Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Luuetäpesäkkeiden ovat erittäin yleisiä komplikaatioita rintasyöpiä. Nykyinen luumetastaasipotilailla hoitoja voimakas anti-imeytyvä aineet ovat vain lievittävä osoittaa, että tekijät riippumaton luun resorption ohjaus luun etäpesäke etenemistä. Autotaxin (ATX /NPP2) on erittyvä proteiini sekä onkogeenisia ja pro-metastasoitunut ominaisuuksia. Kautta lysosphospholipase D (lysoPLD) aktiivisuus, ATX ohjaa tasoa lysofosfatidihappo (LPA) veressä. Verihiutaleperäisen LPA edistää etenemistä osteolyyttiset etäpesäkkeet rintasyövän soluissa. Kysyimme, onko ATX oli mukana luun etäpesäke prosessi. Olemme tunnettu rooli ATX vuonna osteolyyttiset etäpesäke muodostumisen muuntogeenisten rintasyövän soluja hyödynnetään eri osteolyyttiset etäpesäke hiiri malleja.

Menetelmät /Principal Havainnot

Laskimoinjektio ihmisen rintasyöpä MDA -B02 solujen pakotettu ilmentymä ATX (MDA-B02 /ATX) ja inmmunodeficiency BALB /C

nude

hiiret parannettu osteolyyttiset etäpesäke muodostumista, arvioituna lisääntynyt luukadon, kasvain taakka, ja suurempi määrä aktiivisia osteoklastien metastaattista sivustolla. Hiiri rintasyövän 4T1 solujen aiheuttama muodostumista osteolyyttiset etäpesäkkeiden jälkeen sydämensisäisellä injektion immunokompetenteilla BALB /C-hiiriä. Nämä solut ilmaisivat aktiivinen ATX ja hiljentäminen ATX ilmaisun esti laajuus osteolyyttiset vaurioita ja vähensi aktiivisen osteoklastien luun metastaattisen sivustolla.

In vitro

, osteoklastien tehostui läsnäollessa MDA-B02 /ATX soluravintoliuoksista tai yhdistelmä autotaxin joka esti autotaxin estäjä vpc8a202.

In vitro

lisääminen LPA aktiiviseen puuhiilikäsitelty seerumia palautti kapasiteetin seerumin tukemaan RANK-L /MCSF aiheuttama osteoklastigeneesin.

Päätelmä /merkitys

Expression of autotaxin syöpäsolujen ohjaa osteolyyttiset etäpesäke muodostumista. Tämä työ osoittaa uusi rooli LPA tekijänä, joka stimuloi suoraan syövän kasvua ja etäpesäkkeiden, ja osteoklastien. Siksi kohdistaminen autotaxin /Melan kappale nousee mahdollisen uuden terapeuttinen lähestymistapa parantaa lopputulosta potilaiden luuetäpesäkkeistä.

Citation: David M, Wannecq E, Descotes F, Jansen S, Deux B, Ribeiro J , et ai. (2010) Cancer Cell ilmentäminen Autotaxin Controls Bone metastaasin muodostumista hiiren avulla Lysofosfatidihappo riippuva aktivointi osteoklastien. PLoS ONE 5 (3): e9741. doi: 10,1371 /journal.pone.0009741

Editor: Erik Danen, Leiden /Amsterdam Center for Drug Research, Leidenin yliopisto, Alankomaat

vastaanotettu: 14 tammikuu 2010; Hyväksytty: 26 helmikuu 2010; Julkaistu 17. maaliskuuta 2010

Copyright: © 2010 David et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta INSERM (OP ja PC), Comité départemental de la Loire de la Ligue Nationale contre le Cancer (OP), Ranskan National Institute of Cancer, INCA (OP, sopimus 0610-3D1616-102 /PL 2006 ) ja Ranskan Association pour la Recherche sur le Cancer, ARC (OP). M. D. oli vastaanottaja apurahan päässä Ligue Nationale contre le Cancer. J.S. omistaa tutkijatohtorin Tutkimussäätiön – Flanders (FWO). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Bone on yleinen metastaattinen sivuston moniin syöpiin [1]. Luun etäpesäkkeitä liittyvät hypokalsemian takia luun tuhoutumisen, vaikeasti luukipu ja patologiset murtumat. Tuumorisoluja läsnä luun metastaattinen sivuston edistää osteoklastien välittämää luun hajoamista, ja luun kasvutekijät vapautuvat resorboituu luun edistää kasvaimen kasvua, mikä johtaa kehitystä noidankehä. [2]. Valitettavasti nykyiset hoidot käyttämällä tehokkaita antiresorptiivi- aineet (bisfosfonaatit) ei anna elämää pidentää hyötyä potilaille luuetäpesäkkeistä nostamalla tarvetta parempaa tietoa molekyylitason mekanismeja tässä patologian [3]. Olemme äskettäin havainneet, että lysofosfatidihappo (LPA) on johdettu verihiutaleiden vaikuttaa paikallisesti tuumorisoluissa edistää etenemistä luun etäpesäkkeiden [4]. Niistä solun pinnan reseptoreihin ja LPA (LPA

