Krooninen sairaus

tiivistelmä

Solun invaasio on tärkeä mekanismi syövän etäpesäkkeiden ja pahanlaatuisen . Matriksimetalloproteinaasi-9: n (MMP-9) on tärkeä proteolyyttinen entsyymi osallistuu syöpäsolujen invaasiota prosessi. Korkea ilmaus MMP-9 mahasyövän positiivisesti korreloivat kasvaimen aggressiivisuus ja ole merkittävää negatiivista korrelaatiota potilaiden selviytymisen kertaa. Äskettäin mekanismit tukahduttaa MMP-9 phytochemicals ovat yhä tutkittu. Chrysin, joka on luonnossa esiintyvä kemiallinen kasveissa, on raportoitu tukahduttaa kasvaimen etäpesäke. Kuitenkin vaikutukset chrysin on MMP-9 ilmaisun mahasyövän ei ole hyvin tutkittu. Tässä tutkimuksessa testasimme vaikutuksia chrysin on MMP-9 ilmentymistä mahan syöpäsoluissa, ja määritetään sen taustalla olevaa mekanismia. Tutkimme vaikutukset chrysin on MMP-9 ilmaisun ja toiminnan kautta RT-PCR, zymografian, promoottori tutkimus, ja Western blotting ihmisen mahasyövän AGS soluja. Chrysin esti forboli-12-myristaatti-13-asetaatti (PMA) indusoimaan MMP-9 ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla. Käyttämällä AP-1-syötti oligodeoksinukleotideja, olemme vahvistaneet, että AP-1 oli ratkaiseva transkription tekijä MMP-9 ilmaisun. Chrysin estetty AP-1 kautta tukahduttaminen fosforylaation c-Jun: sta ja c-Fos kautta estää JNK1 /2 ja ERK1 /2 polkuja. Lisäksi AGS soluja esikäsiteltiin PMA osoitti merkittävästi parannettu invasiivisuus, joka oli osittain kumottu chrysin ja MMP-9-vasta-aine. Tuloksemme viittaavat siihen, että chrysin voidaan käyttää ainakin osan sen syövänvastainen vaikutus ohjaamalla MMP-9 ilmaisun suppression AP-1-aktiivisuuden kautta lohkon JNK1 /2 ja ERK1 /2 signalointireittien mahasyövän AGS soluja.

Citation: Xia Y, Lian S, Khoi PN, Yoon HJ, Joo YE, Chay KO, et al. (2015) Chrysin Estää kasvain promoottori aiheuttama MMP-9 Expression estämällä AP-1 kautta tukahduttaminen ERK ja JNK Väylät mahasyövän Cells. PLoS ONE 10 (4): e0124007. doi: 10,1371 /journal.pone.0124007

Academic Toimittaja: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 05 lokakuu 2014; Hyväksytty 9 maaliskuuta 2015 Julkaistu: 15 huhtikuu 2015

Copyright: © 2015 Xia et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Research avustus (0720570) National Cancer Center (www.ncc.re.kr), Basic Science Research Program apurahan kautta National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama opetus-, tiede- ja teknologia (2010-0009910, www.moe.go.kr), ja Medical Research Center (2012-000-9442) avustusta Korean Science and Engineering Foundationin ( www.nrf.re.kr). Kaikki edellä rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää hetkellä toisella sijalla globaalissa syöpään kuolleisuus, arviolta 990000 uutta tapausta ja 738000 syöpäkuolemista tuloksena maailmanlaajuisesti vuosittain, vaikka esiintyvyys mahalaukun syöpä on vähentynyt viime vuosikymmeninä [1,2]. Kaukaiset elin tai kudos etäpesäke on merkki huonosta ennusteesta potilailla, joilla on mahalaukun syöpä. Etäpesäke on kaikkein kohtalokas ominaisuus pahanlaatuisia kasvaimia, osuus on yli 90% kasvaimeen liittyvien kuolleisuutta [2]. On osoitettu, että kemoterapiaa ja sädehoitoa ei voi merkittävästi pidentää ja parantaa elämänlaatua potilailla, niissä tapauksissa, [3,4]. Kasvainsolujen etäpesäkkeiden on hyvin monimutkainen prosessi koostuu solujen lisääntymisen, migraation, invaasion, ja myöhemmin tarttuvuus ja angiogeneesiä muissa elimissä tai kudoksissa [3].

