Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

aiemmin tunnistettu välisen assosiaation mismatch korjaus geeni,

MLH1

, promoottori SNP (rs1800734) ja mikrosatelliitti epävakaa (MSI-H) kolorektaalisyövissä (CRC) in kaksi näytettä. Nykyinen tutkimus laajeni tämän toteamuksen selvitimme geneettisen perustan DNA: n metylaation tällä alueella kromosomissa 3. Oletimme, että erityisiä polymorfismien

MLH1

geenialueen altistaa sen DNA: n metylaatio, jolloin menetys

MLH1

geeniekspressiota, epäsuhta-korjaus-toiminto, ja näin ollen genominlaajuisten Mikrosatelliittimarkkerien epävakautta.

Menetelmät /Principal havainnot

ensimmäinen testanneet hypoteesia yhtä näytettä Ontario (901 tapausta, 1097 tarkastukset) ja monistaa suuria löydökset kaksi lisänäytettä Newfoundlandista ja Labrador (479 tapausta, 336 valvonta) ja Seattle (591 tapausta, 629 valvonta). Logistinen regressio käytettiin testaamaan yhteydestä SNP alueella

MLH1

ja CRC, MSI-H CRC,

MLH1

geeniekspression CRC, ja DNA: n metylaatio CRC. Yhdistyksen välinen rs1800734 ja MSI-H CRC, aiemmin raportoitu Ontariossa ja Newfoundlandin, toistui Seattlen näytteessä. Kaksi muuta SNP, vahvassa kytkentäepätasapainossa rs1800734, osoitti vahvaa yhdistysten kanssa

MLH1

promoottori metylaatio, menetys MLH1 proteiinia, ja MSI-H CRC kaikissa kolmessa näytteessä. Logistinen regressiomalli MSI-H CRC, joka sisälsi

MLH1

-promoottorin-metylaatiostatuksen ja MLH1 immunohisotchemistry tila sopii useimpiin parsimoniously kaikissa kolmessa näytteessä yhdistettynä. Kun rs1800734 lisättiin tämän mallin, sen vaikutus ei ollut tilastollisesti merkitsevä (

P

-arvo = 0,72 vs. 2,3 × 10

-4 kun SNP tutkittiin yksinään).

johtopäätökset /merkitys

Havaittu yhdistys rs1800734 MSI-H CRC tapahtuu kautta sen vaikutus

MLH1

promoottori metylaatio, MLH1 IHC puutos, tai molempia.

Citation: Mrkonjic M, Roslin NM, Greenwood CM, Raptis S, Pollett A, Laird PW, et ai. (2010) Erityiset vaihtoehdot on MLH1 Gene alue voi Drive DNA metylaatio, Loss of Protein Expression, ja MSI-H peräsuolen syövän. PLoS ONE 5 (10): e13314. doi: 10,1371 /journal.pone.0013314

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 28 kesäkuu 2010; Hyväksytty: 15 syyskuu 2010; Julkaistu: 13 lokakuu 2010

Copyright: © 2010 Mrkonjic et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Team Grant Kanadan Institutes of Health Research (CIHR avustus CRT-43821 JM, BB, JK, SG, RG, PP ja bY). Lisäksi tämä työ tukivat National Cancer Institute, National Institutes of Health alle Request For Applications CA-95-011 ja sen kautta yhteistyösopimuksia jäsenten paksusuolen perheen rekisterin ja päätutkijat (U01 CA074783 myönnetään Ontario rekisterin Tutkimukset familial peräsuolen syövän, ja U24 CA074794 myönnetty Seattle peräsuolen syövän perhe Registry). A.D.P. ja N.R. tukee Genome Canada. A.D.P. omistaa Kanada Research Chair in Genetics of Complex Diseases. B.W.Z. ja T.J.H. vastaanottavat Vanhempi tutkija Awards päässä Ontario Institute for Cancer Research, kautta antelias tukea Ontario ministeriön tutkimus- ja innovaatio. Lisäksi tämä tuettiin osittain American Institute for Cancer Research myöntää 99B055 (B. B. ja J.K.). M.M. on Research Student Kanadan Cancer Society kautta palkinnon National Cancer Institute of Canada (018668). M.M. tuki myös jatko stipendi päässä Team Monitieteisen tutkimus peräsuolen syövän rahoituksella Kanadan Institutes of Health Research (CIHR) ja Samuel Lunenfeld Research Institute. Kaikki kirjoittajat oli täyden vastuun tutkimuksen suunnittelu, tietojen keruuta, analysointia ja tietojen tulkinta, päätös jättää käsikirjoituksen julkaistavaksi, ja kirjoittaminen käsikirjoituksen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on neljänneksi yleisin syöpä, ja toiseksi suurin syy syöpään liittyvien kuolemien Pohjois-Amerikassa [1]. CRC voidaan parsimoniously jakaa kahteen pääryhmään määritelty geneettinen reittejä mukana. Vaimennin polku, havaittiin 80% CRC tapauksissa sisältää poikkeavuuksia APC /siivetön signalointireitin ja on ominaista usein somaattisten mutaatioiden onkogeenien ja Heterotsygotian menetys kasvainten synnyssä, kromosomi epävakautta, ja mikrosatelliitti vakaa (MSS) kasvaimia. Mutaattorikannasta polku, toisaalta, osuus ~15-20% CRC tapauksissa ja poikkeama johtuu epäsuhta-korjaus (MMR) järjestelmä, joka johtaa genominlaajuisten mikrosatelliittien epävakaus (MSI) [2], [ ,,,0],3]. MSI kasvaimet ovat viittaavia tekijöitä erilliset MSS kasvaimia että niillä on taipumus esiintyy useammin proksimaalisessa paksusuolessa, on mucinous histologia, kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä, huono erilaistumista ja Crohnin kaltainen reaktio [4]. CRC voidaan myös luokitella perustuu epigeneettisellä epävakaan CpG Island Methylator Fenotyyppikuvaus (CIMP) -positiivinen ja CIMP-syöpäkasvain [5]. CIMP-positiivinen CRC kasvaimia voidaan myöhemmin jakaa kahteen ryhmään, joka on yleisempää CIMP1 kasvaimia, jotka ovat MSI-H takia

