Krooninen sairaus

tiivistelmä

VTI1A-TCF7L2

ilmoitettiin toistuva fuusio geenin peräsuolen syöpä (CRC), havaittiin ilmentyvän kolmessa 97 primäärisyövästä, ja yksi solulinja, NCI-H508, jossa genominen deleetio liittyy kaksi geeniä [1]. Tämän tutkimiseksi fuusio tarkemmin, olemme analysoineet suuren suoritustehon DNA ja RNA sekvensointi tietoja seitsemästä CRC solulinjoista, ja tunnistettu geeni

RP11-57H14.3

(ENSG00000225292) uutena fuusio- kumppani

TCF7L2

. Fuusio löydettiin sekä genomista ja transcriptome dataa HCT116-solulinjassa. Kolminkertaisena sisäkkäisiä RT-PCR, testasimme sekä uusia fuusio-transkriptin ja

VTI1A-TCF7L2

ilmentämiseen sarjassa 106 CRC kudosten, 21 CRC-solulinjat, 14 on normaalia koolonin limakalvoa, ja 20 normaaleissa kudoksissa sekalaisten anatominen sivustoja. Kaiken kaikkiaan, 42% ja 45%: n CRC-näytteiden ilmaistaan ​​

VTI1A-TCF7L2

ja

TCF7L2-RP11-57H14.3

fuusio-transkriptien, vastaavasti. Fuusio transkriptit sekä nähtävä 29% normaalista paksusuolen limakalvon näytteitä, ja 25% ja 75% testatuista normaaleista kudoksista muista elimistä, paljastaen että

TCF7L2

fuusio selostukset eivät ole erityisiä syöpään eikä että paksusuolen ja peräsuolen. Seitsemän eri silmukoitumisvariantit havaittiin, että

VTI1A-TCF7L2

fuusio, joista kolme ovat uusia. Neljä erilaista silmukoitumisvariantit havaittiin, että

TCF7L2-RP11-57H14.3

fuusio. Lopuksi olemme tunnistaneet uusia muunnelmia

VTI1A-TCF7L2

fuusio transkriptien, mukaan lukien uusi fuusiokumppani geeni,

RP11-57H14.

3, ja osoittaneet havaittavia määriä suuri osa CRC näytteet, samoin kuin normaalissa paksusuolen limakalvossa ja muita kudostyyppejä. Ehdotamme, että fuusio transkriptit havaittiin tiheä näytteet ovat transkription indusoi kimeerejä jotka ilmentyvät matalalla tasolla useimmissa näytteissä. Samanlainen fuusio selostukset aiheuttama genomista uudelleenjärjestelyjä havaittiin yksittäisissä syöpäsolulinjoissa voi vielä onkogeenisiä ehdotetulla alkuperäisessä tutkimuksessa Bass et al.

Citation: Nome T, Hoff AM, Bakken AC, Rognum TO, Nesbakken A, Skotheim RI (2014) High Frequency Fusion Transcripts Ottamalla

TCF7L2

kolorektaalisyövässä: Novel Fusion Partner ja Splice vaihtoehdot. PLoS ONE 9 (3): e91264. doi: 10,1371 /journal.pone.0091264

Editor: Nathan A. Ellis, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu 16. lokakuuta 2013 Hyväksytty: 10 helmikuu 2014; Julkaistu: 07 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Nome et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus rahoittivat avustusta Norja Cancer Society (TN ja AMH rahoitettiin PhD-opiskelijat PR-2007-0166 avustuksen RIS), NorStore (varastointiin tietokonetiedostojen, projekti NS9013K), ja osittain tukee Research Council Norjan kautta osaamiskeskuksia rahoitusohjelmasta, projektin numero 179571. rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on toiseksi yleisin ja tappava syöpäsairaus maailmanlaajuisesti [2], ja siellä on suuri kysyntä hyviä biomarkkereita sekä varhainen toteaminen ja ositusta potilaat mukaan ennustetta ja ennustetun hoidon vastauksia. Kuitenkin CRC on heterogeeninen sairaus, ja harvat biomarkkerit ovat vielä tehnyt sitä rutiininomainen kliiniseen käyttöön.

Fusion geenit edustavat yhtä luokkaa syövän geenien lupaavia biomarkkereiden potentiaalia, ja kun se johtuu kromosomaalisia uudelleenjärjestelyjä, kuten translokaatiot, poistot tai päällekkäisyyksiä, ne ovat yleensä erittäin syöpää erityisiä. Tähän mennessä vain harvoja erittäin toistuvat fuusio-geenit on tunnistettu CRC. Esimerkit muista syövän tyyppejä sisältää tunnetun

BCR-ABL1

fuusio (Philadelphia-kromosomi), läsnä 95% krooninen myelooinen leukemiat [3], ja

TMPRSS2-ERG

joka on läsnä noin 50% eturauhasen syöpiä [4]. Joissakin tapauksissa, fuusio geeni voi olla terapeuttinen kohde, osoittaa Imatinibi sitoutumisen ja estää kinaasidomeenia BCR-ABL1 fuusioproteiinin.

