Krooninen sairaus

tiivistelmä

Human näytteille suuria eroja niiden aineenvaihduntaan eroavaisuuksien vuoksi geneettisten tekijöiden, ruokavalio ja elämäntapa. Siksi, jotta voidaan havaita aineenvaihdunnan erot yksilöiden vankka analyyttisiä menetelmiä tarvitaan. Protokolla on tuotettu, joka perustuu käytön Liquid Chromatography- High Resolution Mass Spectrometry (LC-HRMS) yhdessä kohtisuorassa Hydrofiiliset Interaction (HILIC) ja Käänteisfaasi (RP) nestekromatografia analysoinnissa virtsan Metabolomi, joka sitten arvioidaan diagnostiikkatyökaluna eturauhassyöpään (yhteinen mutta hyvin heterogeeninen kunnossa). LC-HRMS menetelmän havaittiin olevan vahva ja oli erinomainen toistettavuus retentioajat ( ± 1%), ja massa tarkkuus ( ± 1 ppm). Perustuen normalisoitu data (vastaan ​​kreatiniinipitoisuus, osmolaalisuus tai MS yhteensä hyödyllisiä signaaleja /MSTUS) yhdistettynä valvotun monimuuttujamenetelmin käyttäen Orthogonal Partial Least Square-Diskriminanttianalyysi (OPLS-DA), pystyimme syrjiä virtsanäytteiden miesten kanssa tai ilman eturauhasen syövän R2Y (cum) 0,9. Lisäksi käyttämällä vastaanotin operaattori ominaisuudet (ROC) testi, pinta-ala (AUC) yhdistelmälle neljän parhaiten karakterisoitu biomarkkereiden yhdisteitä oli 0,896. Neljä biomarkkereiden yhdisteet havaittiin myös eroavat merkittävästi (P ​​ 0,05) välillä riippumaton potilaan kohortin ja valvontaa. Tämä on ensimmäinen kerta, kun tiukka testi on sovellettu tämän tyyppistä mallia. Jos vahvistetaan, vakiintuneita protokolla tarjoaa vankan lähestymistapa, jossa mahdollisesti laaja soveltaminen metaboliitin profiloinnin ihmisten Biofluids terveyden ja sairauden.

Citation: Zhang T, Watson DG, Wang L, Abbas M, Murdoch L, Bashford L, et ai. (2013) soveltaminen Kokonaisvaltainen nestekromatografiaa-High Resolution massaspektrometria Based Virtsan Metabolomiikka eturauhassyövän Detection ja biologisten merkkiaineiden. PLoS ONE 8 (6): e65880. doi: 10,1371 /journal.pone.0065880

Editor: Irina U. Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 tammikuu 2013; Hyväksytty: 29 huhtikuu 2013; Julkaistu: 18 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat tunnustaa Scottish Life Sciences Alliance tukea massaspektrometriaa laitteita. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin syöpä miespuolisesta väestöstä länsimaissa. Eturauhassyöpä on erittäin heterogeeninen erittäin vaihteleva hoitotuloksia: veltto tauti ei yleensä edetä edes monien vuosien aikana aggressiivisia (high grade) tauti etenee usein nopeasti johtaa metastaasien mikä väistämättä johtaa ennenaikaiseen kuolemaan. Lisäksi on merkittävä rajoitus spesifisyys nykykäytäntöä käyttäen seerumia prostataspesifisen antigeenin (PSA) mittaaminen diagnostisena välineenä. Näin ollen on kiireellinen tarve parantaa ja ennustavia testejä eturauhasen syöpä.

Kehittyvät todisteet viittaavat tuloon erittäin monipuolinen metaboliareitit tankkaus karsinogeneesissä [1] siten yksityiskohtainen analyysi kasvainliitteisten Metabolomi voi paljastavat uusien biomarkkereiden [2], [3]. Analyysi virtsa, plasma ja /tai kudosnäytteistä voidaan suorittaa Nuclear Magnetic Resonance (NMR) ja /tai massaspektrometrialla (MS) yhdistettynä erotusmenetelmiä, kuten nestekromatografia (LC), ja /tai kaasukromatografialla (GC). Sreekumar

et al

. suorittaa kohdistamattomia metabolomic profilointi eturauhassyövän käyttäen LC /GC-MS poikki kolme erilaista kliinistä näytettä (virtsa, plasmassa ja kudoksissa). Yli 1000 ominaisuudet havaittiin poikki analysoidut näytteet [4]. Kuuden metaboliitteja ehdotettiin merkiksi suuri riski syövän etenemiseen ja ylimääräisiä isotooppi laimennus GC-MS-analyysi tunnistaa sarkosiini mahdollisena virtsan biomarkkeri aggressiivinen eturauhassyöpä. Ikävä sarkosiini kuten (virtsan tai plasma) biomarkkereiden eturauhasen syöpä ei ole tukenut useita riippumattomia tutkimuksia myöhemmin [5] – [15]. Lisäksi vain kourallinen nämä tutkimukset ovat yrittäneet suorittaa kohdistamattomia metaboliitiksi profilointi [6], [16], [17]. Näissä myöhemmissä tutkimuksissa käyttö GC-MS tai ero liikkuvuuden analyysi (DMA) -ms edellyttäen vieläkin vähäisempää kattavuus aineenvaihduntatuotteiden verrattuna tutkimuksen Sreekumar

