Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

D-vitamiini on tunnetusti tärkeä rooli syövän ehkäisy. Yksi ominaisuuksia, jotka liittyvät puhkeamista maligniteetti on korkeus Cu (II) tasot. Tila syövän ehkäisemiseen välittämien kalsitriolin, biologisesti aktiivinen muoto D-vitamiinin, pysyvät suurelta osin tuntemattomia.

Methods

Käyttämällä eksogeenisesti lisätyn Cu (II) stimuloida maligniteetti kuin ehto on novel solukkojärjestelmän kanin kalsitriolin ylikuormitettu lymfosyyttejä, arvioimme lipidiperoksidaatio, proteiini karbonylointikatalysaattoria, DNA-vaurioita ja seurauksena apoptoosin. Vapaiden radikaalien välittäjien tunnistettiin vapaalla radikaalinpoistajat ja rooli Cu (II) reaktio selvitetty käyttäen kelatoivia redoksiaktiivinen solujen metalli-ioneja.

Tulokset

lipidiperoksidaatiossa ja proteiinia karbonylointi- ( merkkiaineiden oksidatiivisen stressin), seurauksena DNA: n fragmentoituminen ja apoptoosin havaittiin takia kalsitriolialtistus-Cu (II) vuorovaikutus. Hydroksyyliradikaalit, vetyperoksidia ja superoksidianionien välittävät oksidatiivisen stressin aikana tuotettujen tämän vuorovaikutuksen. Joukossa cellular redoksiaktiivinen metalleja, kuparia todettiin olevan vastuussa tämän reaktion.

Johtopäätös

Tämä on ensimmäinen raportti syytetään Cu (II) ja kalsitrioli vuorovaikutus syynä selektiivisen sytotoksisen toiminnan kalsitriolin vastaan ​​pahanlaatuisia soluja. Osoitamme, että tämä vuorovaikutus johtaa tuotannon oksidatiivisen stressin vuoksi vapaiden radikaalien tuotanto ja seurauksena DNA-fragmentaation, joka johtaa apoptoosin. Oletettu mekanismi on esitetty selittää biologinen vaikutus.

Citation: Rizvi A, Hasan SS, Naseem I (2013) Valikoiva sytotoksiset Toiminta ja DNA Damage by Kalsitrioli-Cu (II) Interaction: Oletetut Mechanism of Cancer Prevention . PLoS ONE 8 (9): e76191. doi: 10,1371 /journal.pone.0076191

Editor: Partha Mukhopadhyay, National Institutes of Health, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. kesäkuuta, 2013 Hyväksytty: 23 elokuu 2013; Julkaistu: 27 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Rizvi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: AR vastaanotettu UGC-CSIR Junior Research Fellowship päässä Intian hallitus. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

D-vitamiini

3 saadaan ruokaa (täydennettyjä maitotuotteet ja kalaöljyt) tai syntetisoituu ihossa 7-dehydrokolesterolista ultraviolettisäteilytyksellä. Maksassa D-vitamiini

3 hydroksyloituu C-25 D-vitamiinin 25-hydroksylaasin tai P450 ja muodostaa 25-hydroksi-D

3 (25 (OH) D

3). 25 (OH) D

3 kuljetetaan sitten munuaisten jossa proksimaalisessa munuaistiehyiden se hydroksyloidaan C-1 tuloksena muodostumista hormonaalisesti aktiivisen alkaen D-vitamiinia, 1,25-dihydroksi-D

3 (1,25 (OH)

2D

3) tai kalsitriolin joka on välttämätön ravintoaine, joka välittää erilaisia ​​metabolisia prosesseja [1]. Eri linjat todisteiden perustuvan farmakologian ja

in vivo

eläinmallissa tutkimukset osoittavat, että kalsitriolin on syöpälääke

in vivo

[2], joka toimii käynnistämällä apoptoosin ja kasvun estämiseksi useat pahanlaatuisten solulinjojen [3]. Epidemiologiset tutkimukset osoittavat, että vähemmän auringonvaloa ja siitä alemmille tasoille kalsitriolin lisäävät syöpäriskiä ja välittävät etenemistä useiden syöpien, jotka sisältävät syöpää rinta-, munasarja-, paksusuoli-, ruokatorvi, peräsuoli, haima ja veri [4,5]. Monenlaisia ​​pahanlaatuisia soluja, jotka reagoivat vaihteleva taso kalsitriolin osoittaa laajaa rooli kalsitriolin välittämisessä syövän vaikutukset. Kuitenkin tarkka mekanismi, jolla syöpälääkkeen vaikutuksia kalsitriolin toteutuvat edelleen tuntematon.

Yksi ominaispiirteistä maligniteetti on korkeus kupari tasoilla [6-8]. Kupari on tärkeä metalli-ioni havaittu liittyvän kromatiinin kanssa DNA: ta, erityisesti guaniinin [9]. On tunnettua, että pahanlaatuisissa soluissa, kuparin pitoisuudet saattavat kohota kaksi viiteen kertaa, verrattuna niihin raportoitiin normaaleissa soluissa [10]. Vaikka täsmälliset syy elevoitavaksi kuparitasot aikana maligniteetti jää epäselväksi, lisääntynyt angiogeneesi on ajateltu olevan mahdollinen syy [11].

Tässä tutkimuksessa ehdotamme fysiologinen yhteys kalsitriolin ja kuparin pahanlaatuisia soluja. Kuvaamme oletetun, Cu (II) aiheuttama, vapaiden radikaalien välittämän reitin, mikä selittää selektiivinen sytotoksinen toiminta kalsitriolin vastaan ​​pahanlaatuisia soluja. Asian havainnollistamiseksi kalsitriolin toimintaa, olemme käyttäneet solukkojärjestelmässä kalsitriolin ylikuormitettu lymfosyyttien (työtoverit). Osoitamme, että sarakkeet, kun se altistetaan Cu (II) ionien ympäristön simuloimiseksi pahanlaatuisen solun läpi oksidatiivisia vaurioita, ja DNA-vaurioiden, joka lopulta johtaa solun kuolemaan. Koska kalsitriolin, oleellisesti hydrofobinen laji, vaikuttaa DNA, erittäin polaarinen molekyyli, esitämme hypoteesin selittää vuorovaikutusta kalsitriolin ja DNA. Perustuen mutageneesi, biokemiallisten ja rakenne liittyviä tietoja [12-18], keskustelemme mahdollisuudesta, että D-vitamiini-reseptorin (VDR) toimii ”adapteri proteiini”, joka välittää tätä prosessia. Hyödynnämme äskettäin selvitetty rakennetta VDR ja sen sitova kumppani RXR (retinoiinihappo X-reseptori) [19] kertoakseen hypoteesi. Parhaan tietomme mukaan esillä oleva tutkimus on ensimmäinen raportti, joka osoittaa, että Cu (II) on merkitystä kalsitriolin välittämän solukuoleman.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit

Kaikki kemikaalit ja entsyymit, joita käytetään saatiin Sigma Aldrich (USA). Kaikki liuokset valmistettiin samana päivänä ja käytettiin välittömästi.

Eettinen linjaus for Animal koe

eläinkokeista oli sallittua ympäristö- ja metsien, Intian hallitus rekisteröitävänä no 714/02 /a /CPCSEA myöntämien komitea tarkoitus ohjaus ja valvonta eläinkokeiden (CPCSEA) päivätty 16 marraskuu 2002 ja hyväksymä institutionaalisten eettisen komitean Biokemian, Aligarh muslimi University, Aligarh, Intia (Tilaus no: DNo1).

valmistaminen Kalsitrioli Overloaded Lymfosyyttien (työtoverit) B

Viisitoista mies albinokaniinien painavat 1 + 0,1 kg ostettiin ja satunnaisesti kolmeen ryhmään viiden kanit jokaisen. Kaneja kukin omassa teräslevypidin, ja ylläpidetään vakio kani ruokaa ja vettä, edellyttäen

ad libitum

, jossa 12 tunnin valon ja pimeyden sykliä 25 ° C: ssa. Eläimiä sopeutettiin kuukausi ennen alkua koetta. Eläimet ryhmässä yksi sai 200 ng /g painoa Kolekalsiferolin liuotettuna 1 ml: aan etanolia, intraperitonially joka päivä kahden viikon ajan. Eläimet ryhmässä kaksi sai intraperitoneaalisesti injektiota 1 ml etanolia (ajoneuvon hallinnan) ja eläimiä ryhmässä kolme toimivat vertailuryhmänä. Kahden viikon kuluttua eläimet lopetettiin ja veri kerättiin heparinisoitiin putkiin ja laimennettiin ioni-vapaata fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (pH 7,0). Lymfosyytit eristettiin käyttäen Histopaque 1077, ja solut suspendoitiin RPMI 1640 Juuri eristetyt lymfosyytit käytettiin kaikissa kokeissa.

määritys Solunsisäiset kalsitriolin tasot sarakkeet

eristetty lymfosyytit lyysattiin ja solu lysaattia käytettiin edelleen tasojen määrittämiseksi kalsitriolin, käyttäen USCN Life Sciences Inc. (Huston, Texas, USA) mukaisen pakkauksen valmistajan ohjeiden mukaisesti.

lymfosyyttien

Lymfosyytit suspendoitiin yhteensä 3 ml PBS: ää ja inkuboitiin, kun läsnä on Cu (II) (25 uM) 2 tunnin ajan. Reaktio suoritettiin myös, kun läsnä on tiettyjä metalli-ionin kelaattoreita. Desferoksamiinia (50 uM) käytettiin kelatoimaan Fe (II) ioneja, histidiini (50 uM) käytettiin kelatoimaan Zn (II) ja bathocuprione ja neucuprione (50 uM kutakin) käytettiin kelaatin solunulkoinen ja solunsisäinen Cu (II) ioneja. Vapaiden radikaalien poistajat (katalaasi 20 ug /ml, superoksididismutaasi (SOD) 20 ug /ml, ja tiourea 0,1 mmol) käytettiin erilliset reaktiot; syyttämään rooliin ROS Cu (II) välittämän oksidatiivisen stressin. Yhtä suuret määrät lymfosyyttejä (1 x 10

8 + 10

3) käytettiin kaikissa kokeissa.

Cu (II) aiheuttama -lipidiperoksidaation Cols

tiobarbituurihapon reaktiivisen Aineet (TBARS) arvioitiin lymfosyyttien menetelmällä Ramanathan et al. [20], vähäisin muutoksin. 1,5 ml: n reaktioseosta, 0,5 ml 10% TCA: ta (trikloorietikkahappo) ja 0,5 ml 0,6 M TBA (2-tiobarbituurihapon) lisättiin ja seosta inkuboitiin kiehuvassa vesihauteessa 20 minuuttia. Absorbanssi luettiin 532 nm ja muunnetaan nano-moolia TBA reagoivia aineita käyttäen molaarista ekstinktiokerrointa.

Cu (II) aiheuttama proteiinin karbonyloinnin vuonna Cols

Käsitellyt lymfosyytit hajotettiin ja määrä karbonyyliryhmät muodostettu määritettiin [21]. Yksi ml reaktioseosta hoidon jälkeen sekoitettiin 0,5 ml: lla 10 mM 2,4-dinitrofenyylihydratsiinin 2,5 M HCl: ää. Seos jätettiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja 0,5 ml 20% trikloorietikkahappoa lisättiin putkeen. Putki jätettiin jään ämpäri 10 min seurasi sentrifugointi 12000 x g 15 min. Supernatantti heitettiin pois ja proteiinin pelletti pestiin etanoli /etyyliasetaatti (1: 1 v /v) ja liuotettiin 2 ml: aan 6 M guanidiinia (pH 2,3), ja seosta vorteksoitiin. Karbonyylin pitoisuus laskettiin käyttäen molaarista absorptiokerrointa 22000 M

-1 cm

-1

Comet, Pitoisuus (Single Cell alkali geelielektroforeesi) on Cols

Comet määritys suoritettiin käyttäen samaa menetelmää, jota Singh et al. [22], vähäisin muutoksin. Täysin himmeä Objektilasit esipäällystetty 1,0% normaalia sulaminen agaroosia. Lymfosyytit sekoitettiin 90 ul: aan 1,0% matalan sulamispisteen agaroosia muodostamiseksi solususpensio ja pipetoitiin ensimmäisen kerroksen päälle ja peitettiin peitelasilla. Objektilasit pantiin jään pakkauksissa 10 minuuttia jähmettyä agaroosi. Peitinlasit hellävaraisesti poistettiin ja kolmas kerros on 0,5% alhaisen sulamispisteen agaroosia pipetoitiin. Objektilasit peitettiin kansilla ja asetettiin jään pakkauksissa jähmettyä. Peitelasit poistettiin sitten ja objektilasit upotettiin jääkylmään hajotuspuskuriin tunnin ajan. Hajotuksen jälkeen DNA annettiin rentoutua alkalisessa elektroforeettisen liuosta (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 13). Elektroforeesi suoritettiin 4 ° C: ssa, kentänvoimakkuus 0,7 V /cm, ja 300 mA. Objektilasit neutraloitiin jääkylmää 400 mM Tris (pH 7,5), ja värjättiin 75 ui etidiumbromidia (20 mg /ml) ja peitetään kannen slip. Objektilasit pisteytetty kuva-analyysi-järjestelmän (Komet 5,5, Kinetic Imaging, Liverpool, UK) kiinnitetty Olympus (CX41) fluoresenssimikroskoopilla (Olympus Optical Co., Tokio, Japani) ja COHU 4910 integroitu CC kamera (varustettu 510-560 nm: n virityksellä ja 590 nm este suodattimet) (COHU, San Diego, CA, USA). Kuvia 25 solut analysoitiin kustakin kolmena kappaleena dia. Tail pituus (migraatio DNA tuman μmeters) oli käytetty parametri aasin DNA-vaurioita.

Cu (II) indusoi apoptoosin Cols

Käsitellyt lymfosyytit sotkee ​​puhtaalle, etanoli steriloitu lasilevyllä, ja värjättiin Leishmanin tahra. Apoptoottiset solut visuaalisesti sijoitettiin kolmessa satunnaisesti valittu näkökentät mukaan kriteerien Hasan et al. [23] käyttäen Nikon kiikari valomikroskoopilla.

Tilastollinen analyysi

Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona + SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. Data analysoitiin Tukeyn testi, kun yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA) käyttäen GraphPad Prism 5,01 (California, USA). Erot katsottiin tilastollisesti merkittävä P 0.05

Tulokset

Cellular malli tutkia ex vivo vuorovaikutus kalsitriolin ja kuparin

Kuten edellä mainittiin Kalsitriolista tiedetään välittävän syöpälääkkeen vaikutuksia. On raportoitu, että Cu (II) on myös merkittävästi kohonnut pahanlaatuisissa soluissa. Vaikutusten tutkimiseksi kalsitriolin-Cu (II) vuorovaikutus, olemme kehittäneet malli järjestelmä, joka perustuu lymfosyyttejä. Kalsitriolin ylikuormitus lymfosyyttien saavutettiin kautta vatsaonteloon ja kalsitriolin-esiaste kolekalsiferoli, joka tehtiin muuntaminen kalsitriolin, eläimessä järjestelmässä. Sen jälkeen kolekalsiferoli injektio, havaittiin, että kalsitriolin tasoja eristetyssä lymfosyytit kohotettuina 25.52% (kuvio 1). Cu (II) kohoamiseen

in vitro

täydentäminen eristetty, työtoverit Cu (II). Määritykset lipidiperoksidaatio, proteiinia karbonylointi ja DNA-vaurioita seurauksena kalsitriolin-Cu (II) vuorovaikutus tehtiin eristettyjen lymfosyyttien järjestelmä.

Tasot kalsitriolilla kalsitriolin ylikuormitettu lymfosyyttien (työtoverit) lysaatit ja valvonta lymfosyyttejä. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona + SEM (n = 3) * P 0,001 verrattuna valvoa ja ajoneuvon hallinnan.

Cu (II) aiheuttama -lipidiperoksidaation Cols

Kalsitriolia on todettu aiheuttavan oksidatiivisen stressin. Yksi seurauksista oksidatiivisen stressin on peroksidoitumista solulipideistä [20]. Siksi lipidiperoksidaatio käytettiin merkkiaineena arvioida oksidatiivista stressiä funktiona kalsitriolin tasoilla. Korkeus kalsitriolin tasoa ei johtanut merkittäviin -lipidiperoksidaation sarakkeet (kuvio 2). Kuitenkin altistus työtoverit Cu (II) ioneja, johti huomattavaan kasvuun lipidiperoksidaation (kuvio 2). Sen määrittämiseksi, onko lipidiperoksidaation on Cu (II) spesifisen vaikutusta, tai jos muut redox-aktiivisia kaksiarvoisia metalli-ioneja, kuten Fe (II): n ja Zn (II) välittävät lipidiperoksidaatiota läsnä kalsitriolin, kelatoivia Fe (II ) ja Zn (II) ioneja (desferoksamiinia ja histidiini, vastaavasti) lisättiin eristetty sarakkeet. Havaittiin, että poisto Fe (II): n ja Zn (II) ei aiheuttanut merkittävää inhibitiota lipidiperoksidaation (kuvio 2). Kontrollina, kelatoivia Cu (II) otettiin käyttöön testata erityistä roolia Cu (II) aiheuttavat oksidatiivista stressiä sarakkeet. Havaittiin, että merkittävä inhibitio lipidiperoksidaation saavutettiin poistamisen jälkeen Cu (II) (kuvio 2). Tunnistaa sijainti Cu (II) allas (solunsisäinen vs. ekstrasellulaarinen), joka välittää lipidiperoksidaatio, vaikutus Cu (II) kelaattorit eri kalvo läpäisevyys testattiin -lipidiperoksidaation eristyksissä Cols. On merkittävää huomata, että bathocuprione, joka on kalvon läpäisemätön Cu (II) kelaattorin, ei estänyt lipidiperoksidaatiota yhtä tehokkaasti kuin neucuprione, kalvo läpäisevä kuparia kelatoiva (kuvio 2). On pääteltävä, että solunsisäistä allas Cu (II) toimii välittäjänä lipidiperoksidaatiossa vuorovaikutusten kautta kalsitriolin. Havaittiin, että eksogeenisesti lisätyt Cu (II) ohjaus (purettu lymfosyytit) ei indusoinut merkittävää lipidiperoksidaation (kuvio 2). Kuten peroksidaatio on aiheuttanut aktiivisuutta aineiden hapettumista, vapaiden radikaalien poistajat (SOD, katalaasi ja tioureaa), käytettiin määrittämään identiteetin vapaita radikaaleja, jotka ovat mukana Cu (II) -calcitriol indusoitu hapetus tapahtumia. Tehokkaan inhibition Cu (II) aiheuttama lipidiperoksidaation eristetty sarakkeet havaittiin SOD, katalaasi ja tioureaa (kuvio 2). On pääteltävä, että superoksidianionin, vetyperoksidia ja hydroksyyli radikaalit, scavenged vastaavasti SOD, katalaasi ja tiourea, välittävät Cu (II) aiheuttama lipidiperoksidaatiolta.

(A) (B) Ajoneuvon ohjaus (C ) Cu (II) (25 uM) [lisätään non kalsitrioliksi ladattu, ohjaus lymfosyyttejä] (D) kalsitrioli ylikuormitus (E) kalsitriolia ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) (F) kalsitriolia ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + Bathocuprione (50 uM) (läpäisemättömän kalvon Cu (II) kelaattorin) (G) Kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + Neucuprione (50 uM) (kalvon läpäisevä Cu (II) kelaattorin) (H) Kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + desferoksamiinia (50 uM) (Fe (II) kelaattorin) (I) Kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + histidiini (50 uM) (Zn (II) kelaattorin) (J) Kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + SOD (20 ug /ml) (K) Kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + Katalaasi (20 ug /ml) (L) Kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + tioureaa (0,1 mM). Arvot ilmoitetaan keskiarvona + SEM (n = 3). P 0,05 verrattuna ohjata ja työtoverit kanssa Cu (II) (25 uM). Kaikki inkuboinnit suoritettiin 2 tuntia 37º C.

Cu (II) indusoi proteiinia karbonyloinnin vuonna sarakkeet

Protein karbonylointi on seurausta oksidatiivisen stressin ja vuorovaikutus vapaiden radikaalien jossa aminohapon sivuketjuja. Siten proteiini karbonylointi toimii merkkiaineena oksidatiivisen stressin kohtaamat biologisessa järjestelmässä. Altistaminen Cols Cu (II) ioneja johti huomattavaan kasvuun kokonaisproteiinipitoisuus karbonylointi-. Kelatoivat solunsisäinen Zn (II) ja Fe (II) ei vaikuttanut proteiinin karbonylointisyötettä taas kelatoivien Cu (II) järjestelmästä johti heikkenee huomattavasti koko karbonyyli sisältöä. Läsnäolo vapaiden radikaalien poistajat (SOD, katalaasi ja tiourea) järjestelmässä johti heikkenee huomattavasti kokonaisproteiinipitoisuus karbonyyli sisältöä (kuva 3).

(A) (B) Ajoneuvon ohjaus (C) Cu (II) (25 uM) [lisättiin kuin kalsitriolin ladattu, ohjaus lymfosyyttejä] (D) kalsitrioli ylikuormitus (E) kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) (F) kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + Bathocuprione (50 uM) (läpäisemättömän kalvon Cu (II) kelaattorin) (G) Kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + Neucuprione (50 uM) (kalvon läpäisevä Cu (II) kelaattorin) (H) Kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) ( 25 uM) + desferoksamiinia (50 uM) (Fe (II) kelaattorin) (I) Kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + histidiini (50 uM) (Zn (II) kelaattorin) (J) Kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) ( 25 uM) + SOD (20 ug /ml) (K) Kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + Katalaasi (20 ug /ml) (L) Kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + tioureaa (0,1 mM). Arvot ilmoitetaan keskiarvona + SEM (n = 3). P 0,05 verrattuna ohjata ja työtoverit kanssa Cu (II) (25 uM). Kaikki inkuboinnit suoritettiin 2 tuntia 37º C

Cu (II) aiheuttamaa solujen DNA-vaurioita Cols

Generation vapaiden radikaalien aiheuttaa DNA-vaurioita, mikä johtaa apoptoosin [ ,,,0],24]. Yksi ominaisuuksista apoptoosin on rikkoutuminen DNA-fragmentteja, joka havaitaan komeetta määrityksellä. Havaittiin, että kalsitriolin ylikuormitus lymfosyyteille johti DNA-vaurioita, mikä oli merkittävästi parannettu inkuboitaessa työtoverit kanssa Cu (II) (kuvio 4A, 4D). Edelleen spesifisyyden määrittämiseksi Cu (II) välittämisessä DNA-vaurioita, kalvon läpäisevä Cu (II) -chelator neucuprione hyödynnettiin. Inkubointi yksittäisiä Cols kanssa neucuprione esti merkittävästi DNA-vaurioita, syytetään solunsisäinen Cu (II) osallistujaksi kalsitriolin välittämän DNA-vaurioita (kuva 4B, 4D). Osallistuminen muiden kaksiarvoisten kationien kalsitriolin välittämän DNA-vaurioita lymfosyyttien testattiin desferoksamiinia ja histidiinin, mikä ei estänyt DNA-vaurioita, sulje pois osallistumista Fe (II) ja Zn (II) prosessissa (kuvio 4B, 4D ). Estämällä DNA vaurioita SOD, katalaasi ja tiourea merkitsee sitä, että DNA-vaurioita aiheuttaa superoksidianionin, vetyperoksidia ja hydroksyyli radikaalit (kuvio 4C, 4D).

(A) DNA-vaurioita ohjaus lymfosyyteissä, auton hallinnan lymfosyytit, Cols ja työtoverit kanssa Cu (II) (25 uM). Arvot ilmoitetaan keskiarvona + SEM (n = 3) ** P 0.001as vertailuryhmän ja ajoneuvon hallinnan, P 0,001 jolloin * ja ** verrataan). (B) poistaminen Cu (II) ja DNA-vaurioita. Sarakkeet, jossa Cu (II) (25 uM) + neucuprione (Neo) (50 uM) (kalvon läpäisevä Cu (II) kelaattorin), desferroxamine (Desf) (50 uM) (Fe (II) kelaattorin), histidiini (His) (50 uM) ( Zn (II) kelaattorin) Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona + SEM (n = 3). * P 0,001 verrattuna ohjata ja työtoverit kanssa Cu (II) (25 uM). (C) työtovereineen Cu (II) (25 uM) inkuboitiin yhdessä (SOD) (20pg /ml), katalaasia (Cat) (20pg /ml), ja tioureaa (Thio) (0,1 mM) Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona + SEM (n = 3). (D) edustavat kuvat Comet määritys (1) ohjaus (2) Ajoneuvon ohjaus (3) työtoverit (4) työtovereineen + Cu (II) (25 uM) (5) työtovereineen + Cu (II) (25 uM) + Neo (50 uM) (6) työtovereineen + Cu (II) (25 uM) + Desf (50 uM) (7) työtovereineen + Cu (II) (25 uM) + His (50 uM) (8) työtovereineen + Cu (II) (25 uM) + SOD (20 ug /ml) (9) työtovereineen + Cu (II) (25 uM) + Cat (20 ug /ml) (10) työtovereineen + Cu (II) (25 uM) + Thio (0,1 mM). * P 0,001 verrattuna ohjata ja työtoverit kanssa Cu (II) (25 uM). Kaikki inkuboinnit suoritettiin 2 tuntia 37º C.

Cu (II) indusoi apoptoosia sarakkeet

Apoptoosi on tunnusomaista se, morfologiset muutokset solun sisällä. Ytimien apoptoottisten solujen on ominaista muodostuminen erillisiä apoptoottisten kappaleiden ja ydinvoiman pirstoutumista. Altistuminen Cols Cu (II) ioneja, johti merkittävään lisääntymiseen apoptoottisten solujen. Kuparin poistamiseksi järjestelmästä laski kokonaismäärä apoptoottisia soluja, kun taas kelatoituminen muut hapetus-pelkistys-aktiivisen kaksiarvoisia metalli-ioneja (Zn (II) ja Cu (II)) ei vaikuta merkittävästi apoptoosiin. Vapaiden radikaalien poistajat onnistuneesti vähensi apoptoottisten solujen ja siten selkeästi syytetään rooli reaktiivisten hapen lajien Cu (II) indusoi apoptoosin sarakkeet (kuvio 5).

(A) (B) Ajoneuvon ohjaus (C ) Cu (II) (25 uM) [lisätään non kalsitrioliksi ladattu, ohjaus lymfosyyttejä] (D) kalsitrioli ylikuormitus (E) kalsitriolia ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) (F) kalsitriolia ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + Bathocuprione (50 uM) (läpäisemättömän kalvon Cu (II) kelaattorin) (G) Kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + Neucuprione (50 uM) (kalvon läpäisevä Cu (II) kelaattorin) (H) Kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + desferoksamiinia (50 uM) (Fe (II) kelaattorin) (I) Kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + histidiini (50 uM) (Zn (II) kelaattorin) (J) Kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + SOD (20 ug /ml) (K) Kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + Katalaasi (20 ug /ml) (L) Kalsitrioli ylikuormitus + Cu (II) (25 uM) + tioureaa (0,1 mM). Arvot ilmoitetaan keskiarvona + SEM (n = 3). P 0,05 verrattuna ohjata ja työtoverit kanssa Cu (II) (25 uM). Kaikki inkuboinnit suoritettiin 2 tuntia 37º C

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa, tarjoamme alustavaa näyttöä siitä, että kalsitriolin Cu (II) vuorovaikutus on merkittävä aiheuttaa DNA-vaurioita , joka voi johtaa apoptoosin. Koska on osoitettu, että Cu (II) on läsnä sitoutuneena genomista DNA [9] ja se on kohonnut pahanlaatuisten solujen [6-8], Cu (II) testattiin ehdokas metalli aktivoida kalsitriolin kemiaa.

kuvatut tutkimukset täällä testata roolia kalsitriolin-Cu (II) vuorovaikutuksen lipidiperoksidaation, proteiinia karbonylointi ja DNA-vaurioita, kolme indikaattoria oksidatiivisen stressin ja seurauksena apoptoosin. Pro-hapetin aktiivisuutta, reaktiivisten hapen lajien välillä kalsitriolin tarvitaan. Useita proapoptootti- lääkkeet [25,26], kasvi peräisin olevat molekyylit [24,27], ja C-vitamiinia [28], toimivat vahingoittaa DNA-ionin välittämän Fenton kemia.

Ehdotamme otaksuttu mekanismia ( Kuvio 6 A), joka kalsitriolin voivat olla vuorovaikutuksessa DNA: n kanssa sitoutunut Cu (II) kohdistamaan sen pro-hapetin vaikutuksia. Metyleeniryhmä Kalsitriolista hyväksyy electron Cu (II) ja joukko kaksoissidoksen uudelleenjärjestelyjä ja autolyysin veden muotoja hydroksyyliradikaalien. Nämä hydroksi radikaalit voivat joko yhdistää keskenään ja johtaa vetyperoksidin tai voi vaihtoehtoisesti vuorovaikutuksessa Cu (I) ja johtavat tuotannon Cu (II), luoden näin redoksijaksossa.

( A) Tuotanto hydroxl radikaaleja, superoksidianionien ja vetyperoksidin lukemiin DNA-vaurioita ja seurauksena solukuoleman. (B) Hetero-dimeeri VDR (vihreä) ja RXR (oranssi) osoittavat erottaminen kalsitriolin sitoutumiskohta ja sitoutuneen DNA. Ylempi paneeli: Näytä normaali akselin sitoutuneen DNA. Alempi paneeli: Katso akselia pitkin sidottua DNA: ta. Kalsitrioli (tummanvihreä tikkuja ja pallot) sidottu VDR, muodostaa vapaiden radikaalien tuotantoa sivusto, erotetaan DNA molekyylin ~ 39 Å. Viite, retinoiinihappo sitoutuu RXR on myös esitetty. Kaksijuosteinen DNA-molekyyli on esitetty ohut musta /sininen tikkuja. Etäisyysmittaukset ja kuvio valmistelu tehtiin PyMol (www.pymol.org) käyttäen koordinaatit VDR /RXR hetero-dimeeri [Orlov et al. EMBO J. 2012] ystävällisesti B. Klaholz.

Vetyperoksidi kerran muodostunut, voi edelleen reagoida Cu (II), joka johtaa sen homolyyttinen /hetrolytic erittely, joka muodostaa vielä useampi hydroksyyliryhmä, ja Cu (II) pelkistetään Cu (I). Vaihtoehtoisesti superoksidianionia voisivat reagoida veden kanssa ja muodostavat vielä vetyperoksidia.

Koska solunsisäinen kupari sitoutuu DNA ja kalsitriolin tiedetään menevän tuman, tuotanto vapaiden radikaalien ja vetyperoksidin ehdotetun mekanismin, olisi mitä todennäköisimmin, tapahtuu välittömässä läheisyydessä DNA johtaa DNA-vaurioita. Hydroksyyliradikaalit näyttävät olevan tärkeä rooli sukupolven oksidatiivisen stressin, koska tiourea, voimakas raadonsyöjä Hydroksyyliradikaalien voi estää sekä lipidiperoksidaatiossa ja DNA-vaurioita merkittävästi. On myös tärkeää huomata, että kalvon läpäisevän Cu (II) kelaattorin neucuprione myös estää lipidiperoksidaation proteiinia karbonylointikatalysaattoria, DNA-vaurioita ja apoptoosin, mahdollisesti kelatoivia ja siten, tehden DNA: n sitoutuneen kuparin ole käytettävissä reagoimaan kalsitriolin.

sulkea pois osallistumista muiden suurten redox-aktiivisia metalleja läsnä biologisissa järjestelmissä, Fe (II) ja Zn (II) testattiin. Kokeet kelatoivia Fe (II) ja Zn (II) ei aiheuttanut inhibitiota kalsitriolin välittämän lipidiperoksidaation, proteiini karbonylointikatalysaattoria, DNA-vaurioita ja apoptoosin työtoverit. Siksi päätellään, että Cu (II) on spesifisesti vuorovaikutuksessa kalsitriolin välittävän DNA-vaurioita, joka johtaa apoptoosin. Kalsitriolin päätellään olevan rooli aktivoinnissa apoptoosin Cu (II) rikas ympäristö, kuten havaittiin pahanlaatuisten solujen, jotka voivat toimia puolustusmekanismi ohjaamaan solujen pahanlaatuista kasvua.