Ensimmäinen fuusio geenin raportoitu olevan toistuvia CRC, fuusioimalla sekvenssejä on

VTI1A

ja

TCF7L2

, raportoitiin vuonna 2011 [1].

VTI1A-TCF7L2

fuusio transkriptit havaittiin kolmessa 97 (3%) CRC, sekä koolonisyöpäsolulinja NCI-H508. NCI-H508, fuusio johtuu ~540 kb deleetio geenien välisestä

VTI1A

ja

TCF7L2

.

TCF7L2

koodaa TCF4 transkriptiotekijä, joka dimerisoituu kanssa β-kateniinin. β-kateniinin on mukana sääntelyn WNT-signalointireitin, joka on yleisesti muuttunut useimpien, jos ei kaikki, CRC [5]. Ehtyminen

VTI1A-TCF7L2

fuusio transkriptio aiheutti merkittävän menetyksen kiinnityspisteen riippumattoman kasvun fuusio positiivinen CRC solulinja NCI-H508 [1].

Usein mutaatiot polyadenine suolikanavan sisällä

TCF7L2

geeni on aiemmin raportoitu CRC, erityisesti mikrosatelliittien instable kasvaimissa [6]. Mikrosatelliittimarkkereita vakaa kasvaimet ovat kuitenkin myös viime aikoina osoitettu satama usein mutaatioita

TCF7L2

geeni, viittaa mahdolliseen tärkeä tehtävä CRC biology [7].

Tässä tutkimuksessa pyrittiin tutkia tarkemmin läsnäolon ja muunnelmia

VTI1A

–

TCF7L2

fuusioiden CRC. Olemme analysoineet syvälle sekvensoimalla koko genomin ja transcriptome dataa CRC liittyvien fuusioita, joissa yksi fuusioparien ja uusille fuusio breakpoints. Toistumisen

VTI1A-TCF7L2

fuusio, ja uusi fuusio transkriptio välillä

TCF7L2

ja uusi kumppani geeni

RP11-57H14.3,

analysoitiin sarjassa of CRC ja normaalin näytteitä.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaali

yhteensä 106 CRC kudosnäytteistä ja 14 pariksi normaali näytteet kahdesta itsenäisestä potilaan sarja, Series 1 ja Series 2, seulottiin läsnäolo fuusio- transkriptien. Kaikki CRC ovat potilailta hoitaa kirurgisesti sairaaloissa Oslon alueella, Norja. Kaksi potilasta sarjaan kuului sekä microsatellite vakaa (n = 85) ja epävakaa (n = 20) CRC (yksi näyte ei lasketa), joka arvioidaan aikaisempien tutkimusten [8] – [10]. Sarja rikastettiin kliinisen vaiheen II ja III CRC (52 vaihe II, 53 vaiheen III, ja 1 vaihe IV). Staging oli mukainen Yhdysvaltain yhteisen Cancer komitea /Union for International Cancer valvonta (AJCC /UICC). 14 pariksi normaali näytteet Series 1 kerättiin visuaalisesti taudista vapaille alueille paksusuolen limakalvoa. Tutkimus biopankkien on rekisteröity kansallisen lainsäädännön mukaisesti, ja tutkimus on hyväksynyt alueneuvoston Medical Research Ethics (numerot 2781 ja 236-2005-16141).

yhteensä 21 peräsuolen solulinjoja mukana [11]. Solulinjat HCT116, HCT15, LoVo, NCI-H508, RKO, SW48, ja SW620 hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Solulinjat Co115, Colo320, EB, FRI, HT29, IS1, IS2, IS3, LS1034, LS174T, SW480, TC7, TC71, ja V9P ystävällisesti Dr. Richard Hamelin, Inserm, Ranska. Identiteettiä solulinjoja todennettava AmpFLSTR Identifiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).

Lisäksi olemme seulotaan kaksikymmentä normaaleissa kudoksissa sekalaisten sivustoja elin

TCF7L2

johon fuusio selostukset (rasva-, virtsarakon, aivojen, kohdunkaula, paksusuoli, ruokatorven, sydän, munuaiset, maksa, keuhkot, munasarja, istukka, eturauhanen, luurankolihasten, perna, maha, kivekset, kateenkorva, kilpirauhanen ja henkitorvi ; FirstChoice Ihmisen normaali Tissue Yhteensä RNA, jokainen pooli RNA vähintään kolme henkilöä, lukuun ottamatta yksittäisen näytteen mahasta, Ambion, Applied Biosystems Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).

