Krooninen sairaus

tiivistelmä

Koko valinta suodattamalla tarjoaa antigeenin riippumaton lähestymistapa rikastamista harvinainen solupopulaatioiden veressä syöpäpotilailla. Arvioimme suorituskykyä uusi lähestymistapa multiplex harvinaisten solujen havaitsemiseen verinäytteissä metastaattisen rintasyövän (n = 19) ja keuhkosyöpää potilailla (n = 21), ja terveillä verrokeilla (n = 30) käyttäen automatisoitua mikrofluidinen suodatus ja multiplex immunomääritys strategia. Captured solut laskettiin jälkeen peräkkäiset värjäyksen spesifisten tunnistaa verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC), verenkierrossa mesenkyymisolujen (CMC), otaksuttu verenkierrossa kantasolut (CSCS), ja verenkierrossa endoteelisolujen (KIE). Prekliiniset validointi kokeet, joissa käytetään syöpäsolujen piikkeinä terveitä veren osoitti korkea hyötykäyttöaste (keskiarvo = 85%) ja toistettavuus määrityksen. Kliinisissä tutkimuksissa, CTC ja CMC havaittiin 35% ja 58% syöpäpotilaiden vastaavasti ja olivat juuri esiinny terveiden verrokkien (3%,

p

= 0,001). Mean tasot CTC olivat merkitsevästi korkeammat rinta- kuin keuhkosyöpäpotilaita (

p

= 0,03). Viisikymmentä-kolme prosenttia (53%) syöpäpotilaista kanna otaksuttu CSCS, kun taas yksikään ei ollut havaittavissa terveillä verrokeilla (

p

0,0001). Sen sijaan, KIE havaittiin sekä syövän ja kontrolliryhmiin. Suora vertailu CellSearch

® vs. meidän mikrofluidinen suodattimen menetelmässä paljasti kohtalainen korrelaatio (R

2 = 0,46, kappa = 0,47). Serial verikoe syöpäpotilaista osoitti toteutettavuus valvonnan kiertävän harvinaisten solupopulaatioiden ajan. Samanaikainen arviointi CTC, CMC, CSCS ja KIE voi tarjota uusia työkaluja tutkia mekanismeja taudin etenemisen ja hoitovastetta /vastus.

Citation: Magbanua MJM, Pugia M, Lee JS, Jabon M, Wang V, Gubens M, et al. (2015) romaani strategia toteamiseen ja laskemiseen Kiertävä Harvinaiset solupopulaatioiden Metastaattinen syöpäpotilaiden automatisoidulla Mikrofluidistiikan Suodatus ja Multiplex Immunoassay. PLoS ONE 10 (10): e0141166. doi: 10,1371 /journal.pone.0141166

Editor: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 15 heinäkuu 2015; Hyväksytty: 04 lokakuu 2015; Julkaistu: 23 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Magbanua et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimuksen rahoittivat Siemens Healthcare Diagnostics (SHD). Lisärahoitusta saatiin Breast Cancer Research Foundation (BCRF). BCRF ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. SHD oli mukana tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista, ja valmistelu käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: JWP saaneet tutkimusrahoitusta Siemens Healthcare Diagnostics. MP, KM, JP, HS, ja AU ovat työntekijöitä Siemens Healthcare Diagnostics. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Viimeaikaiset teknologiset edistysaskeleet ovat mahdollistaneet luotettavasti havaita ja luonnehdinta kiertävien tuumorisolujen (CTC) veressä syöpäpotilaiden [1, 2]. Aineiden tasojen ja CTC, määrityksiä on kehitetty havaitsemisen helpottamiseksi epiteelisolujen veressä käyttämällä solun markkereita, kuten EPCAM ja sytokeratiineja [3]. Näin ollen kliinistä merkitystä näiden solujen on osoitettu lukuisissa tutkimuksissa osoittavat, että kohonnut CTC numerot liittyy alentunut selviytymisen ja huono hoitovaste [4-7]. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat tunnistaneet CTC alhainen ilmentyminen epiteelin markkereita, esim. Ne, joille epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), joka ei voi havaita epiteelin perustuvissa määrityksissä [8, 9]. Antigeeni-riippumaton rikastamiseen, kuten suodatus järjestelmät, tarjoaa vaihtoehtoisen lähestymistavan, joka voi mahdollisesti poistaa valinnan bias takia painoarvoa erityis- antigeeniekspressiota [10-14]. Suodatin perustuvat menetelmät helpottavat rikastuminen ei-hematologinen harvinaisia ​​soluja (mukaan lukien CTC) hyödyntämällä koon erot näiden solujen ja solujen ääreisverenkierron [10-14]. Vaikka leukosyyttien ja punasolujen tyypillisesti mitata noin 6 8 um halkaisijaltaan, CTC voi vaihdella kooltaan, joiden halkaisija on 10 uM tai enemmän [15, 16]. Lopuksi solut, jotka kiinnittyvät suodattimeen voidaan kohdistaa tarkemmin määritystä toteamiseen ja laskemiseen CTC [17-19].