Tulokset on kuvattu esillä olevassa tutkimuksessa toimittamaan tietoa kalsitriolin Cu (II) -DNA vuorovaikutusta. Tältä osin on tärkeää huomata, että kalsitriolin hydrofobinen molekyyli, vuorovaikutuksessa Cu (II) ja DNA: n, jotka molemmat ovat erittäin polaarisia. Koska lipidijohdannaisen kalsitriolin osioita lipidikaksoiskerroksia. Kun kyseessä on suora vuorovaikutus kalsitriolin ja napa-laji, on välttämätöntä, että sovittimen molekyyli tuo kalsitrioliksi läheisyydessä DNA ja DNA sitoutuu Cu (II). Yksi tällainen molekyyli on D-vitamiinin reseptorin (VDR). On hyvin dokumentoitu, että VDR paikantuu tumassa [29], ja sitoutuu selektiivisesti sekä kalsitriolin ja DNA. Tehokasta hapettumista sijainnin läheisyys välillä kalsitrioli ja DNA (yhdessä sidotun Cu (II) ionien) on tarpeen. Toiseksi VDR hiirten on osoitettu olevan erittäin herkkiä kemiallisille syöpää aiheuttavia aineita. 60 päivän kuluessa altistumisesta, 88% VDR nollahiiriä alttiina kemiallinen karsinogeeni DMBA kehittynyt syöpä [30]. VDR null hiirillä on osoitettu olevan hyvin herkkä kemiallisesti indusoidun lukemia ja kokeellisen VDR ablaatio aiheuttaa lisääntynyt ihon ja maitorauhasen tumuroginesis [30] osoittaa, on selkeä rooli VDR prosessin valvonnassa syövän. On todistettu, että VDR ilmaisua positiivisesti korreloi tuumorisuppressiogeeneksi [30]. Malli täyspitkä VDR rakenne, yhdessä sitovan kumppanin retiinihapporeseptorin (RXR) on raportoitu kautta kylmäpresipitaattien elektronimikroskoopilla (Cryo-EM) jälleenrakennus äskettäin [12]. Se on merkitystä huomata, että VDR sarana-alueen on havaittu olevan joustava, ja tämä joustavuus on ratkaisevan tärkeä tehtävä täyspitkän polypeptidin [13-16]. Kalsitriolin molekyyli on todettu erotetaan sitoutuneen DNA-molekyyli, jonka pituus on noin 39 Å VDR rakenteen (kuvio 6B). Me hypoteesin, että VDR molekyyli voi käydä läpi konformaation muutoksen pitkin sarana, kuva 6B (ylempi paneeli), joka tuo sitoutuneen DNA lähellä kalsitriolialtistus [18].

Se, että kalsitriolin on proxidant pahanlaatuisissa soluissa on osoitettu Koren et al. [31], jotka osoittivat, että MCF-7 solulinja, glutationitasoja kasvaa kun kalsitriolialtistus, mikä on osoitus lisääntynyt ROS sukupolvi. Narvaez ja Walesin [32] ovat osoittaneet, että kalsitriolin induceded apoptoosin pahanlaatuisten solujen riippuu vapaiden radikaalien sukupolvi. Sitoutuminen pahanlaatuisten solujen kalsitriolialtistus-välitteisen apoptoosin on osoitettu olevan kaspaasin riippumattomia, mikä osoittaa, että kalsitrioli-välitteistä apoptoosia pahanlaatuisten solujen suoritetaan ei-klassisen reittejä. Meidän ei entsymaattinen, kupari aiheuttama, ROS välittämä mekanismi johtaa korjaamattomia DNA pirstoutuminen voi olla yksi useita tekijöitä apoptoottista kuolemaa pahanlaatuisten solujen upon kalsitriolialtistus.

Kiitokset

SSH kiittää Purdue University tilat. Kirjoittajat ovat kiitollisia professori M. Mushfiq ja tohtori Saltanat Raza of Dept. of Chemistry, AMU, joka auttoi treenata reaktion mekanismi. AR haluaa kiitos Khursid Alam Khan (Dept of Wildlife Sciences, UMA) hänen tuestaan, kun tämä työ oli käynnissä. Prof. Bruno Klaholz of IGBMC (Ranska), joka on koordinaatit käyttää tuottamaan rakenteen VDR.