et al

[4]. Näin ollen on olemassa todellinen tarve kehittää vankka metodologinen ja analyyttinen alustan helpottaa tulevia toimia globaalissa profilointi Metabolomi eturauhassyövässä biomarkkereiden löytö [18].

Virtsa on joitakin etuja metabolomiikan tutkimuksiin, koska sillä on korkea runsaasti aineenvaihduntatuotteiden, vähän proteiinia, kerätään ei-invasiivisesti ja vaatii vain vähän näytteenvalmistus ennen analyysiä. Äskettäin soveltaminen korkean resoluution (HR) MS perustuu virtsan metabolomiikan on saavuttanut suosiota tutkimuksessa syövän diagnosointiin ja biologisten merkkiaineiden, erityisesti yhdessä erilaisia ​​LC tekniikoita. HRMS arvo on suurempi kattavuus metaboliitteja kuin muut menetelmät ja kyky tunnistaa mahdolliset biomarkkereiden yhdisteistä [19] – [24]. Käyttöönotto Hydrofiilinen Interaction nestekromatografia (HILIC), jossa pitomekanismiin on ortogonaalinen että käänteisfaasi (RP) Liquid Chromatography, tarjoaa sopivalla erotus- alustan monia erittäin polaarisia metaboliitteja virtsassa [25]. Tuoreessa tutkimuksessa virtsarakon ja munuaissyövän biomarkkerit [22], yhdistetty monimuuttujamenetelmin (MVA) ja Orthogonal osittainen pienimmän Square-Diskriminanttianalyysi (OPLS-DA), johon kerättiin RP ja HILIC LC-HRMS osoitti 100% tarkkuuteen erottelevat syöpä ja terveillä koehenkilöillä oikein.

Data normalisointi pidetään keskeisenä mutta unstandardised vaihe ihmisen virtsan analyysi [26]. Principal Component Analysis (PCA) pisteet tontteja voidaan tehdä täysin erilaisia ​​yksinkertaisesti riippuen normalisoinnin menetelmää, ja arvo ehdokas biomarkkereiden voidaan mitätöidä valitsemalla ”väärän” sisäinen komponentti ohjearvon. Signaali /kreatiniinipitoisuuden ja yhteensä ioni nykyinen (TIC) käytetään yleisesti normalisointia tekijöitä LC-HRMS pohjainen virtsametaboliitista profilointi tutkimuksissa [4], [20], [22], [24]. Warrack

et al

käyttöön uuden normalisointi strategiaa, joka perustuu MS Total Hyödyllisiä Signals (MSTUS), joka oli rohkaiseva korrelaatio tietoihin perustuvan normalisoinnin virtsan osmolaalisuus ja suositellaan käyttäen vähintään kahta eri normalisointi menetelmistä varmistaa tilastollisesti merkitsevä muutokset metaboliitteja [27].

protokolla yhdistämällä GC-MS ja LC-MS suorittaa metabolinen profilointi plasma ja seerumi kuvattiin vastikään [28]. Toisin kuin virtsassa ei ole tarpeen normalisoida datan verestä peräisin-näytteet metabolomiikassa tutkimuksissa. Vaikka kattavaa protokollia käyttäen GC-MS ja LC-MS profiloida virtsan Metabolomi on myös raportoitu [29], [30] yksikään niistä ei ole keskusteltu tai verrattuna normalisoinnin menetelmiin kovinkaan paljon. Lisäksi metaboliitin kattavuutta GC-MS rajoittuu välttämättä haihtuvia komponentteja. Yhdistelmä kaksi ortogonaalista LC menetelmää metabolomic profilointia on sovellettu vain ajanjaksolla koska kuvattujen testausmenetelmien viitteet 28 ja 30. Pohjalta meidän aikaisempi työ [25], olemme edelleen optimoineet sekä analyysia putki, ja profiloitu virtsanäytteistä potilailta, joilla eturauhasen syöpä ja valvontaa virtsoista LC-HRMS käyttäen ortogonaalista erotusmenetelmiä. Vaikutus kolmen eri normalisointi menetelmiä data-analyysi osoitti. Käyttämällä tuloksia kliinisissä kokeissa erotteleva kyky metabolomic profiloinnin virtsan nähden eturauhassyövän arvioitiin käyttämällä sekä OPLS-DA malleja ja erityinen biomarkkereita. Tutkimuksen ohjasivat standardit Reporting diagnostisia tarkkuus (Stard) perusteet [31] ja arvioinnin tarkistuslista löytyy (File S1).