MLH1

promoottorin metylaation, ja CIMP2 kasvaimia, jotka ovat MSS [5]. Noin 80-90% satunnaisessa MSI CRC näytteille menetys MMR toiminnon takia

MLH1

promoottori metylaatio [6], [7]. Mahdollinen mekanismi, jonka

MLH1

on epigeneettiseltä vaiennetaan on epäselvä.

aikaisemman työn tavoitteena oli valaista roolia paneelin SNP MMR geenien CRC. Mukana tässä paneelissa oli

MLH1

-93G Promoottori polymorfismi (rs1800734), ja havaitsimme sen yhdessä MSI-H kasvaimia kaksi näytettä Kanadan maakuntien Ontario ja Newfoundlandin ja Labradorin [8]. Useissa tutkimuksissa vahvistettiin myöhemmin ja laajentaneet meidän havainnoista ja huomannut assosiaatioita

MLH1

-93G polymorfismi ja

MLH1

promoottori metylaation CIMP CRC sekä MLH1 IHC puutos [9] , [10], [11]. Ei kuitenkaan ennustava malli on ehdotettu kuvaamaan tällaisia ​​löydöksiä. Yhdistys välinen

MLH1

promoottori polymorfismi (rs1800734) ja metylaatio saattaa osoittaa sekvenssispesifisyytensä DNA: n metylaatio.

Oletimme vaiheittainen eteneminen MSI-H CRC perustuva geneettinen alttius DNA: n metylaatio johtavan että

MLH1

geenien ja microsatellite epävakaus (kuvio 1). Edelleen, me arveltu, että

MLH1

-93G polymorfismi voi olla vahva kytkentäepätasapainossa (LD) ja muita muunnelmia, ja että yksi tai useampi näistä varianttien altistaa alueen metylointi, joka sitten johtaa menetykseen on

MLH1

geenien ilmentyminen ja viallisen MMR järjestelmä, joka johtaa mikrosatelliittien epävakautta. Olemme sitoutuneet populaation lähestymistapaa käyttäen kolmea riippumatonta näytettä. Tässä tutkimuksessa käytettiin ainutlaatuisen yhdistelmän geneettisen epidemiologian ja toiminnallisia strategioita tunnistaa ja kuvata alleelien että on rooli muuttamiseksi CRC kehityksen tärkeä ja yhteinen alaryhmä tapauksista.

Erityisiä SNP altistaa alueella, mukaan lukien

MLH1

-geenin promoottori, ja metylointi, joka johtaa promoottorin hiljentämisen ja menetys

MLH1

geenin ilmentymisen, joka mitataan immunohistokemiallisella värjäyksellä. Menetys

MLH1

geeniekspression johtaa genominlaajuisten mikrosatelliittien epävakautta ja MSI-H peräsuolen syövän.

