VEGF-Trap tai aflibersepti) on suunniteltu kimeerinen proteiini, joka sisältää ekstrasellulaarisen domeenin 2 VEGF-reseptori-1 (VEGFR-1, Flt-1) ja solunulkoisen domeenin 3 VEGFR-2 (KDR), fuusioitu Fc-osaan ihmisen immunoglobuliini G1. VEGF-Trap voimakkaasti estää kaikki VEGF-A isomuotoja ja PIGF sekä ihmisen ja hiiren alkuperästä [6]. VEGF-Trap kykenee sen antiangiogeenisiä vaikutuksia kautta tuumorin verisuoniston [7], [8], normalisointi elossa verisuoniston, ja estämällä uusien kasvainten aluksen itäneet [9], [10]. Nämä lupaavia tuloksia johtivat etenemistä tämän aineen kliinisissä tutkimuksissa [11], ja se on äskettäin hyväksynyt Yhdysvaltain FDA ja peräsuolen syöpään [12]. On kuitenkin epätodennäköistä, että antiangiogeeninen hoitomuodot ovat hoitavia omasta koska antiangiogeeniset aineet itse voi tappaa kasvainsoluja suoraan. Pikemminkin niiden suurin potentiaali voidaan toteuttaa silloin, kun sitä käytetään yhdessä tavanomaisten syövän hoitojen, esimerkiksi kemoterapiaa [13], [14]. Anti-angiogeneesi-indusoidun normalisointi kasvaimen verisuoniston voi parantaa kasvaimen perfuusio ja johtavat parannetun kemoterapian toimitus [15] – [18].

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti. Gemsitabiini on deoksisytidiinideaminaasia analoginen joka on osoittanut tehoa kuin hoito moniin kiinteitä kasvaimia. Gemsitabiini on ollut yleisesti määrätty hoitoon potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [19], [20], mutta sen hyödyt ovat rajalliset johtuen alhaisesta vastausprosentti tai hankittu kasvain vastus.

Tässä tutkimuksessa olemme pyrkinyt arvioimaan tehoa yhdistelmähoidon käyttäen VEGF-trap ja gemsitabiini hiirimallissa LLC keuhkosyöpää malli, ja tutkimaan mahdollinen mekanismi vastuussa lisääntyneestä antituumoritehoon.

Materiaalit ja menetelmät

hiiret ja reagenssit

C57BL /6J naaras hiiret hankittiin Kiinan tiedeakatemian ja majoitettu klo Animal Maintenance Facility Tongji yliopiston vähintään 1 viikko ennen käyttää. Protokollat ​​oli hyväksynyt eläinten eettisen komitean Tongji yliopistossa. Kaikki eläinkokeet suoritettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa in vakiintuneiden ohjeiden mukaisesti. VEGF-trap rakennettiin mukaan Holash ja työtoverit [8], ja ilmaistaan ​​kiinanhamsterin munasarja (CHO) jälkeen vakaa transfektion. Yhdistelmä-DNA-VEGF-Trap puhdistettiin proteiini-A affiniteetti ja ioninvaihtokromatografialla ja liuottaa uudelleen steriiliin PBS: ään. Laatu VEGF-Trap määritettiin pelkistävällä SDS-PAGE: lla. Sitomisaktiivisuus rekombinantti-VEGF-Trap hiiren VEGF varmistettiin ELISA-base suora sitoutumismääritys. Proteiini säilytettiin -20 ° C: ssa, kunnes sen käyttö ihon alle (sc) anto 1 g /kg. Gemsitabiini (Gemzar) ystävällisesti toimitti Eli Lilly (Indianapolis, Ind., USA) ja säilytettiin 4 ° C: ssa. Mukaan aiemmissa tutkimuksissa [21], gemsitabiini liuotettiin steriiliin PBS: ssä intraperitoneaalisesti (ip) injektiolla annoksella 60 mg /kg.