Koska hyökkäys on yksi tärkeimmistä ominaisuuksista pahanlaatuisia syöpäsoluja, valvontaan invaasio on tärkeä terapeuttinen kohde. Soluväliaineen (ECM) vuorovaikutuksia, katkaisu solujen välistä adheesiota, hajoamista ECM, ja hyökkäyksen imusolmukkeiden ja verisuonet ovat tärkeitä askeleita syövän eteneminen ja metastaasit [5]. Tuumori-invaasio vaatii lisääntyneen ilmentymisen matriksin metalloproteinaasien (MMP: t) [6]. MMP, perheen sinkki riippuvaisten endopeptidaasit joka aiheuttaa syöpäsolujen invaasiota ja leviämistä, keskeisessä asemassa ovat etäpesäkkeitä kautta hajoamista ECM ja tyvikalvon [7]. Matriksimetalloproteinaasi-9: n (MMP-9), joka tunnetaan nimellä 92 kDa: n tyypin IV kollagenaasi tai gelatinaasi B, on yksi tärkeimmistä MMP, ja koodaa MMP-9-geenin ihmisissä [8]. On raportoitu, että yli-ilmentyminen MMP voi lisätä kasvainsolujen irtoaminen ja etäpesäkkeiden, jotka liittyvät pahanlaatuisuuden ja huono kliinisiä tuloksia erilaisissa syövissä, kuten mahasyövän [9,10].

Koska toiminta MMP- 9 aikana maligniteetti, tukahduttaminen MMP-9 tasoilla on tärkeä strategia syöväntorjuntakeino. Viime vuosina yhä enemmän huomiota on kiinnitetty löytää MMP-9-inhibiittori, erityisesti luonnossa esiintyvistä materiaaleista. Kim et ai. havaitsivat, että silibinin estää PMA-indusoidun MMP-9 ilmaisun suppression ERK-fosforylaation MCF-7 ihmisen rintasyöpäsoluja [11]. Viime aikoina, Khoi et ai. raportoitu, että (-) – Epigallocatechin-3-gallate lohkoja nikotiinin aiheuttaman MMP-9 ilmaisun ja invasiivisuuden kautta tukahduttaminen NF-KB ja AP-1 in endoteelisolujen ECV304 soluissa [12]. Chrysin, 5,7-dihydroxyflavone, tyyppi luonnossa esiintyvä flavonoidi, on tunnettu angiogeneesin inhiboimiseksi ja etäpesäkkeiden [13,14]. Lin et ai. osoittivat, että chrysin estää IL-6-angiogeneesiä kautta alas-säätely liukoisen IL-6-reseptori /gp130 /JAK1 /STST3 /VEGF-signalointireitin [13]. Äskettäin on raportoitu, että chrysin voisi lisätä kaspaasi-riippuvaista apoptoosia säädellään TRAIL HCT 116-solulinjassa ja CNE1 soluihin [15]. Yang et ai. havaitsivat, että chrysin tukahdutettiin soluinvaasiota annoksesta riippuva tavalla TNBC soluissa. Lisäksi chrysin pienentää etäpesäke liittyviä molekyylejä vimentiinista, etana ja etana, ja estää Akt signalointireitin [16]. Kuitenkin estäviä vaikutuksia chrysin on MMP-9, sekä mekanismi, ei ole hyvin tutkittu, erityisesti mahalaukun syövän soluissa. Esillä olevassa tutkimuksessa selvitimme chrysin vaikutuksista PMA-indusoidun MMP-9 ilmaisun mahasyövän, ja paljasti sen taustalla olevaa mekanismia.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja viljelyolosuhteet

AGS ihmisen mahalaukun syövän solulinja saatiin laitoksesta American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Soluja viljeltiin RPMI-1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 0,6% penisilliini-streptomysiinillä 37 ° C: ssa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Määrittämään vaikutukset chrysin PMA indusoi MMP-9 ilmentymisen, solut esikäsiteltiin eri pitoisuuksia chrysin ja sitten käsiteltiin PMA: lla. Taso MMP-9 lähetti-RNA (mRNA) määritettiin käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) analyysi. Rooli signaloinnin reittejä PMA-indusoidun MMP-9 ilmentymistä tutkittiin esikäsittelemällä AGS solut ERK 1/2 inhibiittori PD98059 (New England Biolabs, Beverly, MA), JNK-inhibiittori SP600125 (Calbiochem, La Jolla , CA), p38-MAPK-inhibiittori SB203580 (Calbiochem, La Jolla, CA), ja chrysin (Sigma Aldrich, USA) 1 tunnin ajan ennen stimulointia PMA.

Solujen elinkelpoisuus

Solut ( 5 x 10

3) inkuboitiin 96-kuoppaisen levyn RPMI, jossa on 10% FBS: ää, joka sisälsi 0-100 uM chrysin 24 tunnin ajan, ja solujen hengityksen määritettiin vakiintunut 3- [4,5-dimetyylitiatsol-2 yyli] -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT, Sigma-Aldrich) määrityksessä. Inkuboinnin jälkeen, 10 ui 5 mg /ml MTT lisättiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan. Formatsaanipitoisuus saadut rakeet liuotettiin 100% dimetyylisulfoksidiin, ja absorbanssi 570 nm: ssä havaittiin 96-kuoppaiselle ELISA-lukijaa (Biotek Inc., Winooski, VT, USA).