Materiaalit ja menetelmät

SNP valintaperusteet

polymorfismit analysoidaan 5′-nukleaasin määritys tässä tutkimuksessa valittiin sen perusteella, laajasta tietokannasta ja kirjallisuudesta hakuja, kuten on kuvattu aiemmin [8], [12]. 500 kb kromosomin alueen 3 ympäröivän

MLH1

oli genotyyppi kaikille saataville polymorfismien yhdistelmästä Affymetrix GeneChip- Ihmisen Mapping 100K ja 500K alustoille. Lisäksi valitsimme SNP alueella kohteisiin, jotka ovat vahvoja LD kanssa rs1800734 vuonna HapMap data (release 27 CEU väestöstä), julkisesti saatavilla osoitteessa https://www.hapmap.org. Kaksi tällaista SNP tunnistettiin ja otettiin myös.

Tutkimus aiheet

Olemme suorittaneet tässä tutkimuksessa aiheita kolmella eri paikkakunnalla: Ontarion provinssin, maakunnassa Newfoundland ja Labrador (jäljempänä kuten Newfoundland), ja Seattlen pääkaupunkiseudulla. Kaikissa paikoissa, vain yksilöiden yhden kasvain oli mukana. CRC potilaiden ja terveiden kontrollien Ontario ja Newfoundlandin kertyivät kuten aiemmin on kuvattu [8], [12]. Lyhyesti, Ontario 1004 CRC potilasta ja 1957 verrokkia tunnistetaan Ontario Familial peräsuolen syövän Registry (OFCCR) [13]. Jotta minimoida väestön kerrostuminen me suljettiin pois analyyseista tapauksista, jotka olivat ei-valkoisia ja ne, jotka eivät ilmoittaneet etnisyys. Niistä 1004 tapauksessa potilaita, 929 olivat valkoiset. Ei aiheeseen liittyviä tapauksia käytettiin tutkimuksessa. Edelleen, me sulkea pois kaikki CRC potilaalla tiedetään MMR ituradan geenimutaatioita (11 tapausta, joiden tiedetään mutaatio MLH1, 10 MSH2, ja yksi MSH6) ja kaikki CRC tapaukset, jotka olivat puutteelliset yksi MMR proteiinien muu kuin MLH1 ( 14 MSH2 /MSH6 IHC puutteellinen kasvaimia). 901 CRC Potilaille ja muodostavat Ontario tapauksissa. Kaikki potilaan tiedot sekä veren ja kudosnäytteet saatiin kuten aiemmin [8].

Yhteensä 1957 verrokeilla välillä Ontario suostui osallistumaan tutkimukseen ja suorittanut kaikki kolme kyselylomaketta (perhe, henkilökohtainen, ja ruokavalio kyselyt). Vuoden 1957, 1314 tarkastuksia edellyttäen verinäytteitä, ja 1097 ne olivat valkoisia. Nämä 1097 verrokeilla onnistuneesti genotyypitetty ja täten muodosti Ontario valvontaa. Noin 21% on OFCCR tapauksista ja 12% valvonnan on ensimmäisen asteen sukulaisia ​​vaikuttaa kanssa CRC.

suoriteperusteinen kuvio seuraa Newfoundlandin Familial peräsuolen syövän Registry (NFCCR) oli samanlainen kuin seuraa OFCCR. Potilaat, joilla on CRC tunnistettiin Newfoundlandin kasvain rekisterissä; 1144 CRC potilaita tunnistettiin, joista 747 vastasi suvussa kyselyyn ja 555 edellyttäen verinäytteet; 490 edellyttäen etnisyys tietoa ja luokiteltiin valkoisina. Ei aiheeseen liittyviä tapauksia käytettiin tutkimuksessa. Neljä CRC tapauksissa tiedetään ituradan mutaatioita MSH2 suljettiin, koska oli 11 ei-MLH1 MPR IHC puutteellinen tapauksissa (5 MSH2, 5 MSH6, ja 1 PMS2 puutos). Loput 479 CRC potilaat muodostavat Newfoundlandin tapauksissa.

Newfoundland valvonta rekrytoitiin käyttämällä satunnaisia ​​numeroinen numerot, ja sovitettu tapauksiin sukupuolen ja 5-vuotiaiden ikäryhmässä; 1602 valvonta suostunut osallistumaan, joista 336, tässä vaiheessa tehnyt kaikki kolme kyselylomaketta ja tarjotaan verinäytteitä. Ei aiheeseen liittyviä tarkastuksia käytettiin tutkimuksessa. Noin 31% NFCCR tapauksista ja 18% valvonnan oli ensimmäisen asteen sukulaisia ​​vaikuttaa kanssa CRC.