rakentaminen Luciferase-ilmentävien Kasvain Cell Line

LLC hiiren keuhkon adenokarsinooma-soluja (CRL-1642) olivat American Type Culture Collection (ATCC), jotka kasvatettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% lämmön avulla inaktivoitua sikiövasikan seerumia (GIBCO-BRL), 1 uM natriumpyruvaatilla, 2 mM glutamiinia ja 100 mg /l penisilliiniä, ja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 ilmassa. Lusiferaasi-geeni monistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) cDNA-malli käyttäen eteenpäin-aluketta: 5′-CAC CGA CTC TAG AGC CGC CAC CAT GGA AGA TGC CAA AAA C ja reverse-aluketta: 5′-CGG CAA GAT CGC CGT GTA ATA ACG GTC CGT CGA CAA TCA AC, reunustaa X-bal I ja Sai I-restriktiokohdan. PCR: t suoritettiin 30 sykliä denaturointi 95 ° C 30 sekuntia, pariutuminen 58 ° C: ssa 45 sekunnin ajan, ja pidennys 72 ° C: ssa 60 sekunnin ajan. PCR-fragmentti hajotettiin X-bal I ja Sai I ja insertoitiin pRRL-CMV lenti-virus plasmidin X-bal I ja Sai I -kohdan. Lenti-lusiferaasi (lenti-Luc) virusvektori pakattiin 293T-soluissa transfektoimalla Lenti-Luc ja pakkaus plasmidit (Invitrogen). 48 tunnin kuluttua transfektion jälkeen, supernatantit sisältävät lenti-Luc virus kerättiin. Sillä lenti-Luc virustransduktio, LLC-solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle ja lenti-virus sisältävät supernatantit lisättiin väliaineeseen (supernatantit: tuoretta elatusainetta = 1:01, noin 1 x 10

8 viruspartikkeleita /ml), kun läsnä polybreenin (8 ug /ml). Vakaa lusiferaasi-ilmentävän kloonin valittiin rajoitettu laimennus luoda Luc-LLC solulinjassa. Lusiferaasiaktiivisuutta Luc-LLC soluihin määritettiin lusiferaasianalyysissä käyttämällä lusiferaasia havaitseminen pakki (Beyotime) ja bioluminescent kuvantaminen (Berthold). Edelleen vertailut solujen kasvua, muuttoliikkeen ja kasvaimen muodostavien kyky LLC ja Luc-LLC-solut tehtiin MTT: llä, haavan paranemista ja ihonalainen kasvain malli arviointia, vastaavasti.

Eläinten Kasvainmalli ja hoito ryhmät

siirrostetaan kasvaimia, 2 x 10

6 Luc-LLC-solut suspendoitiin uudelleen 200 ui: aan seerumitonta DMEM-alustassa, ja injektoitiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen on 6-8 viikkoa vanhoja C57BL /6J-hiirissä. Viikon kuluttua Luc-LLC rokotus, tuumoreita kantavaa hiirtä jaettiin satunnaisesti seuraaviin ryhmiin (n = 8 ryhmää kohti), joka perustuu bioluminisenssimääri- jälkeen mitattu ensimmäisen kuvantamisen ja kasvaimia tilavuus oli noin 100 mm

3: (a) käsittelemätön kontrolli (200 ui PBS kolmesti viikossa injektiona vatsaonteloon); (B) VEGF-Trap yksinään (1 g /kg kolmesti viikossa ihonalainen injektio); (C) gemsitabiini yksin (60 mg /kg kolmesti viikossa vatsaontelon sisäisenä pistoksena); (D) VEGF-Trap /Gemsitabiinin yhdistelmä (VEGF-Trap 1 g /kg kolmesti viikossa injektiona ihon alle, ja gemsitabiinin 60 mg /kg kolmesti viikossa vatsaontelon sisäisenä pistoksena). Hoito jatkettiin 2 viikon välein. Kasvaimen koko seurattiin joka toinen päivä 15 päivän ajan mikrometrillä jälkeen hoidon aloittamisesta. Kasvaintilavuudet määritettiin käyttäen kaavaa: tilavuus (mm

