Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Patologiset angiogeneesiä näytelmiä keskeinen rooli kasvaimen aggressiivisuus ja johtaa epäedullinen ennustetta. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena on havaita mahdollista roolia retinoblastoomasolulinjassa sitovan proteiinin 2 (RBP2) kasvaimen angiogeneesissä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC).

Methods

immunohistokemiallinen värjäys oli käytetään havaitsemaan ilmentymisen RBP2, hypoksia-indusoituva tekijä-1α (HIF-1α), verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF) ja CD34. Kaksi paria siRNA sekvenssit ja pcDNA3-HA-RBP2 käytettiin alas-säädellä ja säätää ylös RBP2 ilmentymistä H1975 ja SK-MES-1-soluissa. Endoteelisolujen putken muodostumiseen määrityksessä, VEGF entsyymi-immunologinen määritys, reaaliaikaista PCR: ää ja western blotting suoritettiin havaita mahdollisten mekanismien välittämien RBP2 kasvaimen angiogeneesiä.

Tulokset

Niistä 102 vaihe I NSCLC yksilöitä analysoitiin, korkea RBP2 proteiinin ilmentyminen liittyy läheisesti kasvaimen kokoa (P = 0,030), korkea HIF-1α lauseke (P = 0,028), korkea VEGF lauseke (P = 0,048), lisääntynyt kasvaimen angiogeneesiä (P = 0,033 ) ja huonoon ennusteeseen (P = 0,037); korkea MVD liittyi korkea HIF-1α lauseke (P = 0,034), korkea VEGF lauseke (P = 0,001) ja huonoon ennusteeseen (P = 0,040). Monimuuttuja-analyysi osoitti, että RBP2 oli itsenäinen vaikutus eloonjäämiseen sairastavien potilaiden vaiheen I NSCLC (P = 0,044). Moduloimalla ilmentymistä RBP2, meidän havainnot ehdottivat, että RBP2 proteiini ehtyminen laski HUVEC-putken muodostumiseen, jonka alaspäin säätäminen VEGF on kunnostettua alustaa. RBP2 stimuloi ylössäätöä VEGF, joka oli riippuvainen HIF-1α, ja aktivoinut HIF-1α kautta inositoli-3-kinaasi (PI3K) /Akt-signalointireitin. Lisäksi VEGF: n lisääntynyt aktivointi Akt säädellään RBP2.

Päätelmät

RBP2 proteiini voi stimuloida HIF-1α ilmentymisen aktivaation kautta PI3K /Akt-signalointireitin alle normoksia ja sitten stimuloida VEGF ilmaisu. Nämä havainnot osoittavat, että RBP2 voi olla ratkaiseva merkitys kasvaimen angiogeneesiä ja toimia houkutteleva terapeuttinen kohde vastaan ​​kasvaimen aggressiivisuutta alkuvaiheen pienisoluista keuhkosyöpää.

Citation: Qi L, Zhu F, Li Sh, Si Lb, hu Lk, Tian H (2014) retinoblastoomasolulinjassa sitova proteiini 2 (RBP2) Edistää HIF-1α-VEGF-aikaansaaman angiogeneesin of Non-pienisoluinen keuhkosyöpä kautta Akt Pathway. PLoS ONE 9 (8): e106032. doi: 10,1371 /journal.pone.0106032

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 27 heinäkuu 2014; Julkaistu: 27 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Qi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Hanke tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 30571844), tieteen ja teknologian kehityksen Foundation Shandongin maakunnassa (nro . 2009GG10002007), ja National Natural Science Foundation of Shandong (nro ZR2009CM090). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on yleisimpiä syöpäsairauksia johtaa syöpään liittyvän kuoleman maailmanlaajuisesti [1]. Huolimatta lukuisista parannuksista kirurgisten tekniikoiden ja adjuvantti kemosädehoito varten NSCLC viime vuosikymmeninä, ennuste on edelleen suhteellisen heikko [2]. Erilaisia ​​uusia molekyylimarkkereita ja mahdolliset uudet tavoitteet on todettu sairauden hoidossa. Kuitenkin syövän etenemistä on monivaiheinen prosessi ja molekyylimekanismin taustalla keuhko syövän synnyn on pitkälti epäselvä.