Seattle, tapaukset ja verrokit rekrytoitaville Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) kuten aiemmin on kuvattu [14] . Lyhyesti, CRC potilasta, joilla oli diagnosoitu vuotiaita 20 ja 74 vuotta Washington King, Snohomish, tai Pierce läänien välillä tammikuuta 1998 ja kesäkuu 2002 otettiin yhteyttä. Kaikki CRC tapaukset olivat mukana riippumatta suvussa. Niistä 1814 tapauksissa ja 1531 tarkastukset, jotka ovat suorittaneet kaksi kyselyä, 1497 tapauksia ja 745 valvontaa lahjoitti verinäytteestä. Tätä tutkimusta varten saimme DNA-näytteiden 668 CRC tapauksissa ja 667 valvontaa valkoihoisia etnisyys. Viisitoista MMR IHC puutteellinen CRC tapaukset jätettiin (10 MSH2, 1 MSH6, ja 4 PMS2 puutos). Ei aiheeseen liittyviä tapauksia tai verrokkia käytettiin tutkimuksessa. Noin 14%: FHCRC tapauksista ja 8% valvonnan oli ensimmäisen asteen sukulaisia ​​vaikuttaa kanssa CRC.

Data kerättiin ikä diagnoosin (tapauksista), ikä loppuun suvussa kyselylomakkeen, kasvain sijainti, kasvain vaiheessa ja kasvaimen, jos saatavilla, arvioimalla patologisten ja /tai kirurgisen raportteja. Kasvaimet lavastettuja ja porrastettu menetelmän amerikkalaisen sekakomitean Cancer [15]. Veri ja kudosnäytteitä saatiin heti tietoisen kirjallisen suostumuksensa osallistua tutkimukseen, koska kohti protokollia hyväksymä tutkimuseettisen laudat Mount Sinai Hospital, University of Toronto, Memorial University of Newfoundland, ja Fred Hutchinson Cancer Research Centerissä.

Molecular Genetic Analysis

yhden emäksen monimuotoisuus genotyypin määritys.

Perifeerisen veren lymfosyytit eristettiin kokoverestä käyttämällä Ficoll-Paque gradienttisentrifugoinnilla mukaan valmistajan (Amersham Biosciences, Baie d ”Urfé, Quebec, Kanada). Fenoli-kloroformilla tai Qiagen DNA (Qiagen Inc., Montgomery Co., MD) käytetään erottamaan genomista DNA: ta lymfosyyttejä. Fluorogeenisen 5′-nukleaasin polymeraasiketjureaktiolla määrityksessä tai TaqMan-määritys [16] käytettiin genotyypin kutakin seuraavista viidestä SNP-kohdista:

MLH1

-93G A (rs1800734), I219V (rs1799977), IVS14-19A G (rs9876116),

LRRFIP2

intronin 26 IVS26-18T C (rs749072),

LBA1

intronin 8 (rs4431050), ja geenien välinen rs13098279. Sekvenssit alukkeiden ja koettimien sekä master reaktioseokset rs1800734, rs1799977, ja rs9876116 kuvattiin aiemmin [8].

LRRFIP2

rs749072,

LBA1

rs4431050, ja geenien välinen rs13098279 polymorfismit olivat genotyypitettiin käyttämällä Eurogentec qtPCR kit (Eurogentec, San Diego, CA) [8]. Sekvenssit alukkeiden ja koettimien rs749072, rs13098279, ja rs4431050 annetaan Täydentävä File S4.

SNP sijaitsee 500 kb kromosomin alueen 3 ympäröivä

MLH1

geeni genotyypattiin vuonna Ontario näytteiden avulla Affymetrix GeneChip- Human Mapping 100K ja 500K alustoja osana riskinarvioinnissa Kolorektaalituumorien Kanadassa (ARCTIC) hanke, kuvattu aiemmin [17]. 94 SNP 500 kb alueelle, lisäksi 5 SNP genotyypitettiin TaqMan, genotyypattiin varten Ontario näytteet kattavat seuraavat geenit:

DCLK3

,

LBA1

,

EPM2AIP1

,

MLH1

,

LRRFIP2

, ja

GOLGA4

. Luettelo SNP genotyyppi varten Ontario näytteiden annetaan Täydentävä File S1. Newfoundlandin ja Seattle näytteet genotyyppi käyttäen Illumina IValitse 500K Chip alustalla. Yhteensä 16 SNP tällä alueella genotyypattiin lukien rs1800734, rs749072, ja rs13098279. Newfoundlandin Näytteet edelleen tunnettu kolmen polymorfismien: rs1799977 ja rs9876116 genotyyppi aiemmin [8], ja

LBA1

rs4431050. Rs1800734 SNP genotyyppi Sekä Affymetrix Chips ja Taqman alustojen Ontariossa ja käytettiin vahvistamaan genotyypitys puhelut. Out of 1884 näytteiden genotyyppi kummankin menetelmillä oli 11 ristiriitaisia ​​puhelut (0,58%, täydentävä File S1).

laadunvalvonta tehtiin genotyypin kuten aiemmin on kuvattu [17]. Lyhyesti, SNP jätettiin data-analyysi, jos alaikäinen alleelin frekvenssi oli alle 1% ja puhelu oli alle 87% kontrollien kunkin kolmen tutkimuksen keskuksissa. Lisäksi SNP jätettiin jos

P

-arvo peräisin testi Hardy-Weinberg tasapaino oli alle 10

-4 kontrolleissa. Yksilöt jätettiin jos genotyypityksen puhelu oli alle 87%.