3) =

×

b

2 x 0,5, jossa

on pitkä halkaisija ja

b

on lyhyt halkaisija kuten aikaisemmin on kuvattu [22]. Kaikki tiedot esitetään keskiarvoina ± SE. Hiiret altistettiin kuvantamisen päivänä 12 aloittamisen jälkeen hoidon. Päivänä 15 hoidon aloittamisen jälkeen, hiiret kaikissa ryhmissä tapettiin. Kasvaimet punnittiin ja kuvat otettiin avauksen jälkeen. Puolet kasvainkudoksen kiinnitettiin periodiitilla lysiiniä-paraformaldehydiä (PLP) ja O.C.T (Sakura Finetek) upotettu immunohistokemiaa. Toinen puoli oli snap-jäädytettiin nestetypessä ja varastoitiin -80 ° C: ssa. Survival käyräanalyysi tehtiin riippumaton hoitoryhmässä. Hiiren kuolema määritettiin käyttäen ennalta määrätty kriteeri.

Bioluminescence Imaging

in vivo

bioluminenssi kuvantaminen suoritettiin käyttäen eläimen kuvantamisjärjestelmä (Nightowl LB 983 Molecular Imaging System , Berthold). Hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti 150 mg /kg D-lusiferiini kaliumsuola (Etu Life Sciences) 200 ul: ssa DPBS: ssä. 5 minuutin jälkeen lusiferiini injektion jälkeen hiiret nukutettiin intraperitoneaalisella injektiolla pentobarbitaalilla (50 mg /kg). Kukin hiiri sijoitettiin vasemmalle sivusuunnassa makuuhaavojen asema ja digitaalinen harmaasävy eläin kuva otettiin, jonka jälkeen hankinnan ja peitto on pseudovärin kuva edustaa tasaisempaa jakautumista havaittu fotonien nousemassa aktiivinen lusiferaasin sisällä eläin. Altistusaika vaihteli 10-30 sekuntia, voimakkuudesta riippuen bioluminenssin emission kasvainsoluja. Fotonit lähtevä tietyille alueille kvantitoitiin käyttämällä Indigo ohjelmisto (Berthold). Kiinnostavat alueet (ROI) vedettiin ympärillä tuumorikohdat ja määrällisesti kuin fotoni impulssit sekuntia kohden.

immunohistokemia

Kasvaimen kudokset fiksoitiin PLP, upotettiin OCT, ja leikattiin 10 um: n leikkeiksi . Sitten leikkeet värjättiin spesifisten vasta-aineiden analyysia varten.

mikroverisuonitiheys analyysi kasvaimen leikkeet värjättiin rotan anti-hiiri-CD31-vasta-ainetta (BD Pharmingen) ja sen jälkeen FITC-konjugoitua kanin anti-rotta IgG: tä (Invitrogen ). Cellular tumat vastavärjättiin DAPI (Sigma-Aldrich). Määrällinen mikroverisuonitiheys (MVD) arvioitiin menetelmän mukaisesti ja Weidner et ai. [23]. Lyhyesti, leikkeet ensin seulottiin pienillä suurennoksilla (× 40 ja x 100) tunnistaa kaikkein verisuonten kasvaimen alueelle (hot spot). Sisällä hot spot-alue, värjätään pienten suonten laskettiin yhteen korkean tehon (x 400) kenttään. MVD ilmaistiin määrä pienten suonten /kenttä. Mitään CD31-värjättyä endoteelisoluja tai endoteelisolujen klustereita, jotka olivat selvästi erillään viereisen pienten verisuonten, kasvainsoluja, tai sidekudoksen elementtejä pidettiin yhdessä laskettavissa pienten suonten.

immunohistokemiallinen analyysi solujen lisääntymisen suoritettiin jäällä tuumorisektioiden rotan anti-hiiri-Ki-67-vasta-aine (Biolegend) ja sen jälkeen FITC-konjugoitua kanin anti-rotta IgG: tä (Invitrogen). Tulokset ilmaistiin prosentteina Ki-67-positiivisia soluja ± SEM per x 400 suurennus. Yhteensä kymmenen x 400 kentät tutkittiin ja laskettiin kolmesta kasvaimia kussakin hoitoryhmässä. Ki-67 leviämisen indeksi laskettiin seuraavalla kaavalla: määrä Ki-67-positiivisia soluja /solujen kokonaismäärään x 100%.