gelatiinitsymografialla

Solut esikäsiteltiin tai ilman chrysin 1 tunti, käsiteltiin 100 nM PMA: lla 20 tuntia. Inkubaation jälkeen keräsimme media supernatantti ja suoritetaan gelatiinitsymografialla tarkistaa MMP-9 toimintaa. Sen jälkeen, media sekoitettiin yhtä suureen tilavuuteen 2P-9 activityrazolium b [62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 25% glyseroli, 4% SDS, ja 0,01% bromifenolisinistä] ja pantiin 7,5% akryyliamidia: bisakryyliamidia (29: 1, Bio-Rad, USA), geeli, joka sisälsi 625 ug /ml gelatiinia (Sigma). Elektroforeesin jälkeen geeli pestiin 2,5% Triton X-100 kolme kertaa (20 minuuttia per kertaa), inkuboidaan sitten 24 tuntia 37 ° C: ssa, inkubointipuskurissa [50 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl: a, 5 mM CaCl

2, ja 1 uM ZnCl

2]. Geelit värjättiin Coomassie Brilliant Blue R250 (Bio-Rad, USA) 3 tunnin ajan, ja sitten huuhdellaan. Proteolyyttinen aktiivisuus näkyi selvä bändejä sinistä taustaa värjättyä liivate. Kuormituksen valvonta gelatiinitsymografialla: Coomassie Brilliant Blue R-250 -värjäys 10% natriumdodekyylisulfaattia polyakryyliamidigeelillä ilman gelatiinia, osoittaa yhtä suuri määrä supernatanttia ladattiin kuhunkin kaistaan.

Käänteinen transkriptio-PCR

Kokonais-RNA uutettiin AGS soluista käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen). Yksi ug kokonais-RNA: ta käytettiin ensimmäisen juosteen komplementaarinen DNA-synteesiä käyttämällä satunnaisia ​​alukkeita ja M-MLV transkriptaasia (Promega). Komplementaarisen DNA alistettiin PCR-monistuksella alukesarjat GAPDH: n ja MMP-9 käyttäen PCR master mix liuosta (introni, Korea). Spesifisten alukkeiden sekvenssit olivat seuraavat: GAPDH sense, 5′-TTG TTG CCA TCA ATG ACC CC-3 ’ja GAPDH antisense, 5′-TGA CAA AGT-GGT CGT TGA GG-3′ (836 bp); ja MMP-9 mielessä 5’- AAG TGG CAC CAC CAC AAC AT -3 ’ja MMP-9 antisense, 5′-TTT CCC ATC AGC ATT GCC GT-3′ (497 bp); c-Jun mielessä 5’-GGA AAC GAC CTT CTA TGA CGA TGC CCTCAA-3 ’, ja c-Jun antisense, 5′- GAA CCC CTC CTG CTC ATC TGT CAC GTT CTT-3′ (287bp); c-Fos mielessä 5’-CAG TCA GAT CAA GGG AAG CCA CAG ACA TCT-3 ’ja c-Fos antisense, 5′-GAA TAA GAT GGC TGC AGC CAA ATG CCG CA-3’ (246bp). PCR-olosuhteet olivat seuraavat: denaturointi 94 ° C 30 sekuntia, pariutuminen 52 ° C: ssa 20 sekunnin ajan ja laajentamisesta 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan.

MMP-9-promoottorin aktiivisuus

transkription säätelyyn MMP-9 tutkittiin ohimenevä transfektiolla MMP-9-promoottori-lusiferaasireportteri- konstruktilla (pGL4-MMP-9). Plasmidi pGL4-MMP-9-promoottori (nukleotidit -925-13) luovutti ystävällisesti Dr. Young-Han Lee (Konkuk University, Korea). AGS solut ympättiin ja kasvatettiin, kunnes ne saavuttivat 70% konfluenssiin. Sitten pGL4-MMP-9-promoottorin plasmidit transfektoitiin soluihin käyttämällä FuGENE 6 (Promega, USA) valmistajan protokollan. PRL-TK transfektoitiin sisäisenä kontrollina. Soluja inkuboitiin transfektion väliaine 12 tuntia ja sitten käsiteltiin PMA: lla 4 tuntia. Vaikutukset chrysin on MMP-9-promoottorin aktiivisuus määritettiin esikäsittelemällä solut chrysin 1 tunnin ajan ennen kuin lisättiin PMA. Kotransfektiojärjestelmää tutkimukset suoritettiin, kun läsnä tai poissa ollessa koodaavan ekspressiovektorin vallitsevan negatiivisen mutantin MEK-1 (PMCL-K97M), dominantti negatiivinen mutantti JNK (PMCL-TAM67), tai dominantti negatiivinen mutantti p38 MAPK (PMCL-MP38 ), jotka toimitti ystävällisesti Dr. NG Ahn (University of Colorado-Boulder, CO), Dr. M. J. Birrer (NCI, Rockville, MD), ja tohtori J. Han (Scripps Research Institute, CA), tässä järjestyksessä. Solut kerättiin soluviljelmän hajotusreagenssia (Promega, USA), ja lusiferaasin aktiivisuudet määritettiin käyttämällä luminometriä (Centro XS lb960 mikrolevyjen luminometrillä, Berthold Technologies, USA) valmistajan protokollan.