Patologiset angiogeneesi on suhteellisen varhainen tapahtuma syövän synnyn, ja lisääntynyt kasvaimen angiogeneesi korreloi invasiivisia kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden ja huono ennuste [3], [4]. On ehdotettu, että verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) ja hypoksia-indusoituva tekijä-1α (HIF-1α) kriittinen rooli kasvainangiogeneesissä. VEGF, joka on laajimmin tunnettu endoteelisoluspesifiseksi angiogeeninen tekijä, johtaa lisääntyneeseen verisuonten läpäisevyyteen, ja sillä on merkittävä rooli fysiologisessa patologisen angiogeneesin [5], [6]. Kertyvät todisteet ovat osoittaneet, että HIF-1α, heterodimeerinen proteiini koostuu HIF-1α ja HIF-1β alayksiköistä, liittyy eri näkökohtia solu- ja fysiologinen prosessi. Under normoksia, HIF-1α on prolyyli-hydroksyloitu, ubiquitylated ja hajoaa proteasomien sitoutumalla von Hippel Lindaun (VHL) kompleksi. Seuraavat hypoksia vakauttaminen, HIF-1α sitoutuu HIF-1β tumaan ja aloittaa kohdegeenien transkription kautta hypoksia-reagoivan elementin [7], [8], [9]. Viime vuosina monet tutkimukset ovat osoittaneet, että HIF-1α myös voisi johtaa kohonnut ilmentyminen eri geenien erilaisia ​​biologisia toimintoja alla normoksia, myös solujen jakautumista, apoptoosia, muuttoliike, invaasio ja angiogeneesi [10], [11].

retinoblastoomasolulinjassa sitovan proteiinin 2 (RBP2), jäsen JARID perheen proteiinien, on ydinvoima fosfoproteiini jossa demetylaasin aktiivisuus lysiini 4 histoni H3 (H3-K4) [12], [13], [14 ]. Vaikutti siltä, ​​että RBP2 saa aikaan toiminnon osittain tukahduttaa kohdegeenien transkription mukana erilaistumiseen ja että sitoutuminen retinoblastoomaproteiinia (pRB) muuntaa RBP2 päässä transkription repressori on transkriptionaalinen aktivaattori [15], [16]. Viimeaikainen tutkimus keuhkosyöpä on todennut, että RBP2 korreloi kasvaimen muuttoliikettä ja hyökkäystä suoraan sitoutumalla integriinin β1 (ITGB1) promoottorit [17]. Toinen tutkimus osoitti, että RBP2 ajan säätelee ilmentymistä N-kadheriinin ja etanat aktivaation kautta Akt signaloinnin [18]. Lisäksi ITGB1 ja Akt signalointi korreloi merkitsevästi kasvaimen angiogeneesiä [19], [20], [21], [22]. Yhdessä nämä tulokset viittaavat onkogeenisessä rooli RBP2 kasvaimen angiogeneesiä ja etenemistä.

Tässä tutkimuksessa RBP2 ilmentyminen havaittiin olevan lisääntynyt NSCLC solulinjoissa sekä NSCLC kudoksissa potilailta. Tutkia tarkemmin mahdollisia rooleja RBP2 kasvaimen angiogeneesissä, voimme esittää näyttöä siitä, että korkea RBP2 ilmentyminen NSCLC solulinjoissa merkittävästi edistää kasvaimen angiogeneesiä ja valottaa mekanismi mukana aktivointi Akt signaloinnin induktio HIF-1α proteiinien kertymistä ja VEGF ilmaisun alle normoksia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tämä hyväksyi tutkimuksen eettisen komitean Qilu sairaalan. Kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan julkistaa asian yksityiskohtia, ja hankinta kudosnäytteiden toteutettiin määräämällä tavalla vakiintuneiden ohjeiden.

