Krooninen sairaus

tiivistelmä

kehittää uusia hoitomuotoja kehitettäessä on tullut tärkeä tutkimuksen painopiste keuhkosyövän hoitoon. Aikaisemmat tutkimus on osoittanut leptomycin B (LMB) esti merkittävästi proliferaatiota keuhkosyöpäsoluissa; kuitenkin, p53 villityypin keuhkosyöpään solut olivat resistenttejä LMB. Siksi Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää ja arvioida uusi hoitostrategia herkistää LMB kestävät keuhkosyöpään solujen yhdistämällä LMB ja doksorubisiinin (DOX). Joukossa eri hoitoyhdistelmien esikäsittely DOX (pre-DOX) ja seuraava käsittely LMB A549-soluihin vähensi 50% estävä pitoisuus (IC50) verrattuna, että LMB yksinään (4,4 nM

vs.

10.6 nM,

P

0,05). Analyysi solukierron ja apoptoosin virtaussytometrialla edelleen vahvisti sytotoksinen tiedot. Tutkia molekyylitason mekanismeja tämän lääkkeen yhdistelmää vaikutuksia, p53 reittejä analysoitiin Western blot, ja ydinvoiman proteomia arvioitiin kaksiulotteinen-ero geelielektroforeesilla (2D-DIGE) ja massaspektrometrialla. Verrattuna kontrolliryhmiin, tasot p53, fosfo-p53 (ser15), ja p21 proteiinit huomattavasti samalla fosfo-p53 (Thr55) ja surviviinin oli merkittävästi vähentynyt käsittelyjen jälkeen pre-DOX ja LMB (

P

0,05). 2D-DIGE /MS-analyysi havainnut, että sequestosome 1 (SQSTM1 /p62) oli merkittävä kasvu pre-DOX ja LMB-käsitellyt solut (

P

0,05). Yhteenvetona tulokset viittaavat siihen, että lääkeresistenttiä keuhkosyöpään solujen p53 villityypin voitaisiin herkistynyt solukuolemaan säännöllisillä yhdistelmähoidon DOX ja LMB kautta aktivoimalla ja palauttaminen p53 sekä mahdollisesti muita signalointireitin (t), joihin liittyy sequestosome 1.

Citation: Lu C, Shao C, Cobos E, Singh KP, Gao W (2012) Kemoterapia herkistyminen Leptomycin B Kestää Keuhkosyöpä solut esikäsittelemällä doksorubisiinin. PLoS ONE 7 (3): e32895. doi: 10,1371 /journal.pone.0032895

Editor: Ashraf B. Abdel-Naim, Farmasian tiedekunta, Ain Shams University, Egypti

vastaanotettu: 13 joulukuu 2011; Hyväksytty: 07 helmikuu 2012; Julkaistu: 07 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Lu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on edelleen suurin syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti ja Yhdysvalloissa [1]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on edelleen vallitseva muoto keuhkosyöpä (noin 85% kaikista keuhkosyövässä), joista keuhkoadenokarsinooma (AC) on yleisin histologinen alatyyppi kaikkien sukupuolten ja rotujen yhdistetty [2]. Ennuste keuhkosyöpään on erittäin huono, jossa on 5 vuoden pysyvyys on alle 15% Yhdysvalloissa. Kemoterapia on edelleen yleisin hoito pidentää elinaikaa ja parantaa elämänlaatua [3], [4], [5], [6].

Syöpä kemoterapiaa on käytetty menestyksekkäästi monissa eri tilanteissa, joissa maligniteetit, mutta sen tehokkuus on usein rajoittaa lääkeresistenssin ja sivuvaikutukset [7]. Therapies keskittymällä tiettyihin molekyyli (t) /reitin (s) on mahdollista voittaa nämä rajoitukset [7]. Leptomycin B (LMB) ja /tai sen johdannaisia, jotka voivat tehokkaasti estää ydinaseiden vientiin erityisesti estämällä kromosomin alueen kunnossapito 1 (CRM1), on tunnustettu uuden luokan syöpähoitojen [8], [9], [10], [11], [12]. CRM1, parhaiten karakterisoitu tumasta reseptori, on keskeinen rooli kanoninen tumasta signaali (NES) -riippuvaista tumasta, kuten suuret tuumorisuppressorin proteiinit (tsps), kuten p53, FOXO, pRB, p21, p27, jne., Kuten sekä estäjä NF-KB: n, eli I-KB: n [9], [13]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet, että CRM1 ilmentyy huomattavasti korkeammalla tasolla kohdunkaulan syövän verrattuna normaaliin kudokseen [14] ja voisi toimia ennustetekijä munasarjasyöpä [15] ja osteosarkooma [16]. Hiljattain julkaistu

in vitro

tutkimukset normaaleilla keuhkojen epiteelisolujen [17] ja bitransgenic hiirimallissa [18] ovat esittäneet, että CRM1 on ratkaiseva rooli keuhkosyövän kehittämiseen. Lisäksi, CRM1 oli yli-ilmentynyt tupakan karsinogeeni aiheuttaman keuhkotulehduksen AC hiirimallissa, ja ihmisen keuhkojen AC (julkaisematon data). Nämä havainnot viittaavat siihen CRM1 voisi toimia molekyylikohteessa syövän hoitoon, mukaan lukien keuhkosyöpä.