TUNEL Pitoisuus

In situ

havaitseminen apoptoottisten solujen kasvainkudoksessa suoritettiin terminaalin deoksinukleotidyylitransferaasin-välitteisen dUTP nick end merkintöjä (TUNEL) tekniikkaa käyttäen kaupallisesti saatavilla apoptoosin havaitsemiseen kit (Beyotime) seuraten valmistajan protokollaa. TUNEL positiivisia soluja 10 itsenäistä kentät kvantifioitiin manuaalisesti. Apoptoosi-indeksi laskettiin seuraavalla kaavalla: määrä apoptoottisten solujen /kokonaismäärä tumalliset solut x 100%.

Western blot -analyysi

Kasvain kudosten 15. päivänä hoidon aloittamisen jälkeen oli homogenisoitiin lyysipuskuria (RIPA) (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoksikolaatti, 1 mM PMSF, 10 mg /ml aprotiniini , 10 mg /ml leupeptiiniä) jäillä. Kun oli sentrifugoitu 14000 rpm: ssä 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan, supernatantit kerättiin ja kokonais-proteiinin konsentraatiot määritettiin BCA-määrityksellä (Pierce). Yhtä suuret määrät denaturoitua proteiinit ladattiin 10% SDS-PAGE geelillä ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Millipore). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa TBST (1 x TBS, joka sisälsi 0,1% Tween 20) ja inkuboitiin sitten anti-hiiri-ensisijainen vasta-aineita CyclinD1, Pro-Caspase-3, Bcl-2, MMP2 ja MMP9 (kaikki Santa Cruz Biotechnology) yön yli 4 ° C: ssa. Pestiin TBST kolme kertaa, HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet sitovat ja suoritettiin kemiluminesenssin avulla SuperSignal West Pico alustan (Pierce). Kaistaintensiteettejä kvantitoitiin käyttämällä Band Leader ohjelmistoa.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen merkittävyys määritettiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA tai opiskelijan

t

testi tarvittaessa.

*

P

0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä ja

**

P

0,01 olisivat tilastollisesti erittäin merkitsevä.

Tulokset

perustaminen LLC Kasvainmalli kanssa Stable lusiferaasiekspressio

paremmin seurata kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden

in vivo

rakensimme LLC solulinjoja vakaa lusiferaasiekspressio ja ihon alle ympättiin Luc-LLC-solut C57BL /6J-hiirissä. Kasvaimet mitattiin ja kuvattiin päivänä 7, 14 ja 21 tuumorin istuttamisen jälkeen. Kuten kuviossa 1A ja B, Luc-LLC kasvaimen kasvua visualisoitiin bioluminenssin kuvantamiseen ja fotoneja emittoituu tietyillä alueilla kvantitoitiin käyttäen Indigo-ohjelmisto, joka oli yhdenmukainen kasvaimen kasvukäyrä (kuvio 1C). Eroa ei ollut välillä Luc-LLC ja patentti LLC solu- morfologia, muuttoliike ja kasvu

in vitro

sekä kasvaimen muodostavan kyvyn

in vivo

(kuva S2). Erilainen kohtelu aikataulut olivat edustettuina kuvassa 1D.

(A) Bioluminescence kuvia LLC kasvainten päivänä 7, 14 ja 21 jälkeen Luc-LLC ihonalainen rokotus (n = 6); (B) mittaukset fotonien sekunnissa kuvaa kasvaimen tilavuutta hiirillä käyttäen Indigo kuvantamisen analyysin ohjelmisto,

*

P

0,05,

**

P

0,01

vs

päivä 7; (C) Kasvaimen kasvukäyrä päivä 5-25 jälkeen Luc-LLC ihonalainen rokotus (n = 6),

*

P

0,05,

**

P

0,01

vs

päivä 5; (D) Kaaviokuva kokeen protokolla on kuvattu materiaalit ja menetelmät, eläimet jaettiin neljään ryhmään: (a) valvonta; (B) VEGF-Trap yksin; (C) gemsitabiini yksin (D) yhdistelmä VEGF-trap ja gemsitabiini.