Transient transfektio AP-1 toimittaja

AP-1 lusiferaasireportteriplasmidi hankittiin Clontech (Palo Alto, CA, USA). Kun AGS solut saavuttivat 60-70% konfluenssin, ne pestiin Opti-MEM-elatusainetta ja transfektoitiin pGL-3 vektoriin, joka sisälsi AP-1 reportteri käyttämällä FuGENE 6 (Promega) mukaan valmistajan protokollaa. Reportteri-transfektoituja soluja esikäsiteltiin chrysin 1 tunnin ajan ja käsiteltiin sitten 100 nM PMA: lla 4 tunnin ajan, ja lusiferaasin aktiivisuudet mitattiin käyttämällä luminometriä.

transfektio AP-1-syötti oligodeoksinukleotidien

perustuen AP-1 sitoutumiskohta ATGAGTCAT, suunnittelimme AP-1-syötti fosforotioaattimuodossa kaksijuosteinen oligo deoksinukleotidi- (ODN) seuraavasti, 5′-CGsT CTT CTG AGT CAT GAA TTC ATG ACT CAG AAG ACsG-3 ’, ja 3 ”-GsCA GAA GAC TCA GTA CTT AAG TAC TGA GTC TTC TsGC-5 ’. Kun AGS solut kasvoivat 60-70% konfluenssiin, AP-1 ODN: t ja pGL4-MMP-9-promoottorin plasmidit kotransfektoitiin soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) valmistajan protokollan. Inkuboimisen jälkeen 20 tuntia, transfektoidut solut käsiteltiin PMA: lla 4 tunnin ajan ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä luminometriä.

Western blot-analyysi

AGS-soluja käsiteltiin PMA pestiin fosfaatti puskuroitua suolaliuosta (PBS), irrotettiin käyttäen trypsiini-EDTA-puskuria, ja niitä säilytettiin -70 ° C: ssa, kunnes niitä tarvittiin. Solun proteiini uutettiin RIPA-puskurilla [1% NP-40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% natriumdodekyylisulfaatti (SDS)], ja proteaasi-inhibiittorit (aprotiniinia, leupeptiiniä, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), bentsamidiini, trypsiini-inhibiittori, natriumortovanadaattia ). Viisikymmentä mikrogrammaa proteiinit erotettiin sitten 10% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin Hybond-P -kalvoille (Amersham Pharmacia Biotech). Membraanit blokattiin TBST, joka sisälsi 5% rasvatonta maitoa, inkuboitiin primäärisen vasta-aineen blokkausliuosta yön yli 4 ° C: ssa, ja pestiin kolme kertaa 0,1% Tween-20: Tris puskuroidussa suolaliuoksessa (TBST), 10 minuutin välein . Piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) käytettiin havaitsemaan immunoreaktiivisia proteiineja, kemiluminesenssin. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: anti-fosfo-p44 /42 MAPK (ERK-1/2) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-fosfo-JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-MMP- 9 (Cell Signaling Technology), anti-fosfo-c-Fos (Cell Signaling Technology), ja anti-fosfo-c-Jun (Cell Signaling Technology). Proteiinin kokonaismäärän tasot määritettiin pesemällä blotatun membraanin strippaus liuosta, joka koostuu 100 mM 2-merkaptoetanolia, 2% SDS: ää, ja 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,7) 30 minuutin ajan 50 ° C: ssa, ja kalvo oli sitten uudelleen koetettiin joko anti-β-aktiini (Cell Signaling Technology), anti-yhteensä ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), anti-yhteensä JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-c-Fos (Santa Cruz Biotechnology , Inc., CA, USA) tai anti- c-Jun (Santa Cruz).

Matrigel invaasiomääritys

kenno invaasiomääritys suoritettiin käyttäen 10-kuoppaista chemotasis kammio (Neuro Probe, Gaithersburg, Maryland, USA) 8 uM huokosten kalvo (Neuro Probe) 10% FBS, joka sisältää RPMI kuten kemoatrak- alemmassa kammiossa. AGS-solut (10

5 280 ui) lisättiin ylempään kammioon yhdessä PMA: n läsnä ollessa chrysin, MMP-9-vasta-aineen tai ei-spesifisen IgG, ja inkuboitiin hyökätä Matrigel 24 tuntia. Sen määrittämiseksi vaikutuksen chrysin ja signaloinnin estäjien PMA-indusoidun solujen invaasiota, AGS soluja esi-inkuboitiin chrysin, curcumin, PD98059 tai SP600125 1 tunti, ja inkuboitiin PMA varten 24 tunnin hyökkäyksen aikana. Ei-tunkeutuvat soluihin yläpinnalla kunkin kalvon poistettiin kammiosta ja tunkeutuvat solut alapinnan kunkin kalvon värjättiin Quick-Diff tahra kit (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) . Kahden vesipesun kammioihin annettiin kuivua. Määrä tunkeutumaan solujen laskettiin käyttäen faasikontrastimikroskoopissa.