Potilaat

Kaikkiaan 102 potilasta (71 miesten ja 31 naisten, keski-ikä 62 ± 3,56 vuotta), joilla on vaiheen I NSCLC joille tehtiin täydellinen kasvaimen resektiota (lobectomy tai pneumonectomy) alueellisiin imusolmukedissektiossa tammi 2006 päivänä joulukuuta 2008 laitoksella Torakaaliikirurgia, Qilu sairaalan, sisällytettiin tutkimus. Histologinen tutkimus ja arvosana syövän solujen erilaistumisen perustuivat luokittelujärjestelmän Maailman terveysjärjestön tarkistettiin vuonna 2004, ja TNM lavastus järjestelmää UICC 2009. Lisäksi 3 potilasta (2 tapausta, jossa suuri solu syöpä ja 1 tapauksessa adenosquamous syöpä ) koki täydellisen kasvaimen resektiota tänä aikana ei otettu takia liian pieni otoskoko. Kliiniset ominaisuudet 102 potilasta on esitetty taulukossa 1.

immunohistokemia

immunohistokemiallinen värjäys RBP2, HIF-1α, VEGF: n ja CD34 suoritettiin käyttäen streptavidiini-peroksidaasia menetelmä . Lyhyesti, 4 um: n paksuisia leikkeitä leikattiin parafinoidut lohkot, ja laseja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla vastaan ​​RBP2 (Bethyl, Montgomery, TX, USA, laimennus 1:100), HIF-1α (BD Biosciences, Pharmingen , Lexington, MA, USA, laimennus 1:100), VEGF (A-20; Santa Cruz Biotekniikka, CA, USA, laimennus 1:150) ja CD34 (sc-19621; Santa Cruz Biotekniikka, CA, USA, laimennus 1: 100) yön yli 4 ° C: ssa. Tämän jälkeen biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineet ja peroksidaasiin konjugoitua streptavidiinia kompleksi reagenssin levitettiin sen jälkeen counterstaining Mayerin hematoksyliinillä. Positiiviset ja negatiiviset kontrollit Jokaisessa vaiheessa. Ilmentäminen RBP2 proteiinin arvioitiin laskemalla yhteensä immuunivärjäystä pisteet kuin tuote sekä intensiteetin pisteet (0, negatiivinen värjäys, 1, heikkoa värjäytymistä, 2, kohtalainen värjäytyminen, 3, vahva värjäytyminen) ja osuus pisteet (0, ei mitään; 1, 10%, 2, 10-50%, 3, 51-80%, 4, 80%). Siten koko pisteet vaihteli 0 7. immunovärjättiin objektilasit arvioitiin kahden riippumattoman tutkijat sokkona ja reevaluated nämä tutkijat alla multihead mikroskoopilla ristiriitainen tapauksissa päästä yksimielisyyteen. Arviointiin positiivisen värjäytymisen RBP2, vähintään 3 osia tai alueita kustakin näytteestä sijoitettiin.

kasvaimeen liittyvät angiogeneesiin määrän, mikroverisuonitiheys (MVD) arvioitiin laskemalla CD34-positiivisia immunovärjättiin endoteelisoluissa. CD34-positiiviset endoteelisolujen samoin kuin klustereista endoteelisolujen, jotka olivat selvästi erillään viereisen mikrosuonten mitattiin mitattavissa mikrosuonten [23], [24], [25]. Määrällisesti MVD, viidestä erittäin verisuonten alueet skannattiin pienitehoisia tunnistamaan ”hot spot” ja laskettiin mikroskooppisesti korkean tehon (200-kertainen suurennus) kenttiä. Keskimääräinen lukumäärä on kymmenen vision kenttien kirjattiin lopullinen MVD (kaksi tarkkailijaa ja viisi verisuonten kriisipesäkkeisiin kukin).

katkaisu arvo RBP2 ja MVD ilmentyminen määritettiin perustuu heterogeenisyys mitattu arvo kautta hak- sijoitus tilastollinen analyysi nähden kokonaiselossaoloaikaa [26]. Lopullinen värjäytyminen pistemäärä 4 valittiin cutoff pisteen syrjiä korkean ja matalan RBP2 ilme. Siksi kasvaimista lopullinen värjäys pisteet ≥4 määriteltiin yli-ilmentävät RBP2 proteiinia. Kasvaimista mikrosuonten ≥57 luokiteltiin korkea MVD; kasvaimista mikrosuonten 57 luokiteltiin alhainen MVD. HIF-1α pidettiin yli-ilmentynyt kun 1% ydinten oli positiivisia edellä kuvatulla tavalla [27]. Kasvaimet jonka lopullinen värjäys pisteet ≥3 määriteltiin joka yli-ilmentää VEGF-proteiinia [28].