Tässä tutkimuksessa arvioimme suorituskyky uusi lähestymistapa havaitsemiseen ja luettelointi useita harvinaisia ​​solupopulaatioiden veressä metastaattisen rintasyövän ja keuhkosyöpäpotilaita automaattisella mikrofluidinen suodatus ja multiplex immunomääritys strategiaa. Eri kiertävä harvinainen solupopulaatioiden havaittiin ja luetella myös verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC), verenkierrossa mesenkyymisolujen (CMC), verenkierrossa endoteelisolujen (KIE-maiden), ja otaksuttu verenkierrossa kantasolujen (CSCS). CTC laskee verrattiin tuloksia CellSearch

® järjestelmä, Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto (FDA) -cleared määritys luettelointia CTC. Testasimme myös mahdollisuutta sarja verikoe alaryhmässä rintasyöpäpotilaiden.

Methods

Ethics lausunto

Tutkimus hyväksyi Institutional Review Boards yliopistossa Kalifornian San Francisco (UCSF; komitean Human Research) ja Siemens Healthcare Diagnostics (Elkhart, IN; Schulman Associates IRB). Tietoon kirjallinen suostumus saatiin kustakin syöpäpotilaasta ja terveillä vapaaehtoisilla, jotka osallistuivat tähän tutkimukseen. Syöpäpotilaat otettiin tammi-elokuussa 2014 UCSF. Terveet luovuttajat rekrytoitiin Siemens.

Patient ja terve Verinäyte Collection

Noin 6-9mL verta kerättiin putkiin, jotka sisältävät kaliumia etyleenidiamiinitetraetikkahappo (K

3EDTA) ja 0,45 ml Transfix

® (Vacutest Kima). Näytteitä UCSF laivattiin Siemens Healthcare Diagnostics eristetyssä laatikot varustettu kontrolloidussa huoneenlämpötilassa pakkauksissa (Saf-T-Pak ™ Inc.) ja digitaalinen lämpötilan tallennin (Track-It ™, Monarch Instrument). Verinäytteet varastoitiin ympäröivässä laboratorion lämpötilassa kunnes jatkokäsittelyyn.

ohjaimen valmistelu

Positiiviset ja negatiiviset kontrollit valmistettiin käyttämällä verinäytteitä terveiltä luovuttajilta. Noin 8 ml verta otettiin putkiin, jotka sisälsivät K

3EDTA ja 0,045% Transfix

®. Sillä positiiviset kontrollit, 10 ui kiinteiden viljeltyjä soluja (10

5 solua /ml) -either SKBR3 (rintasyöpä linja, American Type Culture Collection ATCC

® HTB-30

TM) tai NCI H226 ( keuhkojen syöpä linja, ATCC

® CRL-5826

TM) -were terästetty terveitä verta. Positiivinen kontrolli, joka sisälsi noin 1000 solua ja negatiivinen kontrolli (ei teräviä verta terveistä luovuttaja) sisällytettiin kussakin ajossa.

Kiertävä Cell eristäminen ja Immunosytokemia värjäys

Kaikki verinäytteet käsitelty Siemens Healthcare Diagnostics. Käsittelyvaiheet että mukana suodatus, solujen eristäminen ja immunosytokemia (ICC) värjäys suoritettiin käyttäen Hamilton Starlet ™ robotti (Hamilton Company, Reno Nevada). Väline on erityisesti varustettu suodatuslaite ja ohjelmiston ohjaamaan robottiautomaation loppupään prosesseja. Suodatin kalvon pinta-ala 3,8 cm

2, jonka huokoskoko on 8 um (Whatman ™ Nucleopore ™, GE Healthcare) sovitettiin päälle laitteeseen. 8 um huokoskoko valittiin perustuu optimaaliseen solujen elpymistä kuten raportoitu kirjallisuudessa [15, 20, 21]. Tiedot suodatuksen ja solu erottelumenetelmät kuvataan S1 File ja S1 Kuva. Lyhyesti, kokoverta näytteet laimennettiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), joka sisälsi 0,083% fibrinogeeniä. Laimennetut näytteet suodatetaan sitten läpi mikrofluidistiikkaan suodatinlaitteen. Tämä prosessi rikastaa kierrättämiseksi harvinaisia ​​soluja vaan myös säilyttää noin 50,000-100,000 valkosolujen (WBC: t). Solut kaapattu suodatintoimiset kiinnitettiin, ja automatisoitu ICC värjäys suoritettiin tunnistaa tiettyjä solupopulaatioiden. Optimointi testiparametreja käsitellään S2 File.