tunnistaminen fuusioita Whole-transcriptome ja Whole-Genomikartoituksen data

Parilliset-end RNA-sekvensointi tietoja seitsemästä kolorektaalisyövän solulinjoissa (HCT15, HCT116, HT29, LS1034, RKO, SW48, ja SW480) ja 16 normaalissa kudoksessa sekalaisia ​​alkuperät olivat mukana tutkimuksessa. Nämä kaikki sekvensoitiin käyttämällä Illumina GAIIx (solulinjoja) tai HiSeq 2000 (normaaleissa kudoksissa, sekä sekvensserit päässä Illumina Inc., San Diego, CA, USA). Paksusuolen syöpä RNA-seq tallentamia 220 miljoonaa 76 emäsparin sekvenssin lukee (Euroopan Nucleotide Archive tutkimus liittymistä ID ERP002049) [12] ja normaali näytteet ovat välillä 73 ja 80 miljoonaa 50 ep: n sekvenssi lukee per näyte (ArrayExpress liittymisen id [E-MTAB -513] ja Euroopan nukleotidi- Archive tutkimus [EMBL: ERP000546]). Lisäksi saimme pariksi-end koko genomin sekvenssit solulinjojen HCT15, HCT116, HT29 ja SW480 keskimäärin kattavuus noin 30 x [12] (Data voidaan pyynnöstä tutkijoiden).

luettelo mahdollisista fuusio transkriptien tuotti laukaisemiseksi versio 0.6.0 [13] seitsemän edellä mainittujen RNA-sekvenssi solulinjojen lisäksi CRC-solulinja NCI-H508 (analyysi id 0c7a79cc-bbaf-4c6d-93e1-866f5f5f3d0d ) ladattavissa Cancer Genomics Hub (isännöi Kalifornian yliopistossa Santa Cruz, CA, USA), toimittamat tiedot Cancer Cell Line Encyclopedia [14] ja 16 kudokset Illumina Human Body Map v2. Sillä solulinjoja kanssa pariksi koko genomin sekvenssi (HCT116, HCT15, HT29 ja SW480), RNA fuusio selostukset ja DNA breakpoints tunnistettiin nFuse versio 0.2.0 [15]. Fuusio nimitys- tarvitaan kolme ulottuu luku- paria ja kaksi split lukee RNA-seq data.

Detection of Fusion Transcripts käänteistranskriptaasipolymeraasiketjureaktioanalyysillä PCR

VTI1A-TCF7L2

fuusio, samalla RT-PCR-alukkeita ja sisäkkäisiä alukkeita käytettiin alkuperäisessä julkaisussa [1]. Sillä

TCF7L2-RP11-57H14.3

fuusio, alukkeet ja sisäkkäisiä alukkeita suunniteltiin fuusio transkriptio murtuessa järjestyksessä, jonka osoittaa purkaa, hyödyntämällä Primer3 web-ohjelmisto [16]. Optimaalinen alukesekvensseissä (taulukko S1) on edelleen tilata BioNordika Norway AS (Oslo, Norja) ja syntetisoi Eurogentec (Liège, Belgia). Suoritimme herkkä sisäkkäisiä RT-PCR 20 + 30 sykliä sekä määrityksiä käyttäen 50 ng cDNA: ta kustakin näytteestä syötettäväksi ensimmäisen kierroksen PCR. Tuotteita ensimmäisen PCR laimennettiin lopulliseen pitoisuuteen 1/200 sisäkkäisen PCR. Seuraavat pyöräily protokollaa käytettiin kaikissa PCR-reaktioissa: 15 minuuttia HotStarTaq DNA-polymeraasin aktivoinnin 95 ° C: ssa, kolmivaiheinen kierto denaturaatio 30 sekuntia 95 ° C: ssa, alukkeen yhden minuutin ja 15 sekunnin ajan, optimaalinen aluketta sulaminen lämpötiloissa (taulukko S1), ja laajennuksen yhden minuutin ajan 72 ° C: ssa. Viimeisen syklin jälkeen, lopullinen laajennus vaihe suoritettiin 72 ° C: ssa 6 minuutin ajan. Nested-PCR-tuotteet erotettiin elektroforeesilla 200 V: ssa 30 minuutin ajan 2% agaroosigeelillä ja visualisoitiin käyttäen etidiumbromidia ja UV-valossa. Kolmena kappaleena RT-PCR ajoja tehtiin molemmissa määrityksissä käyttäen identtisiä parametrejä, kaikille näytteille. Ei mallia negatiivisia kontrolleja sisällytettiin kustakin cDNA-synteesin, ensimmäisen kierroksen PCR ja sisäkkäisiä-PCR-reaktioissa.