Cell Lines, viljelyolosuhteet, transfektio ja Sirna Treatment

Ihmisen keuhkon adenokarsinooman solulinjoja A549 , SPCA-1and H1975 ostettiin National Cancer Institute (Bethesda, MD, USA). Ihmisen keuhkojen okasolu- linja SK-MES-1 ja ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen line BEAS2B saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC) hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). BEAS2B, A549, PEAC-1 ja H1975-soluja viljeltiin Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-väliaineessa (Hyclone, Logan, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco, Gaithersburg, USA). SK-MES-1-soluja kasvatettiin MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA), jota oli täydennetty 20% FBS: ää. HUVEC-soluja viljeltiin endoteelisolujen kasvua keskipitkällä M199, johon on lisätty 15% FBS: ää, 1 mg /ml matalan seerumin kasvua täydentää ja 2 mM glutamiinia. Kaikki soluja inkuboitiin 5% CO

2 37 ° C: ssa. RBP2 yliekspressoitui käyttäen pcDNA3-HA-RBP2, antelias lahja W.G Kaelin [12], ja siRNA varten RBP2 ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Plasmidi pcDNA3-HA-HIF-1α hankittiin Addgene (Plasmid 18949) [29], ja siRNA varten HIF-1α (ONTARGET plus SMART-allas, L-004018) ostettiin Dharmacon RNA Technologies (Chicago, IL, USA) . Plasmidi pcDNA3 Myr HA Akt1 ostettiin Addgene (Plasmid 9008) [30]. Pienten häiritsevä RNA (siRNA) käsittely, soluja inkuboitiin 6-kuoppaisille levyille (3,0 x 10

5 /kuoppa) yli yön ja sitten transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Seuraavat siRNA-sekvenssejä käytettiin tässä tutkimuksessa: RBP2 siRNA1 5′-UUGUGUACUCGUCAAACUCUACUCC-3 ’; RBP2 siRNA2 5’-UUAACAUGCCGGUUAUCCAGGCUCU-3 ’; ohjaus siRNA 5’-UUCUCCGAAGGUGUCACGUTT -3 ’.

valmistaminen Pakattu Medium

RBP2-siRNA1 H1975-solut, RBP2-siRNA2 H1975-solujen ja valvonta-siRNA H1975-soluja viljeltiin seerumittomassa olosuhteissa RPMI 1640 väliaineessa 24 tuntia, vastaavasti. Sitten supernatantti kerättiin, sentrifugoitiin, suodatettiin 0,22 mm: n suodattimen (Millipore, Billerica, USA) ja säilytettiin -20 ° C: ssa, kunnes käytettiin entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA), ja putken muodostumisen määritys.

endoteelisolujen putken muodostumisen määritys

putken muodostumiseen määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [31]. Lyhyesti, HUVEC-soluja (1 x 10

4 /kuoppa) siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille päällystettiin Matrigelillä (50 ui) ja inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa 1 h polymeroimiseksi. HUVEC-soluja (1 x 10

4-solut) ympättiin kuoppiin eri vakioitua elatusainetta RBP2-siRNA1 H1975-solut, RBP2-siRNA2 H1975-solujen ja valvonta-siRNA H1975-soluissa. VEGFR-inhibiittori (sunitinibimalaattia, 2,5 uM) [32] lisättiin vakioituun väliaineeseen ohjaus siRNA H1975-solut ja ihmisen rekombinantti-VEGF-165 (rhVEGF165, Millipore, Billerica, MA, USA, 2 ng /ml) lisättiin elatusaine on RBP2-siRNA2 H1975-soluissa. 96-kuoppaisia ​​levyjä inkuboitiin 6 h, ja putken muodostumisen jälkeen valokuvattiin käännettyä mikroskooppia. Putken muodostuminen kyky kvantifioitiin laskemalla kokonaismäärä täydellinen putkia, ja keskimäärin kolme satunnaista x 200 kentät kuoppaa kohti on tallennettu arvo kuoppaa kohti.

VEGF Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

VEGF-määrät eri elatusaineessa määritettiin käyttäen ELISA-kittiä (R 0,05.