LMB on erittäin spesifinen ja voimakas estäjä CRM1 toiminto peruuttamattomasti sitomiseksi sulfhydryyliryhmän of Cys-tähteen lähellä tai sisällä lastin sitova domeeni CRM1 (alkyloidaan Cys 528) [19], [20]. Näin ollen, LMB voisi estää sytoplasmisen sijainnin ja moduloivat syöpää tiettyjä reittejä pitkin, kuten inaktivaatio tärkeää tuumorisuppressorien kuten p53 [10]. Viimeaikaiset tutkimus osoitti, että keuhkojen AC A549 (p53 villityyppi) oli resistentti LMB kuin muut solulinjat kanssa p53 mutantti tai null [12]. On hyvin tunnettua, että p53: lla on tärkeä rooli genomista vakauden, solusyklin pysähtymisen, apoptoosin, DNA: n korjaukseen, ja vanhenemista. Tutkimukset ovat osoittaneet, että toiminnot villityypin p53 solujen kasvun pysähtymisen ja DNA korjaus voi lisätä vastustuskykyä radio- tai kemo- terapeuttisia aineita; se on myös altis voimistavan apoptoosin vastauksena vakaviin DNA vaurioita [21], [22], [23]. Siksi herkistää keuhkosyöpä solun kemoterapeuttisen vaikutuksen LMB, me tässä ehdottaa terapeuttista strategiaa, jossa yhdistetään LMB muiden lääkeaineiden aiheuttaen vakavia DNA-vaurioita ja p53 aktivaation joka voisi lopulta johtaa lisääntyneeseen p53 in apoptoosin eikä DNA: n korjaukseen. Doksorubisiini (DOX) on laajasti käytetty kemoterapeuttinen aine, joka indusoi apoptoosia erilaisissa syöpäsoluissa aktivoimalla p53. Sitä on käytetty hoidettaessa erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia. Kuitenkin lääkeresistenssin DOX sisältävä hoito on suuri ongelma, joka estää paremman vasteen hinnat ja kovettuu ja kardiotoksisia sivuvaikutuksia on raportoitu syöpäpotilailla hoidettu DOX [24], [25], [26]. Yksittäiset hoidot DOX johti voimakasta vastustusta monissa syövän solulinjoissa kuten A549, johtuu useista mekanismeista myös huumeiden biosaatavuus [27], [28] tai NF-KB [29]. Jos DOX yhdistetään muihin kemoterapia-lääkkeet, pienempiä annoksia voidaan käyttää paitsi vähentää sivuvaikutuksia, mutta myös lisätä tehokkuutta [30].

Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet palata lääkeresistenssin DOX ja /tai LMB A549-soluihin eri hoito-of co-hoito DOX ja LMB, sekä arvioida niiden mahdollisia molekyylitason mekanismeja. Olemme havainneet, että esikäsittely DOX kanssa jatkokäsittelyä LMB herkistynyt lääkeaineille A549-solujen kemoterapeuttisen vaikutuksen LMB. Nämä muutokset voivat aiheutua ensimmäisen aktivoinnin p53 DOX hoitoon ja näin ollen CRM1 toiminto esto LMB käsittely kerääntyä aktivoida p53 ydinvoima osastoon. Lisäksi signalointipolkujen mukana muita molekyylejä kuin p53 voisi myös tärkeä rooli edistämisessä terapeuttisia vaikutuksia yhdistetyn hoidon DOX ja LMB.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

doksorubisiini (DOX) ja dimetyylisulfoksidi (DMSO) hankittiin Sigma-Aldrich Co. LLC, St. Louis, MO. LMB (1 mmol) hankittiin LC Labs, Woburn, MA. Varastot DOX (10 mg /ml) ja LMB laimennettiin vaadittuun pitoisuuteen välittömästi ennen käyttöä kasvualustojen. 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) hankittiin USB Corporation. RPMI-1640-väliaine, penisilliiniä /streptomysiiniä, ja naudan sikiön seerumia (FBS) hankittiin Thermo tieteellisen, Logan, UT. Primaarisilla vasta-aineilla, mukaan lukien p53, fosfo-p53 (Ser15), fosfo-p53 (Thr55), p21, sequestosome 1 (SQSTM1 /P62), ja surviviini, ostettiin Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA Ensisijainen kanin polyklonaalista anti-α-tubuliinin hankittiin Abcam, Cambridge, MA. (HRP) konjugoitua aasin anti-kani-IgG: tä ja tehostetun kemiluminesenssin (ECL) pakkaus ostettiin GE Healthcare, Piscataway, NJ. Radioimmunosaostuskokeella (RIPA) hajotuspuskuria ostettiin Santa Cruz Biotechnology.

