Krooninen sairaus

tiivistelmä

Epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) on dedifferentiaation prosessi, joka on ollut sekaantunut etäpesäkkeitä ja sukupolven syövän aloittamista solujen (CIC) kiinteissä kasvaimissa. Tutkia EMT ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), käytimme kolmiulotteinen (3D) soluviljelmässä, jossa soluja kostimuloida kanssa tuumorinekroositekijä-alfa (TNF) ja transformoiva kasvutekijä beeta (TGF). NSCLC sferoidiviljelmiä kohonneita ilmentyminen EMT päävirtakatkaisimen transkriptiotekijöitä,

TWIST1

,

SNAI1 /Snail1

,

SNAI2 /Slug

ja

ZEB2 /Sip1

, ja ovat erittäin invasiivisia. Mesenkymaaliset NSCLC kulttuureissa osoittavat CIC ominaisuudet, näytetään kohonnut ilmentyminen transkriptiotekijöiden

Klf4

,

Sox2

,

POU5F1 /Oct4

,

MYCN

, ja

KIT

. Tämän seurauksena näiden oletettujen CIC näyttää syöpä ”varsi-like” fenotyyppi muodostamalla keuhkoetäpesäkkeet alle rajoittava solu laimennus. Pleiotrooppisten transkriptiotekijän, NF-KB: n, on liitetty EMT ja etäpesäkkeiden. Niinpä ryhdyimme kehittämään NSCLC mallia edelleen luonnehtia roolia NF-KB: n aktivoitumista kehittämisessä CIC. Tässä osoitamme, että induktio EMT 3D kulttuureissa tuloksia konstitutiivista NF-KB: n aktiivisuutta. Lisäksi NF-KB johti menetys

TWIST1

,

SNAI2

, ja

ZEB2

induktio, ja epäonnistuminen solujen hyökätä ja etäispesäkkeitä. Työmme osoittaa, että NF-KB vaaditaan NSCLC etäpesäke, osittain kopiointia gisia päävirtakatkaisimen transkriptiotekijöiden tarvitaan EMT.

Citation: Kumar M, Allison DF, Baranova NN, Wamsley JJ, Katz AJ , Bekiranov S, et ai. (2013) NF-KB Säätelee mesenkymaalitransitioon varten induktio ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Käynnistetään Cells. PLoS ONE 8 (7): e68597. doi: 10,1371 /journal.pone.0068597

Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 tammikuu 2013; Hyväksytty: 30 toukokuu 2013; Julkaistu: 30 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Kumar et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Work oli tukee National Institutes of Health myöntää R01CA132580, R01CA104397 (ja MWM), ja R01CA136705 (sen DRJ). Kaikki rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cancer kehittämiseen varhaisen pre-pahanlaatuinen kasvain täyteen metastaattinen sairaus on monivaiheinen prosessi, johon liittyy kasvaimen epiteeli–strooman vuorovaikutukset, angiogeneesi, ja tunkeutumisen kasvaimeen liittyvien tulehdusta soluihin [1], [2]. Syntymässä hypoteesi ehdottaa, että tämä miljöö solu-solu-vuorovaikutuksia, kasvutekijät ja sytokiinit tunnetaan kasvaimen mikroympäristössä, stimuloi morfogeneesiin kuuluvat kasvainsolujen kutsutaan epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) [3] – [5]. EMT indusoi uudelleenjakoa solunsisäisen arkkitehtuuri, laski solu-soluadheesion ja menetys solujen polarisaatio. Karsinoomasolut jotka ovat läpikäyneet EMT ovat tyypillisesti liikkuva, invasiivisen ja erittäin metastaattinen. Useiden viime vuosien EMT on myös tunnustettu dedifferentiaation ohjelma johtuvan sukupolven kasvaimeen aloittamista tai syöpään aloittamista solujen (CIC), jotka ovat tärkeitä ylläpito syöpä ”stemness” [6] – [9] .

Vaikka useita sytokiinit ja kasvutekijät indusoivat EMT, yksi parhaiten tutkittu tekijöiden transformoiva kasvutekijä beeta (TGFP) [2], [3], [10] – [13]. Stimulointi solujen TGFp johtaa ilmentymisen EMT päävirtakatkaisimen transkriptiotekijöitä, TWIST1, SNAI1 /Snail, SNAI2 /Slug, ja ZEB2 /Sip1 että yhdessä eri tavoin säätelevät geenit edistää mesenkymaalisten fenotyyppi [10], [12]. Vaikka laaja tutkimus yksityiskohdat kyky TGFp aiheuttavan EMT, todisteet osoittavat, että tuumorinekroositekijä (TNF) edelleen voimistaa siirtyminen [14], [15]. Aikana syövän etenemisessä, eritys TGFp sisällä kasvaimen mikroympäris- tapahtuu monin eri solutyyppejä, mukaan lukien kasvaimeen liittyvät fibroblastit, kun taas eritys TNF peräisin kasvaimeen liittyvistä M2 makrofagit [3], [16], [17]. Vallitseva hypoteesi alalla on, että altistuminen syöpäsolujen Näiden sytokiinien sisällä kasvain microenvironment edistää EMT, de-erilaistumista ja muodostumista CIC [2], [5], [17].