S1 Taulukossa luetellaan vasta-aineita ja fluoresoivia koettimia käytettiin tässä tutkimuksessa. Tiedot ICC menettely on kuvattu S1 File. Lyhyesti, solut tehtiin läpäiseviksi ja blokkausliuosta lisättiin estämään ei-spesifinen sitoutuminen vasta-aineita. Soluja inkuboitiin sopivan vasta-aineen liuos, värjäykseen kohdeantigeeniä. Vuokaavio, joka havainnollistaa värjäys prosessi on esitetty S1 kuviossa optimointi testiparametreja käsitellään S2 File.

Seuraavat solulinjat käytettiin verrokkeina määrittämään raja-arvot positiivisen immunovärjäyksellä signaalit: (1) SKBR3, joka on rintasyöpä solulinja, joka on CK +, VIM-, CD144-, TPBG /5T4-, PIWIL2-, CD144-; (2) NCI-H2228, joka on keuhkosyöpä solulinja, joka on CK +, VIM +, CD144-, TPBG /5T4 +, PIWIL2-, CD144-; (3) NCI-H266, joka on keuhkosyöpä linja, joka on CK +, VIM +, TPBG /5T4-, PIWIL2-, CD144-; (4) MDA-MB-231, rintasyöpä solulinja, joka on CK +, VIM-, TPBG /5T4-, PIWIL2-, CD144-; ja (5) transfektoidun MDA-MB-231 ilmentävien PIWIL2 ja siksi on CK +, VIM-, TPBG /5T4-, PIWIL2 +, CD144 (lahja Dr. Jian-Xin Gao, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai, Kiina ). Normaali leukosyyttien ja endoteelisolujen käytettiin positiivisina kontrolleina CD45 ja CD144 värjäys, vastaavasti, ja negatiivisena kontrollina kaikille muille merkeille.

mikroskooppinen analyysi ja leimaus Kiertävä Harvinaiset Cells

Detection ja kuvantaminen soluja suoritettiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Leica DM5000, Leica GmbH) (S1 File). Erilaisia ​​solutyyppejä laskettiin perustuen värjäyskuviot havaittu.

Ensimmäinen havaitsemisraja on se kohta, jossa fluoresenssisignaali oli havaittavissa olevan korkeampi kuin ei-spesifinen fluoresenssin volla. Analyyttinen cut-off oli täsmennetty perustuvat fluoresenssiin tasoilla tunnetaan syöpäsolujen (SKBR-3 tai H226) ja WBCs peräisin terveiden verrokkien hyödynnetään säätimet positiivisten ja negatiivisten signaalien, vastaavasti. Johdonmukaisuuden, vain yksi tutkija (KM) lasketaan solut, kun taas toinen tutkija (MP) vahvisti solujen määrää.

Tilastollinen analyysi

Analysoimme luettelointi tulokset (solua /ml) käyttäen t- testejä. Fisherin tarkkaa testiä käytettiin vertaamaan paljastumisaste ryhmien välillä.

p

-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Pitoisuus Suunnittelu

Kartoitimme uusi strategia multiplex harvinaisten solujen laskentaa käyttäen automatisoitu suodatus-välineen (Siemens Healthcare Diagnostics) ja värjäämällä useita immunofluoresenssimenetelmällä cocktaileja. Laite koostuu suodattimen kalvon asennettu mikrokone tukea, jonka avulla eristämisen harvinaisten solujen, jonka jälkeen autostaining ja mikroskooppiset havaitsemiseen. Tämä kertakäyttöinen integroitu solun talteenoton ja luonnehdinta laite kaiverrettu mikrofluidinen rakenteita mahdollistaa kontrolloidusti suodatus poikki paineessa 10-30 mbar (kuvio 1A). Yksityiskohtainen suunnittelu mikrofluidilaitetta on esitetty S3 kuvassa.

. Suunnittelu mikrofluidistiikkaan suodatinlaitteen ja kaaviokuva käsittelyn vaiheet talteenottoon ja havaitsemiseen verenkierrossa harvinaisten solujen, B. Biomarkers ja immuno-fenotyypit verenkierrossa harvinaisten solujen tunnistetut peräkkäinen värjäyksen menettely, C. Keskimäärin prosenttia toipuminen lisäystasot tunnettu lukumäärä of H226 keuhkosyövän solujen terveitä veren, D. sirontakuvaajan osoittaa määrä H226 piikki solujen ja solujen lukumäärä talteen.