Tulokset

1. Korrelaatio RBP2 proteiinia ja MVD kanssa ennusteeseen viittaavia tekijöitä

Immunohistokemialliset RBP2 (Fig. 1A ja Fig. 1 B) ja HIF-1α (Fig. 1D ja Fig. 1 E) vasta osoitti positiivisen reaktion tumassa, ja VEGF-vasta-aineita (Fig. 1 F ja kuvio. 1G) osoitti positiivisen reaktion sytoplasmassa syöpäsoluja. RBP2 havaittiin olevan yli-ilmentynyt 52 (51%) 102 NSCLC yksilöitä mukaan edellä mainitut vaatimukset. Väliset suhteet RBP2 proteiinin ilmentymisen ja ennusteeseen viittaavia tekijöitä tutkittiin chi-neliö testi ja meidän tiedot osoittivat, että RBP2 yliekspressio liittyi kasvaimen kokoa (

P

= 0.030), korkea HIF-1α lauseke (

P

= 0,028) ja korkea VEGF lauseke (

P

= 0,048). Kuitenkin, ei ollut tilastollista merkitystä suhteita RBP2 ilmaisun ja muiden ennusteeseen viittaavia muuttujat (

P

0,05, taulukko 1).

(A) korkean RBP2 proteiinin ilmentymistä okasolusyöpä ; (B) korkea RBP2 proteiinin ilmentyminen adenokarsinooma; (C) negatiivinen RBP2 proteiinin ilmentymistä in NSCLC; (D) korkea HIF-1α ilmentymistä okasolusyöpä; (E) korkea HIF-1α-proteiinin ilmentyminen adenokarsinooma; (F) korkea VEGF ilmentyminen okasolusyöpä; (G) korkea VEGF adenokarsinooma; (H) korkea CD34 ilmentyminen okasolusyöpä; (I) korkea CD34 ilmentyminen adenokarsinooman.

kasvaimensisäisenä MVD kvantifioitiin laskemalla CD34-positiivisten endoteelisolujen samassa sarjassa keuhkosyöpään kudosten (Fig. 1 H ja Fig. 1I), ja keskimääräinen määrä pienten verisuonten kymmenen kenttää laskettiin mittana MVD jokaisesta näytteestä. Keskimäärin mikroverisuonten MVD kussakin kasvainnäytteessä vaihtelivat laajasti, 6,4 ja 102. Kuten aiemmin on kuvattu, kasvaimista mikrosuonten ≥57 luokiteltiin korkea MVD, ja 46 tapauksessa (45,1%) osoitti korkea MVD. Chi-neliö testi osoitti, että korkea MVD liittyi korkea HIF-1α lauseke (

P

= 0,034) ja korkea VEGF lauseke (

P

= 0,001), mutta mitään merkittäviä korrelaatioita havaittu välillä MVD ja muut ennusteeseen viittaavia tekijät (

P

0,05, taulukko 1).

immunohistokemiallinen värjäys sarjamuotoisen osien syövän kudosten osoitti, että mediaani MVD oli 59,6 korkean RBP2 ilmaisu ryhmä (7,8-102) ja 35,4 matalan RBP2 ilmaisu ryhmä (6,4-94). Lisäksi meidän tilastollinen analyysi osoitti, että korkea MVD havaittiin useammin kasvaimissa RBP2 proteiinin yli-ilmentymisen kuin niissä ei ole yli-ilmentyminen (

P

= 0,033, U-testi, Fig. 2A). Nämä tiedot viittaavat siihen, että RBP2 saattaa edistää patologista angiogeneesiä NSCLC etenemiseen.

(A) välinen korrelaatio RBP2 ilmaisun ja MVD portaalle I NSCLC. NSCLC korkea RBP2 proteiinin ilmentymisen osoitti merkittävästi korkeampi kasvaimensisäisenä MVD kuin alhaisen RBP2 proteiinin ilmentymisen (

P

= 0,033, U-testi). (B) Kaplan-Meier käyrät kokonaiselinaika osoittivat huono 5 vuoden yleinen eloonjäämisluku potilaalla on RBP2 proteiinin yli-ilmentymisen (53,8% vs. 72,0%,

P

= 0,037). (C) Kaplan-Meier käyrät kokonaiselinaika osoittivat huono 5 vuoden yleinen eloonjäämisluku potilailla, joilla on korkea MVD (52,2% vs. 71,4%,

P

= 0,040).