1-6) ilmaisemia tuumorisolut, osoitimme, että LPA

1 aktiivisuuden vallinnut luumetastaasin etenemisen ja että kohdistaminen tämä reseptori oli uusi hoitostrategia vastaan ​​luustometastaaseja [ ,,,0],5]. Kuitenkin, miten LPA syntyy kasvaimen päällä ja kuinka LPA tuotetaan itse kasvainsoluihin voi edistää etenemistä luun etäpesäkkeitä ei vielä tunneta.

Autotaxin (ATX, NPP2) kuuluu nukleotidin pyrofosfaatti fosfodiesteraasi (NPP ) perhe [6]. Sen lisäksi, että konservoituneet fosfodiesteraasin (PDE) aktiivisuutta kaikkien ydinvoimalaitosten autotaxin on ainutlaatuinen lysofosfolipaasille D (lysoPLD) aktiivisuus, jolloin sukupolven LPA peräisin lysofosfatidyylikoliinin (LPC) [7]. Biologinen merkitys PDE ja lysoPLD toimintaa autotaxin toimintoja on vielä määrittämättä. Kuitenkin toiminnallinen merkitys katalyyttisen aktiivisuuden autotaxin

in vivo

äskettäin osoitettiin peräisin hiirten tutkimukset osoittavat, että autotaxin vastaa tasoa LPA verenkierrossa [8], [9]. Välinen yhteys lisääntynyt lysoPLD toiminnan ja muodostumista LPA löydettiin eri sairauksista kuten nivelreuma [10], neuropaattista kipua [11], krooninen hepatiitti C [12] ja adiposyyttien insuliiniresistenssiä lihavuuden [13]. Autotaxin on glykoproteiini identifioitiin aluksi autokriininen motiliteetti tekijä erittävät ihmis-melanooma-solut [14], [15]. Lisääntynyt ilmentyminen autotaxin on osoitettu korreloivan lisääntynyt invasiivisuus rintasyövän solujen [16] ja sen havaittiin parantaa metastaattista potentiaalia ras-transformoituja 3T3-fibroblastien [17]. Expression of autotaxin mRNA havaittiin pohjapinta tasolla lähes kaikissa ihmisen kudoksissa [18]. Kiinnostavaa, säätelyä autotaxin geenin raportoitu monenlaisia ​​syöpiä, kuten glioblastooma [19], aggressiivinen neuroblastooma [20], ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [21], uveal melanooma liittyvät huonoon ennusteeseen [22], kilpirauhasen karsinooma [23 ], maksasyövän etäpesäkkeitä [24], ja rintasyövän [16]. MMTV-

ATX

siirtogeenisiä hiiriä, joilla nimenomaan lisääntynyt ilmentyminen autotaxin maitorauhasen osoittivat lisääntyneen ilmaantuvuuden spontaanien nisäkasvaimia yli kahden vuoden aikana, joka havainnollistaa pro-onkogeenisiä funktio autotaxin [25].

Tässä tarjoamme kokeellista näyttöä siitä, että rintasyövän soluja, jotka ilmentävät autotaxin on selektiivinen etu muodostumisen indusoimiseksi osteolyyttiset etäpesäkkeet seurauksena uusi pro-osteoklastien toimintaa autotaxin johdettu tuote LPA. Nämä tulokset kuvaavat roolin autotaxin kehittyneissä rintasyöpiä ja ehdottaa, että kohdistaminen autotaxin /Melan raita olla lisähyötyä potilaille, jotka kärsivät luumetastaaseja.

Tulokset

De novo

autotaxin ilmentyminen lisää proliferaatiota ja hyökkäys ihmisen MDA-B02 rintasyövän soluja

in vitro

Olemme osoittaneet aiemmin, että MDA-B02-solut eivät ilmennä autotaxin vakaassa tilassa [4]. Sen arvioimiseksi, onko autotaxin on rooli etäpesäkkeiden levittämisen rintasyöpäsoluja, otimme käyttöön cDNA rotan autotaxin osaksi MDA-B02-solut. Käytimme tet-Off säädeltävä ekspres- järjestelmä, jossa autotaxin ilmentyminen yhdessä lusiferaasin saavutetaan erityisesti ilman repressorin, doksisykliini [4]. Ainutlaatuisena jäsenenä NPP perheen autotaxin näyttelyitä sekä lysoPLD ja fosfodiesteraasi toimintaa [26], [27]. Näin ollen, kuten valvonta-solulinja transfektoimme MDA-B02-solut ilmentämisvektorilla, joka koodaa hiiren NPP1, joka toimii nukleotidifosfodiesteraasin, mutta josta puuttuu varten lysoPLD toimintaa.