CTC värjäytyminen cocktail mukana 4 ’, 6-diamidino-2- fenyyli-(DAPI), yleiseurooppalainen sytokeratiini (pan-CK) vasta-aine, ja vasta-aineet CK8 /18, CK19, ja CD45 (S1 taulukko). DAPI-fluoresenssi havaittiin sinisen kanavan ja sitä käytettiin tunnistamaan tumallisia soluja. Fluoresoiva Pan-CK, CK8 /18, ja CK19-vasta-aineita käytettiin etiketti solujen epiteelin alkuperää ja havaittiin punaisen kanavan, kun taas fluoresoivat vasta-aineita CD45 käytettiin label hematopoieettista alkuperää olevien solujen, ja havaittiin pitkälle punaisen kanavan . CTC määriteltiin ytimiä CK-positiivisia, ja CD45-negatiivinen, kun taas WBCs määriteltiin nukleoiduissa mutta olivat CK-negatiivisia ja CD45-positiivisia (kuvio 1 B).

CMC /CEC värjäystä cocktail mukana vasta-aineita vimentiinista (VIM) ja CD144. VIM merkki käytettiin tunnistamaan soluja käynnissä EMT. Solut leimataan fluoresoivalla vasta VIM havaittiin punaisen kanavan. Vasta-aineita CD144 käytettiin tunnistamaan endoteelistä alkuperää oleviin soluihin. Leimattuja soluja havaittiin vihreä kanava. Lisäksi, erottuva värjäyskuvio varten CD144 osoittaa lokalisointi solukalvon helpottaa tunnistamista KIE. Tulokset tästä värjäys prosessia yhdistettiin ne alkuperäisestä tahra, kuten DAPI ja CD45-signaalit olivat vielä näkyvissä. CMC määriteltiin ytimiä VIM-positiivisia, CK-negatiivinen, CD144-negatiivisia, ja CD45-negatiivinen. KIE määriteltiin ytimiä CD144-positiivisia, VIM-positiivisia, CK-negatiivisia, ja CD45-negatiivinen.

CSC värjäys prosessi käyttää korkean herkkyys immunomääritys, jossa käytetään Tyramide signaalin vahvistus (TSA ™, Life Technologies) havaitsemiseksi ilmentymisen ehdokas kantasolujen merkkiaineita, PIWIL2 ja TPBG /5T4, joita ekspressoidaan alhaisilla tasoilla. Vahvistetut signaalit havaittiin vihreä kanava ja käytettiin tunnistamaan otaksuttu CSCS määritellään ytimiä kantasolujen markkeri-positiivisia, CK-positiivinen /negatiivinen, VIM-positiivinen /negatiivinen, CD144-negatiivisia, ja CD45-negatiivinen. TPBG /5T4 ilmentymistä käytettiin tunnistamaan putatiivista keuhkosyöpä CSCS kun PIWIL2 ilmentymistä käytettiin havaitsemaan oletetun rintasyövän CSCS.

erittäin valvotuissa suodatus ja monivaiheinen värjäys parametrit on optimoitu minimoimaan väärien positiivisia terveillä luovutetusta verestä. Käyttö oma veren keräysputki sisältää optimoidun kiinnitystahnat muotoilu (Transfix

®) sekä ohjattu kuljetuksen ja varastoinnin olosuhteissa osaltaan korkea raportoitavien tuloksia (98%).

Analyyttinen Performance

Ensinnäkin arvioimme suorituskyky mikrofluidistiikkaan suodattimen, joka käyttää piikki-mallissa mukana H226 keuhkosyövän soluja. Valikoima 5-160 soluja oli lisätty terveen luovuttajan verta ja eristettiin käyttäen laitetta. ICC värjäys ja mikroskooppiset analyysit tehtiin havaitsemiseksi ja luetella ytimiä CK-positiivisia, ja CD45-negatiiviset solut. Tasaisuus solumäärien havaittu joukossa triplikaattinäytteet osoitti korkea toistettavuus (kuvio 1 C). Lisäksi havaitsimme korkea korrelaatio havaittujen ja odotettujen tuotto (R

2 = 0,99). Eristäminen spiked solujen oli erittäin tehokas, ja kokonaishyödyntämisaste on 85% (kuvio 1 D). 5 piikki soluja, alhaisempi saanto 40% havaittiin, ja johtui putkeen sitoutumista ja solun menetys. Saadut tulokset ovat täysin verrattavissa CellSearch [22, 23]. Esimerkiksi CellSearch luettelointi kontaminoiduissa oli 80% ja 82% [22]. Allard ja työtovereiden [23] ilmoitetaan talteenotto on 4 solu piikki osoitti keskihajonta 2 ja 95% luottamusväli 1-11, jotka ovat tilastollisesti erotettavissa tuloksemme 5 solu piikki.

Kliininen testaus

Clinical validointi mikrofluidistiikkaan suodatinlaitteen suoritettiin koko verinäytettä metastaattisen rintasyövän ja keuhkosyöpä potilaita. Määrittämään taustatasojen terveillä henkilöillä, verinäytteet 30 ohjaa arvioitiin myös. Näytteitä käsiteltiin kautta mikrofluidinen suodatinlaitteen, ja soluja vangiksi kalvon värjättiin markkereita tunnistamaan verenkierrossa olevien solujen kohteisiin. Edustavia kuvia eri solutyyppejä on havainnollistettu kuviossa 2.

edustavat kuvat verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC), valkosolujen (WBC), verenkierrossa mesenkyymisolujen (CMC), verenkierrossa endoteelisolujen (CEC), ja otaksuttu verenkierrossa kantasolut (CSC) metastasoituneen rintasyövän (B) ja keuhko (L) syöpäpotilailla. Mittakaavapalkki edustaa 8 um.

Potilaiden ominaisuudet esitetään taulukossa 1. Niistä 43 potilaasta 40 oli arvioitavissa (S2 Kuva). Lopullinen kohortti koostui 19 rintasyöpäpotilaiden ja 21 keuhkosyöpäpotilaita. 19: syöpäpotilaista, 95% oli ER-positiivisia ja 26% oli HER2-positiivisia, kun taas 81% ja 19% keuhkosyöpä potilailla on diagnosoitu ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja pienisolukeuhkosyöpä ( SCLC), tässä järjestyksessä. Kliinisesti relevantit kuljettaja mutaatioita, esimerkiksi vuonna

EGFR

,

KRAS

, ja

ELM4-ALK

fuusio, oli läsnä 40% keuhkosyöpäpotilaita.

lyhenteet: ER-estrogeenireseptori, NSCLC- ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, SCLC- pienisoluinen keuhkosyöpä.

toteamiseen ja laskemiseen Harvinaiset Kiertävä solutyyppejä

analysoidaan värjäyskuviot jää soluihin käyttäen fluoresenssimikroskopiaa luetella CTC, CMC, KIE-maissa ja otaksuttu CSCS veressä syöpäpotilaiden ja terveiden verrokkien. Numerointi tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 2.

Lyhenteet: Circulating kasvainsoluja (CTC), verenkierrossa mesenkyymisolujen (CMC), verenkierrossa endoteelisolujen (CEC) ja oletetun verenkierrossa kantasolujen (CSC).

CTC havaittiin 35%: syöpäpotilaita, mukaan lukien 47% rintasyöpäpotilaiden ja 24%: n keuhkosyöpäpotilaita (kuvio 3A). CTC olivat pääosin poissa valvontaa, lukuun ottamatta yhden solun havaitaan yksi terve luovuttaja (3%). CTC havaitseminen syöpäpotilailla oli merkittävästi korkeampi kuin terveillä verrokeilla (

p

0,001). Keskimääräinen CTC taso syöpäpotilaista (0,41 CTC /ml) oli merkittävästi korkeampi kuin keuhkosyöpäpotilaita (0,04 CTC /ml,

p

= 0,03) (taulukko 2, kuvio 4A).

Prosenttiosuus näytteiden havaittavissa harvinainen solujen: A. kiertävien tuumorisolujen (CTC), B. verenkierrossa mesenkyymisolujen (CMC), C. CTC ja CMC, B. verenkierrossa mesenkyymisolujen (CMC), D. otaksuttu verenkierrossa kantasolujen ( CSC), ja E. verenkierrossa endoteelisolujen (CEC) in metastasoituneen rintasyövän ja keuhkosyöpäpotilaita, ja terveillä verrokeilla. F. Niiden potilaiden osuus, joilla havaittavissa soluklusterien. Prosenttia tunnistus ryhmien välillä verrattiin käyttämällä Fisherin tarkkaa testejä ja katsottiin merkitseväksi (*), kun

p

-arvo was 0,05, muuten ei merkitsevä (ns).

Mean solua millilitrassa A. verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC), B. verenkierrossa mesenkyymisolujen (CMC), C. CTC ja CMC, D. otaksuttu verenkierrossa kantasolujen (CSC), ja E. verenkierrossa endoteelisolujen (CEC) in metastaattisen rintasyövän ja keuhkosyöpäpotilaita ja terveillä verrokeilla. Yksi otoksen t-testiä käytettiin vertaamaan keskimääräistä solua millilitrassa väestön keskiarvo 0 tähti (*) tarkoittaa

p

-arvo 0,05, F. vertailu numerointitaso tulosten välillä CellSearch

® ja mikrofluidinen suodattimen määritys, G. sopimuksen positiiviset ja negatiiviset väliset puhelut CellSearch

® ja mikrofluidinen suodattimen määritys 16 verinäytteestä. Näytteet, joissa ≥5 verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) per 7,5 ml verta pidettiin positiivisina käyttäen CellSearch

® määrityksessä kun taas näytteitä havaittavissa CTC ( 0) pidettiin positiivisina käyttäen mikrofluidistiikkaan suodatin perustuva määritys.

CMC havaittiin 58% syöpäpotilaita, mukaan lukien 58% rintasyövän ja 57% keuhkosyövän (kuvio 3B). CMC havaitseminen oli merkitsevästi suurempi syöpäpotilailla kuin terveillä verrokeilla, johon ei CMC havaittu (

p

0,001). Mean CMC tasot olivat 0,34 CMC /ml syöpäpotilaista ja 2,37 CMC /ml keuhkosyöpäpotilaita, joka ei ollut merkittävää eroa (

p

= 0,23) (taulukko 2, kuva 4B).

Kun havaitseminen sekä epiteelin (CTC) ja mesenkymaaliset (CMC) solutyyppejä yhdistettiin, CTC + CMC taajuus syöpäpotilailla oli 70%, joista 79% rinta- ja 62% keuhkosyöpäpotilaiden, vastaavasti (kuvio 3C ). Tämä oli huomattavasti korkeampi kuin 3% etsivä arvioida myös terveiden (

p

= 0,001). Mean CTC + CMC tasot rintasyöpäpotilaiden (0,75 solua /ml) ei ollut merkittävästi erilainen kuin keuhkosyöpäpotilaiden (2,41 solua /ml,

p

= 0,32) (taulukko 2, kuvio 4C).

Oletetut CSCS havaittiin 54% syöpäpotilaita, mukaan lukien 58% syöpäpotilaista ja 50% keuhkosyöpäpotilaiden (kuvio 3D). CSC havaitseminen syöpäpotilailla oli merkitsevästi suurempi (

p

0,001) kuin terveillä verrokeilla, jotka eivät osoittaneet mitään havaittavaa CSCS (kuvio 4D).

Aivan toisin kuin CTC, CMC ja CSCS, KIE oli läsnä 43% tervettä verrokkia. KIE havaittiin 55% syöpäpotilaista yleistä, mukaan lukien 53% rintasyöpään ja 57%: n keuhkosyöpäpotilaita (kuvio 3E). CEC ilmaisutaajuudelle ollut merkitsevää eroa syöpäpotilaita ja valvontaa. Kaiken kaikkiaan KIE olivat runsaimmat solupopulaation tutkittu syöpäpotilailla (keskiarvo, 3,61 CEC /ml). Lisäksi tämä tarkoittaa CEC tasoa syöpäpotilailla oli merkittävästi korkeampi kuin terveillä verrokeilla (0,47 CEC /ml,

p

= 0,007), taulukko 2, kuvio 4E).

Keskimääräinen solukoko CMC, CEC, ja CSCS olivat kaikki noin 10 uM halkaisijaltaan (vaihteluväli 5-15 uM). Emme tarkkailla talteen soluista, jotka olivat pienempiä kuin huokoskoko. Me ominaisuus on kyky ansaan pienempiä soluja rajat yhdistää vaikutus paraformaldehydin kiinnitys. Lisäksi havaitsimme, että suodatus talteenotto oli sama kaikissa solutyypeissä samankokoisia. Muut suodatus järjestelmät ovat ilmoittaneet samasta elpymistä viljellyt solut samankokoisia, ja vähentää hyödyntämistä varten solujen pienempiä kokoja [11, 13, 24, 25].

Muut tutkimukset ovat raportoineet läsnäolo CK-positiivisten ja CD45-positiivisten solujen veressä syöpäpotilailla [26, 27]; kuitenkin, näitä soluja ei havaittu meidän näytteitä. Teimme havaita satunnaisia ​​soluryppäitä eri solupopulaatioiden, erityisesti KIE (kuvio 3F). Otaksuttu CSCS kuitenkin havaittiin vain yksittäisinä soluina. Ei merkittävää eroa esiintyvyys soluklusterien välillä havaittiin keuhkosyöpä ja rintasyöpäpotilailla.

Vertailua CellSearch

® Pitoisuus

16 kahtena verinäytettä, CTC analysoitiin käyttäen sekä mikrofluidinen suodatin perustuva määritys ja CellSearch

® järjestelmään. Suora vertailu CTC havaitsemisen paljasti kohtalainen välille sopimuksen määrityksissä (kuvio 4F, R

2 = 0,46; kuvio 4G, kappa = 0,47).

Serial verikoe

3 rintojen syöpäpotilailla, sarja verinäytteitä analysoitiin arvioimaan seurannan toteutettavuus kiertävien solupopulaatioiden ajan.

Potilas A oli 49-vuotias nainen diagnosoitu ER-positiivisia, HER2-negatiivinen metastasoitunut rintasyöpä. Verinäytteet otettiin päivinä 0, 28, ja 84 kliinisen tutkimuksen (kuvio 5A). Mikrokanava suodatin perustuva analyysi paljasti selvän kasvun kaikissa harvinainen solupopulaatioiden (CTC, CMC, CSCS, ja KIE) välillä ajankohtien 2 ja 3. Sen sijaan rinnakkaistestaus kautta CellSearch

® järjestelmä ei havainnut CTC. Kliiniseen testaukseen seerumin tuumorimarkkeri CA 15-3 klo matching ajankohtina paljasti vastaavaa lisäystä välillä ajankohtien 2 ja 3 (CA 15-3 tasot: 84, 88, 124 U /ml). Myöhemmät kliininen arviointi vahvisti, että potilas koki sairauden etenemiseen.