Kaplan-Meier kokonaiselinajan analyysiin osoitettiin myös huono 5 vuoden yleinen eloonjäämisluku potilaalla on RBP2 proteiinin yli-ilmentymisen (53,8% vs. 72,0%,

P

= 0,037; Kuva. 2B) ja korkea MVD ( 52,2% vs. 71,4%,

P

= 0.040, Fig. 2C). Kaikki tilastollisesti merkittävät muuttujat arvioitiin Yksiulotteisissa analyysit sisältyvät Coxin suhteellisen vaaran regressiomallin. Monimuuttuja-analyysi osoitti, että ainoastaan ​​RBP2 oli itsenäinen vaikutus eloonjäämiseen sairastavien potilaiden vaiheen I NSCLC (

P

= 0,044, taulukko 2).

2. RBP2 on yli-ilmentynyt ihmisen NSCLC solulinjoissa

proteiinin taso RBP2 oli säädellään ylöspäin keuhkosyövän solulinjat SK-MES-1, A549, PEAC-1 ja H1975 verrattuna ihmisen keuhkoputken epiteelisolulinja BEAS2B (Fig. 3A). Ilmentymisen taso RBP2 in H1975-soluissa oli korkeampi kuin BEAS2B, SK-MES-1, PEAC-1 ja A549-solut.

(A) RBP2 on yli-ilmentynyt ihmisen NSCLC solulinjoissa SK-MES-1- , A549, SPCA-1 ja H1975 verrattuna ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen linja BEAS2B soluja. (B) vaikutukset RBP2 siRNA1, RBP2 siRNA2 ja pcDNA3-HA-RBP2 on ilmentymisen RBP2 proteiinin.

kaksi kappaletta siRNA: iden ja pcDNA3-HA-RBP2 kohdistaminen RBP2 oli käytetty toiminnallinen analyysi H1975 ja SK-MES-1-soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 3B, tulokset osoittivat, että RBP2-siRNA1 ja RBP2-siRNA2 voisi merkittävästi alas-säädellä ilmentymistä RBP2 proteiinin H1975-soluissa. Lisäksi kaksi siRNA: t osoittivat lähes saman RNAi vaikutuksia, kun taas negatiivinen kontrolli siRNA ei merkittävästi vaikuta ilmaus RBP2. Samaan aikaan, pcDNA3-HA-RBP2 merkitsevästi sääteli ilmentymistä RBP2 SK-MES-1-soluissa, kun taas pcDNA3-HA ei merkittävästi vaikuttanut RBP2 ilme. Näin ollen, RBP2-siRNA1, RBP2-siRNA2 ja pcDNA3-HA-RBP2 valittiin lisätutkimuksia toimintoja RBP2 proteiinin in vitro.

3. Ehtyminen RBP2 proteiinin pienenee HUVEC-putken muodostumiseen aiheuttama kasvualusta

arvioimiseksi toiminnallista merkitystä RBP2 kasvaimen angiogeneesi, RBP2 pudotettiin vuonna H1975 solulinjoissa. Tulokset osoittivat, että kokonaisten putkien aiheuttama väliaine on RBP2-siRNA1 H1975-soluja (12,33 + 3,06) ja RBP2-siRNA2 H1975-soluja (9,67 + 1,53) on huomattavasti vähäisempää kuin kontrolliryhmän siRNA H1975-soluja (38,67 2,52, Fig. 4 A-D,

P

0,01).

Tube muodostumisen määritys: (A) kontrolli-siRNA H1975-solut; (B) RBP2-siRNA1 H1975-solut; (C) RBP2-siRNA2 H1975-soluissa. (D) kvantitatiivinen analyysi putken muodostumisen HUVEC aiheuttamien kunnostetun alustan; (E) Down-sääntely RBP2 proteiinin vähensi ekspressiotasot VEGF vakioidun alustan. (F) putken muodostumiseen aiheuttama väliaine ohjaus siRNA H1975-soluissa esti VEGFR-inhibiittori (sunitinibimalaattia, 2,5 uM). (G) Alennettu putken muodostumiseen aiheuttama väliaine on RBP2-siRNA2 H1975-solujen pelastettiin lisäämällä VEGF-165 (2 ng /ml).