Sanger sekvensointi Fusion Transcript Herkkyysrajat

Näytteet, jotka olivat positiivisia toisen kaksoiskappaleanalyysiä RT-PCR määritykset, ja osoitti yhden nukleotidin vyöhykkeen agaroosigeelillä, sekvensoitiin suoraan molemmilta puolilta käyttämällä sekä eteen- että taaksepäin sisäkkäisiä alukkeita. Ennen sekvensointia, sisäkkäistä PCR-tuotteet puhdistettiin käyttämällä Illustra ExoStar 1-vaiheen puhdistus (GE Healthcare, Little Chalfront, UK). Sykli sekvensointireaktiot suoritettiin käyttäen BigDye Terminator V.3.1 syklisekvensointireagenssipakkausta (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) noudattaen toimittajan suositusten mukaan. Lisäksi sekvensointi tuotteet puhdistettiin ja puhdistettiin käyttämällä BigDye Xterminator (Applied Biosystems), ennen kuin ne analysoitiin kapillaarielektroforeesilla käyttäen ABI 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems). Sekvenssit analysoitiin käyttämällä Sequencing Analysis v.5.3.1 ohjelmiston.

arviointi Tunnistetut Genominen Breakpoint

TCF7L2-RP11-57H14.3

PCR

genominen breakpoint tunnistaa koko genomin sekvensointi data, joka yhdistää

TCF7L2

osoitteeseen

RP11-57H14.3

että koolonisyöpäsolulinja HCT116, validoitiin käyttämällä PCR.

pohjustajat genomi-PCR: llä (taulukko S1) suunniteltiin genomiseen murtuessa sekvenssi, jonka osoittaa nFuse, käyttämällä samaa lähestymistapaa kuin edellä on kuvattu RT-PCR-määrityksissä. Kaksikymmentäyksi CRC solulinjoissa, mukaan lukien HCT116, testattiin tunnistetaan genomisen murtuessa käyttäen 100 ng DNA: ta, kuten tulo kunkin reaktion. Seuraavat pyöräily protokollaa käytettiin genomisen PCR: 15 minuuttia HotStarTaq DNA-polymeraasin aktivoinnin 95 ° C: ssa, kolmen vaiheen aikana (toistetaan 35 kertaa) denaturaatio 30 sekuntia 95 ° C: ssa, alukkeen yhden minuutin ja 15 sekuntia 60 ° C: ssa ja pidennys yhden minuutin ajan 72 ° C: ssa. Viimeisen syklin jälkeen, lopullinen laajennus vaihe suoritettiin 72 ° C: ssa 6 minuutin ajan. PCR-tuotteet erotettiin elektroforeesilla 200 V: ssa 30 minuutin ajan 2% agaroosigeelillä, ja visualisoitiin käyttäen etidiumbromidia ja UV-valossa.

Tulokset

RP11-57H14.3

on Novel Fusion Partner

TCF7L2

jossa Fusion Transcripts

Jos haluat etsiä

VTI1A-TCF7L2

fuusio ja uusia fuusiopartnereiksi, analysoimme pariksi-end RNA -sequencing tiedot kahdeksasta koolonsyöpäsolulinjoissa ja kuusitoista normaalin kudoksen näytteissä sekalaiset anatominen sivustoja. Soveltamalla ohjelmisto purkaa tunnistimme välillä 16 ja 1050 mahdollisia fuusio selostukset näytettä kohti. Koko perimän DNA sekvensointi data neljän paksusuolen syövän solulinjojen nFuse ohjelmiston välillä havaitut 70 ja 126 mahdollisten genomisten raja-arvoihin. Kaikista fuusiot tunnistettu, vain NCI-H508 kanna

VTI1A-TCF7L2

fuusio transkriptio, jossa on yksi breakpoint ulottuen eksonista kaksi

VTI1A

eksonia kuuteen

TCF7L2

kuten jo raportoitu tähän solulinjassa Bass et al. [1]. Olemme kuitenkin tunnistaneet genomista keskeytyskohta (chr10:114,850,371-114,640,318 (GRCh37)) CRC solulinjassa HCT116, joka kesti peräisin introni alueella

TCF7L2

ylävirtaan on

RP11-57H14.3

(ENSG00000225292) vastaavaan RNA-fuusion (taulukko 1).

RP11-57H14.3

sijaitsee intergeenisessä välisellä alueella

VTI1A

ja

TCF7L2

noin 44 kb ylävirtaan

TCF7L2

. Ennustettu genomisesta raja-arvot korreloivat lisääntynyt genomisen peitto alueella välillä, mikä viittaa siihen, genominen päällekkäisyys aiheuttaa fuusion (kuvio 1). Sekä genomisia breakpoint ja fuusio transkripti välillä

TCF7L2

ja

RP11-57H14.3

todennettiin PCR ja RT-PCR. Tunnistetut genominen murtuessa varmistettiin vuonna HCT116 solulinjassa, mutta ei havaittu missään 20 muut testatut solulinjat, mikä vähentää todennäköisyyttä, että genominen keskeytyskohdan kuvastaa yhteistä DNA kopiomäärä polymorfia.

kolme kimeerinen RNA sekvenssi-lukee kesti fuusio transkriptio murtuessa, kulkee eksonista 4