Solut ja Cell Culture

Ihmisen keuhkoadenokarsinooma epiteelisolulinjaa A549 ja NCI-H358 hankittiin American Type Culture Collection (ATCC ). Soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 50 U /ml penisilliiniä ja 50 mg /ml streptomysiiniä. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kosteutetussa inkubaattorissa, jossa 95% ilmaa ja 5% CO

2 tilavuudesta. Soluja aliviljeltiin tai päällystetty myöhempää käsittelyä, kunnes ne lähestyivät noin 80% konfluenssin.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen MTT-määritystä kuten aiemmin on kuvattu [17]. Lyhyesti, solut maljattiin 5 x 10

3 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille. Perustuen sytotoksisuutta DOX tai LMB tässä tutkimuksessa havaitut ja aiemmissa raporteissa [9], [12], [26], [31], [32], [33], 0,5 nM LMB tai 0,5pM DOX valittiin co -käsittelyä tai esikäsittelyä. Soluja käsiteltiin seuraavasti: 1) DOX yksinään (0-5 uM) 24 ja 48 h; 2) LMB yksin (0-10 nM) 24 ja 48 tuntia; 3) co-hoidossa 0,5 nM LMB ja DOX (0-5 uM) samanaikaisesti (DOX + LMB (0,5 nM)) 24 ja 48 tuntia; 4) co-hoidossa 0,5 uM DOX ja LMB (0-10 nM) samanaikaisesti (LMB + DOX (0,5 uM)) 24 ja 48 tuntia; 5) esikäsittely 0,5 nM LMB 24 h (pre-LMB) ja myöhemmät DOX (0-5 uM) 48 tunnin ajan (pre-LMB + DOX); ja 6) esikäsittely 0,5pM DOX 24 h (pre-DOX) ja myöhemmät LMB (0-5 nM) 48 h (pre-DOX + LMB). Etanoli (EtOH, 0,1%) käytettiin ajoneuvon ohjaus LMB. Kolme tuntia ennen jokaisen aikapisteen, 15 ui MTT: tä (10 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 37 ° C: ssa. Kullakin ajanhetkellä, jolloin violetti saostuma oli selvästi nähtävissä mikroskoopilla, 100 ui 100% DMSO: ta lisättiin kaikkiin kuoppiin, ja solujen elinkelpoisuus määritettiin mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 570 nm (viite aallonpituus = 630 nm) käyttäen SpectraMax Plus Spectro- fotometri (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Kuusi rinnakkaista kussakin pitoisuudessa ja aikapisteessä analysoitiin. Kokeet suoritettiin itsenäisesti kolmena kappaleena. Ajoneuvo-käsiteltyihin kontrolleihin ja aihioita inkuboitiin samalle levylle samoissa olosuhteissa. Fractional absorbanssi laskettiin käyttämällä seuraavaa kaavaa:% solujen elävyyttä = keskimääräinen absorbanssi koestussyvennyksiin /absorbanssien keskiarvo kontrollikuopissa × 100.

analyysi Cell Cycle ja apoptoosi virtaussytometrialla

Cells ensin annetaan esikäsittely 0,5 uM DOX 24 tuntia ja sitten käsiteltiin LMB ylimääräisiä 48 tuntia. Näin ollen, solut kerättiin sen jälkeen, kun yhteensä 72 h hoidon jälkeen. Joka perustuu solunelinkykyisyysmääritys, yhteensä 6 ryhmää A549-soluja, joilla on erilaiset hoidot analysoitiin, kuten valvonta, 0,5 uM DOX (pre-DOX), 1 nM LMB (LMB1), pre-DOX ja 1 nM LMB (pre- DOX + LMB1), 5 nM LMB (LMB5), ja pre-DOX ja 5 nM LMB (pre-DOX + LMB5). Solusyklin analyysi, yhteensä 2 x 10

5 solua kustakin hoitoryhmässä kerättiin ja kiinnitettiin 70% etanolilla yli 24 tuntia 4 ° C: ssa. Solut värjättiin Guava Cell Cycle Reagent (Millipore) ja ajettiin Guava EasyCyte ™ Flow Cytometer (Millipore). Yhteensä 5 x 10

3 tapahtumaa laskettiin, ja solujen prosenttiosuus pre-G1, G0 /G1, S ja G2 /M-vaiheisiin solusyklin määritettiin käyttäen GuavaSoft ohjelmistoa (Millipore). Apoptoosin analyysi, ViaCount määritys suoritettiin määrittämään elinkelpoisia ja kuolleita soluja. Lyhyesti, solususpensiota (5 x 10

5 solua /ml), sekoitettiin guava ViaCount reagenssia (Millipore), ja seosta inkuboitiin huoneen lämpötilassa 5 minuutin värjäämään soluja. Värjätyt solu- näytteet ajettiin guava EasyCyte ™ -virtaussytometrillä (Millipore). Kaikkiaan 5 x 10

3 tapahtumaa laskettiin ja tiedot hankittiin käyttäen Guava ViaCount ohjelmistoa (Millipore). Kukin näyte ajettiin kolmena kappaleena, ja jokainen koe toistettiin kolme kertaa.

