Krooninen sairaus

tiivistelmä

Chemoresistance syövän hoidossa on epäsuotuisa ennustetekijä non-small keuhkosyöpä (NSCLC). Solunsisäisten kalsiumin tason monilääkeresistenttiä (MDR) alilinjat johtaa herkistymiseen MDR alilinjat solukuolemaan. Olemme osoittaneet, että sieni proteiini

Ganoderma microsporum

, GMI, nostaa solunsisäinen kalsiumpitoisuus ja vähentää kasvua MDR alalinjan kautta autophagy ja apoptoosin riippumatta p-glykoproteiinin (P-gp) yliekspressio, hiirillä ksenografti- kasvaimia. Lisäksi tutkimme roolit autophagy kuolemaan MDR A549 keuhkosyöpään alilinjat mukaan GMI, thapsigargin (TG) ja tunikamysiinillä (TM)

in vitro

. Sytotoksisuus TG inhiboitui yli-ilmentyy P-gp. Kuitenkin TM aiheuttama kuolema MDR alalinjoja oli riippumaton P-gp tasolla. Yhdistelmät TG ja TM joko dosetakselilla tai vinkristiini osoitti ilman ylimääräisiä sytotoksisia vaikutuksia MDR alilinjat. TG- ja TM-välitteisen apoptoosin MDR alilinjat havainnollistettiin anneksiini V määritys ja Western blot ja tukahdutettu yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä (Z-VAD-FMK). Hoito MDR alilinjat TG ja TM myös täydennetty autophagy kartuttamalla LC3-II proteiineja, jakautuminen P62 ja muodostumisen happamien vesicular soluelimiin (Avós). Esto ATG5 mukaan shRNA Silencing vähensi autophagy ja solukuolemaa mutta ei apoptoosin seuraavia TG tai TM hoitoa. GMI hoito esti fosforylaatiota Akt /S473 ja p70S6K /T389. Mielenkiintoista on, että fosforylaatiota ERK ei liittynyt GMI-indusoitu autophagy. Olemme päätellä, että autophagy soittaa pro-kuolema rooli hankittu MDR ja säätelyä autophagy mukaan GMI kautta Akt /mTOR esto tarjoaa potentiaalia strategian voittamiseksi MDR hoidossa keuhkosyövässä.

Citation: Chiu LY, Hu ME, Yang TY, Xin IL, Ko JL, Tsai KJ, et al. (2015) Immunomodulatorisia Protein from

Ganoderma microsporum

indusoi Pro-Death Autophagy kautta Akt-mTOR-p70S6K Pathway esto in monilääkeresistenssi- Keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 10 (5): e0125774. doi: 10,1371 /journal.pone.0125774

Academic Editor: Vladimir Trajkovic, School of Medicine, University of Belgrad, Serbia

vastaanotettu: 18 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 26 maaliskuu 2015; Julkaistu: 06 toukokuu 2015

Copyright: © 2015 Chiu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustusta National Science Council, Taiwan (NSC-100-2320-B-040-005) ja tiede ja Technology, Taiwan (MOST-103-2320-B-040-015). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin maligniteetti miesten ja naisten välillä. Vaikka kemoterapia on ehdotettu hoito kehittynyt ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), suurin osa potilaista kehittää ristiresistenssiä erilaisille kemoterapeuttisten (monilääkeresistenssin, MDR) [1]. P-glykoproteiinin (P-gp), tuote ihmisen

MDR-1

-geeni, kuuluu suuri ATP-sitoutumisen kasetti perheen kalvoproteiinien [2]. P-gp: n, jos yli-ilmentynyt syöpäsoluissa, voi pumpata syöpälääkkeiden ulos soluista. MDR on kriittinen ongelma kemoterapiaa. Uusia lääkkeitä ja strategioita poistamiseksi tarvitaan MDR saada parempia ennusteita. Tehokkuuden parantamiseksi kemoterapian käyttö kasviperäisten lääkkeiden kuten MDR: n kumoavia aineita [3], MDR modulaattorit ATP-sitova kasetti kuljettajat [4] ja nanomedical ratkaisuja kiertämiseen MDR on käsitelty laajasti [5].

sekä doketakseli (DOC) [6] ja vinkristiini (videonauhuri) [7] tubuliiniin sideaineet (TBA), joka on sovellettu kliinisesti erilaisiin syövän solunsalpaajahoitojen. Kuitenkin ne kykenevät indusoimaan MDR. Käytimme DOC ja videonauhuri valinnan hoitava A549 NSCLC-soluja. Alle jatkuva altistuminen useita DOC ja videonauhuri lääkkeille vastustuskykyiset alalinjoja saatiin jatkotutkimuksia varten. Aikaisemmassa tutkimuksessa olemme kertoi, että kun yhdistetään DOC tai videonauhurin, kolme L-tyypin kalsiumkanavan salpaajat, verapamiili (VER), nifedipiini ja diltiatseemi, käänteinen MDR eri tehoja lääkä- ja videonauhuri kestävä alalinjoja riippumatta ekspressiotasoja of efflux kuljettajat [8]. Näin ollen, on loogista olettaa, että kalsiumkanavan salpaaja aktiivisuus liittyy käänteinen MDR kyky. Kertyneet tiedot ovat osoittaneet, että TBA hoito johtaa häiriöitä kalsiumtasapainoa [9]. Niinpä alhainen solunsisäinen kalsiumin voi sallia MDR-positiivisten solujen ylläpitämään vapaiden radikaalien aiheuttamaa vahinkoa yhdessä muiden tunnistamattomien tekijöihin. Yhdessä muuttaminen solunsisäisen kalsiumin tasoa ([Ca