Kiertävä kasvainsolujen (CTC), verenkierrossa mesenkyymisolujen (CMC), verenkierrossa endoteelisolujen (CEC), ja otaksuttu verenkierrossa kantasolujen (CSC) laskettiin veressä näytteet kerättiin eri aikapisteissä (TP) hoidon aikana. Y-akseli vasemmalla edustaa asteikko CTC, CMC, ja CSC per ml verta, kun taas y-akseli oikealla edustaa asteikon CEC per ml verta. Kliininen vaste arvioitiin käyttäen Response arviointiperusteet kiinteitä kasvaimia (RECIST) arviointikriteerit.

Potilas B oli 54-vuotias nainen diagnosoitu ER-positiivisia, HER2-negatiivinen metastasoitunut rintasyöpä. Verinäytteet kerättiin päivinä 0 ja 14. Mikrofluidistiikan suodatin-analyysi ei osoittanut havaittavaa CTC tahansa ajanhetkenä. CellSearch

® suoritettiin riippumaton näytteen noin kolme viikkoa ennen ensimmäistä mikrofluidinen suodatin-pohjainen testaus (päivä -21), sekä rinnakkais- näytettä ajankohtana 2; Näiden samoin ei näkynyt havaittavissa CTC. Kuitenkin tasot CSCS olivat alhaiset ja pysyivät ennallaan. CMC ja KIE havaittiin myös ja tasoja näytti laskevan ajan mittaan (kuvio 5B). Seerumin CA 15-3 tasot arvioitiin 26 päivää ennen ja 2 päivää sen jälkeen alkuperäisen mikrofluidistiikkaan suodatin-testaus osoitti lievää laskua (50 ja 47 U /ml). Kliininen arviointi osoitti, että potilaalla oli osittainen vaste syövän hoitoon.

Patient C oli 68-vuotias nainen diagnosoitu ER-positiivisia, HER2-negatiivinen metastasoitunut rintasyöpä. Verinäytteet kerättiin päivinä 0 ja 30. Mikrofluidistiikan suodatin-analyysi osoitti kohonneita kaikki kiertävän harvinaisten solupopulaatioiden päivänä 30 (kuvio 5C). CellSearch

® testaus verinäytteistä identtinen ajankohtina myös näkyvissä kasvua CTC tasolla (7 ja 17 CTC kohti 7,5 ml: lla verta). Kliininen arviointi paljasti taudin etenemistä.

Keskustelu

kehittäneet uuden määrityksen rikastamiseen, toteamiseen ja laskemiseen kiertävän harvinaisten solupopulaatioiden syöpäpotilailla. Protokolla on kaksi pääasiallista vaihetta: rikastaminen suodattamalla käyttäen mikrofluidilaitetta ja juokseva multiplex immunovärjäys tunnistaa harvinaisten solutyyppejä. Kun laaja esikliinisiä, arvioimme kliininen suorituskyky meidän määrityksen havaitsemisessa ja luetellaan CTC, CMC, CSCS ja KIE veressä metastaattisen rinta- ja keuhkosyöpää potilaille.

Useat mikrofluidistiikkaan lähestymistapoja eristämiseen CTC on raportoitu [28-32]. Esimerkiksi CTC-iChip, automatisoitu mikrofluidinen erottaminen järjestelmää on käytetty menestyksekkäästi eristämiseksi ja analysoida CTC [28, 32]. Tietääksemme yksikään nykyisistä alustat on käytetty multiplex havaitsemiseen verenkierrossa harvinaisia ​​soluja.

CTC oli usein havaittu rinta- ja keuhkosyöpää potilasta, mutta olivat selvästi vähemmän terveillä verrokeilla. Keskimääräinen taso CTC oli merkitsevästi korkeampi rintojen verrattuna keuhkosyöpäpotilaita, yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen käyttäen CellSearch

® määritys [10]. Head-to-head vertailu meidän mikrofluidistiikkaan suodattimen menetelmällä vs. FDA-selvitetty CellSearch

® järjestelmä paljasti maltillinen sopimus.