Kunkin konstruktin, valitsimme kaksi stabiilia kloonit: MDA-B02-ATX klooni no. 30 ja no. 38, ja MDA-B02-NPP1 klooneja no. 10.5 ja no. 42. ilmentyminen autotaxin erittyvänä proteiinina ja NPP1 kuin kalvoon sitoutunut proteiini varmistettiin western-blottauksella käyttämällä spesifisiä vasta-aineita (kuvio 1A). Klooni valinnat perustuivat korkea lusiferaasiekspressio puuttuessa doksisykliini (kuvio 1 B). Kuten odotettua, havaitsimme, että ilman doksisykliiniä vain MDA-B02-ATX klooneja hankki lysoPLD aktiivisuutta (kuvio 1 B), kun taas sekä MDA-B02-ATX ja MDA-B02-NPP1 klooneista oli lisääntynyt PDE-aktiivisuus, verrattuna emosoluista (kuvio 1 B).

(A) solut, jotka on transfektoitu kaksisuuntainen ilmentämisvektorit pBiL-ATX tai pBil-NPP1 maljattiin kanssa (+) tai ilman (-) doksisykliiniä (Dox). Proteiinit käytetystä elatusaineesta (CM) tai lysaatit kasvainsolujen (CL) kahden stabiilien kloonien (no. 30 ja no. 38 ATX, no. 10,5 ja no. 42 NPP1) on electrophorezed sitten immunoblotattiin anti-ATX-vasta-ainetta (vasen paneeli) tai anti-Myc-vasta (oikea paneeli). (B) kvantitatiivinen lusiferaasiaktiivisuuden (vasen paneeli), lysoPLD aktiivisuus (lähi paneeli) ja PDE-aktiivisuus (oikea paneeli) kussakin klooni ja vanhempien MDA-B02-solut. (C) Solujen proliferaatio stimuloitiin LPC (10 uM) poissa ollessa tai läsnä ollessa Ki16425 (10 uM). Tulokset ilmaistaan%: inen BrdU-liittymisen verrattuna stimuloimattoman MDA-B02 emosoluilta. Tiedot vastaavat keskiarvoa ± SD 6 rinnakkaisnäytteiden ja ne edustavat vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. (D) Cell invaasio stimuloitiin 10% FBS: ää käytetään kemoattraktantti. Tulokset ovat keskiarvoja ± SD solujen 3 rinnakkaisnäytteiden ja ne edustavat vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Tiedot on ilmaistu solujen määrä /mm

2. *,

P

0,05. **,

P

0,01

Olemme osoittaneet aiemmin, että hoito LPA lisää leviämisen MDA-B02-solujen [4]. Täällä, havaitsimme, että ilman doksisykliini, LPC oli mitogeeninen itse sekä vanhempien MDA-B02-solut ja transfektoidut kloonit (kuvio 1 C). Tämä havainnoista saattaisi heijastaa lauseke LPC reseptorit (GPR4, TDAG8) in MDA-B02-solut sekä rinta- kasvaimissa [28]. Kuitenkin LPC-riippuvaista proliferaatiota lisättiin vielä MDA-B02-ATX-soluissa, mutta ei MDA-B02-NPP1 soluja tai emosoluista. Lisäksi solujen käsittely Ki16425, antagonisti LPA

1 ja LPA

3-reseptoreita, täysin estetty autotaxin-riippuvainen, mutta ei LPC-riippuvaista soluproliferaatiota (kuvio 1C). Tämä osoitti, että yhdistelmä-ATX ilmaisemat MDA-B02-ATX solut tuottivat aktiivinen LPA että stimuloi soluproliferaatiota kautta LPA

1-3-reseptori-riippuvaisen reitin.

Autotaxin on liitetty invasiivisuus on ras- transformoitujen fibroblastien ja rintasyövän solujen [16], [17]. Havaitsimme, että, puuttuessa doksisykliini, MDA-B02-ATX klooneja oli merkitsevästi suurempi kyky hyökätä Matrigel ™ vastauksena FBS kuin läsnäollessa doksisykliiniä (kuvio 1 D). Vahvistuksen invaasiokyvyn MDA-B02-ATX kloonien havaittiin myös verrattuna vanhempien soluihin ja MDA-B02-NPP1 klooneja, sijoitetaan joko poissa tai läsnä ollessa doksisykliini. Nämä tulokset vahvistivat, että autotaxin lisäsi invasiivista potentiaalia rintasyövän solujen mekanismi, joka tarvitaan sen lysoPLD toimintaa.