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja materiaalit

HPLC grade asetonitriiliä (ACN) ostettiin Fisher Scientific, UK. HPLC-laatuista vettä tuotetaan Direct-Q 3 Ultrapure Water System Millipore, UK. AnalaR laatu muurahaishappoa (98%) saatiin BDH-Merck, UK. Ammoniumkarbonaattia ja ammoniumasetaatin ostettiin Sigma-Aldrich, UK.

Näytteiden kerääminen

Kaikki tutkitut näytteet saatiin sopivilla kirjallisen suostumuksen potilailta. Näytteenottoa hyväksyi institutionaalisten eettisen Review Board (Joint Kiinan University of Hong Kong – New Territories East Cluster Clinical Research eettisen komitean). Potilaisiin liittyvien kliinisten tietojen mukaan lukien eturauhassyöpä muuttujat esitetään taulukossa 1.

Näytteen valmistus

virtsanäytteet säilytettiin -30 ° C: ssa ja sulatettiin huoneenlämmössä ennen valmistelu LC-MS-analyysiä. Analysoitavaksi HILIC olosuhteissa, 200 ui virtsan sekoitettiin perusteellisesti 800 ui asetonitriiliä, mitä seurasi sentrifugointi 3000 kierrosta minuutissa (rpm) 5 minuuttia; 800 ui supernatanttia siirrettiin sitten LC pulloon. Sillä RP olosuhteissa 200 ui virtsan laimennettiin 800 ul: aan vettä LC injektiopullossa. Yhdistetty näyte valmistettiin keräämällä 100 ui virtsan kustakin näytteestä, joka käsiteltiin sitten kuten edellä.

Measurement kreatiniinin ja osmolaliteetti

50 ui laimennettua näytettä ja valmistaa kreatiniinin standardiliuoksia olivat perusteellisesti sekoitetaan 100 ui kreatiniinin detektioreagenssia (Enzo Life Sciences, UK) 96-kuoppalevylle ja absorbanssi luettiin 490 nm: ssä käyttämällä Spectra Max M5 Molecular Devices. Pitoisuudet kreatiniinipitoisuuden testinäytteiden laskettiin käyttäen 7 pisteen kalibrointikäyrää, jossa jokainen piste mitattiin kahtena kappaleena. Kalibroimisen jälkeen standardiliuoksilla (Vitech Scientific Ltd., UK), jäädytys pisteen masennus mittaus jokaiselle näytteelle suoritettiin osmometrillä (Advanced Micro, malli 3300), jotta voidaan määrittää osmolaliteetti.

LC-MS tiedonkeruu

Näytteet sijoitetaan satunnaisesti autosamplerista lokeroon ja LC-MS koe suoritettiin Accela- 600 HPLC-järjestelmä yhdistettynä Exactive (Orbitrap) massaspektrometrillä Thermo Fisher Scientific (Bremen, Saksa). Zic-pHILIC pylväs (150 x 4,6 mm, 5 um) ja myös ACE C18-AR pylväs (150 x 4,6 mm, 5 pm) (Hichrom, Reading UK) oli käytetty HILIC ja RP erotukset vastaavasti. Liikkuvat faasit, joita käytetään HILIC-olosuhteet olivat 20 mM ammoniumkarbonaatti (pH 9,2) ja puhdas ACN Under RP olosuhteissa 0,1% v /v muurahaishappoa vedessä ja 0,1% v /v muurahaishappoa käytettiin liikkuvaa faasia. HILIC ja RP LC Eluointigradientti profiilit ja MS parametrien asetukset kuvattiin edellisessä tutkimuksessa [25]. Valikoiva MS

2 pirstoutuminen mahdollisia biomarkkereita suoritettiin käyttäen Collision aiheuttama dissosiaatio (CID) 35 V käyttäen Surveyor HPLC järjestelmä yhdistettynä LTQ-Orbitrap massaspektrometri Thermo Fisher Scientific (Bremen, Saksa).