2 +]

cyt) in TBA kestävä keuhkosyöpä alalinjoja voivat moduloida chemoresistance ja ([Ca

2 +]

cyt) -välitteisen reittejä ovat potentiaalisia kohteita voittamiseksi MDR.

Endoplasmakalvosto (ER) on solunsisäinen kalsium varastointi osioon, joka on merkitystä säilyttäminen solun kalsiumin homeostaasin [10]. Häiriöiden ER homeostaasin vaikuta proteiinin taitto tuottamaan unfold proteiinivaste (UPR), jota kutsutaan myös ER stressiä [11]. ER stressi voidaan turvata lääkeaineita kuten thapsigargin (TG) [12] ja tunikamysiinillä (TM) [13]. Kun solut käsitellään TG, [Ca

2 +]

cyt kasvaa [14] tuottaa autophagy [15] ja apoptoosin [16]. Hoito TM johtaa induktioon ER stressin lisääntynyt [Ca

2 +]

syt ja liittyy myös apoptoosin [17] ja autophagy [15,16]. Kolme ER stressitekijät, TM, ditiotreitoli (DTT) ja proteasomin estäjä MG132, on testattu hiiren alkion fibroblasteissa (MEF) ja todettu aiheuttavan autophagy negatiivisesti säätelemällä Akt /nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) reitin [18]. Kuitenkin selvää näyttöä mekanismi, jolla autophagy säätelee solukuolemaa MDR syövissä puuttuu edelleen.

ohjelmoidun solukuoleman luokitellaan apoptoosin, nekroosin tai autophagy [19,20]. Apoptoottisia reittejä kuuluvat ne, jotka ovat ulkoisia, ja ne, jotka ovat luontaisia. Jokainen polku konvergoi aspartaatti-specific kysteiiniproteaaseja tunnetaan caspases (käynnistävät 8, 9, 10 ja pyöveli 3, 6, 7) [20]. Nämä caspases pilkkomiseksi ja aktivoi alavirran apoptoottisia proteiineja, säädeltyä solukuoleman. Apoptoosi on tärkeä vaikutus syövän lääkehoitoa. Autophagy on myös tutkittu laajasti syövän hoidossa. Autophagy ohjaa ryhmä evoluutiossa säilyneitä autophagy geeni-sukuiset proteiinit (ATG proteiinit) on prosessi, joka sisältää: (i) induktio tai aloittamista, joka korreloi muodostumista phagophore; (Ii) nukleaatioon; (Iii) venymä, Atg12-Atg5 ja LC3 /Atg8 hallinnassa kriittinen vaihe muodostettaessa autophagosomes; ja (iv) kypsymisen ja hajoaminen, jossa autophagosomes fuusioituvat endosomeista-lysosomeihin muodostamaan autolysosomes kanssa hajoaminen luumenin sisältö [21]. Sopiva taso autophagy joka kannustaa tuumorisolun eloonjääminen on keskusteltu osana pro-selviytymisen rooli autophagy vakiintuneissa kasvaimissa [22,23]. Autophagy on ehdotettu kohteena indusoimiseksi syöpäsolun kuoleman [24,25] ja estämällä autophagy on havaittu tulosten parantamiseksi syövän hoidossa [26]. Kuitenkin jatkuva stressi voi edistää laaja autophagy, mikä johtaa solun kuolemaan. Tämän vuoksi molemmat autophagic estäminen [27] ja induktio on otettu huomioon hoitostrategioita [24] ja on sovellettu syöpälääkkeen hoitoja. Olipa autophagy soittaa pro-kuolema tai pro-selviytymisen rooli seuraavissa kemoterapian aiheuttama vastus on edelleen epäselvä. Lisätutkimuksia tarvitaan tämän ongelman ratkaisemiseksi ja hallitsemaan paremmin hankittu chemoresistance.