Tilastot

Data näytetään keskimääräisenä ± SD, ja edustavat keskiarvoa vähintään kolme erillistä koetta suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Erot välein kahden tietoaineiston määritettiin t-testejä. Erot pitää merkittävänä tekstissä vastaavat

P

0,05.

Tulokset

Estovaikutus on chrysin PMA stimuloi MMP-9 ilmaisun

tutkia ehkäisevän vaikutuksen chrysin vastaan ​​säätelyä MMP-9, AGS-solut esikäsitellään chrysin inkuboitiin PMA, ja gelatiinitsymografialla ja RT-PCR-analyysi suoritettiin. Kuten on esitetty kuviossa 1A, PMA-stimuloitujen MMP-9 inhiboitui Chrysin annoksesta riippuvalla tavalla, kuten on kuvattu kautta gelatiinitsymografialla määrityksessä. Ennen tätä koetta, onko Chrysin suoraan inhiboi MMP-9: n tai inhiboi MMP-9 on vielä tuntematon. Voit vastata tähän kysymykseen, teemme yhteistyötä Inkuboimme AGS-erittämä MMP-9 chrysin 3 tuntia, ja gelatiinitsymografialla suoritettiin tarkistaa lopullinen taso MMP-9 toimintaa. Kuten kuviossa 1B on esitetty, chrysin voinut vaikuttaa erittyvän MMP-9 toimintaa. Niinpä olemme arveltu, että esto chrysin vastaan ​​MMP-9 voi tapahtua suppressio MMP-9 ilmentymistä. Voit tarkistaa tämän hypoteesin, reverse transkription PCR ja MMP-9 promoottori analyysit suoritettiin tarkistaa MMP-9 transkription tasoa. Kuten on esitetty kuviossa 1C, kun se on käsitelty chrysin, PMA-indusoidun MMP-9 mRNA väheni annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi MMP-9: n promoottorin lusiferaasiaktiivisuus inhiboi Chrysin annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1 D). Ja western blotting osoitti myös estävää vaikutusta chrysin on MMP-9 ilmentyminen (kuvio 1 E). Pitoisuudet chrysin käyttää esillä olevassa tutkimuksessa ei vaikuttanut solujen elinkykyä (kuvio 1F). Nämä tulokset osoittavat, että chrysin inhiboi MMP-9: n aktiivisuutta AGS soluihin vähenemiseen transkription tehokkuutta.

yhteensä 2 x 10

6 solua esikäsitelty konsentraatiot chrysin 1 tunti, käsiteltiin 100 nM PMA 20 tuntia. Inkuboinnin jälkeen soluviljelyalustoja supernatantti kerättiin ja gelatiinitsymografialla suoritettiin analysoida MMP-9 -aktiivisuuden (A). Soluviljelyaine sisälsi AGS soluja erittää MMP-9 inkuboitiin eri pitoisuuksien chrysin 37 ° C: ssa 3 h, sitten gelatiinitsymografialla suoritettiin analysoida lopullinen MMP-9 toimintaa (ensimmäinen kaista, lastaus ohjaus, sisälsi soluviljelyalustoja supernatantti inkubaation chrysin) (B). Solut esikäsiteltiin konsentraatiot chrysin 1 tunti, käsiteltiin 100 nM PMA: ssa 4 tuntia. Inkubaation jälkeen RT-PCR suoritettiin analysoida MMP-9 mRNA: ta. #

P

0,05 vs. kontrolli; *

P

0,05 versus vain PMA (C). Solut transfektoitiin ohimenevästi pGL4-MMP-9-promoottori reportteri-konstrukti. Transfektoituja soluja esikäsiteltiin konsentraatiot chrysin 1 h, sitten inkuboitiin 100 nM: ssa 4 tuntia, minkä jälkeen lusiferaasin aktiivisuus määritettiin käyttäen luminometriä. #

P

0,05 vs. kontrolli; *

P

0,05 versus vain PMA (D). Solut esikäsiteltiin konsentraatiot chrysin 1 tunti, käsiteltiin 100 nM PMA: ssa 8 tuntia. Inkuboinnin jälkeen western pultti suoritettiin analysoida MMP-9-proteiinin tason. #

P

0,05 vs. kontrolli; *

P

0,05 versus vain PMA (E). Solut ko-inkuboitiin 0-80 uM chrysin 24 tuntia, ja sitten niiden elinkykyisyyksiä testattiin MTT-menetelmällä. *

P

0,05 versus kontrolli (ilman chrysin) (F). Data on keskiarvo ± SD kolminkertaisista mittauksista.