TCF7L2

(ENST00000369395) eksonia 3

RP11-57H14.3

(ENST00000428766), kromosomissa 10. Tummat värit osoittavat eksonit eivät kuulu fuusio transkriptio. RNA-seq ilmaisun ja DNA-seuraavissa kattavuus tasot perustuvat sekvensointi datan HCT116-solulinjaa. Kaksi geenilokusten on merkitty sinisellä ja punaisella laatikot. Genominen breakpoint sekvenssin tunnistaa nFUSE CRC solulinjassa HCT116 annetaan; ulottuen introni alueella

TCF7L2

ylävirtaan on

RP11-57H14.3

. Koordinaatit breakpoint (chr10:114,850,371-114,640,318 (GRCh37)) on merkitty kromosomin asennossa akselilla. Sijainti breakpoint korreloi hyvin lisääntynyt genomista kattavuutta nähtynä Genomikartoituksen tiedot.

korkea esiintyvyys

TCF7L2

-involving Fusion Transcripts, molemmat Ottamalla

VTI1A

ja

RP11-57H14.3

Genes

Käyttämällä samaa alukkeita kuten kuvaavat Bass et al. [1] (kuva 2), havaitsimme

VTI1A-TCF7L2

fuusio selostukset eri eksonin eksonin yhdistelmiä 45 ulos 106 CRC näytteistä (42%) (taulukko 2). Fusion transkriptit sekä havaita 4 14 normaalin paksusuolen limakalvon näytteitä. Niistä 14 pariksi kasvaimeen normaali näytteissä, kahdeksan paria olivat positiivisia ainoastaan ​​kasvain, kolme paria olivat positiivisia sekä kasvain ja normaali, ja yksi pari positiivinen yksinomaan normaalissa (taulukko 3). Esiintyvyys fuusio transkriptien oli samanlainen mikrosatelliitti vakaa ja epävakaa kasvaimia. Kymmenen ulos 21 solulinjojen, kuten NCI-H508, tunsivat fuusio selostukset erikokoisia. Lopuksi viisi normaali kudosnäytteitä eri anatomisia sivustoja kehon ilmaisi fuusio selostukset (taulukko S2). Koska RT-PCR Tulokset paljastivat ristiriitaisia ​​tuloksia (Kuva S1 ja Kuva S2), suoritimme kaikki RT-PCR: ää kolmena kappaleena, identtiset parametrit, tutkia toistumisen fuusio selostukset (taulukko S3). Fusion transkriptit havaittiin vain johdonmukaisesti kaikissa kolme ajoa neljän näytteen; kolme kasvain näytteet ja NCI-H508 solulinja (3,1% kaikista CRC näytteiden ja solulinjojen). Tämä taajuus on samanlainen kuin alun perin tunnistettu taajuus

VTI1A-TCF7L2

transkriptien (3%), jonka Bass et al. [1].

Kaikki kolme geenit sijaitsevat 720

VTI1A,

ENST00000428766 vuonna

RP11-57H14.3

ja ENST00000369395 in

TCF7L2

. Lisäksi, sisäkkäisiä PCR-määrityksissä käytetään havaitsemiseen niin fuusio- transkriptien on esitetty. Punainen ja mustat nuolet edustavat ensimmäisellä kierroksella ja toisella kierroksella käytetyt alukkeet, vastaavasti.

Olemme havainneet

TCF7L2-RP11-57H14.3

fuusio selostukset kanssa eri eksoni-eksonin yhdistelmiä 48 ulos 106 CRC näytteistä (45%, taulukko 2). Niistä 14 pariksi kasvaimeen normaali näytteissä, viisi paria olivat positiivisia ainoastaan ​​kasvain, ja neljä paria olivat positiivisia sekä kasvaimen ja normaali (taulukko 3). 19 ulos 21 solulinjojen, tunsivat fuusio selostukset erikokoisia. Myös 15 ulos 20 normaalin kudosnäytteiden oli positiivinen fuusio transkriptien (taulukko S2). Kuten

VTI1A-TCF7L2

fuusio, suoritimme kaikki RT-PCR: ää kolmena kappaleena tutkimaan toistumisen fuusio selostukset (taulukko S3). Oli yhteensä 20 näytettä, jotka toistuvasti positiivisen fuusio selostukset; kuusi kasvain näytteet viisi näytettä normaaleista kudoksista ja yhdeksän solulinjoissa (mukaan lukien HCT116-solulinjaa). Mielenkiintoista, NCI-H508 solulinja oli negatiivinen

TCF7L2-RP11-57H14.3

fuusio selostukset kaikissa kolme toistoa.

Emme löytäneet korrelaatiota CRC positiivisia

TCF7L2

sisältävä fuusio- transkriptien joissa

VTI1A

ja

RP11-57H14.3

(p = 0,33; Fisherin eksakti testi). Edelleen taajuudet fuusio selostukset eivät olleet merkittävästi erilaiset välillä mikrosatelliittimerkkien instable

vs.