LC-MS tietojenkäsittelyä MZMine 2,10 [32]

raakadataa jaettiin yhteen ESI positiivinen ja negatiivinen datajoukko, ja myös muuntaa mzML muodossa käyttäen ProteoWizard. Menettely ja asetuksia kunkin vaiheen käytettävien MZMine 2.10 kuvataan File S2. Tässä strategiassa käyttää datan yhdistettyjen näytteiden suodattaa teknisiä ja jotka eivät liity biologisten poikkeamia datasarjan otettiin käyttöön. Viisi yhdistettyä näytettä valmisteltiin yhdessä testinäytteitä ja ne mitattiin laadunvalvontaa (QCS) määräajoin koko LC-MS kokeilu. Yksi niistä ruiskutettiin kolme kertaa ja loput injektoitiin vain kerran, siis 7 sarjaa QC tiedot hankittiin arvioida järjestelmän vakautta ja tuottaa toistettavuus suodatin. Piirteet ei esitä kaikkien 7 QC aineistoja poistettiin, koska niitä joko aiheuttama vaihtelu näytteen valmistus tai LC-MS-järjestelmä aikana tiedonkeruu. Tämän perusteella suodatetaan piikin listan data yksittäisten testinäytteiden yhtenäistettiin ja kaikki ominaisuudet eivät vastaa kanssa yhdistettyä näytettä huippu lista poistettiin. Ominaisuudet sisällä QC datajoukon sisältyvät vain, jos ne havaitaan 75%: n näytteet. Lopuksi ominaisuuksia suhteellinen keskihajonta (RSD) piikin pinta-ala on vähemmän kuin 25% sisällä QCS käytettiin jatkokäsiteltäväksi.

Normalisation

kreatiniini tai osmolaalisuus normalisoinnin menetelmää, piikin pinta-ala kunkin ominaisuus näytteen skaalattu kreatiniinipitoisuuden tai osmolaalisuus näytteen. Sillä MSTUS menetelmä alla oleva LC kunnossa ja ESI-tilassa, huippu alueilla kaikki ominaisuudet, jotka pysyivät läpi kolme suodattimet tiivistää ja sitten korvattiin niiden prosenttiosuudet kokonaisarvosta.

monimuuttuja /tilastollinen analyysi

SIMCA-P 13 (Umetrics, Ruotsi) käytettiin suorittamaan kaikki MVA. Ennen PCA ja OPLS-DA, data keskiarvokeskitettiin ja yksikkö varianssi (UV) skaalata. Pareto skaalaus kokeiltiin myös, mutta mallien tuottamat hallitsi muutamia ominaisuuksia suuret normalisoidut arvot (esim. Kreatiniini ja dimeerin urean). Niinpä ottaen huomioon, että etsimiseen biomarkkereiden kaikki toiminnot ovat biologisesti yhtäläinen ja että suurin osa melun poistettiin suodattimia, UV skaalaus käytettiin. P-arvot laskettiin kaksi häntää Student

t

testi (Microsoft Office 2010). ROC Testi suoritettiin IBM SPSS Statistics 21.

Tulokset ja keskustelu

LC-HRMS menetelmän arviointi ja validointi

kohdistamattomia metabolomic profilointi perustuu kahdessa kohtisuorassa LC erotusmenetelmiä oli suoritettiin [33] A Žic-pHILIC pylvään liikkuvan faasin kanssa, pH: 9,2, että HILIC menetelmä ja ACE C18-AR pylvästä liikkuvalla faasilla pH on 2,6, että RP menetelmää, jota kutsutaan jäljempänä nimellä ”Žic-pHILIC” ja ” RP ”vastaavasti. Jotta tutkia täydentävät näiden kahden ortogonaalisen LC menetelmistä joitakin standardin aineenvaihduntatuotteita mitattiin yhdessä näytteiden kunkin LC kunnossa. Kuten esitetään edellisessä tutkimuksessa alaniini ja p-alaniini voidaan erottaa alle Zic-pHILIC olosuhteissa [25]. Tässä selkeä erottaminen isomeerien sarkosiini, joka aikaisemmin ehdotettiin eturauhassyöpämerkkiainetta, alaniini ja β-alaniini oli myös saavutettu Zic-pHILIC olosuhteissa, mutta ne kaikki eluoituvat kolonnin kuolleen tilavuuden mukaisesti RP olosuhteissa (kuva S1 ja S2 File S3). LC-HRMS raaka-tietoja käsitellään MZMine 2,10, kuten on kuvattu kokeellisessa osassa. Taulukko 2 esittää useita ominaisuuksia jäljellä jokaisen suodattimen ja niiden prosenttiosuudet perustuu alun perin havaittu ominaisuuksia. Yhdistetty näyte toistettavuus suodatin poistaa tehokkaasti yli 75% havaituista ominaisuuksista, joista useimmat peräisin LC-HRMS järjestelmän ääni ja tausta signaaleja. Numerot ominaisuuksia olivat vähensi hieman läpi 25% puuttuu suodatin, joka poistaa biologisia yhdisteitä, jotka olivat hyvin vaihteleva sisällä näytteitä. Kautta piikin pinta-ala RSD suodatin ominaisuuksia suuri piikin pinta vaihtelut voidaan poistaa. Tällaiset ominaisuudet ovat yleensä alhaisen MS vastauksia tai huono huippuun muotoja. Noin 5200 ominaisuuksia yhteensä selvisi nämä kolme suodatinta ja yhdistettiin yhdessä kokonaisvaltaisen aineisto varten monimuuttuja ja tilastollinen analyysi.