Role of AP-1: PMA-indusoidun MMP-9 ilmentymisen

raportoinut edellisen kirjallisuudessa, AP-1 on tärkein transkriptiotekijän MMP-9 ilmaisun [17]. Tässä tutkimuksessa vahvistaa, että AP-1 on kriittisesti tarvitaan tämän kurssin, käytimme AP-1-syötti fosforotioaattimuodossa kaksijuosteista oligodeoksinukleotidi (ODN) ja pGL3-AP-1 lusiferaasiplasmidin yhteistyöhön transfektoimaan osaksi AGS soluihin. Co-transfektoituja soluja käsiteltiin PMA, ja lusiferaasin aktiivisuudet määritettiin käyttämällä luminometriä. Kuten on esitetty kuviossa 2A, PMA-indusoidun MMP-9-promoottorin Lusiferaasiaktiivisuudet inhiboi AP-1-syötti. Johdonmukaisesti, AP-1-syötti esti myös PMA-indusoidun MMP-9 mRNA ilmaisu (kuvio 2B). On osoitettu, että kaatamalla AP-1 komponentin c-Fos ja c-Jun laski myös PMA-indusoidun MMP-9 ilmentymistä (kuvio 2C). Lisäksi curcumin, AP-1-estäjä, myös käytettiin tarkistaa rooli AP-1 in PMA-indusoidun MMP-9 ilmaisun. Koska RT-PCR-data on esitetty, kurkumiini esti PMA-indusoidun MMP-9 ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2D). Edellä esitetyt tiedot osoittivat, että AP-1 on olennainen tekijä MMP-9 ilmentymistä. Sen jälkeen osoittaa ratkaisevaa roolia AP-1 korkean MMP-9 ilmaisun, me arveltu, että mekanismi chrysin MMP-9 ilmentyminen oli läpi tukahduttaminen AP-1 aktiivisuutta. Myöhemmin AGS transfektoitujen solujen AP-1 lusiferaasireportteri plasmidit esikäsitelty chrysin, ja sitten kannustanut PMA. Kuten on esitetty kuviossa 2E, chrysin tukahdutetaan PMA-indusoidun AP-1lucifease aktiivisuuden annoksesta riippuvaisella tavalla, mikä osoitti, että chrysin on kyky vähentää AP-1-aktiivisuutta.

AP-1-syötti oligonukleotidi oli co -transfected kanssa pGL4-MMP-9 promoottori osaksi AGS soluihin. Inkubaation jälkeen 100 nM PMA: ssa 4 h, MMP-9-promoottorin lusiferaasiaktiivisuus tutkittiin käyttäen luminometriä (A), ja MMP-9 mRNA tutkittiin RT-PCR: llä (B). #

P

0,05 vs. kontrolli; *

P

0,05 versus vain PMA. C-Jun ja c-Fos-siRNA transfektoidut AGS-soluja inkuboitiin 100 nM PMA: ssa 4 tuntia, ja sen jälkeen, kun solujen keräämisen MMP-9 mRNA tutkittiin RT-PCR: llä. #

P

0,05 vs. kontrolli; *

P

0,05 versus vain PMA (C). AGS-soluja esikäsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden curcumin 1 h inkuboitiin 100 nM PMA: ssa 4 tuntia. Inkuboinnin jälkeen, MMP-9 mRNA: n solulysaateista määritettiin RT-PCR: llä. #

P

0,05 vs. kontrolli; *

P

0,05 versus vain PMA (D). PGL3-AP-1-transfektoituja soluja, jotka on esikäsitelty konsentraatiot chrysin 1 h, ja sitten inkuboitiin 100 nM PMA: ssa 4 tuntia, ja AP-1 lusiferaasin aktiivisuus määritettiin käyttäen luminometriä. #

P

0,05 vs. kontrolli; *

P

0,05 versus vain PMA (E). AGS-soluja esikäsiteltiin konsentraatiot chrysin 1 h inkuboitiin 100 nM PMA: ssa 4 tuntia. Inkuboinnin jälkeen, c-Jun, ja c-Fos-mRNA: n solulysaateista määritettiin RT-PCR: llä (F). Solut esikäsiteltiin konsentraatiot chrysin inkuboitiin 100 nM PMA: lla, ja solulysaatit analysoitiin fosforyloitu c-Jun (G), fosforyloitu c-Fos (H), yhteensä c-Jun ja yhteensä c-Fos Western blot analyysi. #

P

0,05 vs. kontrolli; *

P

0,05 versus vain PMA. Yllä olevat tiedot on keskiarvo ± SD kolminkertaisista mittauksista.

Chrysin estää PMA-indusoidun MMP-9 ilmentymisen estämällä transkriptiotekijän AP-1 kautta tukahduttaminen c-Jun: sta ja c-Fos-fosforylaation

on hyvin tunnettua, että c-Jun: sta ja c-Fos ovat komponentteja, AP-1-reitin [18]. Halusimme määrittää mekanismina chrysin estävä vaikutus AP-1, ja tutkitaan, onko chrysin todella kohdistuu sen vaikutus c-Jun ja c-Fos. Mittasimme määrä kokonais-mRNA sekä c-Jun: sta ja c-Fos RT-PCR: llä. Kuten kuviossa 2F, chrysin ei estänyt ekspressiotasot c-Jun ja c-Fos-mRNA: ta. Seuraavaksi testata, jos chrysin estää aktivaatiota c-Jun ja c-Fos, western-blottaus suoritettiin seurata fosforyloidun c-Jun ja c-Fos. Kuvio 2G ja 2F osoittaa, että chrysin teki tukahduttaa PMA-indusoidun c-Jun ja c-Fos-fosforylaation annoksesta riippuvalla tavalla.