Kasvain Mikrosatelliittimarkkerien Epävakaus analyysi.

Kasvaimen MSI-analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [18]. Lyhyesti, paraffiiniin upotetut peräsuolen kasvain ja vastaaviin normaaleihin paksusuolen kudosta potilailla, joilla on tapaus tapauksissa CRC microdissected alueilla, joissa on enemmän kuin 70% soluihin. PCR DNA CRC kasvain ja vastaaviin normaaleihin paksusuolen kudosta käytettiin luomaan ja vertaa MSI kuvioita. MSI analyysi suoritettiin vähintään viisi mikrosatelliittimarkkerin paneelista 10 mikrosatelliittimarkkerin, suosittelema National Cancer Institute [19]. MSI asema nimitettiin MSI korkea (MSI-H, ≥30% epävakaa markkereita kaikkien markkereita testattu), MSI alhainen (MSI-L, 30% markkereita epävakaa), tai mikrosatelliitti vakaa (MSS, ei epävakaa markkereita) suositusten [19]. Analyysissä, MSI-L ja MSS ryhmät yhdistettiin yhdeksi ryhmäksi (jäljempänä ’MSS /L ”). Alukkeet saatiin yhtiöstä Applied Biosystems (Foster City, CA), ja alukesekvenssit on kuvattu aiemmin [8].

MMR Protein immunohistokemiallinen värjäys

Formaliinifiksoidusta, parafiiniin upotetut CRC kudoksia, kerättiin diagnostisiin tarkoitukseen, leikattiin 4 um parafiini ja nesteytyksestä on alkoholin ja ksyleenin immunohistokemiallista analyysiä MLH1 kuten aiemmin on kuvattu [20], [21]. Sen jälkeen nesteytys, levyt sijoitettiin joko painekeitin tai mikroaaltouuni antigeeni haun keskipitkän (10 mmol /l sitraattipuskurissa pH: ssa 6,0 3 minuuttia 115 ° C: MICROMED T /T Mega; Hacker Instruments Industries, Inc., Fairfield , NJ). Proteiini esto (20%) ja avidiinin käytetään estämään ei-spesifinen sitoutuminen (Signet Laboratories, Inc., Dedham, MA). Sen jälkeen, kun levyjä pestiin PBS: ssä, leikkeitä inkuboitiin hiiren vasta-ainetta vastaan ​​MLH1 (1:40, G168-728, PharMingen, San Diego, CA), MSH2 (1:100, FE 11, Oncogene Research Products, Cambridge, MA ), MSH6 (1:100, 44, BD Transduction Laboratories, Mississauga, Ontario, Kanada), tai PMS2 (1:50; BD Biosciences Pharmingen, Mississauga, Ontario, Canada) 1 tunti. Sitten vasta- aineet havaittiin käyttämällä avidiini-biotiini: 3,3′-diaminobentsidiini tetrakloridi käytettiin kromogeeni ja hematoksyliinillä counterstaining.

MLH1 Promoottori metylointi Analyysi

MLH1

promoottori metylaatio analysoitiin MethyLightTM [22], [23]. Kasvain DNA käytettävissä tapauksista oli asetettu natriumbisulfiitin muuntaminen käyttäen EZ DNA Metylointi Gold Kit (Zymo Research, Orange, CA) kohden valmistajan suositusten mukaisesti.

MethyLightTM analyysi

MLH1

promoottori suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [23]. Alu-C4-ohjaus reaktiota käytettiin normalisoimaan vetysulfiitilla muunnetun input DNA [23]. Näytteet luokiteltiin positiivisiksi

MLH1

promoottori metylaatio jos prosenttia metyloitu viite (PMR) ≥10, kuten aiemmin on kuvattu [23]. Aluke ja koetin sekvenssit

MLH1

ja Alu-C4, sekä reaaliaikainen PCR-ohjelma MethyLightTM analyysi on aiemmin raportoitu [23]. Kaikki määritykset suoritettiin 96-kuoppaisilla polypropyleenilevyillä (Axygen Scientific, Union City, CA) ja tulokset analysoitiin käyttämällä ABI 7500HT Real-Time PCR instrumentti ja sen ohjelmiston, SDS versio 2.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Riippumatonta laadunvalvontaa varten MLH1 promoottori metylointianalyysi tehtiin ulkoisesti 15% Ontarion näytteistä.