De novo

autotaxin ilmentyminen lisää

in vivo

MDA-B02 luumetastaasipotilailla muodostuminen

Olemme aiemmin osoittaneet, että LPA johdettu verihiutaleiden tukee etenemistä luuetäpesäkkeistä välittämien MDA-B02-solujen hiirissä [4]. Oletimme, että kohonnut kasvaimen soluista peräisin lysoPLD aktiivisuus voi edistää luun etäpesäke. Kolmekymmentä kaksi päivää sen jälkeen laskimoon ymppäyksen tuumorisolujen

nude

hiirillä, röntgenkuvaus analyysit paljastivat, että eläimet, joissa MDA-B02-ATX kloonia 40%: sta 70% lisäys laajuus osteolyyttisiä leesioita, verrattuna mitä havaittiin MDA-B02-NPP1 klooneista ja vanhempien solut (kuvio 2A). Histologiset tutkimukset ja histomorfometrisillä analyysit vahvistivat röntgenkuvissa havainnot ja osoittaneet, että

de novo

ilmaus autotaxin rintasyöpä solujen vähensi luun tilavuus (BV /TV) ja lisääntynyt luuston kasvaintaakkaa (kuvio 2A). Olemme havainneet eroa jalat metastaattisen sisältämiin eläimiin MDA-B02-NPP1 kloonien verrattuna MDA-B02 vanhempien solujen histologista tasolla (kuvio 2B). Olemme aiemmin osoittaneet, että LPA stimuloi teho syöpäsolujen kasvattamiseksi rekrytoinnin osteoklastien at luun metastaattista sivustolla [4]. Täällä, havaitsimme, että pinta aktiivista osteoklastien kohti trabekkeliluulla alue sijaitsee luun /kasvainsolujen rajapinta nostettiin sisältämiin eläimiin MDA-B02-ATX klooneja, verrattuna saaneilla hiirillä vanhempien tai NPP1 ilmentäviä tuumorisoluja ( kuvio 3).

(A) (vasen paneeli) edustaja röntgenkuvia takaraajojen peräisin metastaattinen hiirillä, joilla on MDA-B02-soluja tai MDA-B02-ATX klooni ei. 30 tai MDA-B02-NPP1 klooni no. 42, 29 päivää tuumorisolujen inokulaation jälkeen. Osteolyyttiset vauriot nuolilla (asteikko bar: 0,5 cm). (Oikea paneeli) kvantifiointi osteolyyttisiä vaurioalueet röntgenkuvissa metastaattisessa eläimillä. Tiedot vastaavat keskiarvoa ± SE kaksi erillistä koetta, on 7-10 eläintä ryhmää kohti. (B) (vasemmanpuoleiset paneelit) edustaja luun histologia Goldner kolmivärimenetelmä-värjättyä sääriluun päässä metastaattisen eläimistä. Bone värjätään sininen; luuytimen ja kasvaimen solut värjätään punaisella. (Asteikko bar: 1 mm). (Oikea paneeli) Histomorfometrinen analyysi metastaattisen hindlimbs käyttäen luun tilavuus /kudoksen tilavuus ration (BV /TV, mustat palkit ja vasen akseli) ja tuumorin tilavuus /kudoksen tilavuuden suhde (TumV /TV, avoimet pylväät ja oikea akseli) kuin verrokit. Arvot ovat keskiarvo ± SE 7-10 eläintä ryhmää kohti edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta. *,

P

0,05.

(ylempi vasen paneeli) edustaja immunohistologinen tutkiminen proksimaalisen sääriluun jaostojen metastaattinen eläimistä 29 päivää kasvainsoluinokulaation jälkeen, käyttäen anti-ATX-vasta 4F1. T on syöpäsoluja. (Alempi vasen paneeli) edustaja histologinen tutkiminen TRAP-värjättyä sääriluun osastoja metastaattisen eläimistä. T on syöpäsoluja. Bone värjätään tummansininen ja osteoclats värjätään punaisella (nuolet). (Oikea paneeli) kvantifiointi aktiivinen-osteoklastien resorptiota pinta per trabekkeliluulla pinta (Oc.S /BS). Tulokset ovat keskiarvo ± SE 8-9 eläintä ryhmää kohti. *:

P

0,05. Mittaviivat: 200 pm.

Kaiken tuloksemme osoittivat, että lisääntynyt ilmentyminen autotaxin by MDA-B02-solujen parannettu muodostumista osteolyyttiset etäpesäkkeitä.

alassäätely autotaxin ilmaisun estää invaasio mutta ei leviämisen hiiren 4T1 rintasyöpäsolujen