Rekombinantti sieni- immunomodulaarisia proteiinia, GMI, kloonattu

Ganoderma microsporum

ja puhdistettu, on osoitettu olevan estävää vaikutusta EGF aiheuttaman muuttoliikkeen ja invaasiota [28]. Tämä proteiini downregulates tuumorinekroositekijä-alfa-indusoitua ekspressiota matriksimetalloproteinaasi 9 kautta NF-kappaB-reitin [29] ja indusoi autophagy kautta kalsium-välitteisen signalointireitin ihmisen keuhkosyövän A549-soluja [30]. Suun kautta anto GMI on osoitettu merkitsevästi estävän kasvaimen kasvua ja aiheuttaa autophagy nude-hiirissä, joilla ksenosiirrettyjä kasvain A549-solut [30]. Lisäksi autophagosome kerääntyminen on osoitettu indusoivan autophagic solukuoleman kautta Akt /mTOR polku on GMI-käsitellyn keuhkosyöpäsolua malli [31]. Edelleen testata antitumor funktio GMI vuonna chemoresistance, ksenosiirrettyjä eläinten kasvaimet Doketakselin vastustuskykyisten A549 alalinja hoidettiin GMI ja analysoidaan. Olemme lisäksi tunnettu roolit apoptoosin ja autophagy in MDR vertaamalla vaikutuksia kahdessa klassisen ER stressin indusoijat, TG ja TM, jossa toimeentulotukea vuonna docetaxel- ja vinkristiini valitut A549 keuhkosyöpää alilinjat.

Tässä tutkimuksessa, osoitimme vaikutukset ja rajoitukset autophagy kuolemasta MDR alilinjat ER stressitekijöitä, TG ja TM, sekä uutena stressitekijänä, GMI, ymmärtää paremmin roolit apoptoosin ja autophagy anti-MDR syövän hoitoon. GMI aiheuttama Akt /mTOR-reitin inhibitio autophagy liittyvän solukuolemaa ehdotetaan menetelmää kiertämisen MDR.

Materiaalit ja menetelmät

Lääkkeet ja kemikaalit

DOC saatiin Aventis Pharmaceuticals Inc. (Bridgewater, NJ). VCR, VER, klorokiini ja TM saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Z-VAD-FMK hankittiin Bachem (Torrance, CA). TG ostettiin Tocris Bioscience (Bristol, Yhdistynyt kuningaskunta) ja U0126 ostettiin Cell Signaling (Danvers, MA). GMI, valmistaja Mycomagic Biotechnology Co., Ltd (Taipei, Taiwan), tuotettiin ja lievittää välillä

Ganoderma microsporum

[28].

Flow-3AM määritys

noin 2 x 10

4 solua kuoppaa kohti ympättiin 24-kuoppaisille levyille. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut altistettiin VER tuoreessa väliaineessa 2 tuntia. Tämän jälkeen solut altistettiin DOC, videonauhurin tai toimeentulotukea. Lopussa Altistuksen jälkeen solut trypsinoitiin ja inkuboitiin 30 min Hankin puskuroitu suolaliuos (HBSS), jossa on 3 uM Flow-3AM (Invitrogen). Värjäyksen jälkeen solut pestiin HBSS: llä kahdesti, laitettiin HBSS: ssä, joka sisälsi 5% FBS: ää, ja analysoitiin virtaussytometrialla.

Solulinjat ja sytotoksisuusmääritys (MTT-määritys) B

Ihmisen A549-soluja ylläpidetään kuten aiemmin on kuvattu [8]. DOC ja videonauhuri resistenttejä alalinjoja perustettiin vanhempien soluista vaiheittain altistamalla kasvavia pitoisuuksia DOC tai videonauhurin. Lyhyesti, sillä DOC alalinja, A549-solut alhainen solujen tiheyden ympättiin 10 cm: n petrimaljaan ja sitä käsiteltiin 0,5 nM DOC kunnes eloonjääneiden solujen kasvoi ilmeinen siirtomaa. Valitun pesäke monistettiin, kun läsnä oli 0,5 nM DOC konfluenssiin asti ennen lääkkeen annosta nostettiin kerrannaisina kaksi seuraavan kierroksen valintaa. DOC kestävä alilinja pidettiin 16 nM DOC oli merkitään A549 /D16. Samanlainen nimitys, A549 /V16, annettiin videonauhuriin vakaasti kestävä alilinja. Solut altistettiin eri pitoisuuksia DOC, videonauhuri tai GMI tuoreessa väliaineessa 48 tuntia. Lääkeherkkyyksiä DOC, videonauhurin ja toimeentulotukea määritettiin MTT kolorimetristä määritystä. Yksityiskohtaiset vaiheet MTT-määritys on kuvattu aikaisemmin [8]. Keskiarvot laskettiin kolmen erillisen kokeen.