Chrysin inhiboi c-Jun: sta ja c-Fos-fosforylaation esto JNK ja ERK signalointi polku

seuraava selvitettiin, miten chrysin tukahdutettu c-Jun ja c-Fos fosforylaatiota. Johtuen tärkeä rooli MAPK pelaa aktivointi AP-1, tutkimme rooli MAPK-reitin MMP-9 ilmentymistä. Kuten on esitetty kuviossa 3A, joukossa MAPK-estäjät, PD98059 (ERK1 /2: n estäjä), SP600125 (JNK1 /2-inhibiittori), ja SB203580 (p38 MAPK: n estäjä), vain PD98059 ja SP600125 kykenivät inhiboimaan PMA-indusoidun MMP-9 ilmentymisen , joka osoitti, että ERK1 /2 ja JNK1 /2 polkuja voi olla ratkaiseva PMA-indusoidun MMP-9 ilmaisun. Edelleen, jossa MEK-hallitseva negatiivinen plasmidi PMCL-K97M, JNK-hallitseva negatiivinen plasmidi PMCL-TAM67 ja p38 MAPK-hallitseva negatiivinen plasmidi PMCL-MP38, varmistimme kriittinen roolit ERK ja JNK MMP-9 ilmaisun mahasyövän AGS -soluissa (kuvio 3B). Lisäksi kuten kuviossa 3C, ERK1 /2 ja JNK1 /2 kriittisesti tarvitaan AP-1 aktivaatio PMA, osoitti kautta kokeilu MEK ja JNK hallitseva negatiivinen plasmideja. Me seuraavaksi tarkastetaan roolit JNK1 /2 ja ERK1 /2 c-Jun ja c-Fos aktivointia. Kuten on esitetty kuviossa 3D, SP600125 ja PD98059 tukahdutetaan PMA-indusoidun c-Jun ja c-Fos-fosforylaation, vastaavasti, mikä osoittaa, että JNK1 /2 on kriittisesti ylävirtaan c-Jun, kun taas ERK1 /2 on kriittisesti ylävirtaan c-Fos. Koska huomasimme, että JNK1 /2 ja ERK1 /2 pelataan olennainen rooli MMP-9 ilmaisun kautta AP-1, me arveltu, että chrysin voi toimia kautta estämällä JNK1 /2 tai ERK1 /2 tukahduttaa MMP-9 ilmaisun. Voit tarkistaa hypoteesia, western-blottaus suoritettiin määrittämään vaikutuksen chrysin on JNK1 /2 tai ERK1 /2 fosforylaatio. Kuten kuviossa 3E ja 3F esittävät, PMA hoito johti huomattava nousu JNK1 /2 ja ERK p42 /44 fosforylaatioon; kuitenkin, kun läsnä on chrysin, PMA-indusoidun JNK1 /2 ja ERK1 /2-fosforylaation estyi annoksesta riippuvalla tavalla.

Solut esikäsitellään pitoisuus 50 uM PD98059 (PD), 50 uM SP600125 (SP ) tai 20 uM SB203580 (SB) 1 h inkuboitiin 100 nM PMA: ssa 4 tuntia. Inkuboinnin jälkeen, MMP-9 mRNA: n solulysaateista määritettiin RT-PCR: llä. #

P

0,05 vs. kontrolli; *

P

0,05 versus vain PMA (A). Koodaavilla ekspressiovektoreilla dominantti negatiivinen mutantti MEK (K97M), mutantti JNK (TAM67) tai mutantti p38 MAPK (MP38) kotransfektoitiin kanssa pGL4-MMP-9-promoottori-konstruktien viemiseksi AGS soluihin. Inkubaation jälkeen 100 nM PMA: ssa 4 tuntia, lusiferaasin aktiivisuus määritettiin käyttäen luminometriä. Data on keskiarvo ± SD kolminkertaisista mittauksista. #

P

0,05 vs. kontrolli; *

P

0,05 versus vain PMA (B). Expression PMCL tyhjän vektorin, joka koodaa dominantti negatiivinen mutantti MEK (K97M) tai mutantti-JNK (TAM67) on ko-transfektoitiin pGL3-AP-1 lusiferaarikonstrukti osaksi AGS soluihin. Inkubaation jälkeen 100 nM PMA: ssa 4 tuntia, lusiferaasin aktiivisuus määritettiin käyttäen luminometriä. Data on keskiarvo ± SD kolminkertaisista mittauksista. #