Vastatakseen roolin autotaxin luun etäpesäke muodostumiseen käytettäessä immunokompetenteilla yhteydessä olemme hyödyntäneet 4T1-solulinja, joka on peräisin yhdestä hiiren maitorauhasen kasvain ja yhteenveto siitä erilliset vaiheet metastaasin kun Siirto tehty osaksi maitorauhasen syngeenisiin BALB /C-hiiriä [29]. Ensinnäkin, huomasimme, että 4T1-solut ilmaisivat mRNA kaikenlaisen LPA reseptorien ja vastasi LPA stimulaation (kuvio 4A ja 4B). Lisäksi olemme havainneet, että 4T1 soluja ilmaisi autotaxin otteen ja proteiinia (kuvio 4A ja 4C), osuus eritystä entsymaattisesti aktiivinen autotaxin proteiinia (kuvio 4C). Analysoida toiminnon endogeenisen ilmentymisen autotaxin rintasyöpä solut luun etäpesäkkeiden muodostumiseen käytimme RNA-interferenssi tapa vahvistaa joukon kolme kloonien 4T1 solujen vakaasti alassäädetty autotaxin ilmentymistä (4T1-siATX), sekä kolme ohjaus 4T1 kloonien muuttumattomana ilmentymä autotaxin (4T1-sbATX) (kuvio 4C). Sen jälkeen yksittäisiä luonnehdinta kunkin kloonin pitoisuuksien proteiinin ilmaisuja ja lysoPLD toimintaa, myöhemmin

in vitro

ja

in vivo

Kokeet suoritettiin käyttäen altaissa kolme kloonia varten 4T1-siATX ja 4T1-sbATX solulinjoissa, vastaavasti.

(A) RT-PCR-monistaminen tuotteita LPA reseptoreihin, LPA

1 (1), LPA

2 (2), LPA

3 (3), LPA

4 (4), LPA

5 (5), GPR87, P2Y5 ja autotaxin (ATX) peräisin 4T1 soluista koko RNA: t analysoitiin 2% agaroosigeelillä. MW, molekyylipainomarkkeri. (B) Cell invaasio stimuloitiin lisääntynyt LPA pitoisuuksia käytettiin kemoatrak-. Tulokset ovat keskiarvoja ± SD solujen 3 rinnakkaisnäytteiden ja ne edustavat vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Tiedot on ilmaistu solujen määrä /mm

2. (C) Autotaxin ilmentymistä 3 klooneja 4T1 solujen transfektoitu pStrike vektori koodaa joko merkityksetön pieni hiusneula RNAi (sbATX, kloonit no. 14, no. 16, no. 20) tai erityisen pieni hiusneula RNAi (siATX, kloonit no. 1, no. 17, no. 52). (Ylempi paneeli) immunoblottausmääritys käyttäen anti-ATX polyklonaalista vasta-ainetta tai anti? Tubuliinin kuin latauskontrollina. (Alempi paneeli) lysoPLD aktiivisuus (pmol LPA /ml) mitattuna soluviljelmissä kasvatusliuos. (D) Solulisääntyminen arvioi BrdU of 4T1 solujen ja poolin kolmen 4T1-sbATX klooneja (no. 14, no. 16, no. 20) tai kolme 4T1-siATX klooneja (no. 1, no. 17, no . 52), vasteena kohonneisiin LPC. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD 6 rinnakkaisnäytteiden ja ne edustavat 3 erottaa kokeita. (E) Invasion määrityksessä. Solut sijoitettiin läsnä ollessa tai ilman LPA (0,1-1 pM) ylempään kammioon ja FBS, käytetään kemoattraktanttia, pantiin alempaan kammioon. Tulokset ovat keskiarvoja ± SD 3 rinnakkaisnäytteiden ja ne edustavat vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Tiedot on ilmaistu solujen määrä /mm

2. *,

P

0,05.

Kuten aikaisemmin havaittu MDA-B02-solujen

in vitro

(kuvio 1 C), LPC osoitti mitogeenisestä toimia 4T1 solut (kuvio 4D). Kuitenkin vaimentaminen autotaxin ilmaisua ei muuttanut leviämisen 4T1-siATX soluja verrattuna havaittuun valvonnan ja vanhempien solulinjoissa (kuvio 4D). Tämä tulos oli yllättävä ja saattaa olla seurausta jäljellä lysoPLD aktiivisuus 4T1-siATX klooneja. Vaihtoehtoinen selitys olisi, että leviämisen 4T1 solujen jo maksimaalisesti kannustanut LPC. Sen sijaan käyttämällä siirtokuoppaan maahanmuutto kammiot päällystetään matrigeelin ™, havaitsimme, että hiljentäminen autotaxin ilmaisu esti FBS-odotuksiin hyökkäys 4T1-siATX soluissa (kuvio 4E). Tämä esto voitettiin lisäämällä LPA soluun osastoon siirtymisen kammioiden osoitetaan, että hyökkäys 4T1 solujen kontrolloitiin autotaxin kautta lysoPLD aktiivisuutta.