Western Blot

Sama 6 hoitoryhmään A549-soluja, kuten on kuvattu virtaussytometrialla analysoitiin Western blot. Solut kussakin ryhmässä lyysattiin RIPA-lyysipuskuria jäissä. Lysaatit sonikoitiin ja sentrifugoitiin sitten 13000 x g: ssä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa supernatantti otetaan talteen. Proteiinikonsentraatiot mitattiin käyttäen Bio-Rad Bradford-proteiinin määrityksen. Yhteensä 30 ug proteiinia per näyte erotettiin 12% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja siirrettiin sitten polyvinylideenifluoridia (PVDF). Immobilisoidun proteiinit inkuboitiin sitten yön yli 4 ° C: ssa estopuskurilla, joka sisälsi 3% rasvatonta kuivamaitoa 1 x fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) ja 0,1% Tween 20 (1 x PBST). Blokkauksen jälkeen membraanit tutkittiin primaarisen vasta-aineen 1 tunti. Vasta-aineen sitoutuminen detektoitiin aasin anti-kani-lgG-HRP laimennoksella 1:1,000 1 h huoneen lämpötilassa. Kun lyhyt inkuboitu ECL, signaalien kalvot altistettiin röntgenfilmeille (Fujifilm Corporation, Tokio). Suhteellinen densitometrinen digitaalinen analyysi Proteiinivyöhykkeet määritettiin käyttäen Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad) ja normalisoitu intensiteetti housekeeping-geeni (α-Tubulin, 1:10,000 laimennos) kunkin näytteen.

vaikutukset DOX ja LMB on Nuclear Protein Profile

vaikutusten arvioimiseksi DOX ja LMB proteiineja paitsi ne, jotka ovat p53-reitin, geeli-pohjainen proteomic lähestymistapa, kaksiulotteinen-ero geelielektroforeesilla (2D-DIGE), oli ensimmäinen suoritetaan tutkia ydinvoiman proteiiniprofiileja jälkeen LMB hoidon. Proteiinitäplät osoittavat suuria muutoksia tunnistettiin nestekromatografialla massaspektrometriaa (LC /MS /MS) ja vahvistettiin Western blot. Muutokset proteiini (t) on edelleen arvioitiin solujen yhteenlaskettu hoitoon DOX ja LMB Western blotilla.

Nuclear Protein Extraction.

proteomiikka-analyysi, ydin- proteiinit uutettiin jälkeen protokollat kuvanneet Lu

et al

[34]. Lyhyesti, jotka perustuvat edellisessä tutkimuksessa [12], A549 tai NCI-H358-soluissa, vehikkeliä ohjaus (0,1% EtOH) tai 20 nM LMB 24 h (kahtena), huuhdeltiin jääkylmällä PBS, korjattu, ja suspendoitiin jääkylmään puskuri A, joka sisälsi 10 mM tris-HCI (pH: 7,4, Bio-Rad), 8 M urea (Bio-Rad), 4% (w /v) 3 – [(3-kolamidopropyyli) dimetyyliammonio] -1-propaanisulfonaattia (CHAPS, Bio-Rad), 0,5 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA, Bio-Rad), 2,5 mM MgCl

2 (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ), 0,5 mM PMSF (Santa Cruz Biotechnology), 1 × proteaasiestäjäseostabletit (Roche, Basel, Sveitsi), ja 1% (v /v) NP-40 (USB Corporation, Cleveland, OH). Seos homogenoitiin 21-gaugen neula, ja sen jälkeen sentrifugoimalla homogenaatti 700 x g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa saostamiseksi ytimiä. Sytoplasmisen uutteet supernatantit kerättiin ja pelletit suspensoitiin uudelleen 1 ml: aan jääkylmää puskuria B (20 mM tris-HCl, pH 8,5 ja 1 x proteaasi-inhibiittoriseosta), sonikoitiin jäillä, ja sekoitettiin 0,737 g ureaa, 0,267 g tioureaa, ja 0,07 g (w /v) CHAPS. Kun oli inkuboitu jäissä 1 tunnin ajan, supernatantit sisältävät tumauutteet kerättiin sentrifugoimalla 100.000 x g 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Proteiinipitoisuudet mitattiin Bradfordin menetelmällä (Bio-Rad). Laatu ydin- louhinta määritettiin, ja tunnistettu proteiini vahvistettiin Western blotit. α-tubuliinin (läsnä solulimassa) ja histoni 3 (läsnä tumassa) käytettiin vahvistamaan ja vahvistaa puhtauden proteiinifraktiot.

2D-DIGE.

Nuclear proteiinin uuttoa varten 2D- DIGE ajettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [35]. Lyhyesti, ydinaseiden proteiini uutteita A549 tai NCI-H358-solujen kanssa tai ilman LMB hoitoa (kahtena) on käänteisesti leimattu Cy3 ja Cy5, vastaavasti (GE Healthcare). Putkiin, jotka sisälsivät 50 ug kutakin näytettä yhdistettiin 1 ui laimennettua Cy3 tai Cy5 (400 pmol /ul N, N-dimetyyliformamidi, Sigma). Sentrifugoinnin jälkeen seos jätettiin jäille 30 minuutin ajan ilman valaistuksessa. Sen jälkeen reaktio pysäytettiin lisäämällä 1 ui 10 mM lysiiniä (Sigma) ja sijoittaminen näytteitä jäillä 10 minuutin ajan pimeässä. Näytteet (jotka sisältävät 100 ug proteiineja) leimattu Cy3: lla ja Cy5: llä, laimennettiin 300 ui lisäämällä 2D nesteytys puskuria (BioRad), joka koostuu 8 M ureaa, 0,5% CHAPS, 10 mM ditiotreitolia (DTT, Bio-Rad), 0,2% biolytes amfolyyttiä, ja jäljittää bromifenolisineä. Näytteet laitettiin sitten 17-cm immobilisoitu lineaarinen pH 3-10 gradientti (IPG) liuskojen (BioRad) yli yön nesteytyksen. Isoelektrinen fokusointi suoritettiin 250 V: ssa 20 minuuttia, nostetaan asteittain 10000 sisällä 2,5 h, ja pidettiin 10000 V yhteensä 50000 Jännite tuntia (Vh). IPG suikaleet jälkeen tasapainotettiin puskurilla I (6 M ureaa, 2% SDS: ää, 375 mM tris-HCI (pH 8,8), 20% glyseroli, 130 mM DTT: tä, ja jäljittää bromifenolisinistä) ja puskuria II (6 M ureaa, 2% SDS, 375 mM Tris-HCI: a, 20% glyserolia, 135 mM jodiasetamidia, ja jäljittää bromifenolisinistä). Proteiinit erotettiin 12% SDS-PAGE-geeleissä ja visualisoitiin käyttäen Typhoon Trio Imager (GE Healthcare) viritysaallonpituuksilla 532 ja 633 nm Cy3 ja Cy5, vastaavasti. Kuvat otettiin manipuloitu ja analysoitiin DeCyder ja ImageQuant ohjelmistot (GE Healthcare); proteiini voimakkuuseroille laskettiin kunkin täplän jokaisella geelillä.

In-geeli Digestion.

2D geelit värjättiin SYPRO-RUBY (Bio-Rad). Täplät kiinnostava eristettiin käyttämällä paikalla poimija, ja laitetaan 0,5 ml: n Eppendorf putki trypsiinihajotuksen on ProGest (Perimän ratkaisut) työasema [35]. Lyhyesti, geeli tulpat pestiin Dih

2O, ja käsiteltiin asetonitriilillä (ACN) ja 15 min. Geeli palat nesteytyksestä on 10 mM DTT ja 0,1 M ammoniumbikarbonaattia (NH

4HCO

3) 30 minuutin ajan 60 ° C: ssa vesihauteessa. Sen jälkeen kutistuminen jälleen ACN, liuos, joka sisälsi 55 mM jodiasetamidia (Bio-Rad) ja 0,1 M NH

4HCO

3 lisättiin 20 minuuttia ilman valaistuksen, joka korvattiin 0,1 M NH

4HCO

3: ssa 15 minuuttia. Geeli tulpat pestiin sen jälkeen 0,1 M NH

4HCO

3: ssa 5 minuutin ajan, ja lisätään yhtä suuri tilavuus ACN 5 min. Toistuvien pesuvaiheen kahdesti, geelipalat oli kuivattu ACN ja kuivattiin sitten 30 min. Yksittäiset geelipalat rehydratoitiin hajotuspuskuria, joka sisälsi 12,5 ng /ul trypsiinillä (Promega), 40 mM NH

4HCO

3, ja 10% ACN 37 ° C: ssa 4 tuntia. Muurahaishappoa lisättiin reaktion pysäyttämiseksi, ja supernatantti analysoitiin suoraan.

LC /MS /MS-tunnistaminen.

trypsinisoitiin peptidit analysoitiin nano LC /MS /MS on ThermoFisher LTQ Orbitrap XL. Lyhyesti, 30 ui hydrolysaatin ladattiin 5 mm x 75 um ID C12 (Jupiter Proteo, Phenomenex) purkautuneet kolonniin virtausnopeudella 10 ul /min. Gradienttieluointi suoritettiin 15 cm x 75 pm ID C12 pylväs 300 nl /min. 30 min gradientti oli työssä. Massaspektrometri toimivat datan riippuvainen tilassa, ja kuuden runsain ioneja valittiin MS /MS: llä. Massaspektrometria tuloksia etsittiin käyttäen Mascot (www.matrixscience.com). Näytteet käsitellään Scaffold algoritmi DAT tiedostoja tuottamat Mascot. Parametrit LTQ Orbitrap XL tiedot vaativat vähintään 2 peptidi täsmää kohti proteiinin vähintään todennäköisyydet 90% proteiinia tasolla.