4. Down-regulation RBP2 proteiinin vähentää ekspressiotasot VEGF kunnostetussa alustassa

Koska korkeat MVD liittyi korkea VEGF ilme (chi-neliö testi,

P

= 0,001, taulukko 1), me seuraavaksi tutkitaan yhdistyksen välillä RBP2 ja VEGF-proteiinin tasot elatusaineessa käyttäen ELISA-määritystä. Tulokset osoittivat, että VEGF-proteiinin tasot elatusaine on RBP2-siRNA1 (0,99 ± 0,11 ng /ml) ja RBP2-siRNA2 (0,94 ± 0,14 ng /ml) H1975-solut olivat huomattavasti alhaisemmat kuin valvonta-siRNA H1975-soluja (1,87 ± 0,10 ng /ml), (Fig. 4E,

P

0,01). Lisäksi meidän tulokset viittaavat siihen, että putken muodostumiseen aiheuttama ilmastoitu väliaine ohjaus siRNA H1975-soluja blokattiin lisäämällä VEGFR-inhibiittorin (sunitinibimalaattia, 2,5 uM, 10,33 + 2,22,

P

0,01, Fig. 4F); alennettu putken muodostumiseen aiheuttama väliaine on RBP2-siRNA2 H1975-solujen pelastettiin lisäämällä VEGF-165 (2 ng /ml, 41,03 + 3,25,

P

0,01, Fig. 4G).

5. RBP2 stimuloi HIF-1α ja VEGF-mRNA ja proteiinin ilmentyminen

HIF-1α on tärkeä transkription tekijä ja on keskeinen rooli kasvaimen angiogeneesiä. Lisäksi transkriptiotekijä HIF-1α säätelee ekspressiotaso eri hypoksia-reagoiva geenien, mukaan lukien VEGF [11]. Me tutkimme seuraavaksi RBP2 voi vaikuttaa ilmentämiseen HIF-1α ektooppisissa RBP2 ilmentävien SK-MES-1-soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 5A täytäntöön ilmentyminen RBP2 sääteli ekspression HIF-1α proteiinin ajan riippuvalla tavalla alle happiolosuhteissa, ja huippuarvo HIF-1α ilmentymistä esiintyi 36 tuntia transfektion jälkeen suoritettiin. Kuitenkin HIF-1α oli epävakaa ja hajoa proteasomien alle normoksia [9], ja tuloksemme ehdotti, että HIF-1α ilmaisun väheni transfektion jälkeen suoritettiin 48 tuntia. Siksi tutkia mahdollisen asetuksen kasvaimen angiogeneesin RBP2, tutkimme ilmaus transkriptiofaktoreiden HIF-1α ja VEGF RBP2 yli-ilmentyvä ja -depleted NSCLC soluja normoksia 36 tuntia transfektion jälkeen. Kuten on esitetty kuviossa. 5B ja kuvio. 5C, alas-säätely RBP2 vuonna H1975 soluissa johti vähentynyt ilmentyminen HIF-1α ja VEGF, kun taas kohdunulkoinen RBP2 ilmentymistä SK-MES-1-soluissa pcDNA3-HA-RBP2 johti säätely ylöspäin HIF-1α ja VEGF.

(A) RBP2 sääteli HIF-1α proteiinin ajasta riippuva tavalla alle normoxic olosuhteissa. (B) ehtyminen RBP2 vähentynyt ilmentyminen HIF-1α ja VEGF H1975 soluissa. (C) Up-regulation of RBP2 lisääntynyt ilmentyminen HIF-1α ja VEGF: SK-MES-1-soluissa. (D) Reaaliaikainen RT-PCR osoitti, että mRNA-ekspressiotasot HIF-1α: n ja VEGF merkittävästi vähentynyt RBP2-köyhdytettyä H1975-soluissa verrattuna kontrollisoluihin. (E) Reaaliaikainen RT-PCR osoitti, että mRNA-ekspressiotasot HIF-1α: n ja VEGF lisättiin merkittävästi RBP2 yli-ilmentäviä SK-MES-1-soluissa.

mRNA: n ilmentymisen tasot HIF -1α (

P

siRNA1 = 0,006,

P

siRNA2 = 0,001) ja VEGF (

P

siRNA1 = 0,000,

P

siRNA2 = 0,000) olivat merkittävästi vähentyneet RBP2-köyhdytettyä H1975 soluissa. Lisäksi, HIF-1α (

P

= 0,001), ja VEGF: n (

P

= 0,000) korotettiin RBP2 yli-ilmentäviä SK-MES-1-soluissa verrattuna kontrollisoluihin (Fig. 5D ja Fig. 5E). Nämä havainnot ehdotti, että RBP2 on tärkeä rooli tässä prosessissa tuumoriangiogeneesin kautta säätely ylöspäin HIF-1α ja VEGF.