Down-regulation endogeenisen autotaxin ilmentymisen 4T1-soluissa estää osteolyyttinen luumetastaasipotilailla muodostuminen riippumattomasti ensisijaisen kasvaimen kasvua

in vivo

Voit selvittää, onko endogeeninen ilmentyminen autotaxin rintasyöpäsoluissa oli tärkeää luun etäpesäke muodostumista, 4T1-siATX ja ohjaus solulinjoja injektoitiin vasempaan kammioon sydämen naisten syngeenisiin BALB /C-hiiriä. Tämä strategia mahdollistaa ohittaa keuhkot ja kohdistaa soluihin muille sisäelimissä ja luun. Kaksi viikkoa sen jälkeen, kun solujen inokulaation, röntgenkuvaus analyysit paljastivat, että eläimet, joissa 4T1-siATX soluilla oli 50%: n lasku laajuus osteolyyttisiä leesioita, verrattuna eläimiin injektoitiin 4T1-sbATX tai 4T1 emosoluista (kuvio 5A). Histologinen analyysit paljastivat, että pinta-aktiivisen osteoklastien kohti trabekulaarisen luun pinta-ala, joka sijaitsee luun /kasvainsolujen käyttöliittymä on merkittävästi vähentynyt eläimillä, joissa 4T1-siATX solujen, verrattuna, joka havaittiin hiirissä, jotka kantoivat vanhempien tai 4T1-sbATX kasvainsoluja (kuvio 5B ). Olemme aiemmin osoittaneet, että LPA tuotetaan kasvaimen mikroympäristössä verihiutaleet [4]. Analysoida roolia endogeenisen autotaxin rintasyövän soluissa

in vivo

riippumatta luun mikroympäristössä, 4T1-siATX ja ohjaus solulinjoja inokuloitiin rasva-tyynyn naisten syngeenisiin BALB /C-hiiriä. Kahden viikon kuluttua, mikä vastasi samassa ajassa kasvaimen kasvun kuin mitä käytetään luun etäpesäkkeiden kokeissa, primaarikasvaimista kerättiin. Havaitsimme, että hiljentäminen autotaxin ilmaisua ei muuttanut kasvua primaarikasvainten sillä ei ollut merkittävää eroa koko 4T1-siATX kasvaimia, kun verrattiin 4T1-sbATX ja vanhempien kasvaimet (kuvio 6A).

In situ

immunologisesti Ki-67 ydin- antigeenin tuumorisektioiden eivät osoittaneet mitään eroa leviämisen 4T1-siATX ja kontrollisolut (kuvio 6B). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittivat, että endogeeninen ilmentyminen autotaxin ohjattu luun etäpesäkkeiden muodostumista, mutta ei kasvua 4T1-solujen

in vivo

.

(A) (vasen paneeli) edustaja röntgenkuvia takaraajojen BALB /C-hiiriä 14 päivän kuluttua sydämensisäisellä injektion 4T1 vanhempien solujen tai altaat 4T1-sbATX klooneja (no. 14, no. 16, no. 20) tai 4T1-siATX klooneja (no. 1, no. 17, no. 52) . Osteolyyttisiä vaurioita on merkitty nuolilla. (Oikea paneeli) kvantifiointi osteolyyttisiä vaurioalueet. Arvot ilmaistaan% leesio alueilla verrattuna vanhempien 4T1 soluihin. Tiedot vastaavat keskiarvoa ± SE kaksi erillistä koetta, on 8-10 eläintä ryhmää kohti. *,

P

0,05. (B) (vasen ylä- paneeli) edustaja immunohistologinen tutkimus proksimaalisen sääriluun osien välille metastaattinen eläinten 14 päivä tuumorisolujen inokulaation jälkeen, käyttäen anti-ATX-vasta-ainetta 4F1. T on syöpäsoluja. (Alempi vasen paneeli) edustaja histologinen tutkiminen TRAP-värjättyä sääriluun osastoja metastaattisen eläimistä. T on syöpäsoluja. Bone värjätään tummansininen ja osteoclats värjätään punaisella (nuolet). (Oikea paneeli) kvantifiointi aktiivinen-osteoklastien resorptiota pinta per trabekkeliluulla pinta (Oc.S /BS). Tulokset ovat keskiarvo ± SE 8-10 eläintä ryhmää kohti. *:

P

0,05. Mittaviivat: 200 pm.

4T1 vanhempien solujen 4T1-sbATX klooneja ja 4T1-siATX klooneja ruiskutetaan maitorauhasen normaaleissa syngeeninen BALB /C-hiiriä. 14. päivänä, primaarikasvaimista resekoitiin, ja punnittiin. (A) Rasiakuvaajat edustavat kasvaimen paino (mg). (B) Ensisijainen kasvaimia upotettiin parafiiniin. Kasvainkudossektioista analysoitiin mmunohistochemistry käyttämällä spesifistä vasta-ainetta vastaan ​​suunnattu ydin- ki-67-antigeenin. Mitoosi indeksi (numerot kussakin paneelissa) laskettiin prosenttiosuutena ytimien positiivisia ki-67 (tulokset ovat keskiarvo ± SD, asteikko bar: 50 pm). (C) Eläimet lopetettiin 35 päivää sen jälkeen, kun kasvainsolujen injektion ja keuhkot kerättiin määrällisesti spontaanisti metastaasit muodostumista 4T1-soluja. (Ylempi paneeli) edustava valokuvia keuhkojen kudosleikkeiden värjätään eosiinilla. (Alempi paneeli) kvantifiointi keuhkometastaasitestissä pesäkkeitä. Lukumäärä metastaasipesäkkeiden oli lueteltu alla mikroskoopilla. P 0,05. T osoittaa metastaasipesäkkeiden. Mitta-asteikko: 200 um.