Effects of VEGF-trap in yhdessä gemsitabiinin on LLC Kasvaimet

tutkimiseksi terapeuttisia vaikutuksia yhdistelmähoidon VEGF-Trap ja gemsitabiinin kasvuun LLC kasvainten, C57BL /6-hiirillä, joilla on LLC kasvaimia jaettiin neljään hoitoryhmään, kuten edellä on kuvattu. VEGF-Trap valmistettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Puhdistettu VEGF-Trap näkyi yksittäisenä vyöhykkeenä, jonka näennäinen molekyylipaino on 50 kD (kuvio S1A) ja sillä oli voimakas sitoutumisaktiivisuus hiiren VEGF määritettynä suoran sitoutumisen määritys (kuvio S1B). Kun määrät kasvainten oli noin 100 mm

3, hoito aloitettiin. Päivänä 6 hoidon aloittamisesta, VEGF-Trap ja gemsitabiinin yhdistelmähoito osoitti merkittäviä estäviä vaikutuksia kasvaimen kasvuun verrattuna kontrolliryhmään. Vaikka VEGF-trap tai gemsitabiinin yksin myös merkitsevästi esti kasvaimen kasvua, yhdistelmähoito johti vakaampi eston kasvaimen kehitystä ja piti merkittävin viivästymistä kasvaimen kasvua määritettynä kasvaimen päivänä 9, 12 ja 15 hoidon aloittamisesta ( Kuva 2C,

P

0,01 verrattuna kontrolliryhmään). Bioluminenssi kuvantaminen analyysi LLC kasvainten päivänä 12 aloittamisen jälkeen hoidon vahvisti kasvaimen vastaisen vaikutuksen (kuvio 2A ja B). Merkittäviä eroja kasvaimen kokoa ja painoa nähtiin päivänä 15, kun hoito lopetettiin ja kasvaimet leikeltiin (kuvio 2D ja E). Mitään tilastollisesti merkitsevää eroa kasvaimen koon välillä havaittiin VEGF-trap ja gemsitabiinin monoterapiana ryhmiä. Siten yhdistelmähoito VEGF-trap ja gemsitabiinin lisääntynyt antituumoriteholla LLC kasvain malli. Samoin lisääntynyt tuumorin kasvun yhdistelmähoidossa käännettiin pidentynyt eläimen selviytymisen mukaan Kaplan-Meier-analyysi ja hiirillä, jotka saivat yhdistelmähoito pysyi 100% eloonjääneitä loppuun mennessä seurantajakso (kuvio 2F) .

(A) Bioluminescence kuvia ihonalaisen siirrostetun LLC kasvaimia päivänä 12 aloittamisen jälkeen hoidon; (B) kuvantaminen analyysi (fotonien sekunnissa) kuvaa kasvaimen tilavuutta hiirillä käyttäen Indigo kuvantamisen analyysi ohjelmistot; (C) Kasvaimen tilavuus laskettiin päivänä 3, 6, 9, 12,15 kuluttua hoidon aloittamisesta; (D) edustaja kasvain valokuvaa päivänä 15 aloittamisen jälkeen hoidon; (E) Kasvaimen painot mitattiin vuorokautena 15, jolloin kasvaimet kerättiin talteen; (F) Survival konstruoitiin mukaisesti Kaplan-Meier-analyysi. n = 8 kullekin ryhmälle, *

P

0,05, **

P

0,01

vs

kontrolliryhmässä.

esto tuumoriangiogeneesin ja Cell Proliferation

LLC kasvaimia kaikissa hoitoryhmissä kerättiin päivänä 15 aloittamisen jälkeen hoidon ja laadittiin immunehistochemistry tutkimusten kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. Angiogeneesi sisällä kasvainkudoksessa arvioitiin laskemalla mikroverisuonitiheys seuraavat immunohistokemiallisella värjäyksellä CD31. Käsittely VEGF-Trap tai yhdistelmähoidossa johti ilmeinen inhibitio angiogeneesi tuumoreissa verrattuna kontrolliryhmään. Keskimääräinen alus iskuina suuritehoisia kentän VEGF-trap tai yhdistelmä ryhmässä oli merkitsevästi alempi (

P

0,01) kuin kontrolliryhmässä (kuvio 3A ja B). Vaikka oli tilastollista merkittävyyttä mikroverisuonitiheys, huomasimme myös, että gemsitabiini-käsitellyt tuumorit osoittivat vahvempaa CD31-positiivinen alue kuin kasvaimia yhdistelmähoitoa saaneiden ryhmässä.