Tilastollinen analyysi

Jokainen seuraavat tulokset testattiin yhdessä kunkin SNP logistisen regressiomallin: paksusuoli syöpä (kaikki CRC tapausta vs. kontrollit), metylointi (

MLH1

denaturoidulla kasvaimia vs. ei-metyloitu kasvaimet), IHC (MLH1 IHC-puutosta vs. taitavia kasvaimet), ja MSI (MSI-H vs. MSS /L kasvaimet) käyttämällä lisäainetta koodaus genotyyppien kullekin SNP. Sex ja ikä tentti, kerätään potilaiden ja terveiden valvontaa, käytettiin covariates kun CRC oli tulos, kun taas sukupuolen ja iän diagnoosin (käytettävissä potilaille vain) käytettiin malleissa muiden tulosten. Analyysi erillisten mallien kolmen keräyspaikat ja yhdistetty aineisto tehtiin. Analyysissä yhdistetyn datan, site sisällytettiin kovariaattina.

Useita logistista regressiomallia MSI tila arvioitiin myös osajoukon tietojen joissa ei ollut puuttuvia arvoja kaikki muuttujat mukana malleissa (ikä, MSI, IHC, metylaatio, ja kolme SNP). MSI tila oli taantunut yhdistelmiin IHC, metylaation ja SNP, kunkin kolmen SNP, joka osoitti yhdistysten alkuperäisessä logistinen regressio malleja. Koska otokset ovat pieniä, erityisesti Seattlessa, regressio suoritettiin kaikilla näytteillä yhdistetty, kun käytät kovariaattina rekrytoinnin sijainti. Voit tarkistaa saatujen tulosten johdonmukaisuus, mallien ajettiin myös kunkin näytteen erikseen. Johtuen vahvan yhteyden MSI, IHC, ja metylaation ja lähes täydellinen erottaminen, suurin rangaistaan ​​todennäköisyys käytettiin tuottamaan äärellinen parametriestimaatit [24]. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin R 2.7.0 (https://www.R-project.org).

Jotta kontrolloida vaikutuksen useiden testaus, tehokas määrä testejä arvioitiin varten Ontario , Seattle ja Newfoundlandin, perustuu menettelyyn, Li ja Ji [25]. Tämä menettely käyttää spektrin hajoamista havaittu korrelaatio SNP: iden lukumäärän arvioimiseksi täysin ja osittain korreloivat testit. Niinpä hallita tyypin I virhe, nimellinen merkitsevyystasolla 0,05 säädetään arvioitu tehokas useita testejä käyttäen tavanomaista Bonferronin menettelyä. Spektrin hajoaminen suoritettiin käyttäen modifioitua skriptejä kotisivulta Dale Nyholt (https://gump.qimr.edu.au/general/daleN/SNPSpD 4. heinäkuuta 2005), sekä GOLD 1.1.0 [26] ja R 2.7.0 (https://www.R-project.org).

tulokset

genotyyppi 901 tapausta ja 1097 tarkastuksia Ontariosta 99 SNP 500 kb kromosomin alueen 3 ympäröivä

MLH1

geenin (kuva 2).

yhteensä 99 polymorfismien tutkittiin Ontario näytteet poikki 500kb kromosomin alueen 3 ympäröivä

MLH1

geeni. Geenit tällä alueella on kuvattu (yläpaneeli) yhdessä niiden transkription suuntaavuus (alapaneeli). Kolme polymorfismit kohteita on merkitty. Muokattu Ensembl (www.ensembl.org).

Poistimme 25 SNP vuoksi laadunvalvonta kysymyksiä: vähäinen alleelifrekvensseiltään 1% (22), soita asti 87% (1) tai Hardy-Weinberg

P

-arvo 10

-4 (2), jolloin 74 analysoitiin SNP. Sitten seulotaan Newfoundlandin (479 tapausta ja 336 tarkastukset) ja Seattle (591 tapausta ja 629 kontrollit) näytteitä 19 ja 16 SNP kiinnostavat, tässä järjestyksessä. Kaikki merkkiaineiden Newfoundlandin ja Seattle näytteiden läpäissyt laadunvalvontaa suodattimia. Kasvaimen mikrosatelliittimarkkereita epävakaus arvioitiin 744 Ontario, 463 Newfoundland, ja 487 Seattle tapauksissa. MLH1 IHC värjäys toteutettujen 709 Ontario, 462 Newfoundland, ja 517 Seattle tapauksissa ja