TNF on tehokas tulehdusta edistävä sytokiini, joka stimuloi signa- aktivoida tumatekijä kappa B (NF-KB). Kuten transkriptiotekijän NF-KB: n keskeinen rooli geenien ekspressiota osallisina syövän taudin alkamisen ja etenemisen. Ylössäätely NF-KB: n aktiivisuus esiintyy usein ensisijainen kiinteiden ja hematologisten kasvaimia, suoraan korreloi de erilaistunut morfologia, kehittynyt kasvain vaiheessa ja huono kliininen ennuste [18]. Tärkeää on, että NF-KB: n on liitetty maitorauhasen CIC: t [19], [20]. NF-KB indusoi ja ylläpitää EMT mallissa järjestelmiin kaksi mekanismia, säätelyä EMT päävirtakatkaisimen transkriptiotekijöiden [21] – [24] ja vakauttamiseen Snail [25]. NF-KB koostuu viidestä Rel perheenjäsenten: RelA /p65, RelB, cRel, P50 ja P52. Stimuloimattomissa soluissa, estävä IKB alayksiköt liittävät NF-KB-dimeerit ja eristää ne sytoplasmassa. Kun solujen stimulaatio proinflammatoristen sytokiinien, IκBα fosforyloituu että IKB kinaasin (IKK) kompleksi, ubikitinoitu SCF-tyyppinen E3-ligaasi, E3RS

IKB /β-TrCP ja hajottaa 26S-proteasomin [26]. Vapautunut NF-KB sitten siirtyy tumaan, geeni-ilmentymisen aktivoimiseksi rekrytoimalla transkription koaktivaattoreiden [27]. Laboratoriossamme ovat osoittaneet, että posttranslational muutostöitä RelA tarvitaan koko NF-KB transkriptionaalisen aktiivisuuden [27] – [30].

Vaikka EMT rintasyövässä malleissa edellyttää NF-KB: n aktiivisuuden [31], rooli tämä transkriptio kiihdyttänyt EMT ja kehittää CIC vuonna NCSLC ei ole tutkittu perusteellisesti. Kuitenkin vahvaa näyttöä olemassa läsnäolon NSCLC kantasolujen /kantasolujen ensisijainen adenokarsinooman ja vakiintuneet solulinjat [32] – [35]. Tässä osoitamme, että koordinoitu aktivaatio TNF: n ja TGFp signa- tehokkaasti indusoi EMT: n ja geenien ilmentymistä, jotka liittyvät de-erilaistumista ja stemness. Lisäksi osoitamme, että mesenkymaaliset NSCLC soluilla konstitutiivisesti aktiivinen NF-KB, ja että NF-KB pienenee EMT, CIC muodostumista, ja metastaattinen potentiaali.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

NSCLC linjat A549, H359, H1299, ja H157 saatiin ATCC ja ylläpidetään 2D viljelmiä DMEM (Cellgro), 10% FBS (Invitrogen) ja penisilliiniä /streptomysiiniä (Invitrogen). Käytetyt vasta-aineet ovat: E-kadheriinin (BD Pharmingen- 610404), N-kadheriinin (BD Pharmingen- 610920), vimentiinistä (V6630), fibronektiinin (BD Pharmingen- 610078), α-Tubulin (Sigma T6793), HMGA2 (Biocheck 59170AP ), Twist1 (Cell Signaling 4119), Snail1 (Cell Signaling 4719), Sip1 (SCBT sc-48789), Slug (Abcam ab27568), IκBα (pS32, Cell Signaling 2859), IκBα (SCBT sc-371), RelA (pS536 , Cell Signaling 3031), RelA (SCBT sc-372), ja M2-Flag (Sigma F1804). Baculogold proteaasinestäjät saatiin BD Biosciences. TGF (PHG 9204) ja TNF (PHG 3015) ostettiin Invitrogen /Life technologies. Kaikki muut kemikaalit olivat Sigmalta.

kolmiulotteisen monisoluisten sferoidiviljelmiä

kolmiulotteisen monisoluisten sferoidiviljelmiä luotu käyttämällä modifioitua roikkuu pisaran menetelmää [36]. Soluja kasvatettiin noin 80% konfluenssiin standardin kudosviljelmän levyt. Solut sen jälkeen trypsiinillä, suspendoitiin uudelleen DMEM /10% FBS: ää, ja laskettiin. Luoda 25000 solun sferoideja, solususpensio laimennettiin pitoisuuteen 1000000 solua /ml, ja 25 ui solususpensiota pipetoitiin alapuolen steriilin 10 cm kudosviljelmän levyn kansi. Jokainen kansi mahtuu noin viisikymmentä pisaroita. Lataamisen jälkeen pisarat, kansi pantiin päälle kudosviljelymaljalle, joka sisältää 6 ml steriiliä PBS: ää ja inkuboitiin 48 tunnin ajan helpottaa solujen aggregaatiota ja pallomainen muodostumista. Juuri muodostunut palloset siirrettiin sitten 10 cm: n suspensioon sisältävät levyt DMEM ja 2% FBS: ää, jotta solun sitoutumista lautasen. Suspension levyjä valmistettiin lisäämällä 8 ml poly-HEMA-liuosta (Sigma-Aldrich P3932, 10 mg /ml) 95%: ista etanolia ja steriiliä polystyreeni petrimaljaan levyt (Fisher Scientific). Levyjä inkuboitiin sitten 24 tunnin ajan steriilissä ympäristössä, jotta etanolin haihduttamiseksi. Ennen käyttöä levyt pestiin steriilillä PBS: llä poistamaan kaikki jäljellä etanolia tai muita epäpuhtauksia. Jokainen Ripustuslevy mahtuu 100 pallosia. Siirron jälkeen palloset käsiteltiin ajoneuvon tai 10 ng /ml TNF: n ja 2 ng /ml TGF, ja inkuboitiin 48 tunnin ajan. Inkuboinnin jälkeen solut altistettiin toiseen hoitoon ajoneuvon tai TNF: n ja TGF, ja inkuboitiin vielä 48 tunnin ajan. Palloset kerättiin sitten ja analysoitiin erilaisissa määrityksissä.

Immunofluoresenssimikroskopia

A549-soluja ympättiin lasipeitinlevyille ja altistettiin EMT induktion tai ne jätetään hoitamatta. Induktion jälkeen, solut kiinnitettiin 100% metanolissa, minkä jälkeen niitä inkuboitiin primääristen vasta-aineiden solunulkoisen domeenin E-kadheriini (SCBT, sc-7870). AlexaFlour-konjugoitua vuohen anti-kani-vasta-ainetta (Invitrogen) käytettiin sekundaarisena vasta-aineena, ja epäsuoralla immunofluoresenssilla E-kadheriinin kuvattiin käyttämällä Nikon E3800 fluoresenssimikroskoopilla.

Migration and Invasion

In vitro

maahanmuutto- ja invaasion määritykset suoritettiin valmistajan protokollan (BD Biosciences). 2D- ja 3D-viljelmiä eritelty trypsiinillä ja sittemmin laskettiin. 1 x 10

5-solut (muuttoliike) tai 1 x 10

4 solut (hyökkäys) ympättiin tavallinen DMEM alkuun kuoppaan transwell ohjauslevyn (BD 354578) tai Matrigel invaasio levy (BD 354480). Pohja hyvin ladattiin DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää, kuten kemoattraktantti, ja levyjä inkuboitiin kahdeksan tuntia (siirtymä) tai kaksikymmentäneljä tuntia (hyökkäys) 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Jälkeenpäin solut ylä- puolella kaivoa poistettiin, ja jäljellä olevat solut fiksattiin 100% metanolilla ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla. Värjätyt solut kuvattiin ja kvantitoitiin käyttäen Adobe Photoshop.

kasvainmuoto

Yksikerroksinen (2D) ja 3D-A549 kulttuureissa, jotka oli jätetty hoitamatta tai käsitelty TNF ja TGFp trypsinoitiin, suspensoitiin uudelleen DMEM /0,5% FBS, ja huolellisesti laskettiin ja laimennettiin sopiva ruiskutettavaksi. Soluja ihon alle (SC) ruiskutetaan naaras ulkosiittoiset Crl: NU /NU nude-hiiriä (Charles River). Viisi hiiriin ruiskutettiin kohti koeolosuhteissa. Kaikki eläinkokeet suoritettiin kuten kolmen erillisen kokeen. Hiiret tapettiin neljäkymmentä päivää injektion jälkeen. Ensisijainen SC tuumorit poistettiin ja punnittiin. Lisäksi keuhkot poistettiin, kiinnitettiin formaliiniin, ja pinta keuhkometastaaseista laskettiin. Määrän kvantitoimiseksi koko kasvaimen taakka formaliinissa keuhkokudoksessa, genominen DNA uutettiin [37], ja määritettiin läsnä ihmisen genomi-materiaalin, kuten on kuvattu käyttämällä kvantitatiivista reaaliaikaista-polymeraasiketjureaktio (QRT-PCR) spesifisiä alukkeita ihmisen endogeeninen retrovirus-3 (ERV3, taulukko S1) [38], [39].

tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksesta Animal Care ja Käytä komitea (ACUC) ja University of Virginia. Protokolla hyväksyi ACUC Number 3914. Kaikki kokeet lopetettiin 40 päivän jälkeen jolloin SC kasvaimia olivat vähemmän kuin 1,0 cm

3 kokoa; Näin rajoittaminen kasvaintaakkaa. Kaikki pyrittiin minimoimaan kipua ja kärsimystä.

QRT-PCR, Immunoblotit, ja elektroforeettinen liikkuvuus shift määritykset (EMSAs) B

QRT-PCR ja immunoblottaus suoritettiin kokeita kuten aikaisemmin on kuvattu [28 ]. PCR-alukkeet on esitetty taulukossa S1. Tumauutteita valmistettiin käyttäen palloset päässä A549.V ja A549.I solulinjoja käsiteltiin kanssa tai ilman TNF: n ja TGF. EMSAs ja supermuutoksena määritykset suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [40].

Tilastot

Tarvittaessa vertailuja koeryhmään toteutettiin suorittamalla yksisuuntaista Studentin

t

testi Microsoft excel. Tiedot kaikista kokeista pidettiin tilastollisesti merkitsevä, kun p 0,05.

Tulokset

malli tutkia EMT NSCLC

TNF: n on osoitettu voimistavan TGFli välittämää EMT kautta aktivointi kostimuloivien reittejä [15]. Tämän havainnon varmistamiseksi meidän kolmiulotteisia (3D) malli, timecourse suoritettiin käyttäen molempia sytokiinien tandem ja yksin. Monisoluisten sferoidiviljelmiä luotu käyttämällä modifioitua roikkuu pisaran menetelmää [36]. Kahden päivän jälkeen, sferoidit suspendoitiin poly-HEMA päällystetyille levyille ja käsiteltiin kahden päivän välein, jossa on esitetty sytokiinien indusoimaan EMT (kuvio 1A). Näytteitä otettiin käsittelemättömistä (0 päivä) ja sytokiinien-käsitellyissä viljelmissä (1-8 päivää). Epiteelin (E-kadheriinin) ja mesenkymaalisten (N-kadheriinin, vimentiinistä, ja fibronektiinin) markkereita mitattiin immunoblottauksella. Hoito TNF johti vaatimaton kasvu N-kadheriinin ja fibronektiinin, mutta ei eronnut muiden merkkiaineiden (kuvio 1 B). Yhdenmukainen induktion EMT, TGFp hoito johti menetykseen E-kadheriinin ilmentymisen ja nostaa N-kadheriinin, vimentiinistä, ja fibronektiinin. Lisäksi stimuloimalla yhdessä TNF ja TGFp tuottivat enemmän mesenkymaalisten fenotyyppi ja jatkui koko kahdeksan päivän ajan kurssi (kuvio 1 B). Tärkeää on, stimulaatio TNF ja TGFp tehokkaasti indusoi EMT sekä A549- ja H358 solulinjoja neljän päivän kuluessa hoidon verrattuna H1299, joka jo osoittaa muutokset E-kadheriinin ja vimentiinista (kuvio 1 C). Tulosten perusteella kuviossa 1, käytimme neljä päivää aikataulussa koko meidän jäljellä kokeita.

(A) aikajana havainnollistaa tätä menettelyä käytetään luomaan kolmiulotteinen mesenkymaalisten solupopulaatio konfluenteis- yksisolukerrosten. (B) Sferoidiviljelmiä A549-soluja käsiteltiin, TNF, TGF, tai molempien sytokiinien joka neljäkymmentäkahdeksan tuntia ilmoitettu kertaa. Immunoblottianalyysi mitataan muutoksia epiteelin (E-kadheriinin) ja mesenkymaalisten (N-kadheriinin, vimentiinistä, ja fibronektiini) merkkiaineiden yli kahdeksan päivää timecourse. (C) 3D-viljelmiä useita NSCLC solulinjojen (A549, H358, H1299) inkuboitiin yhdeksänkymmentäkuusi tuntia poissa tai läsnä ollessa TNF ja TGFp. Epiteelin ja mesenkymaaliset markkereita myöhemmin mitattiin immunoblottauksella. Tulokset Kuvio 1B ja 1C ovat edustavia esimerkkejä vähintään kolmen erillisen kokeen; α-tubuliinin toimii proteiinia latauskontrollina.

3D kulttuureissa tehdään EMT tehokkaammin kuin 2D kulttuureissa

Voit selvittää 3D A549 kulttuureissa tehdään EMT tehokkaammin kuin kaksiulotteinen (2D ) yksikerrosviljelmiä, mittasimme ilmentyminen epiteeli- ja mesenkymaalisten merkkiaineita vasteena stimulaatiolle TNF ja TGFp, kuten on kuvattu kuviossa 1. sen jälkeen sytokiinin käsittely, 3D viljelmiä osoittavat merkittävää vähenemistä

CDH1 /E-kadheriinin

ilmentymistä verrattuna 2D-viljelmät (kuvio 2A). Lisäksi sferoidit myös hallussaan lisääntyneen ilmentymisen mesenkymaalisten merkkiaineiden

VIM

,

HMGA2

ja EMT päävirtakatkaisimen transkriptiotekijöitä,

TWIST1

,

SNAI1 /Snail1

,

SNAI2 /Slug

ja

ZEB2 /Sip1

(kuviot 2A ja 2B). Immunoblot-analyysi sferoidiviljelmiä vahvistavat, että ero mRNA: n ilmentymisen seurauksena vastaavan muutoksen proteiinin tasot (kuvio 2C). Lisäksi tutkimme muutokset solun morfologiassa ja E-kadheriinin lokalisointi mikroskoopilla. Sekä 2D- ja 3D-viljelmiä käsiteltiin sytokiinien kuvatun, trypsinoitiin, uudelleen pinnoitettu lasipeitinlevyille, ja epäsuora immunofluoresenssivärjäyksellä toteutettiin kahdeksantoista tuntia myöhemmin. Kuten odotettua, käsittelemätön yksikerroksisen ja sferoidiviljelmiä A549 näytteet osoittivat vahvaa E-kadheriinin ilmentymisen, vaikka junktionaalinen lokalisointi ilmestyi vähentynyt soluja 3D viljelmät (kuva S1). Lisäksi solut on johdettu sytokiini-käsiteltyjen pallosia näkyy parannettu menetys E-kadheriinin verrattuna 2D käsiteltyjen näytteiden, viittaa siihen, että 3D-viljelmät tehtiin tehokkaampi EMT. Tulokset on esitetty kuvioissa 2 ja S1 on kuvattu merkittäviä EMT induktio 3D kulttuureissa mitattuna muutokset mesenkymaalisten markkereita, EMT päävirtakatkaisimen transkriptiotekijän ilmaisun, ja solun morfologiassa.

(A ja B) Yksikerroksinen (2D) ja 3D-viljelmiä A549-solut yksin (ei lisäosia) tai käsitelty TNF ja TGFp (TNF /TGF) varten yhdeksänkymmentäkuusi tuntia. Expression of epiteelin markkereita (

CDH1

), mesenkymaaliset markkereita (

VIM, HMGA2

), ja EMT päävirtakatkaisimen transkriptiotekijöiden (

TWIST1, SNAI1, ZEB2, SNAI2

) mitattiin QRT-PCR. (C) immunoblottianalyysi 3D A549 kulttuureissa, jätetään yksin (ei lisäosia) tai käsitelty TNF ja TGFp (TNF /TGF), suoritettiin E-kadheriinin, vimentiinistä, HMGA2, Twist1, Snail1, Sip1, Slug, ja α- tubuliinia. Tulokset kuviossa 2A ja 2B normalisoitiin

GAPDH

, ja lasketaan keskiarvo ± SD, * p 0,05, N = 3. Immunoblotit kuvassa 2C ovat edustavia esimerkiksi vähintään kolmen erillisen kokeen.

mesenkyymikasvaimia NSCLC-solut ovat invasiivisia ja endogeenisesti ilmaista geenien tiedetään edistävän varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia

Fenotyypiltään mesenkyymisolujen on korkea siirtymänopeuksien ja erittävät entsyymejä, jotka hajottavat soluväliaineen helpottamiseksi solujen invaasiota. Käyttämällä

in vitro

siirtokuoppaan määrityksiä, mittasimme muuttoliikettä ja hyökkäys ominaisuudet A549-solut kasvatettiin joko 2D- tai 3D-viljelmiä. Mielenkiintoista, käsittelemätön 3D sferoidiviljelmiä osoitti korkeampia siirtymänopeuksien kuin 2D yksikerrosviljelyissä (kuvio 3A, vasemmalla). Kuitenkin hoito 3D kulttuurien TNF ja TGFp edelleen voimistua muuttoliike verrattuna hoitamattomiin 3D kulttuureissa. Sferoidit käsitelty sytokiinien tunkeutuneet kautta matrigeelin tehokkaammin kuin mikään muu sairaus (kuvio 3A, oikealla). Lisäksi sytokiini käsiteltiin A549 pallosia näytetään ilmen- tymisen lisääntymisen ilmentymisen

MMP-9

,

LOX

, ja

COL22A1

(kuvio 3B), geenit, joiden tiedetään voimistavan hyökkäys [41], [42 ]. Nämä tulokset osoittavat, että viljellään 3D rakeita läsnä TNF: n ja TGFp muodostaa erittäin invasiivinen mesenkymaaliset väestöstä. Lopuksi, sytokiini-käsitelty pallosia osoittivat endogeenisen säätelyä merkkiaineita, jotka liittyvät de-erilaistumisessa ja ylläpidossa CIC: t [43] – [48], mukaan lukien

Klf4, Sox2, POU5F1 /Oct4, MYCN

, ja

KIT

(kuvio 3C). Tiedot kuviossa 3 osoittavat, että kostimulaatio sferoidit TNF ja TGFp edistää fenotyyppisiä muutoksia A549-soluja, jotka johtavat lisääntyneeseen hyökkäyksen ja ilmentymistä liittyviä geenituotteita varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia.

Yksikerroksinen ja 3D A549 kulttuureissa jätettiin yksin (ei lisäosia) tai käsitelty TNF ja TGFp (TNF /TGF) varten yhdeksänkymmentäkuusi tuntia. (A) Soluja eriteltyjä ja seuraavaksi altistaa maahanmuuttoa ja invaasion määrityksissä. (B ja C) Expression of invaasio (

MMP-9, LOX, COL22A1

) ja kantasolujen merkkiaineita (

Klf4 Sox2, POU5F1, MYCN, ja KIT

) mitattiin QRT- PCR. Kuvion 3 tulokset on laskettu keskiarvo ± SD, * p 0,05, N = 3. Tulokset 3B ja 3C normalisoitiin

GAPDH

.

Mesenkymaaliset solut ovat erittäin metastaattinen ja näyttö syöpä aloittamista fenotyypit

tutkia induktio EMT kehitystä edistävä CIC

in vivo

, käytimme vierassiirrännänmallissa kasvain malli nude-hiirissä. TNF ja TGFp käsiteltiin 2D- ja 3D-viljelmät eriteltyjä ja solususpensiot SC ruiskutetaan oikeaan kylkeen nude-hiirten. Neljäkymmentä päivää myöhemmin, eläimet tapettiin ja SC kasvaimet resekoitiin ja punnittiin, kun keuhkot leikattiin irti ja sijoitettiin pinta etäpesäkkeitä. Yllätykseksemme, TNF: n ja TGFp-käsitellyt solut eivät muodostaneet SC kasvaimia samassa määrin kuin sytokiini-käsiteltyjen 2D viljelmissä (kuvio 4A, vasemmalla). Kuitenkin tutkimus keuhkojen pinta näillä hiirillä laaja etäpesäke (kuvio 4A, oikealla). Ainoa uskottava selitys näille tuloksille on, että mesenkymaaliset solut 3D viljelmistä tunkeutuneet ja metastasized keuhkojen kehittämättä SC kasvaimia.

(A) Yksikerroksinen ja 3D-A549 viljelmiä käsiteltiin TNF ja TGFp varten yhdeksänkymmentäkuusi tuntia . Soluja eriteltyjä ja SC injektoitiin paljaisiin hiiriin (1 x 10

6 solua /eläin). Neljäkymmentä päivää myöhemmin, ensisijainen SC kasvaimia resekoitiin ja punnittiin. Lisäksi, keuhkot leikattiin irti ja useita pinnan metastaasit olivat määrittämiseksi. (B) Yksikerroksinen ja 3D-A549 viljelmiä joko jätetään hoitamatta tai käsitelty TNF ja TGFp ja rajoittamalla solujen määrä (1 x 10

3 /eläin) olivat SC injektoitiin paljaisiin hiiriin arvioida läsnäolo CIC. Etäpesäke arvioitiin pinta keuhkojen kasvain count ja keuhkojen kasvaintaakkaa arvioitiin käyttämällä genomista QRT-PCR havaitsemiseksi ihmisen DNA yhteensä keuhkokudoksessa. Paino ja keuhkoetäpesäkkeet tiedot kuviosta 4 ovat keskiarvo ± S.D. Viiden hiiren kohti kunnossa, * p 0,05, N = 3 itsenäisestä kokeesta. Genomisen QRT-PCR tiedot Kuvio 4B on normalisoitu yhteensä keuhkokudoksessa (mg).

mittaaminen laajuudesta etäpesäkkeiden alle rajoittava solu laimennuksen osoittautuu luotettava testi läsnäolo rikastettu CIC epiteeli- johdettuja kasvaimia [49]. Siksi kokeet toistettiin käyttäen yhden tuhat solua SC injektion. Solususpensioita johdettu TNF ja TGFp käsiteltiin pallosia, tuotti enemmän pinta keuhkoetäpesäkkeet alle rajoittava solu laimennuksen kuin sytokiinien käsitellyn monolayers tai käsittelemätöntä 3D kulttuureissa (kuva 4B vasemmalla). Rajoittaminen solu laimennus määritykset osoittavat, että induktio EMT 3D kulttuureissa tuottaa CIC väestö tehokkaasti metastasizes keuhko. Kuten odotettua, analyysi DNA eristettiin hiiren keuhkoista varmisti metastaattisen taakkaa ja varmistanut, että vauriot olivat peräisin ihmisestä (kuvio 4B oikealla). Me päätellä kokeita kuviossa 4 että de-eriyttäminen, CIC muodostumista, ja metastaattinen potentiaali ovat kaikki merkittävästi parannettu EMT aiheuttama sferoidiviljelmiä.

NF-KB on konstitutiivisesti aktiivinen 3D kulttuureissa, jota tarvitaan induktioon EMT:

TNF, voimakas NF-KB-aktivaattori, parantaa induktio EMT NSCLC solulinjoissa. Siksi me arvioi EMT induktio johtaa NF-KB: n signaloinnin immunoblottauksella. Mielenkiintoista on, että mesenkymaaliset A549 sferoidit näytetään konstitutiivisen IKK aktiivisuus mitattuna fosfo-spesifisiä vasta-aineita, jotka tunnistavat IκBα pS32 ja RelA pS536 (kuvio 5A ja kuvio S2A). Muutos E-kadheriinin ja vimentiinista tasot vahvistettiin tehokasta EMT on sytokiini saaneilla pallosia. Lisäksi QRT-PCR kokeet osoittivat voimistunutta ilmentymistä NF-KB-geenien

IL8

ja

BIRC3 /cIAP2

sisään mesenkymaaliset 3D kulttuureissa (kuvio 5B). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että sytokiini-hoito 3D A549 kulttuurien tuloksia lisääntynyt fosforylaatioon IKK-säänneltyjen alustoille ja konstitutiivista NF-KB: n transkription aktivoitumisen.

Yksikerroksinen ja 3D-viljelmiä A549-soluja inkuboitiin sytokiinien yhdeksänkymmenen -Kuusi tuntia. (A) mesenkyymikasvaimia A549 näyttää konstitutiivista NF-KB aktivoituu reittejä, mikä määritetään fosfospesifisiä vasta IκBα ja RelA. (B) Käsittelemättömät ja TNF: n ja TGF stimuloidaan 2D- ja 3D-viljelmiä A549-solut kerättiin ja analysoitiin ekspressiota NF-KB: n geenien QRT-PCR. (C ja D) kolmiulotteinen viljelmät A549.V (vektorisäätö) ja A549.I (SR-IKB) inkuboitiin yhdeksänkymmentäkuusi tuntia poissa tai läsnä ollessa TNF ja TGFp. (C) Immunoblotit vahvistavat ilmentyminen Flag-merkittyjen SR-IκBα että A549.I linja, joka onnistuneesti estetty tumaansiirtymiseen ja DNA: ta sitova, mitattuna EMSA. (D) QRT-PCR vahvisti kyvyttömyys A549.I solun upregulate NF-KB-geenien seuraavat TNF ja TGFp hoitoa. Immunoblotit kuvassa 5A ovat edustava esimerkki kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tulokset kuviossa 5B ja 5D lasketaan keskiarvo ± SD, * p 0,05, N = 3. RNA-arvot normalisoituivat

GAPDH

.

määrittämiseksi merkitystä NF KB: n aktiivisuuden induktion aikana EMT in NSCLC solulinjoissa, vakaa klonaalisen altaat ilmentävien super-repressori IκBα (SR-IκBα) tuli. SR-IκBα kestää proteasomaalisten hajoamista, ja näin ollen sitoo NF-KB sytosoliin. Solut, jotka ilmentävät SR-IκBα proteiinin vuoksi näyttää NF-KB-välitteisen transkription [50]. Kuva 5C (ylhäällä) vahvistaa ilmentyminen Flag-merkittyjen SR-IκBα A549 vakaa soluissa (A549.I) verrattuna tyhjän vektorin ohjaus soluja (A549.V). Lisäksi tumaproteiiniuutteet A549.I sferoidiviljelmiä, käsitelty TNF ja TGFp, puuttui NF-KB: n DNA: ta sitovan aktiivisuuden verrattuna A549.V uutteita (kuvio 5C, alhaalla). Supershift kokeet vahvistavat, että NF-KB aktiivisuus koostuu pääasiassa a RelA-p50-heterodimeeri kompleksi (kuvio S2B). QRT-PCR-määritykset osoittavat, tukahdutettu sytokiini-välitteisen induktion

IL8

ja

BIRC3 /cIAP2

in A549.I soluissa verrattuna kontrollisoluihin A549.V (kuvio 5D). Toisin kuin suuria annoksia TNF: n (100 ng /ml), pienillä annoksilla (10 ng /ml) ei johda solun elinkyvyn menetykseen in A549.I linjat, koska ilmentymisen talon pitäminen geenin, HPRT, ei muutosta ja käytettiin normalisointia kuviossa 5D. Nämä tiedot varmista, että SR-IκBα ilmentymistä A549.I solulinjassa estää tehokkaasti NF-KB: n transkriptionaalista aktiivisuutta.

karakterisointi NF-KB voimistamaan mesenkymaaliset fenotyyppi

NF-KB on ollut osoitettu säätelemään EMT päävirtakatkaisimen transkriptiotekijöitä useissa mallijärjestelmissä [21] – [24]. Siksi me arveltu, että estämällä NF-KB: n aktiivisuuden A549.I solulinjassa hillitsisi EMT induktio. Immunoblot-analyysi vahvisti, että A549.I solut eivät alas säädellä E-kadheriinin ekspression tai upregulate mesenkymaaliset markkereita (vimentiinin, N-kadheriinin ja fibronektiinin) kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio 6A). Lisäksi sytokiini-käsiteltyjen A549.I solut osoittivat vain vähäisiä säätelyä

TWIST1

,

ZEB2

ja

SNAI2

geenin ilmentymisen jälkeen, TNF: n ja TGF hoitoa (kuvio 6B). Nämä tulokset osoittavat, että NF-KB: n on tarpeen upregulate

TWIST1

,

ZEB2

ja

SNAI2

, kun taas ekspressio

SNAI1

tulee riippumaton NF KB-riippuvaista transkriptiota A549.I solulinjassa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ilmaus kriittisten EMT päävirtakatkaisimen transkriptiotekijöiden edellyttää NF-KB: n aktiivisuutta.