6. RBP2 induktio VEGF riippuu HIF-1α

Vahvista roolin RBP2 säätelyssä HIF-1α in NSCLC soluissa, me moduloitu HIF-1α ilmentymistä transfektoimalla soluja siRNA erityisiä vastaan ​​HIF-1α (si -HIF-1α) ja plasmidi pcDNA3-HA-HIF-1α, ja arvioitiin VEGF: n ilmentymistä 36 tunnin kuluttua. Kuten on esitetty kuviossa. 6A ja kuvio. 6B, knockdovvn HIF-1α ilmentymisen kohdunulkoinen RBP2 ilmentävien SK-MES-1-soluissa johti alas-säätely VEGF verrattuna ryntäily epäspesifinen ohjaus siRNA; säätely ylöspäin HIF-1α ilmentymisen RBP2-köyhdytettyä H1975 solujen johti ylössäätöä VEGF. Nämä tulokset osoittivat, että RBP2 välittämää tuumoriangiogeneesissa NSCLC-solujen saattaa osittain säänneltävä aktivoitumisen HIF-1α.

(A) ehtyminen HIF-1α kanssa siRNA erityisiä vastaan ​​HIF-1α in RBP2- yli-ilmentävät SK-MES-1-soluissa johti alas-säätely VEGF verrattuna ryntäily epäspesifinen kontrolli siRNA. (B) ylös-säätely HIF-1α ilmentymisen RBP2-siRNA2 H1975 solujen johti ylössäätöä VEGF.

7. RBP2 aktivoi HIF-1α kautta PI3K /Akt-signalointireitin

Tuore tutkimus osoittaa, että RBP2 säätelee N-kadheriinin ja etana aktivoitumisen kautta Akt signaloinnin [18]. Lisäksi alle happiolosuhteissa, ilmaisua ja toimintaa HIF-1α ja myöhemmin erittyy angiogeenisten tekijöiden syövän voi olla poikkeuksellisen up-säännellään eri signalointireittejä [34], [35], [36] joihin Akt ja sen loppupään efektorien [20], [22]. Siksi me arveltu, että RBP2 säätelee HIF-1α aktivoitumisen kautta Akt signalointia, ja lisäksi pyrittiin tunnistamaan signalointi mekanismeja RBP2-välitteistä kasvaimen angiogeneesiä. Tuloksemme paljasti, että hiljentäminen RBP2 ilmaisu joko RBP2-siRNA1 tai RBP2-siRNA2 in H1975 soluissa merkittävästi vähentynyt fosforylaatiota Akt, kun taas pakko ilmaus RBP2 pcDNA3-HA-RBP2 SK-MES-1-soluissa lisäsi aktiivisuutta Akt (Fig. 7A). Lisäksi, kun konstitutiivisesti aktiivisen muodon Akt in RBP2-siRNA2 H1975-solut ilmaistiin, ekspressio HIF-1α: n ja VEGF lisättiin kontrolliin verrattuna; PI3K /Akt-inhibiittori LY294002 estivät merkittävästi ekspressiota HIF-1α ja VEGF pcDNA3-HA-RBP2 SK-MES-1-solut (Fig. 7B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että RBP2 edistää kasvaimen angiogeneesiä aktivoitumisen kautta PI3K /Akt-signalointireitin NSCLC solulinjoissa.

(A) vaimentaminen RBP2 ilmentyminen H1975-soluissa merkittävästi vähentynyt fosforylaatio Akt, ja pakko ilmaus RBP2 SK-MES-1-soluissa lisäsi aktiivisuutta Akt. (B) Kun Akt oli konstitutiivisesti aktivoitu RBP2-siRNA2 H1975, ilmaus HIF-1α ja VEGF korotettiin kontrolliin verrattuna. PI3K /Akt estäjä LY294002 estivät merkitsevästi ilmaus HIF-1α ja VEGF pcDNA3-HA-RBP2 SK-MES-1-soluissa. (C) Westernblots näyttää ajan kuluessa Akt-fosforylaation RBP2-siRNA2 H1975-soluja, koska VEGF-165 (25 ng /ml). Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa.