Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hypoksia on merkittävä ympäristön muutoksen moniin syöpiin. Hypoksinen kapeampiin voi täyttyä syöpä varsi /kantaisä kaltaisia ​​soluja, jotka liittyvät syövän etenemiseen ja kestävyys sädehoidon ja kemoterapian. Kuitenkin, se ei ole vielä täysin selvitetty, miten hypoksia vaikuttaa varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia eturauhassyöpäsolujen. Tässä raportissa selvitettiin hapen niukkuuden vaikutuksilta ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, PC-3 ja DU145. Verrattuna normoksia (20% O

2), 7% O

2 indusoi korkeampia ilmauksia HIF-1α ja HIF-2α, joka liittyi säätelyä Oct3 /4 ja Nanog; 1% O

2 indusoi vielä suurempaan näistä tekijöistä. Voimistunut

Nanog

mRNA: n ekspression hypoksia vahvistettiin olevan pääasiassa retrogene

NANOGP8

. Samanlaisia ​​kasvulukuja havaittiin soluja viljellään hypoksisissa ja happiolosuhteissa 48 tuntia; kuitenkin pesäkemuodostusta paljasti, että 48 tunnin hypoksinen esikäsittelyn aikana, jolloin muodostui enemmän pesäkkeitä. Käsittelemällä 1% O

2 laajensi myös G

0 /G

1 vaiheessa, mikä lisää puoli populaation soluja, ja indusoi CD44 ja ABCG2 ilmaisuja. Hypoksia myös lisäsi positiivisten solujen ABCG2 ilmaisun, jotka pääasiallisesti havaittiin olevan CD44

kirkas soluja. Vastaavasti lajiteltu CD44

kirkas solut ilmensivät korkeampia tasoja ABCG2, Oct3 /4, ja Nanog kuin CD44

dim soluja, ja hypoksinen esikäsittely lisäsi merkittävästi ilmaisuja näiden tekijöiden. CD44

kirkas soluja normoksia muodostuu huomattavasti enemmän pesäkkeitä ja aloilla verrattuna CD44

dim soluja, ja hypoksinen esikäsittely jopa lisääntynyt tätä vaikutusta. Meidän tiedot osoittavat, että syöpäsolujen hypoksiaolosuhteissa oltava suurempi kara-kaltaisia ​​ominaisuuksia.

Citation: Ma Y, Liang D, Liu J, Axcrona K, Kvalheim G, Stokke T, et ai. (2011) Eturauhassyöpäsolulinjat hypoksiaolosuhteissa Näyttelytilat Suur Stem-Like Properties. PLoS ONE 6 (12): e29170. doi: 10,1371 /journal.pone.0029170

Editor: Dean G. Tang, The University of Texas M. D Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 01 elokuu 2011; Hyväksytty: 22 marraskuu 2011; Julkaistu: 28 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Ma et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Norja Radium Hospital Research Foundation lupanumeroon 333005 ja ZS. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

somaattinen kasvaimet, kuten eturauhassyöpä, sisältävät pienessä määrässä kantasolujen kaltaisia ​​soluja, nimeltään syöpä kantasolut, jossa valmiuksia itseuudistumisen, erilaistumista ja aloittaminen uusia kasvaimia. On osoitettu, että syövän kantasolut voivat paeta sädehoidon ja kemoterapia, ja ne voivat muodostaa etäpesäkkeitä muissa elimissä [1], [2]. Syöpä kantasolut edullisesti sijaita tietyn hypoksinen mikroympäristössä-markkinaraon, usein vallitsevissa kasvaimia [3], [4].

hypoksian indusoima tekijä (HIFs) ovat keskeisiä sääntelijöiden löytyy nisäkässoluissa alapinnan happea jännitystä; ne ovat mukana useita toimintoja, kuten solujen eloonjäämisessä, angiogeneesissä, ja kantasolujen ylläpitoon ja toistaa olennainen rooli solu- ja systeeminen homeostaasiin vastauksena hypoksia [5]. HIFs ovat heterodimeerejä;

HF1A

(HIF-1α) ja

EPAS1

(HIF-2α) ovat kaksi isoformia on α-alayksikköä, ja jakaa korkea sekvenssihomologia. Oct3 /4 (kutsutaan myös POU5F1) ja Nanog ovat kantasolujen markkereita, jotka ovat tärkeitä transkription ja ylläpitämisessä itseuudistumisen Alkion kantasolujen ja alkuitusolujen. Niitä on myös tunnistettu eri somaattisten kasvaimissa, kuten pään ja kaulan, keuhko-, paksusuolen ja peräsuolen, munasarja-, ja eturauhasen syöpiä [6] – [11]. Verrattain, ilmaukset näiden geenien alassäädetty kaikissa eriytetty somaattisten solujen tyyppejä,

in vitro

sekä

in vivo

[12], [13].

Nanog

, jota kutsutaan myös

NANOG1

, on useita pseudogeenien, ja niiden joukossa

NANOGP8

on myöhemmin vahvistettu olevan retrogene. Sekä

NANOG1

ja

NANOGP8

ilmaisuja on tunnistettu eri syöpäsolutyyppien [14], [15], mukaan lukien eturauhasen syöpäsolujen [16].

Useat pintamarkkereiden on käytetty eristämään oletetun syövän kantasoluja /progenitorisolujen. Eturauhasen syöpä, varhainen esisolujen liittyy useita erityisiä pinnan markkereita, kuten CD44, CD133, ja CXCR4 [17] – [19]. Side väestö tekniikka on myös käytetty eristämään syövän kantasoluja, joilla on kyky pumpata Hoechst 33342 [20]. Ulosvirtaus väriaine johtuu jäsenille ATP-sitova kasetti perheen, kuten ABCG2 (rintasyöpä resistance protein, BCRP). Ylössäätelyyn ABCG2 vastaa myös kemoterapeuttisten resistenssin tiettyjen syöpäsolujen [21]. Rinta- ja eturauhasen syöpiä, aiemmat tutkimukset ovat tunnistaneet CD44

+ tai CD117

+ /ABCG2

+ solujen kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia, kuten lisääntynyt klonogeeniset /tuumorigeenisia ominaisuudet, korkeampi ilmauksia stemness geenien, ja vahvempi kyky muodostaa kasvaimia eläinmalleissa [19], [22], [23].

Hypoksia auttaa alkion kantasoluja ylläpitää stemness ja korkeamman happipaineille ajaa solujen lisääntyminen ja erilaistuminen, jotka ovat herkempiä tavanomaisten hoitomuotoja [24], [25]. Samanlaisia ​​tuloksia on havaittu aikuisten solujen, kuten adiposyyttien, fibroblastien, ja useita syöpäsoluja [26] – [28]. Kuitenkin vaikutukset hypoksia eturauhassyövän solut eivät ole täysin selvitetty. Siksi tässä tutkimuksessa selvitimme eturauhassyövän solulinjoissa PC-3 ja DU145 eri happi jännitteitä, jotta voidaan paremmin ymmärtää vaikutusta hypoksia varren kaltainen solujen ominaisuuksia. Stemness tekijät, Oct3 /4 ja Nanog, ilmennettiin korkeammilla tasoilla soluissa hypoksisissa viljelyn ja näiden solujen osoittivat kohonnutta pesäkkeiden muodostumisen mahdolliset verrattuna soluja normoxic kunnossa. Lisäksi upregulated

Nanog

mRNA ilmaisu hypoksiaolosuhteissa vahvistettiin pääosin peräisin retrogene

NANOGP8

. Näissä eturauhassyövän solulinjoissa, hypoksia myös lisääntynyt osa puolen väestöstä soluja, pidensi G

0 /G

1 vaihe ja näkyi korkeana ABCG2 ja CD44 ilmaisuja. Muita kokeet osoittivat, että CD44

kirkas soluja osoitti merkitsevästi enemmän stemness, varmennettuna pesäkemuodostusta, pallo kasvun määrityksessä, ja stemness tekijä ilmaisun analyysejä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen eturauhassyöpäsolulinjoissa, PC-3 ja DU145, ostettiin ATCC (American Type Culture Collection, USA) ja pidettiin meidän lab tätä tutkimusta varten. Tavanomaisen soluviljelmä, solut ympättiin viljelypulloissa RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Viljelmiä pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa inkubaattorissa ilmakehässä 20% O

2, 5% CO

2, ja 75% N

2.

Xvivo Suljettu Incubation System (Xvivo järjestelmä 300 C, BioSpherix, New York, USA) käytettiin tässä tutkimuksessa, jotta saavutetaan tarkasti eri happi jännitteitä eri lokeroihin. 24 tunnin kuluttua viljelyn tavanomaisissa soluviljelmässä (mahdollistaa solujen kiinnittymään pulloihin), solut siirrettiin eri kammioihin 1% O

2, 5% CO

2, ja 94% N

2; 7% O

2, 5% CO

2, ja 88% N

2; tai 20% O

2, 5% CO

2 ja 75% N

2 muuttujan aikoja ennen korjataan lisäanalyysi.

semikvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR (RT PCR) B

Kokonais-RNA uutettiin viljeltyjen solujen käyttämällä RNeasy Kit (Qiagen, CA, USA) valmistajan ohjeita. Poistamaan kaikki DNA, DNaasi I käytettiin RNA: n eristys menettelyä. RNA-näytettä pitoisuudet kvantitoitiin käyttämällä spektrofotometriä (Nanodrop ND-1000, USA) OD260 /280.

Täydentävä DNA (cDNA) on myöhemmin syntetisoitiin 5 ug kokonais-RNA: sta käyttäen Multiscribe käänteistranskriptaasia (Applied Biosystems, Foster city, CA). Edellytykset käänteistranskriptioon olivat: 25 ° C: ssa 10 minuuttia, 37 ° C: ssa 12 minuutin ajan, 85 ° C: ssa 5 minuuttia, minkä jälkeen pitämällä 4 ° C: ssa. cDNA varastoitiin -70 ° C: ssa myöhempää käyttöä varten PCR-analyysejä.

PCR-monistus cDNA tehtiin käyttämällä PCR-järjestelmää (DOPPIO VWR, UK) ja seuraavaa ohjelmaa: alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 10 minuuttia; seurasi 30 sykliä (28 sykliä GAPDH) ja pariutuminen 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan, ja pidennys 72 ° C: ssa 30 sekunnin ajan; seurasi irtisanominen kanssa 10 minuutin pidennysvaiheen 72 ° C: ssa. Alukkeet, joita käytetään RT-PCR olivat: ja Nanog, F 5′-ATGCCTCACACGGAGACTGT-3 ’ja R 5′-AGGGCTGTCCTGAATAAGCA-3′, monistetaan 66-bp: n fragmentin; for Oct3 /4, F 5’- ACATGTGTAAGCTGCGGCC-3 ’ja R 5′-GTTGTGCATAGTCGCTGCTTG-3′, monistetaan 297 bp fragmentti; for HIF-1α, F 5’-AGTGTACCCTAACTAGCCGAGGAA-3 ’ja R 5′-CTGAGGTTGGTTACTGTTGGTATCA-3′, monistetaan 113 bp fragmentti; for HIF-2α, F 5’-GACCAGCAGATGGACAACTTGTAC-3 ’ja R 5′-CAGAAAGATCATGTCGCCATCTT-3′, laajennetaan 84-emäsparin fragmentti; ja GAPDH, F 5’-CCTCAAGATCATCAGCAATGC-3 ’ja R 5′-TGGTCATGAGTCCTTCCACG-3’, monistetaan 101-bp tuote. Kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

monistetut PCR-tuotteet erotettiin 7,5% polyakryyliamidigeelillä elektroforeesilla, värjättiin GelRed (Molecular Probes, Invitrogen), ja visualisoitiin Syngeeni kuvan järjestelmän (G: BOX Syngene , USA).

mRNA ilmauksia

NANOG1

ja

NANOGP8

mitattiin kvantitatiivisella PCR käyttäen Taqman ABI 7900 Sequence Detector System (Applied Biosystems). Julkaistu spesifisiä alukkeita ja koettimia [29], käytettiin tässä tutkimuksessa. Sillä

NANOG1

: forward-aluke oli 5′-CGCCCTGCCTAGAAAAGACATTT -3 ’, käänteinen aluke oli 5′-AGAAGCCGTCTCTGGCTATAGATAA -3’, ja koetin oli CTGCTAAGGACAACATTGAT; for

NANOGP8

: forward-aluke oli 5′-CGCCCTGCCTAGAAAAGACATTT-3 ’, käänteinen aluke oli 5′-ACGAGTTTGGATATCTTTAGGGTTTAGAATC-3’, ja koetin oli CCTTGGCTGCCGTCTCTG. Kaikki alukkeet ja koettimet leimattiin FAM-MGB saatiin Applied Biosystems. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina, ja Ct-arvoja 20% O

2 käytettiin kalibraattorit arvioitaessa

NANOG1

ja

NANOGP8

ekspressiotasot vastauksena hypoksia. Kokeet suoritettiin kahtena kappaleena. Ilmaisu tasot

NANOG1

ja

NANOGP8

analysoitiin läpi ΔΔCt menetelmällä [29].

Immunoblottausmääritys

Solut huuhdellaan nopeasti jään kylmä fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS) ja raaputettiin RIPA-puskuria (25 mM Tris HCI, pH 7,6, 100 mM NaCl, 1% NP40, 1% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS; Thermo Scientific Pierce, Saksa), proteaasi-inhibiittorit (0,1 pM aprotiniinia, 1,0 mM PMSF, 1 uM leupeptiini, 1 uM pepstatiini) lisätään välittömästi ennen käyttöä. Näytteet sentrifugoitiin 15000 rpm 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja supernatantit siirrettiin uusiin putkiin. Proteiinin pitoisuudet mitattiin Bio-Rad proteiinimäärityksellä mukaan valmistajan ohjeiden. Näytteet kuumennettiin työtaso lämmitin (malli 111002, Boekel Scientific, USA) 100 ° C: ssa 5 minuuttia SDS-latauspuskuria (500 mM Tris-HCI, pH 6,8; 10% glyseroli, 2% SDS, 0,6 M DTT: tä, 0,05% bromifenolisinistä) ja sitten yhtä suuri määrä proteiinia (50 ug) per näyte altistettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi siirto kalvo (BIO-RAD, USA). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa TBS-Tween 60 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sitten inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineiden optimaalinen laimennus TBST /5% maitoa yön yli 4 ° C: ssa. Optimoitu vasta-aineita käytetään tässä tutkimuksessa olivat: HIF-1α (1 ug /ml MAB1536, R luettelo numero: NB100-150, Novus), HIF-2α (kani, 1:100; luettelo numero: NB100-122, Novus), Oct3 /4, (vuohi, 10 ug /ml; luettelonumero: AF1759, R luettelonumero: AF1997, R Sigma) lisättiin sitten loppupitoisuuteen 5 ug /ml, ja seosta inkuboitiin ajoittainen ravistellen 90 minuuttia 37 ° C: ssa, kun läsnä on tai ei ole verapamiilin (50 uM; Sigma). Sitten solut pestiin jääkylmällä HBSS, jossa on 2% FBS: ää, sentrifugoitiin 4 ° C: ssa, ja suspendoitiin uudelleen jääkylmään HBSS, joka sisälsi 2% FBS: ää. Propidiumjodidia lisättiin suspendoidut solut lopulliseen konsentraatioon 2 ug /ml, jotta paljastaa elinkelpoisia soluja. Ennen analyysiä, solut suodatettiin 70 um: n solusiivilän, jotta saadaan yksisolususpension. Solu aggregaatit hylättiin analyysistä, jonka kaksinkertainen syrjintä ja yksittäisiä soluja analysoitiin LSRII -virtaussytometrissä (BD Biosciences). Hoechst 33342 väriaine viritettiin 350 nm ja puoli-populaatio soluja tarkasteltiin käyttämällä punaista (punainen, 660/10 nm) vs. sininen (sininen, 424/44 nm).

ABCG2 /CD44 fenotyypin ja fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) B

48 tunnin kuluttua inkuboinnin happipaineille 1% ja 20%, PC-3 ja DU145-solut trypsinoitiin, laskettiin, pestiin kylmällä FACS-puskurilla ( PBS + BSA 0,03%), ja suspendoitiin uudelleen loppukonsentraatioon 10

6 solua /ml. Solut ennalta blokattiin 5% BSA: ssa 30 minuuttia jäillä, ennen kuin ne värjättiin primaaristen vasta-aineiden (anti-CD44 monoklonaalinen vasta-aine konjugoitiin suoraan APC (allophycoyanin) ja anti-ABCG2 monoklonaalinen vasta-aine konjugoitiin suoraan FE (phycoerythin); BD Pharmingen Company) jäällä, pimeässä, 30 minuutin ajan. Solususpensiot pestiin kahdesti, resuspendoitiin 400 ul: FACS-puskuria, ja suodatetaan 70 um: n nailonverkon. Näytteet analysoitiin virtaussytometrillä (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) havaitsemiseksi ABCG2 ja CD44, ja FACS DiVa solulajittelijaa käytettiin solujen lajittelua. Viljelyn jälkeen 1%: n tai 20% O

2: ssa 48 tuntia, PC-3 ja DU145-solut lajiteltiin perustuu CD44 ilmentymisen. Sillä CD44-positiivisia soluja, vain top 10% ilmentävät solut valittiin (nimeltään CD44

kirkas); että CD44-negatiiviset solut, pohja 10% ilmentäviä soluja eristettiin (nimeltään CD44

dim). Kunkin näytteen, elinkelpoisia ja yhden solut porteilla; APC hiiri IgG2b (BD Pharmingen, USA) ja FE hiiri IgG2b: tä (BD Pharmingen, USA) isotyyppikontrolleja käytettiin negatiivisina kontrolleina.

Sphere muodostumista määrityksessä

määritystä käytetään perustui aiemmin on kuvattu menetelmiä [30]. Kun CD44

kirkas soluja lajiteltiin menetelmällä edellä kuvatulla tavalla yksi CD44

valoisa ja CD44

dim-solut maljattiin tiheydellä 300 solua per kuoppa, in ultralow kiinnitys kuuden kuoppalevyillä (Ultra pieni klusterin levyt, biotieteet). Nämä solut viljeltiin seerumittomassa DMEM /F12-väliaineessa (Invitrogen), jota oli täydennetty 20 ng /ml EGF: ää ja 20 ng /ml bFGF kymmenen päivän ajan normoksia olosuhteissa ennen pallojen arvioitiin alla käänteinen miscopy ja lasketaan (yli 30-solujen sisällä pallo pidettiin täydellinen pallo). Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

Tilastolliset analyysit

Kutakin koetta varten, tiedot esitetään keskiarvona ± SEM vähintään kolmen riippumattoman kokeen; SPSS (versio 16.0) käytettiin analyysiin. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA testi ja Opiskelijan

t

-testi (

P

0,05 pidettiin tilastollista merkitystä).

Tulokset

hypoksia indusoi ilmentymisen HIF-1α, HIF-2α, Oct3 /4 ja Nanog

HIF-1α ja HIF-2α, suuret transkriptiotekijöitä vastaa hypoksia, tutkittiin ihmisen eturauhasen syöpäsolujen PC- 3 ja DU145 jotka olivat altistuneet eri happipaineille muuttujan aikoja. 20% O

2 jännitystä, HIF-1α ja HIF-2α olivat heikosti ilmenneet sekä mRNA ja proteiini tasoilla; verrattain korkeampi HIF-1α ja HIF-2α ilmentyminen havaittiin 7% O

2 jännitystä, ja korkeimmat tasot havaittiin 1% O

2 kireys (Kuva 1A). Alennettuun hapen paineen tasolle, nämä kaksi tekijää jo voimistunut kuluttua 6 tunnin viljelyn. Heidän ilmaisuja saavutti korkeimman tason 12 tunnin viljelyn 7% O

2 jännitystä, mutta saavutti korkeimman tason vain 6 tunnin viljelyn 1% O

2. Proteiinin ilmentyminen sen jälkeen, kun 48 tunnin viljelyn eri happipaineille tutkittiin myös immunosytokemialla (kuvio 1 B). Ilmaukset HIF-1α ja HIF-2α olivat jatkuvasti korkeammat hypoksia käsiteltyjä soluja, kanssa havaintojen saatiin RT-PCR: lla ja immunoblottaus.

(A) verrattuna soluihin viljelty 20 % O

2, soluja viljeltiin 7% O

2 osoittavat korkeampaa HIF-1α ja HIF-2α, ja soluja viljeltiin 1% O

2 osoittavat korkeimman HIF-1α ja HIF-2α sekä RT-PCR ja immunoblottauksella. (B) Immunosytokemia paljastaa korkeampi HIF-1α ja HIF-2α ilmaisuja soluissa viljellään 7% O

2 ja korkeimman HIF-1α ja HIF-2α ilmaisuja soluissa viljellään 1% O

2 molemmille solulinjoissa. Rintasyöpäsolulinjalla leikkeitä käytettiin positiivisina kontrolleina sekä HIF-1α ja HIF-2α. Kaikki kuvat on alun perin otettu 200 x ja kaikki insets tehtiin 400 ×.

Oct3 /4 ja Nanog käytetään usein merkkiaineina erilaistumattomat solut ja niillä on tärkeä rooli ylläpitämisessä kapasiteetti itseuudistumisen aikuisten kantasoluja [31], [32]. Ilmaisut Näiden transkriptiotekijöiden tutkittiin myös PC-3 ja DU145 soluja, jotka viljeltiin eri happi jännitteitä. Sekä mRNA ja proteiini tasoilla (kuvio 2A), heikko ilmauksia Oct3 /4 ja Nanog paljastui näissä kahdessa solulinjassa viljeltiin 20% O

2 jännitystä, kun taas niiden ilmaisuja ilmentyivät soluissa viljellään 7% ja 1% O

2 olosuhteissa. Molemmissa solulinjoissa, ilmaisuja näiden kahden tekijän olivat korkeammat 1% O

2 yli 7% O

2. Kuten nähtiin myös immunoblottauksella analyyseissä (kuvio 2A), Oct3 /4 ja Nanog alkoivat lisätä huomattavasti jo 6 tunnin kuluttua solut siirrettiin 1% O

2, ja saavutti enimmäismäärät 12 tuntia sekä solujen linjat. Kun solut saatettiin 7% O

2, ilmaisuja näiden kahden tekijän merkittävästi myös koholla 6 tunnin kuluttua, ja saavutti korkeimman tason 12 tunnin viljelyn; kuitenkin, nämä ekspressiotasot olivat heikommat kuin havaittiin soluissa altistettiin 1% O

2. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös immunosytokemialla (kuvio 2B). Seuraavat altistuminen hypoksinen kunnossa, parannettu Oct3 /4 ja Nanog ilmaisuja nähtiin sekä PC-3 ja DU145-soluissa.

(A) verrattuna soluihin viljeltiin 20% O

2, solut viljeltiin 7% O

2 osoittavat korkeampaa Oct3 /4 ja Nanog ilmaisuja, ja soluja viljeltiin 1% O

2 osoittavat korkeimman Oct3 /4 ja Nanog ilmaisuja PC-3 ja DU145 solu linjat sekä RT-PCR ja immunoblottauksella. (B) Immunosytokemia paljastaa vastaavat korkeampaa Oct3 /4 ja Nanog ilmaisuja 7% O

2 ja korkeimman Oct3 /4 ja Nanog ilmaisuja 1% O

2, verrattuna soluihin viljeltiin 20% O

2 molemmille solulinjoissa. Ihmisen seminooma kudosleikkeet käytettiin positiivisina kontrolleina näiden kahden vasta-aineen. Kaikki kuvat on alun perin otettu 200 x ja kaikki insets tehtiin 400 ×.

Voit selvittää koholla

Nanog

ilmentyminen oli peräisin

NANOG1

tai

NANOGP8

, kvantitatiivinen RT-PCR-analyysit suoritetaan lisäksi, vastaaviin soluihin viljellään normoksia kuin kalibraattorit. Se oli toistuvasti vahvistanut, että

NANOG1

ilmentymistä soluissa alle normoksia oli hyvin alhainen, keskimääräinen Ct-arvot 37.24 ja 37.37 PC-3 solujen ja DU145 soluja, tässä järjestyksessä. Kuitenkin

NANOGP8

ilmentymistä soluissa alle normoksia oli suhteellisen korkea, keskimääräinen Ct-arvot 33.56 ja 33.51 PC-3 solujen ja DU145 soluja, tässä järjestyksessä. Vaikka korkeampi

NANOG1

ja

NANOGP8

ilmaisuja voitiin havaita molemmissa solulinjoissa hypoksiaolosuhteissa, kohonnut

Nanog

ilmentyminen vahvistettiin pääasiallisesti

NANOGP8

, jopa 6-kertaiseksi ja 10-kertainen ilmaisun PC-3 ja DU145 soluja 1% O

2, vastaavasti (kuva 3). Koska

NANOG1

ilmentymistä soluissa alle normoksia oli erittäin alhainen, 2,6-kertainen ja 3,1-kertainen nousu tämän geenin ilmentyminen PC-3 ja DU145 soluja 1% O

2 edustettuna edelleen melko alhainen ekspressiotaso.

verrattuna punasolut normoksia, siellä ovat koholla

NANOG1

ja

NONOGP8

ilmaisuja soluissa alle 7% O

2 molemmat solulinjat, jopa 1,8-kertainen

NANOG1

ilmaisun ja jopa 2,5-kertainen

NONOGP8

lisäystä sekä solulinjoissa; punasolut 1% O

2 ilmaista vieläkin korkeampi

NANOG1

ja

NONOGP8

, 2,6-kertainen ja 3,1-kertainen nousu

NANOG1

ilmaisun PC-3 ja DU145 solulinjoissa, vastaavasti, ja 6-kertaiseksi ja 10-kertainen

NONOGP8

ilmaisuja PC-3 ja DU145 solulinjoissa, vastaavasti.

hypoksia suurentaa pesäkkeenmuodostus valmiudet ja ulottuu G

0 /G

1 vaiheessa

Koska hypoksia lisäsi ilmaisun stemness tekijöistä, tutkimme seuraavaksi hypoksia vaikuttanut näiden solujen. PC-3 ja DU145 soluja viljellään normoksia (20% O

2) tai hypoksiaolosuhteisiin (1% O

2 ja 7% O

2) 48 tuntia runsaudenmäärityksessä. Kuten kuviossa 4A, kunkin solulinjan ei ollut tilastollisesti merkitseviä eroja solujen lisääntymisen viljellään eri happi jännitteitä (

P

0,05), vaikka solut kasvoivat hieman hitaammin hypoksiaolosuhteissa kuin normoksia. Seuraavaksi kysyimme, onko hypoksia-esikäsittely voi vaikuttaa clonogenicty näissä soluissa. Solut perin alttiina erilaisille happipaineille 48 tuntia, jonka jälkeen siirtää normoxic kammioon (20% O

2) 14 vuorokautta pesäkemuodostusta. Verrattuna soluihin, jotka oli tasaisesti viljeltiin 20% O

2, enemmän pesäkkeitä havaittiin soluissa, jotka oli esikäsitelty 7% O

2, ja vielä enemmän pesäkkeitä havaittiin soluissa esikäsitellään 1% O

2 (kuva 4B). Verrattuna soluihin aina viljeltiin normoksia, tilastollisesti merkitsevästi suurempi pesäkkeiden muodostumisen tehokkuutta tunnistettiin hypoksia-esikäsitellyt PC-3 ja DU145 ells (kuvio 4C). Solusyklin analyysit osoittivat pidennetyn G

0 /G

1 vaiheessa solut, jotka altistettiin 1% O

2 48 tuntia verrattuna soluihin viljeltiin 20% O

2 as säätimet (

P

0,05) (kuvio 4D ja E), joka osoittaa useampia soluja lepotilassa asema hypoksian.