Western blot-analyysi

Tätä koskevat menettelyt on kuvattu aiemmassa raportissa [8]. Proteiinit saatetaan reagoimaan yhden seuraavista: anti-LC3A (# 4599), anti-LC3B (# 3868), anti-PARP (# 5625), anti-GADD153 (# 2895), anti-GRP78 (# 3177), anti- -t-Akt (# 9272), anti-p-Akt Ser473 (# 9271), anti-p-ERK (# 4370), anti-p-p70S6K Thr389 (# 9234) ostettiin Cell Signaling (Danvers, MA), anti-p62 (GTX100685) saatu GeneTex (Irvine, CA) tai monoklonaalista anti-β-aktiini (Sigma, AC-40). Immunohistokemiallinen (IHC) suoritettiin polyklonaalista anti P-gp: n, jota seurasi anti-vuohi-lgG (Santa Cruz Biotechnology) konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin. Hematoksyliinillä käytettiin counterstaining.

anneksiini V-määritys

Solut trypsinoitiin ja inkuboitiin 30 min sitomispuskuriin propidiumjodidilla (PI) ja anneksiini V (FITC anneksiini V Apoptosis Detection Kit 1, BD Biosciences, San Jose, CA), jota seurasi analyysi virtaussytometrialla.

mittaus mitokondrion kalvon potentiaalia JC-1 määritys

Käytimme JC-1 (5 ’, 6,6 ”-tetrakloori-1,1 ’, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodidi) ja mitokondriaalisen kalvon potentiaalinen haitta, CCCP (karbonyyli syanidi 3-chlorophenylhydrazone), tutkimista varten mitokondrion kalvon potentiaali (JC-1, Molecular Probes, Eugene, TAI). Polarisoitunut mitokondriot näkyvät punaisina ja depolarisoituneiden mitokondrioita vihreinä. Apoptoosi osoittaa lisääntyminen vihreä /punainen fluoresenssi-intensiteetin suhteen. Kunkin näytteen solut (5 x 10

5 solua /ml) suspendoitiin 1 ml: aan PBS-puskurilla ja JC-1 (lopullinen konsentraatio, 2,5 ug /ml) lisättiin näytteeseen, joka inkuboitiin 10 min 37 ° C: ssa. Värjätyt solut sentrifugoitiin sitten 400 x g: ssä 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja supernatantti poistettiin varovasti. Sitten pelletti pestiin 1-2 ml: lla PBS: ää. Solut analysoitiin välittömästi virtaussytometrillä (BD FACSCalibur).

havaitseminen ja kvantifiointi happamien vesicular soluelimiin (Avós) B

yksityiskohtaiset vaiheet AVO analyysi on kuvattu aiemmin [30]. Lyhyesti, käsittelyn jälkeen solut pestiin HBSS: llä kahdesti, mitä seurasi värjäys 1 g /ml akridiinioranssia (Sigma A 6014) ja HBSS: ssä, joka sisälsi 5% FBS 15 minuuttia. Värjäyksen jälkeen solut pestiin HBSS: llä ja suspendoitiin HBSS, joka sisälsi 5% FBS: ää. Solut havaittiin alle punaisen suodattimen fluoresenssimikroskoopilla. Määrällisesti AVO muodostumista, akridiini oranssi värjättiin solut kerättiin ja pestiin kaksi kertaa HBSS: llä, uudelleensuspendoitiin HBSS, joka sisälsi 5% FBS: ää ja analysoitiin virtaussytometrillä ja CellQuest-ohjelmaa.

ATG5 hiljentämiseltä shRNA ilmentävät lentivirus

Lentivirusvektorikonstruktit infektio A549 /D16 ja A549 /V16 alilinjat suoritettiin vakaasti integroida ja ilmaista lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) kohdistaminen ATG5 mRNA-sekvenssit. Yksityiskohtaiset vaiheet lentivirusta tuotannon on kuvattu aiemmin [30].

eläinmalli ksenograftikasvaimissa

in vivo

kasvaimen kasvua määrityksessä, 4 viikon ikäisiä uros- immuunivajaisiin hiiriä (NOD.CB17-Prkdcscid /IcrCrlBltw) hankittiin BioLASCO Taiwan Co., Ltd (Taipei, Taiwan). Kokeelliset menettelyt ja käsittely tehtiin kansainvälisten ohjeiden mukaisesti laboratorio- eläinkokeissa. Nykyinen tutkimus hyväksyi Chung Shan Medical University Animal Care Committee (Luvan numero: 1238) ja kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen. Perustaa A549 tuumoriksenografteja, hiiriin injektoitiin subkutaanisesti 5 x 10

6 A549 /D16-soluja (100 ui) ja 100 ui Matrigeliä (BD Biosciences, 354234). Kuuden eläimen sitten satunnaisesti kahteen ryhmään, joka koostuu kolmesta eläimestä kullekin. Seitsemän päivän kuluttua soluistutusryhmä, hiiret PBS-ryhmässä käsiteltiin 100 ul: lla PBS: ää letkulla kerran päivässä ja toimivat kontrolleina. Vähimmäistoimeentulojärjestelmä ryhmä annettiin GMI (160 ug hiirtä laimennettuna 100 ul PBS) letkuruokinnalla kerran päivässä. Kasvaimen koot mitattiin 3 päivän välein joka alkaa 16. päivänä solujen injektion ja kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla: 0,5 x suurempi halkaisija (mm) x pieni halkaisija