vakaus LC-HRMS järjestelmä varmistettiin vertaamalla tarkka massat (± 3 ppm) ja retentioajat (± 0,5 min) yhdisteiden läsnä virtsassa vastaan ​​aitoja standardeja: 42 ja 51 ominaisuudet on sovitettu standardien Zic-pHILIC olosuhteet ESI positiivinen ja negatiivinen tilat vastaavasti, ja 39 ja 34 ominaisuudet määrättiin alla RP olosuhteissa. Järjestelmän vakaus seurattiin suhteen vaihtelua retentioaika, piikin pinta-ala ja massa tarkkuutta Näiden tunnistettujen aineenvaihduntatuotteiden 7 laadunvalvonnan näytteet alla LC-HRMS kunnossa (File S3). Sen jälkeen MZMine käsittely, useimmat standardin Hyväksytty aineenvaihduntatuotteet läsnä näytteet osoittivat erittäin alhainen RSDs massan tarkkuuden ( 1 ppm) ja retentioaika ( 1%). Vain harvat heistä osoitti suuria vaihteluita piikin pinta-ala ( 25%), koska niiden alhaisen MS vastauksia; Näiden ei ota huomioon 25% RSD suodatin. On kehittänyt tietojen suodatuksen menetelmät nämä suodattimet sitten levitetään tietoja 30 potilasta ja 30 kontrollinäytteitä. Piirteet jälkeen jäljellä soveltamalla Sitten suodattimet jatkokäsitellään.

Normalisation ja monimuuttuja /tilastollinen analyysi

Tällä hetkellä ei ole yksimielisyyttä normalisoinnin menetelmää (t) virtsassa metabolomiikan tutkimuksissa. Käytimme kolme riippumatonta normalisointi menetelmiä ja vastaava PCA pisteet käyrää kuvassa 1. Kun otetaan huomioon monimuotoisuus elämäntapa välillä aiheita, valvomattoman MVA ei erotellut näytteet syövän ja kontrolliryhmiin. Lisäksi niillä ei ole samankaltaisuutta voitaisiin havaittu kuvio rakenteiden mikä näkyy täysin eri suuntiin ja etäisyydet (vektorit), joka perustuu yhteen näytteeseen (muotoinen kuin timantti) viitataan kolmeen muut näytteet (muotoiltu 4 pisteen tähden, 5-piste tähden ja käännetyn kolmion) kussakin rakenteessa. Summa ensimmäisen ja toisen pääkomponenttien on alle 30% kunkin mallin heijastaa huono korrelaatio muuttujien (piirteet) on aineisto. Mikä tärkeintä, kaikissa neljässä PCA malleissa 7 QC ominaisuuksista (vihreä) ovat lähellä toisiaan klusterin keskellä kuvio, joka edelleen varmistaa erinomainen järjestelmän vakautta kaikkialla. Valvottuna MVA menetelmä, OPLS-DA pystyi erillisen tutkimuksen ryhmiin ennalta biologisiin kriteereihin [22], [34]. Tässä tutkimuksessa kuvattua testiä 5 syöpäpotilailla myös 3 varhaisessa vaiheessa (T1N0M0) ja 5 valvonta otettiin pois jokaisesta ryhmästä kantavassa OPLS-DA mallit ovat muodostuneet käyttämällä loput 25 eturauhassyöpä ja kontrollinäytteitä koulutus asettaa tietojen avulla normalisoitiin käyttäen kolmea eri normalisointi menetelmiä ja YK-normalisoitu data. Kuvio 2 esittää syrjintä koulutuksen asetettu ja ennustaminen koepaketin saadaan soveltamalla OPLC-DA YK-normalisoitu data ja datan normalisoitu kolmella eri menetelmällä. Hyvin selkeä erottamiset kaksi ryhmää saavutettiin koulutukseen asetettu mallit generoidaan seuraavan datan normalisoinnin kreatiniinin ja MSTUS. Vain yksi syövän ja yksi kontrollinäyte ylittäneet rajaviiva mallissa generoidaan osmolaliteetista menetelmällä ja raakadatan. Arvo R2Y (cum), mikä selittää syrjivä voima OPLS-DA malli, on enemmän kuin 0,9 kreatiniinin ja MSTUS normalisointi ja 0,8 osmolaliteetti normalisointia, mutta alle 0,7 un-normalisoitu data. Arvo Q2Y (cum), joka lasketaan 7-kansion ristivalidointi ja pystyy osoittamaan ennusteita mallin, on noin 0,3 kaikki menetelmät. Vaikka tämä arvo ei ole yhtä suuri kuin odotettu ( 0,5) kaikkien näytteiden testissä, olivat ennusti oikein kaikkien kolmen normalisointia menetelmiä, paitsi yksi MSTUS mallia. On mielenkiintoista huomata, että toisin kuin PCA mallintaa OPLS-DA malleja eri normalisointikertoimia osoittavat samanlaista mallia rakenteisiin ja tämä jopa tapauksessa normalisoimattoman data. Vektorit samasta näytteestä muut kolme ovat hyvin samankaltaisia ​​kaikissa OPLS-DA mallin (kuvio 2). Edellä esitetyn perusteella havaintojen näyttää siltä, ​​että normalisointi strategia vaikuttaa suuresti lopputulokseen valvomattoman MVA mutta ei valvottu. Kuitenkin poistamalla poikkeama metaboliittipitoisuus käyttöön virtsan tilavuuden vaihtelu, normalisointi parantaa suorituskykyä valvotun MVA. Arvo Variable merkitys Projection (VIP) osoittaa vaikuttavuuskerroin muuttujan malliin. Yleensä muuttuva pidetään tärkeänä mallin jos sen VIP arvo on 1. Kaiken kaikkiaan 406 ainutlaatuisia ominaisuuksia VIP arvot 2 valittiin kaikista kolmesta OPLS-DA malleja. Todettiin, että 76 olivat yleisiä kaikissa kolmessa mallissa, 89 oli kahden malleja ja 241 olivat vain yhtä mallia (Kuva S1 File S4). Ne ominaisuudet yleinen kolme mallia osoitti korkein keskimääräinen VIP-arvot verrattuna niitä yhteisiä kahdessa tai vain yksi malli, ja niihin sisältyi 80% top 10 ominaisuuksia VIP arvo kustakin mallista ja loput 20% voisi löytyä ryhmä, joka oli yleinen kaksi mallia. Suosittelema Warrack