Vakaa kasvaimia, eikä välissä kliinisen vaiheen (tuloksia ei ole esitetty).

Kaikki sisäkkäisiä PCR replikoituu sekä määritykset sisälsivät negatiivinen no templaattikontrollien. Nämä negatiiviset -kontrollireaktiot koskaan tuottanut havaittavaa PCR-tuotteet (Kuva S1 ja S2).

Kimeeriset Jaksot katetaan yleensä Ehjä eksoni Splice sivustoja Partner Geenit

Yhdestä RT-PCR suoritetaan, kaikki näytteet, jotka olivat positiivisia fuusioista ja oli yksi PCR-tuote valittiin Sanger-sekvensoinnilla kimeerisen RNA-sekvenssejä tunnistamaan tarkka raja-arvot. Sillä

VTI1A-TCF7L2

(n = 25), saimme sekvenssit kaikki 25 tällaisen erillisen fuusion transkriptio RT-PCR-tuotteet, joissa 24: 25 oli sekvenssit yhdistää ylävirran sekvenssit eksonien 1, 2, 3, 5 tai 7

VTI1A

myötävirtaan sekvenssit eksonien 4 tai 6

TCF7L2

, jossa säilyttäminen saman eksonin eksonin rajoja kuten jo selityksin geenin rakenteet (ENST00000393077 in

VTI1A

ja ENST00000369395 in

TCF7L2

). Yksi jaksotelluille tuote ei sisällä selkeää eksoni-eksoni rajoja, mutta kytketty kaksi selostukset keskellä eksonissa 7

VTI1A

ja 6

TCF7L2

. Yhteensä seitsemän erilaista fuusiota raja-arvot havaittiin (taulukko S3), mukaan lukien alkuperäinen murtuessa välillä eksonin 2

VTI1A

ja eksonin 6

TCF7L2

NCI-H508 (kuvio 3) [1] . Tämä tarkka murtuessa ei havaittu missään muissa näytteissä, mutta suurin osa ehjä fuusio selostukset koostui samasta osasta

TCF7L2

(n = 17) noin ottaa eksonin 4

TCF7L2

silmukoituna eksoniin 6 (n = 7).

VTI1A

alkupään osuus vaihteli enemmän, joilla on viisi eri yhdistelmiä liitetään alavirtaan

TCF7L2

osia.

Sangerin sekvensoinnilla vahvisti alkuperäisen fuusio transkriptio löydetty NCI-H508, esittäen breakpoint sekvenssi ulottuu eksoni-eksoniliitokset välillä eksonissa 2

VTI1A

ja eksonin 6

TCF7L2

. Bass et al. havaitsivat myös kolme muuta fuusio transkriptien sisäkkäisiä-PCR. Koska transkriptio huomautus ei ollut riittävästi kuvattu, emme voi sanoa, jos nämä fuusiot ovat identtisiä joihinkin transkriptien olemme tunnistaneet.

TCF7L2-RP11-57H14.3

(n = 27), saimme sekvenssit kaikista 27 eristetty fuusio transkriptio RT-PCR-tuotteiden, jossa 26 ulos 27 oli sekvenssit yhdistää perusteella eksoni 4

TCF7L2

sekvensseille eksonien 1, 2 tai 3

RP11-57H14.3

, myös säilyttäminen saman eksonin eksonin rajoja kuten jo selityksin geenin rakenteet (eksoni numerointi on sama kuin edellä

TCF7L2

ja mukaan ENST00000428766 varten

RP11-57H14.3

). Yksi utelias tapauksessa kimeerinen sekvenssi merkitty, tunnistettu CRC solulinjassa FRI, oli fuusio transkriptio ulottuen kolme geenien ei-kanoninen genomista järjestyksessä, liittymällä

TCF7L2

eksoni 4

VTI1A

eksonien 5 , 6, ja 7, ja edelleen ulottuu

RP11-57H14.3

eksonit 1, 2, ja 3 myös tähän ainutlaatuiseen tapauksessa saman eksonin eksonin rajoja käytettiin vuonna jo selityksin geeni kuvatut rakenteet edellä. Kaikkiaan neljä erilaista fuusiota transkriptien tunnistettiin joissa

TCF7L2-RP11-57H14.3,

kaikki esiintyvät useissa näytteissä jokaisessa.

Keskustelu

Meillä on tässä kertomuksessa tunnistettu geeni

RP11-57H14.

3 uutena fuusio- kumppani

TCF7L2

CRC. Herkkien sisäkkäisiä RT-PCR, olemme paljastaneet, että molemmat aiemmin raportoitu

VTI1A-TCF7L2

fuusio selostukset, ja tässä identifioitu

TCF7L2-RP11-57H14.3

, ovat erittäin yleisiä keskuudessa CRC vaikka ilmaisi alhaiselle tasolle. Olemme myös havainneet fuusio-transkriptien normaalissa paksusuolen limakalvossa, samoin kuin normaaleissa kudoksissa muista anatomisissa kohdissa. Kolme rinnakkaista sisäkkäisiä-PCR tutkimaan läsnäolon

TCF7L2

johon fuusio selostukset osoitti vaihtelevia tuloksia, joitakin näytteitä testaamalla aluksi positiivinen fuusio transkriptio, mutta negatiivinen suoritettaessa peräkkäistä aikavälillä tai

päinvastoin

. Kuitenkin Sanger sekvensointi johti vahvistuksen puhtaan eksonin eksoniin murtuessa risteykset, vähentää todennäköisyyttä, että PCR esineitä, kuten polymeraasi mallin kytkentä [17], koska syy epäjohdonmukaisuutta. Negatiiviset kontrollit tehtiin myös kaikissa RT-PCR toimenpiteet, mukaan lukien cDNA-synteesi, ensimmäisen kierroksen PCR ja sisäkkäisiä-PCR. Yksikään negatiivisista kontrolleista johti havaittavissa tuotteita, tukevat, että korkean taajuuden fuusion selostukset havaittu ei seurausta PCR saastuminen (Kuva S1 ja Kuva S2). Vaikka fuusio transkriptit havaittiin korkealla taajuudella sisällä testattu biopankki materiaalien tunnistaminen

TCF7L2

sisältävä fuusioita kokonaisten transcriptome sekvensointi data oli menestyksellinen ainoastaan ​​kahdesta solulinjojen yhteensopivat genomisen raja-arvot. Nämä kaksi solulinjaa ei yhtä hyvin olla johdonmukaisesti vahva ilmaus fuusio selostukset, koska ne tuotetaan johdonmukainen ja selkeä RT-PCR-tulokset kaikkien rinnakkaisnäytteiden. Näiden tulosten perusteella ehdotamme, että fuusio transkriptit tuotetaan välillä

TCF7L2

ja joko

VTI1A

tai

RP11-57H14.3

ilmaistaan ​​matalalla tasolla Tuumorinäytteissä, ja jotkut normaalia näytteitä. Läsnäolo fuusio selostukset ilmaisi matalalla tasolla ovat yhdenmukaisia ​​kolme fuusio selostukset äskettäin tunnistettu CRC, jossa

AKAP13-PDE8A, COMMD10-AP3S1,

ja

CTB-35F21.1-PSD2

havaittiin 17-58%: 106 ensisijaista syövän kudoksissa [12].

kaikki kolme kumppani geenit sijaitsevat koura kromosomin 10, sisällä 721 kbp, ja ne kaikki luetaan saman lohkon vuonna jotta

VTI1A, RP11-57H14.3, TCF7L2

(kuva 2). Tämä viittaa siihen, RNA-polymeraasi lukea läpi mahdollisena mekanismi tuottaa

VTI1A-TCF7L2

transkriptien ilman vastaavan genomisen keskeytyskohta. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että geenien lähellä ihmisen genomissa ilmaistaan ​​yhdistyivät geenejä, joita kutsutaan myös tandem-kimeerojen transkriptien, jotka on yhdistetty ainakin osittain yhden eksonin kahdesta tai useammasta erillisestä geenejä, jotka sijaitsevat samassa kromosomissa [18] – [20]. On ehdotettu, että ilmaus conjoined geenien lisätä monimutkaisuutta ihmisen perimän kääntämällä erillisiin proteiineja, tai että nämä transkriptit on rooli sääntelyn kanoninen transkriptipitoisuuksissa. Yksi ehdotettu mekanismia niiden sukupolvi on, että transkriptio kone vältetään päättymisestä signaalin ylävirtaan geenistä ja jatkuu litterointia alavirtaan geenistä ennen päättyy alavirran päättymisen signaali [19], [21]. Suurin osa conjoined geenien uskotaan ilmaistaan ​​matalalla tasolla, koska ne ovat usein tuettu vain yksi expressed sequence tag tai mRNA-sekvenssin perimän tietokantoihin, mikä on linjassa havaintoja heikosti ilmaistu

TCF7L2

sisältävä fuusio transkriptien CRC.

sukupolvi

VTI1A-TCF7L2

selostukset voidaan selittää kuin tuote polymeraasin lukea läpi, mutta tämä ei voi olla toiminnan mekanismina varten

TCF7L2-RP11-57H14.3

fuusio selostukset. Tässä tapauksessa eksonia

TCF7L2

ja

RP11-57H14.3

liitetään yhteen ei-kanoninen genomista järjestyksessä käyttämällä konsensus jatkos-sivustoja. Tämä transkription mekanismi on aiemmin kuvattu Nigro et al. kuten eksoni muokkaamisella; prosessia, jossa eksonit ovat liittyneet tarkasti yksimielisyyden liitoskohdat, mutta eri järjestyksessä kuin esiintyy ensisijaisen transkriptio [22]. He löysivät ilmiön tutkiessaan ehdokas tuumorisuppressorigeeniä (