MLH1

promoottori metylointianalyysi suoritettiin 569 Ontario, 468 Newfoundland, ja 210 Seattle tapauksissa. Ominaisuudet kaikkien kolmen näytteen populaatioiden on yhteenveto taulukossa 1. Yleinen kliininen ja patologinen piirteet CRC meidän koko tapaus väestön olivat samanlaisia ​​kuin asiassa populaatioiden käytetään useita logistinen regressio malleja, lukuun ottamatta Seattlessa, jossa oli harhaa kohti MSI-H kasvaimet (ja vastaavasti IHC-puutosta kasvaimia). Luettelo kaikista polymorfismien genotyypitetty annetaan Täydentävä File S1. Spectral hajoaminen paljasti, että testaaminen 74 SNP Ontario näytteissä vastasi 28 tehokasta testejä; siten, yhdistys

P

-arvoja verrattiin kriittisen kynnyksen

P

= 0,0018, ohjaamaan kokeilu-viisasta merkitsevyystasolla 5%. Sillä Newfoundlandin tietojen analysointi 19 SNP muodostivat 8 tehokas testit (

P

-arvo kynnys = 0,0063), ja Seattlen datan 16 SNP vastasi 6 tehokkaan testit (

P

-arvon kynnys = 0,0083).

ensimmäinen testattu yhteydestä kunkin SNP ja riski CRC (vs. kontrollit), MSI-H CRC (vs. MSS /L CRC), MLH1 IHC-puutteellinen CRC (vs. MLH1 IHC-positiivinen), ja

MLH1

promoottori metylaatio (vs. metyloimaton

MLH1

promoottori) (täydentävä File S2). Kaksi SNP tilastollisesti merkitsevästi liittyy lisääntynyt riski CRC Ontario: rs931913 (

P

= 0,001) ja rs4624519 (

P

= 0,005).

Kolme uutta SNP oli merkitsevästi liittyy lisääntynyt riski MSI-H CRC, MLH1 IHC puutteesta CRC, ja

MLH1

promoottori metyloituja CRC Ontario (varten rs1800734

P

= 0,005,

P

= 0,04, ja

P

= 0,018 vastaavasti, sillä rs749072

P

= 3,0 × 10

-4,

P

= 0,011, ja

P

= 0,003 vastaavasti, ja rs13098279

P

= 0,017,

P

= 0,090, ja

P

= 0,037 vastaavasti; täydentävä File S2). Tutkimme nämä havainnot kahdessa muiden näytteiden sillä rs1800734 Newfoundlandissa,

P

= 8,53 x 10

-5, 1,92 x 10

-5, ja 8,95 x 10

-7 MSI-H, MLH1 IHC-puutos, ja

MLH1

promoottori metylaatio vastaavasti ja, Seattle,

P

= 0,08,

P

= 0,02, ja

P

= 0,04 vastaavasti; for rs749072 Newfoundlandissa,

P

= 0,001,

P

= 2,4 × 10

-4,

P

= 6,65 x 10

-6 vastaavasti ja , Seattle,

P

= 0,03,

P

= 0,004, ja

P

= 0,014 vastaavasti; for rs13098279 Newfoundlandissa,

P

= 4,5 × 10

-4,

P

= 4,30 x 10

-5, ja 1,98 x 10

-6 vastaavasti ja , Seattle,

P

= 0,24,

P

= 0,07, ja

P

= 0,14 vastaavasti. Katso Täydentävä File S2. Yksikään kolmesta jälkimmäisen SNP liittyivät merkittävällä tavalla yleisen riski CRC Kolmen näytteen tutkittu (Täydentävä File S2). Nämä kolme SNP span 197,5 kb alueen rs1800734 sijaitsee

MLH1

promoottori, 93 nukleotidia ylävirtaan translaation aloituspaikasta; rs749072 sijaitsee intronin 26

LRRFIP2

(IVS26-18T C); ja rs13098279 välissä

LRRFIP2

ja

GOLGA4

(kuva 2). Kaikki kolme SNP: t ovat voimakkaassa kytkentäepätasapainossa vuonna Ontario valvonta (pareittain

r

2

0,73,

D

’ 0,98). Pairwise

D

’ja

r

2

kaikkien SNP genotyyppi Ontariossa verrokkeihin esitetään Täydentävät kuvissa S1 ja S2.

analyysi kaikkien kolmen näytteen yhdistettynä paljasti vahva yhdistysten välillä rs749072 ja alentuneeseen

MLH1

-promoottorin-metyloitu CRC (

P

= 3.80 x 10

-6 TAI yhteisen alleelin = 0,45, CI = 0,34 -0,60); kohonnut MLH1-proteiinia ilmentäviä CRC mitattuna IHC värjäytymistä (

P

= 3,99 x 10

-7 TAI yhteisen alleelin = 1,87, CI = 1,47-2,39); ja alentuneeseen MSI-H CRC (

P

= 2,50 x 10

-7 TAI yhteisen alleelin = 0,55, CI = 0,44-0,69). Koska kaksi muuta SNP (rs1800734 ja rs13098279) ovat vahvoja kytkentäepätasapainossa rs749072, analyysit näistä SNP tulokset olivat samanlaiset (taulukko 2).