TILASTOANALYYSI

Factorial ANOVA suoritettiin vaikutusten testaamiseksi DOX ja /tai LMB pitoisuuksia ja inkubointia kertaa solujen elinkykyä. Probit-analyysiä käytettiin laskettaessa 50% estävät konsentraatiot (IC50). Sillä saadut tiedot virtaussytometrialla, keskimääräinen solun prosentit laskettiin ja tilastollinen merkitsevyys määritettiin kautta yksisuuntainen ANOVA ja post-hoc testit. Proteiinin ilmentymisen tasot ohjaus, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, ja pre-DOX + LMB5, yksisuuntainen ANOVA ja Tukeyn post hoc testejä käytettiin verrattaessa densitometrisellä intensiteetti yksittäisten näytteiden ryhmien välillä. 2D-DIGE, kuva-analyysi suoritettiin DeCyder ohjelmisto (GE Healthcare) ja ImageMaster ohjelmistoja. Sillä DeCyder ohjelmiston, Differential In-Gel Analysis (DIA) moduuli käytettiin käsitellä kuvapari yhdestä geelistä, ja suorittaa paikalla havaitsemiseen ja kvantifiointiin. Biologinen Vaihtelu Analysis (BVA) käytettiin laskemaan suhdelukua ja kontrollit suorittamalla geeli-to-geeli matching parin paikalla karttojen kustakin geelistä. Pilkut yli kaksinkertainen muutos käännetyn merkitty päällekkäisiä kokeita verrattuna kontrolleihin pidettiin kohdeproteiineihin. Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen SPSS ohjelmistoa (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) ja erot

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

sytotoksisuus DOX tai LMB

MTT-määritys suoritettiin solujen elinvoimaisuuden määrittämiseen kunakin ajankohtana. Kuten kuviossa 1A ja 1B, sekä DOX ja LMB esti merkitsevästi solujen lisääntymisen A549 annoksesta ja aikaa riippuvasti (

P

0,001). IC50 DOX ja LMB 48 h olivat 2,2 uM ja 10,6 nM, vastaavasti (taulukko 1). Vastaavasti sekä DOX ja LMB esti merkitsevästi solujen lisääntymistä NCI-H358 annoksesta ja aikaa riippuvasti (

P

0,001, kuva S1A ja S1B).

, Sytostaatti vaikutukset DOX yksinään ja DOX + LMB solujen elinkelpoisuuden A549-solut määritettynä MTT-määritystä. Tiedot ilmaistaan ​​prosentteina vertaamalla ajoneuvon ohjaus DOX ja LMB (0,5 nM) DOX + LMB. Arvot esitetään keskiarvoina ± SD, n = 6 B, sytotoksiset vaikutukset LMB yksin ja LMB + DOX solujen elinkelpoisuuden A549-solut määritettynä MTT-määritystä. Tiedot ilmaistaan ​​prosentteina vertaamalla ajoneuvon ohjaus LMB ja DOX (0,5 uM) ja LMB + DOX. Arvot ovat keskiarvoja ± SD, n = 6 C, sytotoksiset vaikutukset DOX yksinään ja pre-LMB + DOX solujen elinkelpoisuuden A549-soluja 48 h määritettynä MTT-määritystä. Tiedot ilmaistaan ​​prosentteina vertaamalla ajoneuvon ohjaus DOX ja ennalta LMB edeltävään LMB + DOX. Arvot ovat keskiarvoja ± SD, n = 6 D, sytotoksiset vaikutukset LMB yksin ja pre-DOX + LMB solujen elinkelpoisuuden A549-soluja 48 h määritettynä MTT-määritystä. Tiedot ilmaistaan ​​prosentteina vertaamalla ajoneuvon ohjaus LMB ja pre-DOX pre-DOX + LMB. Arvot ovat keskiarvoja ± SD, n = 6. Kokeet suoritettiin kolminkertaisesti tulokset olivat samanlaiset.

sytotoksisuus Co-hoito DOX ja LMB

Samanlainen DOX tai LMB ryhmiä, DOX + LMB (0,5 nM) tai LMB + DOX (0,5 uM) esti A549 proliferaatiota annoksesta ja aikaa riippuvasti (

P

0,001, kuvio 1A ja 1B). Kuitenkin samanaikaisesti hoidot DOX + LMB (0,5 nM) tai LMB + DOX (0,5 uM) ei muuttanut sytotoksisia vaikutuksia A549-soluja verrattuna DOX yksinään tai LMB yksinään sekä 24 ja 48 tuntia (

P

0,05, kuviossa 1A ja 1B). IC50 DOX + LMB (0,5 nM) ja LMB + DOX (0,5 uM) 48 h olivat 2,1 uM ja 10,4 nM, vastaavasti (taulukko 1). Samoin samanaikaisesti hoidot DOX + LMB (0,5 nM) tai LMB + DOX (0,5 uM) ei muuttanut sytotoksisia vaikutuksia NCI-H358-soluissa verrattuna DOX yksinään tai LMB yksinään sekä 24 ja 48 tuntia (

P

0,05, kuvio S1A ja S1B).

sytotoksisuus pre-LMB + DOX tai pre-DOX + LMB

Kuten kuviossa 1C on esitetty, esikäsittely 0,5 nM LMB ei lisätä sytotoksisia vaikutuksia DOX A549-soluja 48 h verrattuna DOX yksinään (

P

0,05). IC50 48 h ennen LMB + DOX ja DOX yksinään oli 2,8 ja 2,2 uM, tässä järjestyksessä (taulukko 1). Kuitenkin esikäsittelyllä 0,5 uM DOX huomattavasti sytotoksista vaikutusta LMB A549-soluja 48 h (

P

0,05, kuvio 1 D). IC50 on 48 h ennen DOX + LMB oli 4,4 nM, joka oli merkittävästi alhaisempi kuin LMB yksinään (10,6 nM,

P

= 0,037, taulukko 1). Lisäksi joko ennen LMB tai ennalta DOX ei parantanut sytotoksisille vaikutuksille DOX tai LMB on NCI-H358-soluissa (

P

0,05, kuva S1C ja S1D).