2 (mm). Johtuen tuumorin koon vaihtelu ja pieni koko ryhmien ei-parametrinen U-testi on sovellettu p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Sen jälkeen, kun eläimet tapettiin, kasvaimen painot mitattiin mikrovaakaan ja kasvaimen lysaatit (10-50 ug) analysoitiin Western blot käyttäen Tissue Protein Extraction Buffer (FIVEphoton Biochemicals, San Diego, CA) ja proteiini valmistamiseksi.

tilastollinen analyysi

Kaikki arvot esitetään keskiarvona ± SD. Tiedot verrattiin ryhmien välillä käyttäen t-testiä ja * p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Low solunsisäisen kalsiumin tasoa ([Ca

2 +]

syt) of solunsalpaajaresistentti A549 soluja voimistuvan yhdistelmä TBA ja verapamiili hoitoa tai GMI

Aikaisemmin olemme osoittaneet, että MDR A549 /D16 alilinja välittyy ABC kuljettajat (tyypillinen MDR) ja MDR A549 /V16-alalinjan välittyy ei-ABC transporter liittyvä tekijät (epätyypillinen MDR) [8]. P-gp on yliaktiivista A549 /D16 alalinja ja vaimentua A549 /V16-alalinjan. Molemmat alalinjoja ovat ristiresistenttejä DOC ja videonauhuri. Oletimme, että mekanismi L-tyypin kalsiumkanavan salpaajat kääntämään TBA herkkyys lääkkeille vastustuskykyiset solut liittyy muutos solunsisäisen kalsiumin homeostaasiin. Täsmentämiseksi solunsisäinen kalsiumpitoisuus ([Ca

2 +]

cyt) vanhempien syöpäsolujen ja monilääkeresistenteistä alalinjoja, Fluo-3AM toimi fluoresoiva indikaattori solunsisäisen kalsiumin on virtaussytometrialla. Lisäksi muuttaminen [Ca

2 +]

cyt seuraavista yhdistetyn VER ja TBA hoito määritettiin. Tulokset osoittivat, että [Ca

2 +]

cyt of monilääkeresistenteistä, P-gp yli-ilmentävät, A549 /D16 alalinja (kuvio 1A) pidetään osoituksena alemman fluoresenssin tasoa kuin vanhempien A549-soluja. Mielenkiintoista on, että solunsalpaajaresistentti ja P-gp vaimentua A549 /V16 alilinja alempi [Ca

2 +]

syt myös yllä (kuvio 1 B). Tiedot osoittivat, että [Ca

2 +]

cyt in solunsalpaajaresistentti alilinjat on pienempi kuin vanhempien A549-soluja. Kun A549 /D16 (kuvio 1 C) ja A549 /V16 (kuvio 1 D) soluja esikäsiteltiin VER seurasi TBA taso havaittiin fluoresenssin merkittävästi lisääntynyt, mikä tarkoittaa, että [Ca

2 +]

syt of solunsalpaajaresistentti alalinjoja on kohonnut, kun VER uudelleen herkistäviä solunsalpaajaresistentti solut altistuvat TBA sytotoksisuuteen. Säätelyä [Ca

2 +]

CYT yhdistetyn VER ja TBA hoitoja oli riippumaton taso P-gp ilme. Testaamiseksi vaikutuksen GMI on [Ca

2 +]

cyt molemmat alilinjat käsiteltiin GMI (1,2 uM) 24 tunnin ajan tai 48 tuntia, minkä jälkeen analyysi Fluo-3AM määrityksessä. Fluoresenssin signaali GMI-käsiteltyjen A549 /D16 alilinja lisääntynyt kuluttua 24 h (kuvio 1 E) ja edelleen lisääntynyt kuluttua 48 h GMI hoidon (kuvio 1 G) Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin A549 /V16 alilinja käsitelty GMI 24 h (kuvio 1 F ) ja 48 h (kuvio 1 h). Tiedot tukevat hypoteesia, että kohonnut [Ca

2 +]

syt on merkittävä rooli solunsalpaajaresistentti keuhkosyöpäsolua herkistyminen kuolemaan. Lisäksi toimeentulotukea pystyy aiheuttamaan [Ca

2 +]

cyt korkeus MDR alilinjat.

tarkastella [Ca

2 +]

cyt, fluoresoivalla värillä Fluo -3AM inkuboitiin (A) vanhempien A549 ja A549 /D16-solujen, (B) vanhempien A549 ja A549 /V16-solut 30 min. Ohut viiva esittää fluoresenssia taustalla ilman Fluo-3AM inkubointia. Paksu viiva edustaa fluoresenssi mitattiin virtaussytometrialla. Mitata VER modulaatioon [Ca

2 +]

cyt, (C) A549 /D16-solujen ja (D) A549 /V16-soluja esikäsiteltiin VER (10 uM) 2 tunnin seurasi DOC ( 16 nM) ja videonauhuri (16 nM) hoitoa 48 h. Esiin tulee [Ca

2 +]

cyt A549 /D16-solujen käsitelty GMI (1,2 uM) 24 tunnin ajan (E) tai 48 h (G) on voimistunut. Esiin tulee [Ca

2 +]

cyt A549 /V16-solut käsiteltiin GMI (1,2 uM) 24 tunnin ajan (F) tai 48 h (H) on myös voimistunut. Jälkeen fluo-3 AM inkuboinnin jälkeen solut visualisoitiin käyttäen virtaussytometriaa. Solujen lukumäärä count (Count) on osoitettu Y-akselin ja Fluo-3AM intensiteetti (FL1-H) on esitetty X-akselilla.