Jotta tutkia nämä SNP liittyivät polku, että me arveltu (kuvio 1), seuraavan kerran luoneet logistista regressiomallia MSI-H vs. ei-MSI-H CRC yhdistetyn aineisto (täydentävä File S3). Me mallinnettu MSI-H funktiona kunkin ylävirran ennustavat, sekä yhdistelmät ennustavia: ensimmäisen MLH1 IHC asema; sitten

MLH1

-promoottorin-metylaatiostatuksen; SNP; molemmat MLH1 IHC tila ja

MLH1

promoottori metylaatiostatuksen; ja lopuksi MLH1 IHC tila,

MLH1

-promoottorin-metylaatiostatuksen ja kunkin SNP (taulukko 3). MLH1 IHC tila yksinään oli vahva ennustaja MSI-H CRC (

P

= 2,08 x 10

-30) kuten oli

MLH1

-promoottorin-metylaatiostatuksen (

P

= 1,33 x 10

-44) varten SNP Mielenkiintoinen paikka (rs1800734,

P

= 2,30 x 10

-4, sillä rs749072

P

= 1.36 × 10

-5, ja rs13098279

P

= 5.10 x 10

-3). Malli, jossa MLH1 IHC asema ja

MLH1

-promoottorin-metylaatiostatuksen antoi pienin Akaike Information Criterion (AIC) (225,12) ja lisäämällä rs13098279 johti toiseksi parsimonious malli (AIC = 225,94) (taulukko 3 ). Mallissa kanssa MLH1 IHC asema ja

MLH1

-promoottorin-metylaatiostatuksen, molemmat muuttujat olivat tilastollisesti merkitseviä, kuten SNP mallissa, jossa se oli ainoa ennustaja. Kuitenkin, kun SNP kiinnostava lisättiin malliin MLH1 IHC asema ja

MLH1

-promoottorin-metylaatiostatuksen, SNP enää edelleen tilastollisesti merkitsevä:

P

-arvon päässä testi merkitys rs1800734 muuttunut 2,30 x 10

-4 kun se oli ainoa ennustaja, 0,72 kun SNP,

MLH1

promoottori metylaatiostatuksen ja MLH1 IHC tila oli ennustajia; for rs749072, alkaen 1,36 x 10

-5-+0,98; ja rs13098279, 0,005-0,29 (taulukko 3). Kaikkein parsimonious malli, rekrytointi keskus ei ollut merkittävää vaikutusta mallin (

P

≥0.26, täydentävä File S3).

arvioidaan samalla malleja sijainti erityisiä aineistoja ja tulokset olivat yhdenmukaisia ​​yhdistetyn tuloksiin (täydentävä File S3). MLH1 IHC tila,

MLH1

promoottori metylaatiostatuksen, ja SNP kiinnostava olivat kaikki vahvoja ennustavat kasvain MSI-H tila. Malli, joka sisälsi MLH1 IHC tila ja

MLH1

-promoottorin-metylaatiostatuksen antoi pienin AIC kaikissa kolmessa näytteessä. Lisääminen tahansa kolmesta SNP ei johtanut merkittävästi parempi malli sovi (Täydentävä File S3).

Keskustelu

Tämä laajamittainen monikeskustutkimus tarkasteltiin ituradan DNA-markkereita ja niiden maksut somaattisten tapahtumia, erityisesti alttius DNA: n metylaation CRC. Kolmessa riippumatonta näytettä, kolme polymorfismit, rs1800734, rs749072, ja rs13098279 liittyi

MLH1

-promoottorin-metylaatiostatuksen aiheuttaen MLH1 proteiinin ja microsatellite epävakautta. Vaikka nämä kolme merkkiä eivät liity lisääntymiseen riski CRC yleistä, he eivät osansa peräsuolen tuumorigeneesiä alaryhmässä kulutustarviketta, joka näyttää genominlaajuisten microsatellite epävakautta. Niistä tapauksista kunkin yksittäisen näytteen väestön ja analyysi kaikkien kolmen yhdistetyn, tilastollisesti merkitseviä välillä ei havaittu näistä kolmesta polymorfismien ja

MLH1

promoottori metylaatio, MLH1 IHC puutos, ja MSI-H kasvain tila. Useamman logistinen regressio malleja, kukin SNP liittyi kasvaimeen MSI-H asema;