(A) edustaja kuvia CD31-positiivisten pienten suonten alue ja Ki67-positiivisten solujen elinkelpoiset LLC kasvain kudoksia 15. päivänä hoidon aloittamisen jälkeen arvioitiin immunohistokemiallisella värjäyksellä; (B) ja (C) mikroverisuonitiheys ja prosenttiosuus Ki67-positiivisten solujen määritettiin laskemalla positiivisen värjäytymisen per suuritehoisia kentän jaksossa, kuten kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät”. *

P

0,05, **

P

0,01

vs

kontrolliryhmässä. Mittakaava, 50 pm.

tarkastella solujen lisääntymistä kasvainkudoksissa hoidon jälkeen, pakastetut tuumorisektioiden värjättiin Ki-67-vasta-aineen ja Ki-67 leviämisen indeksi laskettiin perustuen immunohistokemiallinen analyysi. Ki-67 leviämisen indeksi osoitti 8-kertaisesti alentunut VEGF-trap ja gemsitabiinin yhdistelmä ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään (kuvio 3A ja C), mikä viittaa siihen, merkittävä suppressio kasvainsolujen proliferaatiota hoitoryhmissä.

kasvaimen solukuoleman

tutkimiseksi edelleen mekanismia yhdessä vaikutukset VEGF-Trap ja gemsitabiinin on LLC kasvaimia, eli TUNEL määritys suoritettiin tutkimaan tuumorisolujen apoptoosin. Kuten kuviossa 4A ja B, TUNEL määritys paljasti selvän kasvun apoptoosin kuluessa kasvaimen kudokset yhdistelmähoitoa saaneiden ryhmässä (

P

0,01), verrattuna muihin ryhmiin.

(A) Solujen apoptoosin arvioitiin TUNEL värjäys, edustaja osat LLC kasvain kudosten saatiin hiiristä päivänä 15 hoidon aloittamisen jälkeen; (B) apoptoottiset indeksi määritettiin kuvatulla tavalla ”Materiaalit ja menetelmät”. *

P

0,05, **

P

0,01

vs

kontrolliryhmässä. Mittakaava, 50 pm.

Down-regulation Expression of leviämisen, Anti-apoptoosin ja Invasion liittyvät proteiinit

Todettuaan muutoksia mikroverisuonitiheys, solujen lisääntymisen ja apoptoosin indeksi vastauksena VEGF-trap ja gemsitabiinin yhdistelmähoitoa, me vieressä pyrki tutkimaan mahdollinen mekanismi yhdistetyn havaitut vaikutukset kasvaimen mallissa

in vivo

arvioimalla ilmentymistä solujen lisääntymistä (sykliini D1), anti-apoptoosin ( pro-kaspaasi-3-, Bcl-2), ja invaasio (MMP2, MMP9), jotka liittyvät proteiinit käyttäen western blot. Vuonna otteita LLC kasvaimia 15. päivänä sen jälkeen, kun hoidon aloittamisesta, sykliini D1, prokaspaasia, Bcl-2, MMP2 ja MMP-9 ilmentyminen säädellä vähentävästi VEGF-trap ja gemsitabiinin yhdistelmän ryhmä verrattuna kontrolliryhmään (

P

0,01). Western blot Tulokset vahvistivat, että VEGF-Trap tai gemsitabiinin monoterapiana voisi alas-säädellä ilmentymistä kaikkien näiden proteiinien, mutta yhdistelmähoito parantaa entisestään näitä vaikutuksia (kuvio 5A ja B). Tämä data oli yhdenmukainen tulosten immunohistokemiallista analyysiä ja TUNEL-määritys (kuvio 3, kuvio 4).