GMI estää P-gp: n yli-ilmentävät kasvaimen kasvua hiirillä ksenograftimallissa

Aiemmin on osoitettu, että esikäsittelyn jälkeen kanssa kalsiumkelaattoria BAPTA-AM, GMI-solukuolema on estetty. Ilmeisesti, GMI aiheuttaa keuhkosyöpää solukuoleman kautta kalsium-riippuvaisen signalointireitin [30]. Siksi testasimme herkkyys solunsalpaajaresistentti syöpäsolujen GMI hoidon MTT-määrityksellä (kuvio 2A). Tulokset osoittivat, että sekä A549 /D16 ja A549 /V16 alalinjoja vastata GMI (0,3-1,2 uM) annoksesta riippuvalla tavalla. Vähimmäistoimeentulojärjestelmä herkkyydet A549, A549 /D16 ja A549 /V16-solut laskettiin IC

50 on lueteltu taulukossa 1. Lisäksi hiiriin istutettiin ihonalaisesti A549 /D16 alilinja ilmentävät korkeita P-gp. Kasvain rasitteita hoidetuilla hiirillä PBS tai GMI esitetään kuviossa 2B. Kun verrataan ryhmän hiirten annettiin PBS, kasvainten kasvua in GMI ryhmässä oli merkitsevästi estyy. Vaikka laskettu kasvaimen tilavuus oli verrattavissa P1 ja P3, huomattava kuolio P2 kasvain johti pienin koko noudetun P2 kasvain. Varmistamiseksi leviämisen implantoidun syöpäsolujen, testasimme GMI tehoa, kun kasvaimet saavuttivat tilavuuden 200 mm

3 40. päivänä istuttamisen jälkeen (kuvio 2C). Anti-kasvain vaikutus GMI ei rajoitettu suuria kasvaimia.

(A) analyysi vaikutuksista GMI (0,3, 0,6, 0,9 ja 1,2 uM) solujen elinkelpoisuutta A549, A549 /D16 ja A549 /V16 solujen MTT-määritys. (B) Seitsemän päivän kuluttua A549 /D16 soluistutusryhmä, hiiret PBS-ryhmässä käsiteltiin PBS: llä tai GMI letkuruokinnalla kerran päivässä. Kasvain koot PBS-ryhmässä ja GMI ryhmä mitattiin jälkeen hiiret tapettiin päivänä 64. (C) Hiirille ruiskutettiin ihon alle A549 /D16 soluistutusryhmä. Kun tuumorin tilavuus oli 200 mm

3 päivänä 40, hiiret PBS-ryhmässä käsiteltiin PBS: llä tai GMI letkuruokinnalla kerran päivässä. Tulokset esitetään keskiarvona ± SD. ei-parametrinen U-testi on sovellettu p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. (E) tasot c-PARP, LC3A ja LC3B kuudessa ksenograftikasvaimissa määritettiin Western blottauksella tilastollinen analyysi LC3A-II ja LC3B-II ilmaisuja. (D) edustaja immunovärjäystä tulokset P-gp keuhkojen kasvain A549, A549 /D16 käsitelty PBS (P1) ja A549 /D16 käsitellään GMI (G1) saatiin IHC.

Apoptosis -välitteisen pilkkomisen poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP-1) by capase-3 tuotti 89 kDa: n C-terminaalinen fragmentti (c-PARP, joka sisältää katalyyttisen domeenin), joka toimi molekulaarinen merkkiaine immunobloteissa. Valaisemiseksi ER stressin säännelty autophagy, mikrotubuleihin liittyvä proteiini kevyt ketju (LC3) proteiini analysoitiin. LC3 on kolme isoformeja (LC3A, LC3B, ja LC3C) [32], jonka LC3A ja LC3B tutkittiin. Vähimmäistoimeentulojärjestelmä saaneista kasvaimet ilmaisivat korkea c-PARP, LC3A-II ja LC3B-II proteiineja, mikä osoittaa korkeampi autophagic ja apoptoottisten toimintaa kuin PBS-käsitellyn ohjaus kasvaimet (kuvio 2D). Osoittaakseen korkea P-gp ilmentymistä ksenograftikasvaimissa, IHC P-gp levitettiin edustaja kasvaimia P1, G1 ja vanhempien A549-soluja (kuvio 2E). P1 ja G1 kasvaimia osoitti vahvaa P-gp: n ilmaisun toisin kuin kasvaimia A549-solut. Tiedot näistä hiiristä ksenografti kasvain kokeet osoittivat, että GMI estää niiden kasvun, P-gp: n yli-ilmentävät solunsalpaajaresistentti soluja ja indusoi apoptoosia sekä autophagy.