DCC

), ja tunnistaa, että tuloksena salattu selostukset ilmaistaan ​​ja löytyy suhteellisen alhaiselle tasolle sekä normaaleissa että neoplastisten solujen. Äskettäin perustuvat syvään sekvensointi RNA, kuten salattu selostukset sadoista geeneistä tunnistettiin [23]. Tämä ryhmä ehdotti myös, että huomattava osa salattu selostukset ovat pyöreitä RNA: ita, jotka selittävät liittyminen eksonien ei-kanoninen järjestysrelaatio. He totesivat myös, että monet pyöreän isoformeja oli läsnä vastaavia määriä kuin heidän kanoninen lineaarinen kollegansa.

Kaiken kaikkiaan nämä lisätään tasoilla transkription ja genomin monimutkaisuus on linjassa tuoreimman raportin perusteella ENCODE hankkeen raportointi huomattavia väheneminen pituudet intergeeniset alueiden, ja yhä päällekkäisiä geenien aikaisemmin oletettu olevan erillisiä geenipaikkojen, yhteensä kehotukset uudelleenmäärittelyä käsite geenin [24].

tunnistaminen genomista breakpoints yksittäisissä solulinjoissa for

TCF7L2

fuusiot sekä mukana

VTI1A

ja

RP11-57H14.3

, on kiehtova. Genominen raja-arvot tunnistettu osuvat hyvin usein havaittu fuusio selostukset löydettiin muissa näytteissä, joissa ei ole tällaisia ​​genominen uudelleenjärjestelyjä. Solulinjoista kanssa tunnistetaan genomisen raja-arvot, fuusio transkriptit havaitaan vahvalla tasolla kaikissa RT-PCR replikoituu, mikä viittaa siihen, että nämä solut ilmentävät fuusio-transkriptien korkeammilla tasoilla. Lisäksi solulinja

VTI1A-TCF7L2

genomista fuusio (NCI-H508) oli negatiivinen

TCF7L2-RP11-57H14.3

fuusio selostukset kaikissa rinnakkaisnäytteiden tukevat ~540 kb genominen deleetio geenien välinen alue välillä

VTI1A

ja

TCF7L2

alun perin tunnistettiin Bass et al.

läsnäolo fuusio- transkriptien sekä normaaleissa soluissa ja CRC-näytteiden yhdessä tunnistaminen genomista breakpoints yksittäisistä syöpäsolulinjasta liittyminen samat kaksi geenien genomin tasolla, ovat linjassa raportin fuusio transkriptin

JAZF1-JJAZ1

tunnistettu sekä normaaleilla limakalvon strooman solujen ja kohdun limakalvon stroomakasvaimet [25].

JAZF1-JJAZ1

on havaittavissa tran- normaaleissa endometriumin stroomasoluissa mutta genomista uudelleenjärjestelyjä löytyy vain neoplastiset solut. Li et ai. hypothesize että trans-silmukoinnin tuottavan näitä fuusio selostukset, sekä muut fuusio selostukset, voi esiintyä säännöllisesti normaaleissa soluissa ja kudoksissa. Lisäksi he viittaavat siihen, että saattaa olla yhteys trans-silmukoinnin tuottavan näitä fuusio selostukset ja sukupolvi genomisen uudelleenjärjestelyjen [26]. Genominen uudelleenjärjestelyt tai muut mekanismit voivat johtaa yli-ilmentymisen näiden fuusio selostukset, joilla voi olla onkogeeninen.

merkitystä geenin

TCF7L2

CRC kehitys suosii sen toimintaa.

TCF7L2

koodaa TCF4 transkriptiotekijä, joka on keskeinen alas-stream transkriptiotekijän WNT /β-kateniinin-signalointireitin muuttunut useimmissa CRC [5]. Alkuperäinen raportti

VTI1A-TCF7L2

todettu, että ehtyminen fuusio transkriptin aiheutti merkittävän menetyksen kiinnityspisteen riippumattoman kasvun fuusio positiivinen CRC solulinja NCI-H508 [1]. Usein mutaatiot polyadenine suolikanavan sisällä

TCF7L2

geeni on aiemmin raportoitu CRC, erityisesti mikrosatelliittien instable kasvaimissa [6]. Lisäksi mikrosatelliitti vakaa kasvaimet ovat äskettäin osoitettu satama usein mutaatioita

TCF7L2

[7]. Havainto, että

TCF7L2

johon fuusio transkriptit ovat havaittavissa niin suuri osa CRC näytteistä, mutta myös normaalia paksusuolen limakalvoa ja muita normaalia kudosta tyyppejä, paljastaa, että

TCF7L2

fuusio selostukset eivät ole erityisiä syöpään eikä paksusuolen ja peräsuolen. Näin ollen ne eivät ole potentiaalia syövän havaitseminen biomarkkerit kuten alun perin odotettiin.