Jotta analysoimiseksi kapasiteetti endogeenisen autotaxin tukemaan muodostumista spontaani metastaaseja 4T1 solujen

in vivo

solut ruiskutetaan utarerasvaa pad BALB /C-hiiriä. Ensisijainen kasvaimia kasvatettiin kahden viikon ajan, jolloin ne resekoitiin, jolloin syntyy spontaanisti etäpesäkkeitä. Kolme viikkoa sen jälkeen, kun resektio primaaristen kasvainten, eläimet tapettiin. Keuhkot kerättiin, kiinteät ja upottaa parafiiniin. Keuhkokudoksen leikkeet tutkittiin mikroskoopilla läsnäolo metastaasipesäkkeiden. Olemme havainneet, että hiirillä, jotka inokuloitiin 4T1-siATX soluja oli huomattavasti alhaisempi keuhko- metastaasien lukumäärä (80% vähennys) verrattuna hiirillä, jotka inokuloitiin 4T1 emosoluista (kuvio 6C).

Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että endogeenistä autotaxin kontrolloi kapasiteettia 4T1 rinta- syöpäsolujen metastaaseja ja indusoida osteolyyttiset etäpesäkkeet itsenäisesti soluproliferaatiota.

ilmentyminen autotaxin mRNA: n primaaristen kasvainten potilailla, joilla on rintasyöpiä

sitten kysytään vaikutuksia autotaxin ilmentymisen havaittiin hiiren kokeellisissa malleissa rintasyövistä voisi korreloi ihmisen sairauden. Analysoimme ilmentymistä autotaxin ilmentävien geeniä (

ENNP2

) reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR: llä sarjassa 167 rintojen kasvainbiopsioissa potilailta, joilla (n = 145) tai (n = 22) todettu etäpesäkkeitä klo diagnoosin ajankohdasta. Havaitsimme, että ilmaus

ENPP2

normalisoitu koodaavien geenien ribosomaalinen proteiini L32 (L32) tai TATA-box sitovan proteiinin (TBP, tuloksia ei ole esitetty), ei ollut muuttunut merkittävästi potilailla, joilla on luun tai pehmytkudoksen etäpesäkkeitä aikaan diagnoosin, verrattuna ei-metastaattinen potilailla (kuvio 7). Olemme myös löytäneet vastaavia tasoja

ENPP2

mRNA ensisijainen kasvaimia ei-metastasoituneen potilasta, jotka olivat kehittäneet luu- tai pehmytkudoksen etäpesäkkeitä viiden vuoden aikana (kuvio 7). Sitten tutkimme ilmaus

ENPP2

suhteessa kliinisiä, patologisia ja biologiset ominaisuudet, kuten on määritelty taulukossa 1. Me havaittu, että vaikka absoluuttinen mediaaniarvot

ENPP2

transkriptitasot oli kasvanut tasaisesti yhdessä ominaisuudet huono ennustavat, erot eivät saavuttaneet tilastollisesti merkitystä. Tämä osoitti, että ilmentyminen

ENPP2

in primaaristen kasvainten rintasyöpäpotilaiden oli riippumaton kasvaimen koon, luokka, solmu, estrogeenireseptori (ER) ja progesteronireseptori (PgR) tila (taulukko 1).

Yhteensä-RNA uutettiin ensisijainen rintojen kasvainbiopsioissa potilaita ilman tai etäpesäkkeitä aikaan diagnoosin. Pehmeä ja Bone edustavat subsets metastaattisen potilailla, joilla pehmytkudoksen vain ja etäpesäkkeitä luustossa, vastaavasti. W /O-Rec koostuvat osasta ei metastasoituneen potilailla, joilla ei toistuisi etäpesäke aikana viiden vuoden ajan. Pehmeä Rec ja Bone Rec edustavat potilasryhmissä, joilla uusiutumisen etäpesäkkeitä pehmytkudoksen vain ja luuhun viiden vuoden ajan, tässä järjestyksessä. n ilmaisee potilaiden määrä kussakin ryhmässä. Expression of Enpp2 /ATX mRNA mitattiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä. Kvantitatiivinen normalisoitiin vastaavan L32 RNA-arvot. Tiedot annetaan rasiakuvaajien mediaanin. Laatikko käsittää 25

th 75

th persentiilit. 5

th prosentit näkyvät virhejanoina.