Apoptoosi ja autophagy differentiaalisesti parantaa GMI, TG ja TM MDR keuhkosyövän alilinjat

Voit selvittää vaikutukset GMI, TG ja TM apoptoosiin ja autophagy ovat annoksesta riippuvia, käsittelimme MDR alilinjat eri pitoisuuksilla GMI, TG ja TM seuraa luonnehdinta molekyylimarkkereiden immunobloteissa. Yksi komponenttien ER stressi-välitteistä apoptoosia reitti on C /EBP homologista proteiinia (CHOP), joka tunnetaan myös nimellä kasvun arrest- ja DNA-vaurioita-geenin, 153 (GADD153). Toinen ER-stressi välittämä proteiini on GRP78, joka tunnetaan myös nimellä BIP [11]. ER stressiin liittyviä GADD153 ja GRP78-proteiinit havaittiin A549 /D16 (kuvio 3A) ja A549 /V16 (kuvio 3B) alalinjoja seuraavat GMI hoitoon. Apoptoosi-välitteinen proteiini C-PARP oli voimistunut seuraavat GMI kohtelun kuin oli autophagic markkereita LC3A-II ja LC3B-II proteiineja.

(A) A549 /D16-solujen (2 x 10

5 solua) käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla GMI 48 tuntia. Tasot GADD153, GRP78, c-PARP, LC3A-I, LC3B-I, LC3A-II, LC3B-II ja p62 havaittiin Western-blottauksella. Samanlaisia ​​olosuhteita levitettiin (B) A549 /V16-soluja käsiteltiin GMI. (C) Western blot analyysi proteiinin tasot A549 /D16 alalinja ja (D) A549 /V16 alalinja aiheuttama TG. (E) A549 /D16-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla TM 48 tuntia. Samanlaisia ​​olosuhteita levitettiin (F) A549 /V16-soluissa. (G ja H) Molemmat alilinjat hoidettiin osoitettu GMI konsentraatio, kun poissa tai läsnä klorokiinin. Ekspression β-aktiini toimi latauskontrollina.

GADD153-proteiinia ei havaittu A549 /D16 alalinja (kuvio 3C), mutta se on saatu aikaan TG A549 /V16 alalinja (kuvio 3D). Proteiinit GRP78 voitiin heikosti havaita pidentämällä valotusaikaa (kuvio 3C). Ne löytyivät huomattavasti suurempia määriä A549 /V16 alalinja (kuvio 3D) on immunoblot. Oli annoksesta riippuva induktio GADD153 TM on A549 /D16 (kuvio 3E) ja A549 /V16 (kuvio 3F) alalinjoja. Tasot c-PARP-proteiinien koordinoitu hyvin GADD153 proteiinin tasot molemmissa alilinjat (kuvio 3D, 3E ja 3F). Tuloksemme osoittivat myös, että LC3A-II ilmaistaan ​​A549 /D16 alalinja ja kasvaa seuraavien 200 nM TG hoitoa, kun taas taso LC3B-II ei kasva edes suuren annoksen (200 nM) TG käsittely (kuvio 3C) ja pidemmän valotusajan on immunoblottaus. Mielenkiintoista on, että alle TBA valinta, sekä A549 /D16 ja A549 /V16 alalinjoja osoitti vähäistä LC3B-II ilmentymistä (kuvio 3A, 3C, 3E, 3B, 3D ja 3F, 0 nM, vastaavasti). TG ja TM parannettu kertymistä LC3-II proteiineja annoksesta riippuvaisella tavalla A549 /V16 MDR alilinja muttei A549 /D16-alalinja, joka ilmaisi korkea P-gp seuraavat TG hoidon (kuvio 3C). Mielenkiintoista on, että kun p62, The autophagy vuon indikaattori, joka hajoaa autolysosomes [33], seurattiin MDR alalinjoja seuraavissa GMI hoidon, sen ilmentyminen ei vähentynyt, kun LC3-II lisäsi (kuvio 3A ja 3B). Sitä vastoin proteiini tasoja p62 vähentynyt TG (kuvio 3D) ja TM-käsiteltyjen alalinjoja (kuvio 3E ja 3F). Muodostuminen LC3-II ja huomattava jakautuminen P62 osoittaa aloittamisesta ja valmistumisen autophagic vuon seuraavista TG ja TM hoito MDR alilinjat (kuvio 3D, 3E ja 3F). Meidän edellisessä raportissa, osoitimme, että GMI aiheuttama autophagosome kertymistä tuloksia autophagic kuoleman A549-soluja [31]. Tämä saattaa selittää tasainen taso p62 in GMI saaneilla alalinjoja (kuvio 3A ja 3B). Testasimme lisäksi, onko GMI-indusoidun autophagic vuo voidaan havaita lysosomaalinen estäjä, klorokiini, joka inhiboi endogeenisen LC3-II liikevaihdon [24]. Kun verrataan GMI hoidon merkittävä kertyminen LC3A-II proteiineja alilinjat että yhteistyössä käsitelty klorokiinin osoitettiin (kuvio 3G ja 3H). Nämä tiedot osoittivat, että GMI aiheuttama autophagic vuon MDR syöpäsoluja. Näistä tuloksista täydennetty ER stressi edistää ilmauksia autophagy ja apoptoosin säännelty proteiinien MDR alilinjat. Tiedot osoittivat, että astetta apoptoosin ja autophagy ovat riippuvaisia ​​GMI, TG ja TM pitoisuuksia. GMI indusoi ER stressiä, apoptoosin ja autophagy in MDR alilinjat samanlainen TG ja TM toimintaa mutta eri teho.