et al

[27], jotta varmistetaan luotettavuuden biomarkkerit keskityimme VIP ominaisuuksia, jotka olivat yleisiä kolmessa normalisointi menetelmiä. Tämä ryhmä sisältyy monia ominaisuuksia, jotka osoittivat samaa m /z-arvot eri LC-olosuhteet tai havaittiin sekä positiivisia että negatiivisia ioni tiloja sama retentioaika. Tämä havainto viittaa siihen, että nämä ominaisuudet voitaisiin valita yhden aineenvaihduntatuotteita, jotka tekisivät niistä luotettavampia kuin aito biomarkkereita. Parittomia Student

t

ja ROC suoritettiin Näiden ominaisuuksien kaikissa näytteissä, ja laskennallinen P-arvot ja ala (AUC) on saatu ROC on esitetty taulukossa S1 File S4. Odotetusti ne kaikki osoittivat korkeaa AUC ( 0,63) ja matalan P-arvot ( 0,05) ja niiden väliset suhteet syövän ja ohjaus näytteet ovat myös hyvin samankaltaisia ​​keskenään eri LC-HRMS olosuhteissa erilaisilla normalisointi menetelmiä, jotka tukevat luotettavuutta tuloksiin. Joitakin muita ominaisuuksia voidaan myös pitää mahdollisena biomarkkereita vuoksi merkittäviä tilastollisia tuloksia, vaikka ne olivat vain läsnä yhdessä LC-HRMS kunnossa. Erotteluärsykeominaisuuksiin kyky sarkosiinimetyylieste- eturauhassyövän arvioitiin myös (taulukko S1 File S3); sopusoinnussa useissa aiemmissa raporteissa, löysimme ei merkittävää eroa sarkosiini tason syövän ja kontrolliryhmien [6], [8] – [10], [12], [15].

Syöpä aiheet ovat merkitty punaisella, hallitsee sininen ja QCS vihreänä. Vektorin timantti 5-pisteen tähden on merkitty mustalla, 4-pisteen tähden vihreä ja käännetyn kolmion violetti. (A-C) Normalisation kreatiniinin, MSTUS ja osmolaliteetti vastaavasti. (D) raakadataa ilman normalisointi.