Effects DOX ja LMB solusyklin ja apoptoosi

Solulisääntyminen esto voisi olla seurausta joko solusyklin pysähtymisen tai apoptoosin, joten nämä kaksi näkökohtaa tutkittiin edelleen virtaussytometrialla analyysi A549-solut jälkeen LMB ja DOX hoitoa. Solusyklin analyysi paljasti, että solujen prosenttiosuus G2 /M oli 15,1 ± 0,4, 26,9 ± 2,8, 22,7 ± 1,0, 22,9 ± 4,2, 22,5 ± 2,8, ja 18,6 ± 1,3 valvonnassa, pre-DOX, LMB1, pre -DOX + LMB1, LMB5, ja pre-DOX + LMB5, vastaavasti (taulukko 2). Pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, ja pre-DOX + LMB5 kaikki johti kertymistä G2 /M vaiheessa versus kontrolli (

P

0,05, kuvio 2 ja taulukko 2 ). Lisäksi, solusyklin analyysi paljasti, että solujen prosenttiosuus pre-G1 olivat 5,4 ± 2,2, 9,0 ± 2,1, 8,2 ± 2,0, 18,6 ± 7,1, 10,2 ± 4,7, ja 27,5 ± 2,8 valvonnassa, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, ja pre-DOX + LMB5, vastaavasti (taulukko 2). Pre-DOX + LMB1 ja pre-DOX + LMB5 käyttöön lopullinen kertymistä edeltävässä G1 vaiheeseen verrattuna paitsi säädön lisäksi LMB yksin (

P

0,01, kuvio 2 ja taulukko 2). Apoptoosin analysointi paljasti, että LMB hoitoon merkittävästi indusoi apoptoosia (

P

0,01, taulukko 2). Apoptoosi entisestään jälkeen solut ko-annettava ennalta DOX ja LMB verrattiin LMB yksinään (

P

0,01, taulukko 2). Prosenttiosuus apoptoottisten solujen olivat 13,2 ± 1,6, 15,8 ± 2,6, 19,2 ± 2,4, 27,1 ± 0,6, 22,4 ± 4,0, ja 29,6 ± 2,1 valvonnassa, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, ja pre -DOX + LMB5, vastaavasti (taulukko 2).

edustaja histogrammit solukierron analysointiin DOX ja LMB-käsiteltyjen A549-solut. Ohjaus, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, ja pre-DOX + LMB5 kerättiin ja leimattiin guava Cell Cycle Reagent (Millipore), ja analysoitiin virtaussytometrialla (pre-G1, G0 /G1, S, ja G2 /M). Y-akseli esittää solujen lukumäärä laskettiin ja x-akseli esittää yhä enemmän Guavan Cell Cycle Reagent sisällyttäminen /solu (vasemmalta oikealle). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena tulokset olivat samanlaiset. LMB1: 1 nM LMB, LMB5: 5 nM LMB.

Western Blot analyysit p53, Phospho-p53 (Ser15), Phospho-p53 (Thr55), p21, ja surviviinia Protein Expression jälkeen DOX ja LMB hoito

Expression tasoja p53, fosfo-p53 (Ser15), ja p21 (alavirran kohde p53) lisääntyivät merkitsevästi soluissa annettava ennalta DOX + LMB kuin valvonnan ja osoittivat merkittävää annos-vaste-vaikutus (kuvio 3A). Suhteellinen proteiinin ekspressiotasot p53 (mielivaltaisina yksikköinä) oli 0,02 ± 0,00, 0,03 ± 0,00, 0,07 ± 0,00, 0,13 ± 0,03, 0,45 ± 0,01, ja 0,44 ± 0,00 kontrolliryhmässä, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, ja pre-DOX + LMB5, vastaavasti (kuvio 3B,

P

0,05, LMB1

vs.

valvonta;

P

0,01, pre -DOX + LMB1, LMB5, tai pre-DOX + LMB5

vs.

kontrolli). Suhteellinen proteiinin ekspressiotasot fosfo-p53 (Ser15) (mielivaltaiset yksiköt) oli 0,06 ± 0,00, 0,06 ± 0,00, 0,13 ± 0,03, 0,15 ± 0,01, 0,21 ± 0,01, ja 0,77 ± 0,04 kontrolliryhmässä, pre-DOX, LMB1 , pre-DOX + LMB1, LMB5, ja pre-DOX + LMB5, vastaavasti (kuvio 3B,