TM ja TG aiheuttaa kuoleman MDR keuhkosyöpään alilinjat mutta TG tehoa on rajoitettu P-gp yli-ilmentymisen

perehtyi sääntelyä kasvun molempien MDR alilinjat TG ja TM MTT-määrityksessä. Vanhempien A549-soluja, oli noin 32% solujen selviytymistä hoidon jälkeen 200 nM TG. Sytotoksisuus parantunut, kun A549-solut cotreated TG ja DOC (16 nM), jolloin 19% solujen eloonjäämistä 200 nM TG. Elinkelpoisuus A549 /D16 alilinja ei vaikuttanut TG tai TG yhteiskäsittely kanssa DOC (kuvio 4A). Sitä vastoin, kun A549 /V16-soluja käsiteltiin TG (200 nM), 41% soluista selviytyi (kuva 4B). Yhdistelmä videonauhurin (16 nM) ja TG ollut mitään ylimääräisiä sytotoksista vaikutusta A549 /V16-alalinjan. On raportoitu, että TG on substraatti P-gp: n [29]. Siksi me soveltaa P-gp-salpaaja, VER, onko sytotoksisuuden TG saadaan takaisin A549 /D16-alalinjan. Tulokset osoittivat, että kun 4 uM VER lisättiin, elinkelpoisuutta A549 /D16-alalinjan alennettiin 42% 200 nM TG (kuvio 4E).

(A) Vanhempien A549 ja A549 /D16-solujen (2 × 10

4 solua /kuoppa) käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla TG kanssa DOC (16 nM) tai ilman DOC 48 tuntia lääkeaineen herkkyys mittauksiin. Samanlaisia ​​ehtoja levitettiin (B) A549 ja A549 /V16-soluissa ja videonauhuri (16 nM). (C) Vanhempien A549 ja A549 /D16-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla TM kanssa DOC tai ilman DOC 48 tuntia lääkeaineen herkkyys mittauksiin. Samanlaisia ​​olosuhteita levitettiin (D) A549 ja A549 /V16-soluissa. (E) A549 /D16-soluja esikäsiteltiin VER (0, 0,5, 1, 2 ja 4 uM) 2 tunnin ajan, jota seuraa eri pitoisuuksia TG 48 tuntia. Solujen elinkykyisyys analysoitiin MTT-määrityksessä.

vanhempien A549-solut olivat myös herkkiä TM sytotoksisuuden annoksesta riippuvalla tavalla. Kun A549-soluja käsiteltiin TM (2,5 uM), noin 33% selvisi. Kun DOC yhdistettiin TM, 18% vanhempien A549-solut pysyivät. A549 /D16-alalinjan myös vastasi TM sytotoksisuuden, mutta pienempi herkkyys kuin vanhempien soluja. DOC yhteiskäsittely TM osoitti ilman ylimääräisiä sytotoksisuutta A549 /D16-solujen (kuvio 4C). A549 /V16 alalinja oli vähemmän herkkä TM kuin A549 /D16 alalinja 70% elossa soluja 2,5 uM TM. Yhteiskäsittely videonauhuri ei ollut merkittävää vaikutusta kannattavuuteen A549 /V16-soluissa (kuvio 4D). Nämä tiedot osoittivat, että vanhempien A549-soluja herkistyneet TG /TM ylimääräisiä cytotoxicities kun DOC tai videonauhuri yhdistetään TG tai TM. Kuitenkin A549 /D16 ja A549 /V16 alilinjat ovat vähemmän herkkiä TM kuin vanhempien soluja. Lääke herkkyydet A549, A549 /D16 ja A549 /V16 solujen TG ja TM kanssa laskettiin IC

50 on lueteltu taulukossa 1. analyysi tiedoista, vain A549 /V16-soluja herkempiä TG kuin vanhempien A549-soluja (kuvio 4B). MDR alalinjoja olivat herkkiä TG (kuvio 4A) ja vähemmän herkkiä TM verrattuna vanhempien A549-soluja (kuvio 4C ja 4D).

kvantifiointi TG- ja TM: n indusoiman apoptoosin ja autophagy

lisäksi tutkitaan proteiinimarkkereita apoptoosin, käytimme JC-1 ja anneksiini-V määritys määrällisesti apoptoosin TG ja TM-käsitelty alalinjoja.