Syöpä aiheita on muotoiltu neliöt ja valvontaa kuin piireissä. Harjoitussarjassa on merkitty täynnä punaisia ​​ja testi asetettu ontoksi sininen. Neljä valitut aiheet ja vektorit ovat samanmuotoinen ja värillinen kuten kuvassa 1.

tunnistaminen mahdollisen biomarkkereiden paneeli

Kaikki ominaisuudet käytetyt MVA etsittiin täsmällisen massan kanssa 3 ppm toleranssialueen vastaan ​​in-house metaboliitin kirjasto [25]. 1673 ja 1159 ominaisuuksia on oletettavasti tunnistettiin aineenvaihduntatuotteiden tai niihin liittyvien signaalien alle Zic-pHILIC ja RP olosuhteissa vastaavasti. Tunnistaminen tulokset Excel-muodossa voi ladata nettisivuiltamme: https://www.metabolomics.strath.ac.uk ja ihmiset haluavat tiedostojen jakamiseen raakadataa ovat tervetulleita ottamaan yhteyttä meihin. Biomarkkerit File S4 onnistuneesti siirretty aito aineenvaihduntatuotteita, mutta jotkut niistä useita isomeerejä. Jotta viimeistellä identiteettiä biomarkkerit MS

2 koe suoritettiin. Ominaisuus mainittu taulukossa S1 File S4 (145,062 m /z ESI negatiivinen ja 147,076 m /z ESI positiivinen moodi) on valittu kaavan C

5 H

10N

2O

3 massa virhe alle 1 ppm. Kolme isomeerit voidaan osoittaa tämän kaava HMDB. Nämä ovat glutamiini, ureido isovoihappoa ja alanyyli. Kuten voidaan jo nähdä kuviosta 3A mielenkiintoinen piirre viittaa Peak B puretut ioni kromatogrammit. MS

2 analyysiä Peaks A ja C oli sama fragmentaatiomalli joka voidaan selittää kuten kuvassa 3B ja tunnistettiin glutamiini vertaamalla tavallisella MS /MS-spektri on HMDB. Peak B osoitti täysin eri fragmentaatiomalli ja vastaa ureido isovoihappo tulkinnasta MS

2 spektrit. Ei vakio MS /MS-spektri löydy mistään julkiseen tietokantaan. Sirpaloitumistestin näyttää ohjannut ureido molekyylissä (kuvio 3B). Koska vapaan amiiniryhmän vähentää napaisuus molekyylin, joka selittää vastakkaiseen Eluutiojärjestys kuin glutamiini alle kahdessa kohtisuorassa LC-olosuhteet (kuvio 3A). Lopulta tarkistamalla raakadataa Peak A tunnistettiin johtuvan in lähdekoodin fragmentti alfa-N-fenyyliasetyyli-L-glutamiinia, joka on erittäin runsas osa ihmisen virtsasta. Alanyyli voisi vastata pieni huippu ennen ja jälkeen Peak B alle Zic-pHILIC ja RP olosuhteissa vastaavasti. Kuitenkin sen signaali jäsenvaltioiden tasolla 1 oli liian heikko saada luotettavaa MS

2 pirstoutumista. Lopullinen potentiaali biomarkkereita ja identiteettinsä, kuten MS

2 pirstoutuminen tiedot, esitetään File S5. Enemmän mahdollisia biomarkkerit havaittiin alle Zic-pHILIC olosuhteissa kuin alla RP olosuhteissa. Oli mielenkiintoista huomata, että joitakin biomarkkereita tunnistettu elintarvikkeista esim stachydrine ja 3-hydroxystachydrine. Niiden luotettavuus /aitouden biomarkkereina luonnollisesti epäiltiin.

Extracted ioni kromatogrammit alle 4 eri LC-HRMS olosuhteissa (A) ja tulkintaa niiden MS

2 sirpaloitumista (B).

meidän kirjallisuuskatsauksen syövän diagnoosin metabolomiikan tutkimuksia ei arvioitu erotteleva kyky ehdotettujen biomarkkereiden yhdessä paperin testaamalla näytteitä kerättiin täysin riippumatta alkuperäisen tutkimuksen. Suoritimme analyysin virtsanäytteiden saatu 30 ylimääräistä eturauhassyöpäpotilaalla ja verrattiin data vastaan ​​ohjaus analysoitujen näytteiden aikaisemmin. Perustuen optimaalisen menetelmän edellä mainitut nämä 60 näytettä vertailtiin ainoastaan ​​Zic-pHILIC olosuhteet ja tulokset normalisoitiin vastaan ​​kreatiniinipitoisuus. Verrattaessa valvonnan ja itsenäisesti kerättyjen eturauhassyöpänäytteissä 14 ulos 33 biomarkkereiden olivat alle 0,05 P-kynnysarvo lukien ureido isovoihappo joka oli lähes identtinen tilastollisten tulosten sekä ES1 positiiviset ja negatiiviset tilat (taulukko 3). Jotkut elintarvikkeita metaboliitit eivät osoittaneet merkitsevää eroa syövän ja terveiden ryhmiä. Neljä 14 validoitu biomarkkereita tunnistettiin luottamusta ureido isovoihappoa, indolylacryloyglycine, acetylvanilalinine ja 2-oksoglutaraatiksi joita kaikkia ei ole raportoitu edellisessä metaboliitin profilointi tutkimuksissa eturauhasen syöpä.