(A) Western blot -analyysi osoitti, että VEGF-Trap yhdistettynä gemsitabiinin inhiboi ilmentymisen sykliini D1, Pro- kaspaasi 3, Bcl-2, MMP2 ja MMP-9 LLC kasvaimet; (B) kvantitointi proteiinin tasoja. p-aktiini toimi sisäisenä kontrollina. Densitometri kvanti- oli suhteessa ensimmäiseen datan asetettu kussakin tapauksessa (merkitty arvo 1). Kaikki tiedot edustavat vähintään kahdessa riippumattomassa kokeessa. *

P

0,05, **

P

0,01

vs

kontrolliryhmässä.

Keskustelu

Angiogeneesi on tiukasti säännelty prosessi, johon liittyy dynaaminen tasapaino stimuloivat että estävät signaalit. Angiogeneesi tapahtuu, kun tasapaino angiogeenisten yllykkeet ja estäjien kannattaa stimulaattoreiden [24]. Saarto avaimen angiogeenisten stimulaattori, VEGF, on tehokas keino estää angiogeneesiä eläinten kasvainten mallit [25], [26]. Kuitenkin anti-VEGF monoterapia on kliinistä hyötyä syöpäpotilaiden ja suuria annoksia voi usein johtaa erilaisiin haitallisia vaikutuksia, kuten kohonnut verenpaine, proteinuria, verisuonitukosten, ja GIP [27], [28]. Siksi lisätutkimuksia tarvitaan maksimoida antituumorivaikutuksen minimoiden määrä sivuvaikutuksia antiangiogeenisiä terapia.

Lisääntyvä tutkimusten mukaan yhdistelmä angiogeneesiestäjät kemoterapiaan tuotti parempia hoitotulosten vuonna syövän hoidossa [29] – [35]. Faasi III kliinisessä tutkimuksessa osoitti, että yhdistelmä anti-VEGF monoklonaalinen vasta-aine bevasitsumabi karboplatiinin-paklitakselin parantaa merkittävästi yleistä (OS) keuhkosyöpäpotilaiden verrattuna kemoterapiaa yksinään [36]. Näin ollen on kliinisesti merkityksellisiä tutkia enemmän yhdistelmät antiangiogeenisiä aineita ja Chemo hoito lisää hoitovaihtoehtoja.

Koska laaja käyttö gemsitabiinin hoidossa NSCLC, on tärkeää selvittää, onko yhdistelmä antiangiogeenisen aine gemsitabiinihoito voi tuottaa kliinistä hyötyä. Äskettäin III-vaiheen tutkimuksessa (turhaan tutkimus), jossa verrattiin bevasitsumabi plus sisplatiinin-gemsitabiinia ja chemocherapy (sisplatiini-gemsitabiinin) osoitti parannettu edistymistä elinaika, mutta ei eloonjäämiseen [37]. Se on edelleen haaste laajentaa yleistä elossaololuku päälle Gemsitabiinihoidon.

VEGF-Trap on kimeerinen VEGF valereseptori-Fc-fuusioproteiinin ja on äskettäin hyväksynyt Yhdysvaltain FDA metastasoituneen kolorektaalisyövän [12]. Verrattuna bevasitsumabia, VEGF-Trap on voimakkaampi angiogeneesinestäjän johtuen korkeammasta affiniteetti VEGF. Lisäksi VEGF-Trap voi myös estää PIGF, joka on myös pro-angiogeenisen tekijän. Siten, olisi mielenkiintoista arvioida, onko yhdistelmä VEGF-Trap ja gemsitabiini voi johtaa tehokkaammin hoito keuhkosyöpä.