P

0,05 vs. kontrolli; *

P

0,05 versus vain PMA (C). AGS-soluja esikäsiteltiin 50 uM PD98059, 50 uM SP600125, ja 20 uM SB203580 inkuboitiin 100 nM PMA: lla, ja solulysaatit analysoitiin fosforyloitu c-Jun ja fosforyloitu c-Fos Western blot -analyysillä. #

P

0,05 vs. kontrolli; *

P

0,05 versus vain PMA (D). AGS-soluja esikäsiteltiin ilmoitetun pitoisuuden chrysin inkuboitiin 100 nM PMA: lla, ja solulysaatit analysoitiin fosfo- JNK1 /2 ja fosforyloitua p42 /44 Western blot -analyysillä. #

P

0,05 vs. kontrolli; *

P

0,05 versus vain PMA (E ja F).

vaikutus chrysin solun invasiivisuus

On tunnettua, että korkea MMP -9 ilmaisu ovat tärkeitä invasiivisen fenotyypin syöpäsoluja. Tutkia vaikutus chrysin PMA-indusoidun solujen invaasiota, tutkimme soluinvaasiota läpi modifioidun Boyden hyökkäystä kammioon. AGS soluja inkuboidaan PMA johtivat lisääntynyt määrä tunkeutuneet soluja, jotka läpi keinotekoinen matrigeeliä. Kuitenkin, kun läsnä on chrysin tai MMP-9-vasta-aineen määrä hyökkäsi solujen vähentynyt, mikä osoittaa, chrysin voi estää PMA-indusoidun solujen invasiivisuutta MMP-9 ilmentymistä (kuvio 4A ja 4B). Lisäksi, kuviossa 4C osoitti chrysin laski PMA-indusoidun AGS hyökkäyksen annoksesta riippuvalla tavalla. Seuraavaksi tutkimme vaikutus signaloinnin estäjän PMA-indusoidun AGS soluinvaasion. Kuten on esitetty kuviossa 4D, chrysin, kurkumiinin, PD98059 ja SP600125 inhiboi solujen invaasiota indusoi PMA, mikä osoittaa, että chrysin todennäköisesti estää PMA-indusoidun MMP-9 kautta AP-1 vaimennus, joka johtuu estää JNK1 /2 ja ERK1 /2 reittejä .

Soluja inkuboitiin 50 nM PMA: n läsnä tai poissa ollessa 30 uM chrysin tai 200 ng /ml MMP-9-vasta-aineen BIOCOAT Matrigel laitteessa 24 tuntia (A ja B). Soluja inkuboitiin 50 nM PMA: n läsnä ollessa 0-50 uM chrysin (C). Soluja inkuboitiin 50 nM PMA: n läsnä ollessa 30 uM chrysin, 20 uM curcumin, ja joko 30 uM PD98059 (PD) tai 30 uM SP600125 (SP) (D). Inkuboinnin jälkeen solut tunkeutuu alapinnan kammioiden ja laskettiin käyttäen faasikontrastimikroskoop- valomikroskoopilla jälkeen värjäämällä Diff-Quick Stain Kit. Data on keskiarvo ± SD kolminkertaisista mittauksista. #

P

0,05 vs. kontrolli; *

P

0,05 versus vain PMA.

Keskustelu

Luonnollisesti esiintyviä yhdisteitä anti-syöväntorjuntatoimista häiritsevät kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen syövän estämällä erilaisia ​​mekanismeja kuten solujen vaeltamiseen, invaasiota ja etäpesäkkeiden. Chrysin, luonnollinen flavonoidi laajalti monissa kasviuutteita, hunaja, propolis, on chemopreventive ominaisuuksia, kuten antiproliferatiivisia ja pro-apoptoosin vastaisen toiminnan eri syöpiä [19,20]. Kuitenkin, anti-hyökkäys ominaisuuksia chrysin ei ole hyvin tutkittu mahalaukun syöpäsoluja. On hyvin tunnettua, että MMP: t ovat voima tuhoaminen soluväliaineen, sekä tärkeimpiä indusoijia solun invasiivisuus. Olemme tutkineet estäviä vaikutuksia chrysin on MMP: iden ilmentyminen mahalaukun syöpäsoluja. Chrysin inhiboi MMP-9 ilmentyminen (kuvio 1) ja muut MMP: t, kuten MMP-2 ja MMP-7 (dataa ei esitetty). Asetus mekanismi chrysin voidaan riippui kunkin MMP, ja tässä tutkimuksessa keskitymme MMP-9 regualtion.

PMA, forboli-12-myristaatti 13-asetaattia, proteiinikinaasi aktivaattori, käytetään yleisesti kuten biolääketieteellisen tutkimuksen väline malleja syövän. Tässä tutkimuksessa, huomasimme PMA lisäsi MMP-9 aktiivisuuden kautta voimistumista sen ekspressiotason. Läsnä ollessa chrysin, PMA-indusoidun MMP-9 laski on chrysin-annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1A).