Olemme aiemmin raportoitu toteutettavuutta numerointitaso ja eristämisen CTC Fluoresenssiaktivoitujen cell lajittelu (FACS) seuraava immunomagneettisia rikastamiseen [33-35]. Kuitenkin sekä immu- rikastamiseen ja FACS-värjäys perustuivat EPCAM ilme. Suodatus perustuvaa menetelmää käytetään nykyisessä tutkimuksessa poistaa riippuvuus pintamerkkiaineita tunnistamiseen CTC. Niinpä, lisäksi CTC epiteelin merkki ilme, meidän määritys havaitsi myös verenkierrossa harvinaisia ​​solujen mesenkymaalisten merkki ilme. Todellakin, CMC havaittiin 58% syöpäpotilaiden, eikä yksikään havaittiin terveillä verrokeilla. Yhdistetty havaitseminen epiteelin (CTC) ja mesenkymaaliset (CMC) harvinainen solutyyppejä (eli CTC + CMC) oli 79% ja 62% rinta- ja keuhkosyöpää potilaista, jotka edustavat mahdollista herkkyyden lisääntyminen yli CTC tai CMC yksin.

syöpä kantasolu hypoteesi arvelee, että harvinaisen alapopulaatio kasvainsolujen pystyy itse uusiminen ja multipotenttisuus vastaavat kasvaimen aloittamista ja kasvua [36, 37]. Useat markkereita, kuten CD44, CD24, ja ALDH1, on käytetty tunnistamaan ja rikastuttaa luulotellun CSCS kiinteiden kasvaimien [38-40]. Tässä tutkimuksessa käytettiin kahta uutta ehdokas kantasolujen merkkiaineita, PIWIL2 [41, 42] ja TPGB /5T4 [43, 44], voidaan havaita oletetun CSCS syöpäpotilailla. PIWIL2 kuuluu P-elementin aiheuttama wimpy kives /Argonaute (PIWI /AGO) perheeseen ja on tärkeä rooli kehitettäessä sukusolujen [45]. Tutkimukset ovat äskettäin osoittaneet, että PIWIL2 ilmaistaan ​​precancerous ja syövän kantasoluja [41, 42, 46, 47]. Lisäksi tämä geeni ilmentyy eri vaiheissa rintasyövän, mutta ei normaalissa rintarauhaskudoksessa [48]. Muut oletetun kantasolujen markkeri, trophoblast glykoproteiini (TPBG /5T4), on onkofetaalinen proteiini, joka ilmentyy sikiön trofoblasteissa, uloin kerros solujen nisäkkään alkion [49]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että TPBG /5T4 ilmaistaan ​​kasvaimen aloittamista solujen keuhkosyöpään [43, 44], ja voimakasta ilmentymistä useissa syöpätyypeissä on liittynyt huonompi kliiniseen tulokseen [43, 50-52]. Tässä tutkimuksessa, oletetun CSCS havaittiin useimmissa rinta- ja keuhkosyöpää potilailla, mutta olivat täysin poissa terveillä verrokeilla.

Endoteelisolut liikkeeseen voi syntyä kasvaimen angiogeneesiin liittyvät prosessit syöpäpotilailla, samoin kuten loukkaantumisen normaalin verisuoniston [53-55]. Muutokset CEC tasoja on havaittu useissa taudin asetuksia, kuten syövän, infektioiden, ja sydän- ja verisuonisairauksia [56-60]. KIE kuitenkin havaitaan usein tautivapaan ihmiset sekä [54, 55]. Tutkimuksessamme KIE olivat runsaimmat solun väestön tutkittu sekä syöpäpotilaiden ja terveillä henkilöillä; kuitenkin, syöpäpotilailla ei näyttävät osoittavan jonkin verran korkeampi. Tämä havainto on yhtäpitävä tulosten aikaisemmassa tutkimuksessa osoittaa, että suurin osa verenkierrossa harvinaisten solujen vangiksi koon valinta oli endoteelisolujen [19].

demonstroida sarja- analyysiä, verenkierrossa harvinainen solujen valittu rintojen syöpäpotilasta määritettiin eri ajankohtina aikana hoidon. Vertailu numerot kiertävän harvinaisten solujen tasot vahvistettu kliinisten merkkiaineiden, kuten CA 15-3 ja CTC määrityksessä Cellsearch

®, osoittivat samanlaisia ​​suuntauksia. Lisäksi alustavat havainnot tässä pieni määrä potilaita osoitti, että Veren harvinaisia ​​soluja voidaan korreloida vastaus lopputulokseen.

Vaikka peräkkäisiä immuunivärjäysmenetelmällä lähestymistapa lopulta saadaan erittäin puhdasta solupopulaatioiden solujen talteenotto voidaan edelleen parantaa arvioimalla eri suodatin ja suodatuksen parametrit [13, 15]. Myös rinnakkainen testaus eri eristäminen tekniikoita, mukaan lukien virtaussytometria, voidaan suorittaa vertailua kaapata tehokkuusetuja.

Meidän lähestymistapamme on samanlaisia ​​rajoituksia kuin muilla koon perustuvia menetelmiä.