Esillä olevassa tutkimuksessa olemme arveltu, että yhdistelmähoito, joka käsittää VEGF-Trap ja gemsitabiinin voisi saavuttaa parempi antituumorivaikutuksia. Tämän hypoteesin testaamiseksi, tutkimme terapeuttisia vaikutuksia tämän yhdistelmähoitoa LLC keuhkosyöpä malli. Tulokset osoittivat, että yhdistelmä hoito VEGF-trap ja gemsitabiinin antanut enemmän terapeuttisia hyötyjä kuin yksittäisiä modality. Yhdistelmähoito oli merkittävästi korkeammat estäviä vaikutuksia kasvaimen kasvuun ja pitkittynyt eloonjäämisaste, paitsi tuumorin angiogeneesin ja solujen lisääntymistä, mutta myös kasvava solujen apoptoosin kasvainkudosten sisällä.

tutkia mahdollisen mekanismin taustalla parannettu anti- kasvain tehoa VEGF-trap ja gemsitabiinin yhdistelmähoitoa, kasvainkudos uutteet tutkittiin western blottauksella proteiinin ilmentymisen. Tulokset osoittivat, että VEGF-trap tai gemsitabiinin yksin alassäädetty ilmaus leviämisen (sykliini D1), anti-apoptoosin (prokaspaasia 3, Bcl-2), ja invaasio (MMP2, MMP9) liittyviä proteiineja, mutta yhdistelmä hoito johti merkittävämpi alas-säätely nämä merkit verrattuna monoterapiaan ryhmiin. Tämä data oli yhdenmukainen tulosten immunohistokemiallista analyysiä ja TUNEL-määritys, joka tukee sitä ajatusta, että yhdistelmähoito VEGF-Trap ja gemsitabiinin voi parantaa kasvaimen vastainen teho.

korkea teho VEGF inhibition VEGF-Trap merkkeihin tämä aine ihanteellisen kumppanin yhdistelmänä lähestymistavoissa, joilla pyritään muita mekanismeja syövän etenemisen. Klinikoilla, VEGF-Trap hoito voi tarjota lisäetuja kautta normalisoitumista kasvaimen verisuoniston, mikä vähentää interstitiaalinen paineen ja alusten läpäisevyyttä, ja lisää sekä muiden aineiden kasvaimeen kudoksiin, mikä voi tehdä tuumorisolut herkempiä kemoterapiaa [38] – [40]. Yhdistelmä jatkuvan VEGF: n esto VEGF-Trap muiden hoitomuotojen voi edustaa enemmän optimaalinen terapeuttinen vaihtoehto useita kasvaintyypeissä.

tulokset viittaavat siihen, että yhdistelmä VEGF-Trap ja gemsitabiinin voisi olla enemmän tehokas vaihtoehto ihmisen keuhkosyöpä, joka voi muodostaa perustan perusteluna kliinisissä tutkimuksissa tutkia hyödyt yhdistelmähoidon VEGF-trap ja gemicitabine keuhkosyövässä.

Yhteenvetona yhdistelmähoitoa VEGF -Trap ja gemsitabiinin paransi antituumoriteholla LLC kasvain malli. Yhdistelmähoito esti kasvaimen kasvua ja pidentää eläinten eloonjääminen kautta esti tuumorin angiogeneesiä ja solujen lisääntymistä, sekä lisääntynyt kasvainsolujen apoptoosin. VEGF-Trap /gemsitabiini yhdistelmähoito saattaa aiheuttaa lupaava strategia ihmisen keuhkosyöpä.

tukeminen Information

Kuva S1.

laatu ja aktiivisuutta VEGF-Trap. (A) laatu VEGF-Trap määritettiin pelkistävällä SDS-PAGE osoittaa yhtenä vyöhykkeenä, jonka näennäinen molekyylipaino on 50 kD; (B) VEGF-Trap osoitti voimakas sitoutumisaktiivisuus hiiren VEGF vahvistettu sitoutumistestissä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0068589.s001

(TIFF)

Kuva S2.

vertailu biologisia ominaisuuksia LLC ja Luc-LLC soluissa. Solujen morfologia ja muuttoliike (A) kasvu (B), ja kasvaimen muodostavien kyky (C) LLC ja Luc-LLC solut suoritti haavojen paranemista, MTT-määritystä ja ihonalainen kasvain malli arviointi, vastaavasti, mikä osoitti eroa siirtogeenisiä ja ei-siirtogeenisten solujen. Mittakaava, 200 um.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0068589.s002

(TIFF) B

Kiitokset

Kiitämme Eli Lilly and Company Shanghaissa ystävällisesti tarjota gemsitabiini (Gemzar).