(A) solujen proliferaatio käyrät osoittavat tilastollista eroa solujen kasvun mukaisesti eri happi jännitteitä (

P 0,05

). (B) Pesäkkeenmuodostusta määritys molemmissa solulinjoissa näkee enemmän pesäkkeitä soluissa esikäsitellyt 7% O

2 48 tuntia ja vielä enemmän pesäkkeitä soluissa esikäsitellyt alle 1% O

2 (C ) histogrammit varten pesäkkeenmuodostusta hyötysuhde osoittaa tilastollisesti suurempi tehokkuus soluissa esikäsitellyt hypoksiaolosuhteissa (7% tai 1% O

2) sekä solulinjoja (

P

0,0001). (D) Virtaussytometria ohjelmia laajennetaan G

0 /G

1 vaiheessa sekä solulinjoja, joita on viljelty alle 1% O

2 48 tuntia, verrattuna soluihin aina jatkuvasti normoksia. (E) Tilastolliset analyysit paljastavat merkittävästi pidentää G

0 /G

1 vaiheessa soluja viljellään hypoksiaolosuhteissa sekä solulinjoissa (

P

0,05).

Hypoksia suurentaa osa solujen kantasolujen kaltaisia ​​fenotyyppi

Side väestö soluja, oletetaan sisältävän otaksuttu eturauhassyövän kantasolut, tiedetään pumpata väriaine Hoechst 33342 [20], [33]. Solut, joilla tämä toiminta oli edelleen arvioitiin viljelyn aikana eri happi jännitteitä. Korkeampi jakeet näistä puolella väestöstä solut havaittiin viljelmissä pidettiin 1% O

2 kireys 48 tuntia verrattuna soluihin viljeltiin 20% O

2 (kuvio 5A ja B).

PC-3 ja DU145-soluja viljeltiin 1% O

2 ja 20% O

2 coditions 48 tuntia analysoida varsi kaltainen fenotyyppi kautta virtaussytometrialla määrityksessä. (A) Edustaja kuvat osoittavat, että puolella väestöstä solut indusoitiin molemmissa solulinjoissa jälkeen hypoksinen hoidon. (B) Tilastollinen analyysit osoittavat merkittävää eroa puolella väestöstä. (C) Virtaussytometria analyysit osoittavat korkeampia ABCG2 ilmentymisen intensiteetti molemmissa solulinjoissa hypoksiaolosuhteissa. (D) Histogrammi osoittaa tilastollisesti merkittävää eroa ABCG2 ilmaisua. (E) Virtaussytometria analyysit osoittavat korkeampia CD44 ilmentymisen intensiteetti molemmissa solulinjoissa hypoksiaolosuhteissa. (F) Histogrammi osoittaa tilastollisesti merkittävää eroa CD44 ilme.

ABCG2 ja CD44 on kuvattu eturauhassyövän varsi kaltaiset markkereita perustuu kliinisiin tutkimuksiin ja selvityksiin eturauhassyövän solulinjoissa [19], [ ,,,0],33]. Siksi ABCG2 ja CD44 ilmaisuja PC-3 ja DU145 soluja, jotka inkuboitiin 1% tai 20% O

2 jännitteitä 48 tuntia tutkittiin virtaussytometrialla. Kuten kuvioissa 5C ja D, heitti oli 1,20-kertainen ja 1,42-kertainen nousu ABCG2 ilmentymistä PC-3 ja DU145 soluja 1% O

2, vastaavasti, verrattuna soluihin aina viljellään normoksia. Samoin oli 1,50-kertainen ja 1,45-kertainen nousu CD44 ilmentymistä PC-3 ja DU145 soluja 1% O

2, vastaavasti, verrattuna soluihin aina viljellään normoksia (kuviot 5E ja F).

Koska hypoksia saattaa aiheuttaa sekä ABCG2 ja CD44 ilmentymisen molemmissa solulinjoissa, olemme edelleen tutkitaan suhdetta CD44 ja ABCG2. Kaksoisvärjäys Näiden kahden pinnan markkereita osoitti, että hypoksian aiheuttaman ABCG2

+ solut olivat pääasiassa CD44

kirkas soluja ja CD44

dim soluja samoissa viljelyolosuhteissa olivat enimmäkseen negatiivisia ABCG2 lauseke (kuva 6A ).

(A) Double värjäys CD44 ja ABCG2 pintamarkkerien virtaussytometrillä määritys osoittaa korkeampaa ilmaisuja näistä tekijöistä molemmissa solulinjoissa hypoksiaolosuhteissa 48 tuntia.