P

0,05, LMB5

vs.

valvonta;

P

0,01, pre-DOX + LMB5

vs.

kontrolli). Lisäksi säätely ylöspäin fosfo-p53 (Ser15) pre-DOX + LMB5 oli merkittävä verrattuna LMB5 ryhmän (

P

0,01). Suhteellinen proteiinin ekspressiotasot p21 (mielivaltaisina yksikköinä) oli 0,29 ± 0,08, 0,69 ± 0,01, 0,85 ± 0,09, 1,07 ± 0,03, 1,14 ± 0,08, ja 1,57 ± 0,02 kontrolliryhmässä, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1 , LMB5 ja pre-DOX + LMB5, vastaavasti (kuvio 3B,

P

0,01, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, ja pre-DOX + LMB5

vs.

ohjaus). Lisäksi säätely ylöspäin p21 pre-DOX + LMB5 oli merkitsevä (

P

0,05) verrattuna LMB5 ryhmän.

, Effects of pre-DOX + LMB hoito proteiinien p53, fosfo-p53 (Ser15), fosfori-p53 (Thr55), p21, ja surviviinille A549. Soluja käsiteltiin 0,5 pM DOX 24 h ennen käsittelyä LMB (1 nM tai 5 nM). 48 tunnin kuluttua LMB hoitoon, solut kerättiin Western blot analyysi määrittää proteiinin tasot. Blotit myös koestettiin α-tubuliinin vahvistamaan yhtäläiset Proteiinilisäyksen. B, suhteellinen proteiini intensiteetit p53, fosfo-p53 (Ser15), fosfo-p53 (Thr55), p21, ja surviviini verrattuna intensiteetti α-tubuliinin. Voimakkuus kunkin kaistan kvantitoitiin käyttäen Määrä Yksi ohjelmistoa. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD, n = 3. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. LMB1: 1 nM LMB; LMB5: 5 nM LMB; *,

P

0,05 verrattuna kontrolliin; **,

P

0,01 verrattuna kontrolliin; #,

P

0,05 verrattuna LMB5; ##,

P

0,01 verrattuna LMB5.

Toisin kuin p53, fosfo-p53 (Ser15), ja p21 ekspressiotasot, fosfo-p53 (Thr55) ja surviviini (toinen alavirtaan tavoite p53) ekspressiotasot olivat merkittävästi ja annoksesta riippuvaa laskua soluissa annettava ennalta DOX + LMB verrattiin kontrolleihin (kuvio 3A). Suhteellinen proteiinin ekspressiotasot fosfo-p53 (Thr55) (mielivaltaiset yksiköt) oli 0,67 ± 0,06, 0,56 ± 0,01, 0,65 ± 0,01, 0,57 ± 0,00, 0,56 ± 0,01, ja 0,42 ± 0,00 kontrolliryhmässä, pre-DOX, LMB1 , pre-DOX + LMB1, LMB5, ja pre-DOX + LMB5, vastaavasti (kuvio 3B,

P

0,01, pre-DOX + LMB5

vs.

kontrolli). Suhteellinen proteiinin ekspressiotasot surviviinin (mielivaltaisina yksikköinä) oli 0,28 ± 0,02, 0,23 ± 0,03, 0,23 ± 0,05, 0,14 ± 0,01, 0,12 ± 0,05, ja 0,08 ± 0,00 kontrolliryhmässä, pre-DOX, LMB1, pre-DOX + LMB1, LMB5, ja pre-DOX + LMB5 käsitelty ryhmissä, vastaavasti (kuvio 3B,

P

0,05, pre-DOX + LMB5

vs.

kontrolli).

vaikutukset DOX ja LMB on Nuclear Proteiiniluokkaa

Nuclear Protein Extraction.

puhtaus ydin- ja sytoplasman proteiineja testattiin Western blot-analyysi anti-histoni 3 ja anti-α-tubuliinin . Suurin osa α-tubuliinin löydettiin vain solulimafraktio A549 ja NCI-H358-soluissa; histoni 3 todettiin vain tumafraktios- A549 ja NCI-H358-soluissa, mikä viittaa siihen, että valmiste rikastettiin tumaproteiinit (kuviot 4A ja S2A).

, Western blot ydin- ja sytoplasmaproteiinin uutteita A549; α-tubuliinin toimi sisäisenä kontrollina sytoplasman proteiineja, ja histoni 3 toimi kontrollina tumaproteiineja. B, 2D-DIGE analyysit ydinvoiman proteiinien A549-soluja ja 3D-näkymät SQSTM1 A549 solun ajoneuvon hallintaan tai LMB hoitoon. Nuclear proteiinit käsitelty LMB tai ajoneuvon hallinnan leimattiin Cy3 (vihreä kanava) ja Cy5 (punainen kanava), tässä järjestyksessä. Tumaproteiinien erotettiin perustuvat isoelektrisen pisteen (PI, vaaka-akseli) ja molekyylipainon (MW, pystysuora akseli). Tiedot ovat keskiarvoja ± SD.