LPA hallitsee osteoklastien

Osoitimme aikaisemmin, että LPA lisää tehoa syöpäsolujen indusoimaan eriyttäminen osteoklastien

in vitro

ja niiden rekrytointi

in vivo

klo luun metastaattista sivustolla [4].

In vitro

, väliaine kerätään MDA-B02-ATX kloonien merkittävästi parannettu erilaistumista kypsän osteoklastien luuytimestä soluprekursorit, verrattuna elatusainetta valmistettiin vanhempien soluista tai MDA-B02-NPP1 klooneja (kuva 8A). Lisäksi rekombinantti autotaxin kasvoivat merkittävästi M-CSF /RANK-L aiheuttama osteoklastien

in vitro

(kuvio 8B). Sen määrittämiseksi, onko vaikutus autotaxin johtui sen lysoPLD toimintaa, käytimme β-substituoitu analogi LPA (vpc8a202) kuvattu spesifinen inhibiittori [30]. Havaitsimme, että vpc8a202 esti autotaxin riippuva lisääntynyt osteoklastogeneesiä luuytimen soluissa, joita käsiteltiin M-CSF: n ja RANK-L (kuvio 8B). Osoitimme aikaisemmin, että LPA ohjaa epäsuorasti rintasyöpäsolulinja-induktion osteoklastogeneesin kautta eritystä pro-osteoklastien sytokiinien, IL-6 ja IL-8, kasvainsolujen [4]. Seerumi tarvitaan koko osteoklastien stimuloitaessa osteoklastiesiasteiden M-CSF /RANK-L

in vitro

[31]. Seerumi sisältää suuria määriä sekä LPA ja LPC [32]. Näin ollen meidän tulokset viittaavat siihen, että LPA syntyy autotaxin läsnä seerumin voi ohjata suoraan osteoklastien erilaistumista. Tämän hypoteesin testaamiseksi, käsittelimme sikiön seerumia aktiivihiilellä poistamiseksi kaikki lipidifraktioita. Havaitsimme, että lipidejä köyhdytettyä seerumi ei voinut tukea osteoklastigeneesin aiheuttamien M-CSF /RANK-L (kuvio 8C). Tämä estävä vaikutus rasva-köyhdytettyä seerumi pelasti lisäämällä puhdistettua LPA elatusaineissa (kuvio 8C). Tämä tulos osoitti, että LPA oli tarpeen seerumin /M-CSF /RANK-L indusoiman osteoklastogeneesiä.

(A) Luuytimen soluja viljeltiin läsnä FBS (10%), hiiren M-CSF, RANK- L ja MDA-B02 solu tai MDA-B02-ATX klooni # 30 tai MDA-B02-NPP1 klooni # 10.5 kasvatusliuos. (B) Luuytimen soluja viljeltiin läsnä FBS (10%), hiiren M-CSF, RANK-L ja rekombinantti-ATX, puuttuessa (-) tai kasvavien pitoisuuksien läsnä ATX-inhibiittorin, vpc8a202. (C) Luuytimen soluja viljeltiin läsnä hiiren M-CSF, RANK-L ja FBS (Control) tai lipidejä köyhdytettyä FBS (Dep. FBS) puuttuessa tai läsnä ollessa, 1-oleyyli-LPA (1 uM). (Vasen paneelit) edustaja kuvia monitumaisia ​​soluja värjättiin TRAP toimintaan. (Oikea paneelit) kvantifiointi osteoklastien määrä perustui multinucleation TRAP-positiivisten solujen. Tulokset ovat keskiarvoja ± SD 3 erillisestä kokeesta. *:

P

0,05. Mittaviivat: 200 pm.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että ilmaus autotaxin kontrolloi etenemistä osteolyyttiset etäpesäkkeiden aiheuttama rintasyövän soluja. Osoitimme aikaisemmin, että lysofosfatidihappo (LPA) tuotetaan kasvain mikroympäristössä ohjaa etenemistä osteolyyttiset etäpesäkkeitä rintasyövän solujen ja korosti tärkeää roolia verihiutaleiden tässä prosessissa [4]. Kuitenkin molekyylitason mekanismit tuotannon LPA ja suoran roolin LPA luun solut luun metastaattista sivustolla ovat vielä tuntemattomia. Tyrmäyseläin analyysit paljastivat, että autotaxin ohjaa tasot LPA verenkierrossa [8], [9]. Pakko ilmentymisen autotaxin ihmisen rintasyövän MDA-B02-solujen määrä nousi muodostumista osteolyyttiset etäpesäkkeiden hiirillä, kun taas knockdown endogeenistä autotaxin hiiren maitorauhasen kasvain 4T1 solujen vähentynyt laajuus osteolyyttisiä vaurioita. Se on tunnettu kaksi vuosikymmentä, että verihiutaleet ovat runsas lähde LPA seerumissa [33], [34]. Kuitenkin Aoki ryhmä osoitti, että LPA vapautuu suoraan verihiutaleet muodostaa vain pienen osan seerumin LPA [32].