(A) A549.I soluja ei osoita muutoksia mesenkymaalisten markkereita, määritettynä immunoblot-analyysillä. (B) NF-KB tarvitaan upregulate mRNA ilmentymisen päävirtakatkaisimen transkriptiotekijöiden. (C) Sferoidiviljelmiä A549 ja H157 solulinjat, jotka ilmentävät tyhjän vektorin tai Flag-IKB super-repressori, jätettiin yksin (ei lisäosia) tai käsitelty TNF ja TGFp (TNF /TGF) yhdeksänkymmentä-kuusi tuntia. Solut eriteltyjä ja altistettiin hyökkäystä määrityksissä. (D) A549.V ja A549.I 3D viljelmiä yksin (ei lisäosia) tai käsitelty TNF ja TGFp (TNF /TGF) varten yhdeksänkymmentäkuusi tuntia. Solut olivat eriteltyjä ja SC injektoitiin paljaisiin hiiriin (1 x 10

6 /eläin). Neljäkymmentä päivää myöhemmin, eläimet tapettiin ja useita pinnan keuhkometastaasien oli päättänyt. Lisäksi SC kasvaimet irrotettiin ja märkä kasvaimen paino määritettiin. Paino ja keuhkoetäpesäkkeet data kuvasta 6 ovat keskiarvo ± S.D. Viiden hiiren kohti kunnossa, * p 0,05, N = 3 itsenäisestä kokeesta. Käyrät kuviossa 6 ovat keskiarvo ± S.D., * p 0,05, kolmen itsenäisen kokeen. Tietojen

P

arvo on suurempi kuin 0,05 katsottiin ole merkitsevä (

ns

). QRT-PCR kokeita normalisoidaan

GAPDH

ilme.

Seuraavaksi arvioi NSCLC tarvitaan NF-KB varten hyökkäystä käyttäen Transvvell- määrityksiä. Esti NF-KB aktiivisuuden A549.I soluissa lakkautetaan hyökkäyksen kautta matrigeelin verrattuna ohjauslinjat (kuvio 6C). Tätä vaikutusta ei ole cell line erityinen, koska toinen NSCLC ekspressoi SR-IKB (H157.I) osoittivat samanlaisia ​​tuloksia kuin A549.I soluja. Koska tiedot on esitetty kuviossa 6 osoittavat, että NF-KB: n on tarpeen ei-pienisoluisen keuhkosyövän tehdään EMT, testasimme A549.V ja A549.I solujen kykyä etäpesäkkeitä keuhkoissa käyttämällä nude-hiirimallissa. Kuten odotettua, sytokiini-käsiteltyjen A549.I solut eivät muodostamiseksi keuhkometastaaseja (kuvio 6D, vasemmalla). Kyvyttömyys näiden solujen etäpesäkkeitä keuhkoissa ei johtunut menetys solujen elinkelpoisuuden tai kyvyttömyys muodostaa ensisijaisen kasvaimia, koska hoitamaton A549.I muodostettu SC kasvaimia samanlaisia ​​kasvuprosentteja A549.V soluja (kuvio 6D, oikealla). Siten data kuviossa 6 osoittavat, että TNF ja TGFp käsitellään 3D NSCLC kulttuureissa edellyttää NF-KB upregulate päävirtakatkaisimen transkriptiotekijöitä, aiheuttaa EMT, ja edistää invasiivisia ominaisuuksia. Lisäksi ilman NF-KB transkriptionaalisen aktiivisuuden A549-solut menettävät kykynsä etäpesäkkeitä keuhkoissa vaikuttamatta ensisijaisen kasvaimen kasvua.

Discusson

NF-KB säätelee EMT voimistavan metastasointiin NSCLC

käyttöön yksinkertaisen ja suhteellisen nopea 3D-kulttuurin järjestelmä tutkia merkitystä NF-KB: n signaloinnin aikana EMT induktion ja CIC leviämisen rajoittamiseksi NSCLC solulinjoissa. Vastauksena TNF: n ja TGF-altistuminen, A549 sferoidiviljelmiä näytetään menetys E-kadheriini ja kohonnut ilmentyminen mesenkymaalisten markkereita, N-kadheriini, vimentiinin, ja fibronektiinin. Lisääntynyt ilmentyminen mesenkymaalisten proteiinimarkkereita todennäköisesti tapahtuu induktion vuoksi EMT päävirtakatkaisimen transkriptiotekijöitä,

TWIST1

,

SNAI1

,

SNAI2

ja

ZEB2

. Lisäksi pallojakaantuminen populaatiot mesenkymaalisten A549-solut osoittavat kohonneita endogeenistä transkriptiotekijöiden tiedetään vahvistavan erilaistamattomuuden, kuten

Klf4

,

Sox2

,

POU5F1

,

MYCN

ja

KIT

. Mielenkiintoista, mesenkymaaliset A549 solut sferoidiviljelmiä jättänyt tuottavat suuria SC kasvaimia verrattuna 2D kulttuureissa. Tästä huolimatta vaikutus, sytokiini-käsiteltyjen 3D A549-solut oli kohonnut keuhkojen pinta etäpesäkeleesioita. Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että CIC kulkeutuu verenkierron ja etäispesäkkeitä keuhkoihin muodostamatta SC kasvaimia. Olemme lisäksi osoittaneet, että EMT aiheuttama A549 3D kulttuureissa tehokkaasti etäispesäkkeitä keuhkojen rajoittavissa solujen laimennoksia, läsnäolon vahvistamiseksi rikastettua ”varsi-like” CIC väestöstä.