Perustuen yhteensä 90 koehenkilöä (60 syöpä vs 30 ohjaa) diagnostiset tehoa eturauhassyövän arvioitiin ROC testi kullekin sekä niiden yhteenlaskettu teho. Piikin pinta-ala oli UV skaalata ja jos taso biomarkkereiden oli suurempi syövän ryhmässä kuin terveet ryhmässä, se katsottaisiin myönteinen vaikutus ja alemmat kuin negatiivinen vaikutus. Syntyvä AUC-arvo yhdistettyyn biomarkkereita oli 0,896 ja herkkyys ja tarkkuus paranivat myös parhaaseen rajakohta verrattuna muihin yhden biomarkkerit (Kuva 4. diagnostinen teho voitaisiin parantaa edelleen ottamalla mukaan enemmän yhdellä biomarkkerit mutta koska niiden otaksuttu tunnistaminen ne eivät sisälly yhdistelmä. Kaiken käyttö yhdistetyn biomarkkereiden paneeli on verrattavissa käyttöön PSA-testaus (AUC 0,94). Kun tulevaisuudessa hienosäätö, niin paneeli voi olla kliinistä käyttöä joko yksin tai yhdessä PSA itse. Koska määrän rajoittamisen aiheita mitattuna tässä tutkimuksessa ja epävarmuus merkityksen muutamia merkittäviä biomarkkereita valittu yli tuhat ominaisuuksia, edelleen validointi paneelin ja erityinen biomarkkereita tehdään enemmän aiheita ja tiedot ovat julkisesti saatavilla sivuillamme: https://www.metabolomics.strath.ac.uk.

neljä tunnistettu biomarkkerit eivät liity ilmeisellä tavalla, vaikka erikseen ne ovat jonkin verran mielenkiintoinen biokemiallisia tausta biomarkkerit muita sairauksia. Ureidoisobutyric happo (UIBA) on vakiintunut merkkeihin virtsassa synnynnäinen virhe aineenvaihdunnan vuoksi ureidopropionase puute jossa sen tasot ovat koholla [35]. Kyseisessä tapauksessa sen taso on pienempi potilailla, joilla on eturauhasen syöpä. UIBA on metaboliitti DNA base tymidiinin. UIBA on myös DNA: n hajoamistuote on peräisin hapettumista tymidiiniä ja tällaisten vahingoittuneet emäkset poistetaan DNA korjaus entsyymi DNA-glykosylaasi [36] – [38]. Jättäminen poistaa tällaisia ​​jäämiä voi johtaa mutaatioiden aikana muodostuneen replikoinnin väärän -emäspariutumisen vahingoittuneeseen alueeseen. Alhaisempi UIBA saattaisi viitata alennettua Leikkauskorjauksessa.

Indoylacroylglycine (IAG) on ehdotettu merkkiaineena autismi lapsilla. Sen alkuperä on epäselvä, vaikka on ehdotettu, että se on valmistettu metabolisen transformaation tryptofaanin suolen mikroflooran. Kuitenkin on todettu, että sen tasot vaihtelevat ihmisen virtsassa mukaan aikaan vuodesta ja suurina määrinä se voi koskea lisääntynyt altistuminen UV-valossa. Tässä suhteessa se on analoginen urokaanihappo, joka on tuotettu histidiini vastauksena UV-säteilylle [39].

N-acetylvanilalinine (AVA) on seurattu virtsassa havaitsemiseen harvinainen synnynnäinen aineenvaihduntahäiriö johtuen aromaattisen aminohapon dekarboksylaasin (AAD) puute [40]. Ryhmässä biomarkkereita esitetty taulukossa 3 on tunnistamaton merkki (268,083 m /z, negatiivinen asetus), joka kuten AVA on erittäin koholla eturauhassyöpäpotilailla. Tämä merkki eroaa alkuainekoostumuksen yhden happiatomin päässä AVA viittaa kävisi hydroksyloitu AVA.

Johtopäätökset

Nykyinen tutkimus on perustanut yksinkertainen vankka protokolla seulonnassa virtsan biomarkkereiden käyttämällä ortogonaalisia LC menetelmiä yhdessä HRMS. Tietojen louhinta protokolla perustuu MZmine perustettiin poistaa tekniset ja biologisesti liittyvän muunnelmia. Kehitetyn menetelmän soveltaminen onnistuneesti suorittaa alustavan tutkimuksen virtsan metabolomiikan diagnosoimiseksi eturauhassyövän ja biomarkkereiden löytö. Verrattuna aiempien tutkimusten paljon kattavampi aineenvaihduntatuote profiloinnin saavutettiin käyttämällä kahdessa kohtisuorassa LC menetelmiä ja HRMS joka tarjosi enemmän mahdollisuuksia löytää lisää potentiaalisia biomarkkereita.